專利名稱：西馬特羅膠體金試紙條及其制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品安全領(lǐng)域中涉及β2_受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及西馬特羅膠體金試紙條及其制備方法。
背景技術(shù)：
β 2受體激動(dòng)劑(β 2-agonist)是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)和生理功能類似腎上腺素和去甲腎上腺素的苯乙胺類藥物，西馬特羅(CimateiOl)作為β 2_受體激動(dòng)劑的代表藥物之一，它能調(diào)節(jié)交感神經(jīng)興奮、松弛氣管平滑肌，但是長(zhǎng)期用高劑量的西馬特羅給動(dòng)物飼喂時(shí)，西馬特羅會(huì)對(duì)動(dòng)物體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行再分配，促進(jìn)蛋白質(zhì)沉積而抑制脂肪形成，從而顯著提高動(dòng)物的瘦肉率。因此，近年來(lái)西馬特羅成為了鹽酸克倫特羅的一個(gè)主要的替代品應(yīng)用于動(dòng)物飼料中。西馬特羅在體內(nèi)代謝緩慢、作用時(shí)間久、性質(zhì)穩(wěn)定、藥物殘留率高，當(dāng)人類食用殘留該藥物的動(dòng)物性食品后勢(shì)必會(huì)對(duì)健康產(chǎn)生相當(dāng)?shù)奈：?，所以研發(fā)出一種能夠方便、快速、準(zhǔn)確的定量檢測(cè)動(dòng)物性食品中西馬特羅的方法具有相當(dāng)?shù)谋匾?。目前，?guó)內(nèi)外檢測(cè)西馬特羅的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。在食品安全檢測(cè)中，往往先用ELISA進(jìn)行初篩后，再對(duì)陽(yáng)性樣本用HPLC或GC-MS、LC-MS進(jìn)行確證。但是上述方法所用的儀器設(shè)備昂貴復(fù)雜、成本高，同時(shí)需要對(duì)操作人員進(jìn)行特殊培訓(xùn)，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能立即顯示，因此不適用于商檢、防疫、畜牧生產(chǎn)者對(duì)懷疑對(duì)象的快速在線檢測(cè)和監(jiān)控。膠體金試紙條是以膠體金作為免疫層析的指示物，其原理是以條狀纖維層析材料為固相，通過(guò)毛細(xì)作用使樣品溶液在層析條上泳動(dòng)，并同時(shí)使樣品中的待測(cè)物與層析材料上針對(duì)待測(cè)物的受體(如抗體或抗原)發(fā)生高特異高親和性的免疫反應(yīng)，層析過(guò)程中免疫復(fù)合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域(檢測(cè)帶)，通過(guò)直接運(yùn)用可目測(cè)的膠體金標(biāo)記物而得到直觀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。雖然該方法快速方便，但是膠體金試紙條仍有以下缺點(diǎn):(I)只有當(dāng)金顆粒集聚到一定量(IO7個(gè)/mm2)時(shí)，才出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紫紅條帶，且該顏色條帶與背景對(duì)比度不大，從而限制了檢測(cè)靈敏度。(2)樣品基質(zhì)效應(yīng)明顯，背景干擾大。(3)無(wú)法實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。因此，目前對(duì)于西馬特羅的定量檢測(cè)手段仍有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問(wèn)題之一為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種能有效檢測(cè)西馬特羅的試紙條和其制備方法及其用途。在本發(fā)明的第一方面，參考圖1，本發(fā)明提出了一種西馬特羅膠體金試紙條，包括:底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次形成有濾紙、樣品墊、結(jié)合物墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中，所述結(jié)合物墊上是含有膠體金標(biāo)記的抗西馬特羅單克隆抗體，所述硝酸纖維素膜上進(jìn)一步形成有檢測(cè)線和質(zhì)控線，所述檢測(cè)線由能與抗西馬特羅單克隆抗體結(jié)合的西馬特羅檢測(cè)抗原線狀點(diǎn)樣組成，所述質(zhì)控線由能與抗西馬特羅單克隆抗體結(jié)合的驢抗小白鼠抗體線狀點(diǎn)樣組成。由此，可以有效地獲得西馬特羅膠體金試紙條，從而對(duì)樣品中西馬特羅進(jìn)行定量檢測(cè)。在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種制備前面所述的西馬特羅膠體金試紙條的方法，其包括下列步驟:制備硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜上形成有檢測(cè)線和質(zhì)控線；制備結(jié)合物墊；以及組裝試紙條，其中，用能與抗西馬特羅單克隆抗體結(jié)合的西馬特羅檢測(cè)抗原在所述硝酸纖維素膜上進(jìn)行線狀點(diǎn)樣作為檢測(cè)線；用能與抗西馬特羅單克隆抗體結(jié)合驢抗小白鼠抗體在所述硝酸纖維素膜上進(jìn)行線狀點(diǎn)樣作為質(zhì)控線。由此，由本發(fā)明提供的方法能有效制備前面所述的西馬特羅膠體金試紙條，從而對(duì)樣品中西馬特羅進(jìn)行定量檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，用于制備檢測(cè)線的西馬特羅檢測(cè)抗原是通過(guò)下列方法獲得的:稱取50mg西馬特羅，用IOmL pHl.0的蒸餾水將其溶解作為A液，稱取60mg亞硝酸鈉用2mL蒸餾水將其溶解作為B液，稱取232mg BSA,用pH8.00.0lM的PBS溶解作為C液；冰浴條件下把B液緩慢滴入A液中，4攝氏度磁力攪拌反應(yīng)4小時(shí)后，在冰浴條件下將其緩慢地加入C液中，加完后調(diào)pH至8.0，室溫磁力攪拌反應(yīng)過(guò)夜；以及最終產(chǎn)物用0.0lM pH7.4的PBS透析除去雜質(zhì)得到用于制備檢測(cè)線的西馬特羅偶聯(lián)物。由此，通過(guò)本發(fā)明實(shí)施例的方法，可以有效地制備具有西馬特羅檢測(cè)抗原的檢測(cè)線，從而獲得具有檢測(cè)線的西馬特羅膠體金試紙條，進(jìn)而有效地對(duì)西馬特羅進(jìn)行定量檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，用于制備質(zhì)控線的抗體是通過(guò)下列步驟獲得的:通過(guò)在驢體內(nèi)注射小白鼠免疫球蛋白，并提取含抗體的血清經(jīng)純化后制得的，以便獲得用于制備質(zhì)控線的抗體。由此，通過(guò)本發(fā)明實(shí)施例的方法，可以有效地制備具有能夠與西馬特羅檢測(cè)抗原結(jié)合的抗體的質(zhì)控線，從而獲得具有質(zhì)控線的西馬特羅膠體金試紙條，進(jìn)而有效地對(duì)西馬特羅進(jìn)行定量檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述檢測(cè)線和質(zhì)控線是通過(guò)下列步驟獲得的:將硝酸纖維素膜按20mm 30mm寬的尺寸剪裁；將經(jīng)純化濃度調(diào)整為0.2mg/mL 1.0mg/mL的西馬特羅檢測(cè)抗原，在膜上線狀點(diǎn)樣作為檢測(cè)線，其中，檢測(cè)線點(diǎn)樣位置離膜底邊15mm 18mm ;將經(jīng)純化濃度調(diào)整為0.5mg/mL 1.5mg/mL的驢抗小白鼠免疫球蛋白抗體，在膜上線狀點(diǎn)樣作為質(zhì)控線，質(zhì)控線點(diǎn)樣位置離膜底邊Ilmm 13_ ;將所述硝酸纖維素膜室溫干燥30分鐘，置于1%牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30分鐘，取出吸干水分，于37攝氏度下孵育30分鐘。由此，通過(guò)本發(fā)明實(shí)施例的方法，可以有效地制備大小均一、位置固定并且分別具有特定濃度抗原、抗體的檢測(cè)線和質(zhì)控線，從而獲得具有檢測(cè)線和質(zhì)控線的西馬特羅膠體金試紙條，進(jìn)而有效地對(duì)西馬特羅進(jìn)行定量檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，結(jié)合物墊是通過(guò)下列步驟獲得的:選用能與西馬特羅結(jié)合的抗西馬特羅單克隆抗體標(biāo)記膠體金；以及把經(jīng)過(guò)標(biāo)記的膠體金，分散在玻璃纖維紙上。由此，通過(guò)本發(fā)明實(shí)施例的方法，可以有效地制備具有能與西馬特羅結(jié)合的抗西馬特羅單克隆抗體標(biāo)記的膠體金的結(jié)合物墊，從而獲得具有結(jié)合物墊的西馬特羅膠體金試紙條，進(jìn)而有效地對(duì)西馬特羅進(jìn)行定量檢測(cè)。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種前面所述的西馬特羅膠體金試紙條檢測(cè)西馬特羅的方法，包括以下步驟:配制已知系列濃度的西馬特羅標(biāo)準(zhǔn)品并加入膠體金讀取儀樣本孔中，IOmin后檢測(cè)對(duì)應(yīng)的光密度數(shù)值并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將含有檢測(cè)樣品的試紙條放入所述膠體金讀取儀中，讀取檢測(cè)數(shù)值，以及通過(guò)所述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所述檢測(cè)樣品中的西馬特羅含量。由此，通過(guò)本發(fā)明所提供的方法，可以有效地制備采用該膠體金讀取儀的校準(zhǔn)曲線，從而配合本發(fā)明提供的西馬特羅膠體金試紙條有效地對(duì)西馬特羅進(jìn)行定量檢測(cè)。有益效果1、靈敏度高:本發(fā)明采用西馬特羅膠體金試紙條配膠體金讀取儀的方法，能通過(guò)儀器替代肉眼觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，克服了肉眼判斷帶來(lái)的誤差，從而提高了檢測(cè)靈敏度，檢測(cè)限低至Ippb。2、定量:本發(fā)明采用西馬特羅膠體金試紙條配膠體金讀取儀的方法，可以根據(jù)膠體金讀取儀顯示器上的顯示數(shù)值和標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得出被檢樣品中的西馬特羅的含量。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。


本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:圖1是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的檢測(cè)西馬特羅的膠體金試紙的結(jié)構(gòu)圖；圖2是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的一種膠體金讀取儀的示意圖；圖3是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的定量檢測(cè)西馬特羅流程圖。
具體實(shí)施例方式本實(shí)施例給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例1免疫抗原的合成
權(quán)利要求
1.一種西馬特羅膠體金試紙條，其特征在于，包括: 底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次形成有濾紙、樣品墊、結(jié)合物墊、硝酸纖維素膜和吸水墊， 其中，所述結(jié)合物墊上是含有膠體金標(biāo)記的抗西馬特羅單克隆抗體， 所述硝酸纖維素膜上進(jìn)一步形成有檢測(cè)線和質(zhì)控線，所述檢測(cè)線由能與抗西馬特羅單克隆抗體結(jié)合的西馬特羅檢測(cè)抗原線狀點(diǎn)樣組成，所述質(zhì)控線由能與抗西馬特羅單克隆抗體結(jié)合的驢抗小白鼠抗體線狀點(diǎn)樣組成。
2.一種制備權(quán)利要求1所述的西馬特羅膠體金試紙條的方法，其特征在于，包括下列步驟: 制備硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜上形成有檢測(cè)線和質(zhì)控線； 制備結(jié)合物墊；以及 組裝試紙條， 其中， 用能與抗西馬特羅單克隆抗體結(jié)合的西馬特羅檢測(cè)抗原在所述硝酸纖維素膜上進(jìn)行線狀點(diǎn)樣作為檢測(cè)線； 用能與抗西馬特羅單克隆抗體結(jié)合驢抗小白鼠抗體在所述硝酸纖維素膜上進(jìn)行線狀點(diǎn)樣作為質(zhì)控線。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，用于制備檢測(cè)線的西馬特羅檢測(cè)抗原是通過(guò)下列方法獲得的: 稱取50mg西馬特羅，用IOmL pHl.0的蒸餾水將其溶解作為A液，稱取60mg亞硝酸鈉用2mL蒸餾水將其溶解作為B液，稱取232mg BSA,用pH8.00.0lM的PBS溶解作為C液；冰浴條件下把B液緩慢滴入A液中，4攝氏度磁力攪拌反應(yīng)4小時(shí)后，在冰浴條件下將其緩慢地加入C液中，加完后調(diào)pH至8.0，室溫磁力攪拌反應(yīng)過(guò)夜；以及 最終產(chǎn)物用0.0lM pH7.4的PBS透析除去雜質(zhì)得到用于制備檢測(cè)線的西馬特羅偶聯(lián)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，用于制備質(zhì)控線的抗體是通過(guò)下列步驟獲得的: 通過(guò)在驢體內(nèi)注射小白鼠免疫球蛋白，并提取含抗體的血清經(jīng)純化后制得的，以便獲得用于制備質(zhì)控線的抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述檢測(cè)線和質(zhì)控線是通過(guò)下列步驟獲得的: 將硝酸纖維素膜按20mm 30mm寬的尺寸剪裁；將經(jīng)純化濃度調(diào)整為0.2mg/mL 1.0mg/mL的西馬特羅檢測(cè)抗原，在膜上線狀點(diǎn)樣作為檢測(cè)線，其中，檢測(cè)線點(diǎn)樣位置離膜底邊 15mm 18mm ； 將經(jīng)純化濃度調(diào)整為0.5mg/mL 1.5mg/mL的驢抗小白鼠免疫球蛋白抗體，在膜上線狀點(diǎn)樣作為質(zhì)控線，質(zhì)控線點(diǎn)樣位置離膜底邊Ilmm 13mm; 將所述硝酸纖維素膜室溫干燥30分鐘，置于1%牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30分鐘，取出吸干水分，于37攝氏度下孵育30分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法， 其特征在于，結(jié)合物墊是通過(guò)下列步驟獲得的:選用能與西馬特羅結(jié)合的抗西馬特羅單克隆抗體標(biāo)記膠體金；以及 把經(jīng)過(guò)標(biāo)記的膠體金，分散在玻璃纖維紙上。
7.一種采用如權(quán)利要求1所述的西馬特羅膠體金試紙條配膠體金讀取儀定量檢測(cè)西馬特羅的方法，其特征在于，包括下列步驟: 配制已知系列濃度的西馬特羅標(biāo)準(zhǔn)品并加入所述膠體金讀取儀的樣本孔中， 10分鐘后檢測(cè)對(duì)應(yīng)的光密度數(shù)值并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線， 將含有檢測(cè)樣品的試紙條放入所述膠體金讀取儀中， 讀取檢測(cè)數(shù)值，以及 通過(guò)所述標(biāo)準(zhǔn)曲線 計(jì)算所述檢測(cè)樣品中的西馬特羅含量。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種西馬特羅膠體金試紙條及其制備方法，其中西馬特羅膠體金試紙條包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次形成有濾紙、樣品墊、結(jié)合物墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中，所述結(jié)合物墊上含有膠體金標(biāo)記的抗西馬特羅單克隆的抗體，所述硝酸纖維素膜上進(jìn)一步形成有檢測(cè)線和質(zhì)控線，所述檢測(cè)線由能與抗西馬特羅單克隆抗體結(jié)合的西馬特羅檢測(cè)抗原線狀點(diǎn)樣組成，所述質(zhì)控線由能與抗西馬特羅單克隆抗體結(jié)合的驢抗小白鼠抗體線狀點(diǎn)樣組成。利用該試紙條能有效檢測(cè)西馬特羅。
文檔編號(hào)G01N33/558GK103207270SQ201310121618
公開(kāi)日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2013年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月9日
發(fā)明者賴衛(wèi)華, 彭濤, 楊萬(wàn)春, 陳媛, 劉文娟 申請(qǐng)人:江西中德生物工程有限公司