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一種基于Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>納米材料的食源性致病菌NMR檢測(cè)方法

文檔序號(hào):5853732閱讀:673來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱(chēng):一種基于Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>納米材料的食源性致病菌NMR檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種致病菌NMR檢測(cè)方法,尤其涉及一種基于Fe3O4納米材料的食源性 致病菌NMR檢測(cè)方法。
背景技術(shù)
基本原理:將單克隆抗體或抗原分子與酶分子通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合,這種結(jié)合不會(huì)改 變單克隆抗體、抗原和酶的免疫學(xué)特性及生物活性,特異性的單克隆抗體只會(huì)與特異性的 抗原結(jié)合。其主要的原理步驟1.利用Fe3O4磁珠,包被一層高分子化合物,經(jīng)過(guò)改性后采 用適當(dāng)?shù)呐悸?lián)劑將待檢目標(biāo)菌的單克隆抗體偶聯(lián)在磁珠表面,形成特異性免疫磁珠。2.將 另一部分目標(biāo)菌的特異性單克隆抗體采用一定的方法固定在固相載體表面,并將多余活性 位點(diǎn)封閉。3.將制備的特異性免疫磁珠用于抓取富集目標(biāo)菌,通過(guò)外加磁場(chǎng)將磁珠分離出 來(lái),此時(shí),結(jié)合了目標(biāo)菌的磁珠和沒(méi)有結(jié)合目標(biāo)菌的磁珠還是混在一起。4.將上述混在一 起的磁珠,加到第2步的固相載體表面,則抓取了目標(biāo)菌的磁珠將與固相載體表面單克隆 抗體發(fā)生特異性結(jié)合,形成雙抗夾心,用無(wú)菌的去離子水清洗可以將未發(fā)生結(jié)合的磁珠洗 脫。5.再采用洗脫劑將固定載體上的結(jié)合的特異性納米免疫磁珠洗下來(lái),清洗掉離子,溶 齊IJ。此部分磁珠如果存在,就是抓取了目標(biāo)菌的磁珠。由于Fe3O4具有順磁和超順磁特性, 對(duì)于共振儀器非常敏感,相對(duì)于其他分子而言,微量的Fe3O4能夠大幅降低無(wú)菌的去離子水 的自旋-晶格馳豫參數(shù)Tl和自旋-自旋弛豫時(shí)間T2,而無(wú)菌的去離子水在一定的均勻場(chǎng)強(qiáng) 下,T1/T2是固定的。將洗脫液置于核磁共振儀中,與無(wú)菌的去離子水對(duì)照組進(jìn)行對(duì)照。顯 著發(fā)生T2/T1值降低的說(shuō)明有磁珠存在,從而間接說(shuō)明食品樣品中有致病菌檢出。磁珠含 量與T2/T1值降低呈正比。通過(guò)加標(biāo),可以定量檢測(cè)目標(biāo)菌。該方法中Fe3O4磁珠既是分 離富集的手段,同時(shí)它具有的順磁和超順磁特性,又可作為定量檢測(cè)的探針。該方法的主要 優(yōu)點(diǎn)就是快速、靈敏度高。相對(duì)于致病菌的微生物培養(yǎng)2-3天甚至幾天的時(shí)間。此方法主 要取決于樣品的預(yù)處理時(shí)間,核磁共振檢測(cè)只需幾分鐘。因此,用該方法可做大規(guī)模待檢樣 本的陽(yáng)性篩選,檢出的陽(yáng)性樣還需用微生物培養(yǎng)進(jìn)行確證。目前,國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道 這種方法,但是采用免疫磁珠進(jìn)行致病菌的富集,目標(biāo)物的富集等的報(bào)道還是很多的,但都 沒(méi)有采用核磁共振做進(jìn)一步的檢測(cè)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于Fe3O4的NMR納米探針的核磁共振技術(shù)快速檢測(cè)出 食品中的有害致病菌的方法,用于對(duì)各種不同的食品樣品進(jìn)行評(píng)價(jià),該方法是一種客觀有 效的檢出食品中有害致病菌的方法,從而在某種程度上大大縮減了食品樣品有害致病菌的 篩選時(shí)間。
一種基于Fe3O4的NMR納米探針的核磁共振技術(shù)快速檢測(cè)出食品中的有害致病菌 的方法,核磁共振儀對(duì)順磁、超順磁物質(zhì)的響應(yīng)敏感性,提出核磁共振弛豫參數(shù)變化與Fe3O4 納米超順磁免疫磁珠含量的相關(guān)性指標(biāo)。不同的致病菌檢出下限不同。
該方法依賴(lài)于建立的可用于食品樣品中有害致病菌特征性免疫磁珠富集、分離, 從核磁共振弛豫信號(hào)參數(shù)變化的角度,檢測(cè)出樣品中的有害致病菌。采用偶聯(lián)了特異性單 克隆抗體的超順磁免疫磁珠,可以將樣品中的特異性致病菌進(jìn)行富集。由于核磁共振儀自 旋-晶格弛豫效率和自旋-自旋弛豫效率對(duì)Fe3O4納米粒子非常敏感,即在去離子水中,存 在微量的超順磁Fe3O4納米粒子,則水的自旋-晶格弛豫時(shí)間(Tl)和/自旋-自旋弛豫(T2) 就會(huì)顯著下降。在一定條件下,超順磁免疫磁珠的順磁特性使核磁共振的弛豫衰減信號(hào)T2/ Tl產(chǎn)生線性減小。通過(guò)定量檢測(cè)出樣品中的免疫磁珠含量,從而可以間接定量出食品樣品 中的有害致病菌含量。檢測(cè)出的致病菌含量與磁珠含量線性相關(guān),相關(guān)系數(shù)R2為0.98,擬 合度較好。最終以超順磁免疫磁珠與致病菌間的對(duì)應(yīng)關(guān)系為紐帶,確定食品樣本中的致病 菌菌落數(shù)。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的,步驟如下:1)檢測(cè)目標(biāo)菌的特異性免疫磁珠的制備;2)將目標(biāo)菌特異性單克隆抗體固定在固相載體表面;3)免疫磁珠富集目標(biāo)菌株,并分離:將第I步制得的免疫磁珠加入待檢樣品,充分混合 震蕩,抓取目標(biāo)菌后通過(guò)施加外加磁場(chǎng),則磁珠就匯集到磁場(chǎng)一邊,吸走上清液則可以分離 出磁珠若待檢樣本中有目標(biāo)菌,則被磁珠所富集,加少量無(wú)菌的去離子水則形成目標(biāo)菌的 磁珠懸池液;4)將富集的磁珠懸濁液加到第2步制作的固定了單克隆抗體的固相載體上,若存在目 標(biāo)菌則形成雙抗夾心;用無(wú)菌的去離子水清洗,則沒(méi)有抓取到目標(biāo)菌的磁珠就被洗掉,若不 存在目標(biāo)菌,則所有磁珠都被洗掉;5)之后,用洗脫劑將固定板上的雙抗夾心的磁珠洗下來(lái),用外加磁場(chǎng)分離磁珠的方法 用無(wú)菌的去離子水清洗掉離子和溶劑,如果還存在磁珠就是抓到目標(biāo)菌的磁珠;6)這部分磁珠,加入無(wú)菌的去離子水形成磁珠的懸濁液,進(jìn)行核磁共振的弛豫時(shí)間測(cè) 定,以無(wú)菌的去離子水為空白,測(cè)得的懸濁液的弛豫時(shí)間T1/T2相比無(wú)菌的去離子水有顯 著降低,則說(shuō)明含有磁珠,從而間接證明樣本中有目標(biāo)致病菌,磁珠的量與T1/T2的下降呈 正比,可以通過(guò)定量磁珠而間接定量出目標(biāo)菌的量。
所述NMR納米探針為Fe 30 4材料,Y晶形的納米粒徑小于1000納米。
所述的目標(biāo)菌的最終檢出評(píng)價(jià)方法基于核磁共振技術(shù)的弛豫時(shí)間特性參數(shù)的變 化。
所述弛豫時(shí)間特性,是指自旋-晶格弛豫時(shí)間(Tl)和自旋-自旋弛豫時(shí)間(T2)。
所述弛豫時(shí)間特性,Tl采用180° - τ -90°脈沖方法測(cè)定,Τ2采用CPMG序列方法 測(cè)定。
本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供一種客觀的快速檢測(cè)出食品中的有害致病菌的方 法,其特征是依賴(lài)于建立的可用于檢測(cè)超順磁免疫磁珠的核磁共振檢測(cè)方法。該方法可以 客觀有效地對(duì)食品中有害致病菌進(jìn)行檢測(cè),相比于致病菌的生物培養(yǎng)確認(rèn),該方法具有快 速檢測(cè)的優(yōu)勢(shì),可以用于大規(guī)模樣本的快速篩選。
具體實(shí)施方式
實(shí)例I檢測(cè)食品樣本中是否含有有害致病菌——李斯特菌。
1.免疫磁珠制備:磁珠與單克隆抗體的偶聯(lián)。采用商品化的奧潤(rùn)公司的羧基化磁珠, PM3-020 (180nm)與單克隆抗體偶聯(lián)。單克隆抗體采用生物試劑公司購(gòu)買(mǎi)的商品李斯特菌 單克隆抗體,或自行制備單克隆單克隆抗體并分離純化。偶聯(lián)步驟:①清洗:分別取5mg羧 基化磁珠于5mL離心管中,2mL磷酸緩沖液(PB)0.02M,pH=6.0洗2次,洗滌后用2mL水嗎 啉乙磺酸(MES) 0.05M, pH=6.0重懸;②活化:超聲使磁珠分散,再分別加入Img碳二亞胺 (EDC),Img N-羥基琥珀酰亞胺(NHSS)(用0.05M, pH=6.0 MES溶解),25°C活化2h,旋轉(zhuǎn)儀 15r/min保持懸浮狀態(tài);③偶聯(lián):磁分離,吸去上清,2mL PB (0.02M,pH=7.4)洗滌一次并轉(zhuǎn) 移至新的離心管,3mL磷酸鹽緩沖液(PBS) 0.02M,pH=7.4重懸,超聲使磁珠分散。再分別 將275 μ g抗體加入到已活化磁珠中,25°C偶聯(lián)3h,旋轉(zhuǎn)儀15r/min保持懸浮狀態(tài);④封閉: 磁分離,取出上清(上清中的蛋白含量用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè),測(cè)算偶聯(lián)量),加入 lmg/mL乙醇胺及l(fā)mg/mL牛血清白蛋白(BSA)封閉(0.02M,pH=7.4的PB溶解,并調(diào)節(jié)pH至 中性),25°C封閉2h,旋轉(zhuǎn)儀15r/min保持懸浮狀態(tài);⑤保存:0.0lM PBS洗滌磁珠2次,磁分 離,去上清,用3mL pH7.4 PB (0.02M,0.02% NaN3,0.5%BSA)重懸,存于4°C。制備的免疫磁 珠備用。
2.單克隆單克隆抗體固定:可以采用常規(guī)的酶標(biāo)板固定方法,也可以采用以下方 法。用干凈的蓋玻片5X5_2正方形,鍍膜機(jī)先噴一層Cr (2-4 nm)用以幫助固定金。再 用在表面濺射噴上一層納米金,再采用200微升2 mmol 二硫基-琥珀酰亞胺-丙酸酯 (DSP)對(duì)納米金進(jìn)行修飾(DMS0,二甲基亞砜稀釋DSP)。加入李斯特菌單克隆單抗,即將100 PL 100 Pg/mL單克隆單克隆抗體通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)法固定在玻璃板上并37 °C孵育45 min。加入1%牛血清蛋白(BSA),22°C,I小時(shí),將板上剩余的活性位點(diǎn)進(jìn)行封閉并干燥。
3.將食品樣本進(jìn)行預(yù)處理,對(duì)樣品進(jìn)行過(guò)濾、增菌活化等預(yù)處理,得到待檢樣本。 將第一步制得的免疫單克隆抗體磁珠加入后進(jìn)行充分震蕩5分鐘。上磁力架分離磁珠,力口 少量水得到磁珠的乳液。此時(shí),如果待檢樣本中有目標(biāo)李斯特菌,則通過(guò)免疫磁珠的特異性 反應(yīng)就達(dá)到了目標(biāo)菌富集的目的。將此富集的磁珠乳液加到第2步所制備的單克隆抗體固 定板上,則磁珠乳液中結(jié)合了李斯特菌的磁珠會(huì)進(jìn)一步與固定板上的單克隆抗體發(fā)生特異 性結(jié)合,形成雙抗夾心結(jié)構(gòu)。此時(shí)用無(wú)菌的去離子水清洗,就可以將沒(méi)有結(jié)合李斯特菌的磁 珠洗去。在固定板上剩下的就只有結(jié)合了李斯特菌的磁珠。
4.用洗脫液將固定板上的結(jié)合了李斯特菌的磁珠洗脫下來(lái)。上磁力架,分離磁珠 并清洗1-2次,將離子洗去。得到的溶液,用核磁共振儀(NMR20,紐邁公司或miniNMR華東 師范大學(xué))測(cè)定溶液的Tl和T2.以去離子水為空白,得到水的T1/T2,溶液測(cè)得的T1/T2與 空白相比較,有顯著差異,說(shuō)明溶液中有磁珠存在,從而說(shuō)明樣本中有李斯特菌,磁珠的量 與T1/T2的下降值呈正比。下降的越多說(shuō)明磁珠越多,從而間接說(shuō)明李斯特菌越多,通過(guò)加 標(biāo)驗(yàn)證可以定量檢測(cè)樣本中目標(biāo)菌的數(shù)目。
具體實(shí)施方式
實(shí)例2測(cè)定食品樣品是否含有有害致病菌大腸桿菌0157:H7。
1.免疫磁珠制備:磁珠與單克隆抗體的偶聯(lián)。采用商品化的奧潤(rùn)公司的羧基化磁珠, PM3-020 (180nm)與單克隆抗體偶聯(lián)。單克隆抗體采用商品的大腸桿菌0157:H7單克隆抗 體,或自行制備單克隆單克隆抗體并分離純化。偶聯(lián)步驟:①清洗:分別取5mg羧基化磁珠 于 5mL 離心管中,2mL PB (0.02M, ρΗ=6.0)洗 2 次,洗滌后用 2mL MES (0.05M, ρΗ=6.0)重 懸;②活化:超聲使磁珠分散,再分別加入Img EDC, Img NHSS(用0.05Μ,ρΗ=6.0 MES溶解), 25°C活化2h,旋轉(zhuǎn)儀15r/min保持懸浮狀態(tài);③偶聯(lián):磁分離,吸去上清,2mL PB (0.02M, pH=7.4)洗滌一次并轉(zhuǎn)移至新的離心管,3mL PB (0.02M,pH=7.4)重懸,超聲使磁珠分散。再 分別將275 μ g單克隆抗體加入到已活化磁珠中,25 V偶聯(lián)3h,旋轉(zhuǎn)儀15r/min保持懸浮狀 態(tài);④封閉:磁分離,取出上清(上清中的蛋白含量待檢),加入lmg/mL乙醇胺及l(fā)mg/mL BSA 封閉(0.02M,pH=7.4的PB溶解,并調(diào)節(jié)pH至中性),25°C封閉2h,旋轉(zhuǎn)儀15r/min保持懸浮 狀態(tài);⑤保存OlM PBS洗滌磁珠2次,磁分離,去上清,用3mL pH7.4 PB (0.02M,0.02% NaN3,0.5%BSA)重懸,存于4°C。制備的免疫磁珠備用。
2.單克隆單克隆抗體固定:可以采用常規(guī)的酶標(biāo)板固定方法,也可以采用以下 方法。用干凈的蓋玻片5X5mm2正方形,鍍膜機(jī)先噴一層Cr (2-4 nm)用以幫助固定金。 再用在表面濺射噴上一層納米金,再采用200微升2 mmol 二硫基-琥珀酰亞胺-丙酸酯 (DSP)對(duì)納米金進(jìn)行修飾(DMS0,二甲基亞砜稀釋DSP)。加入0157:H7單克隆單抗,即將100 PL 100 Pg/mL單克隆單克隆抗體通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)法固定在玻璃板上并37 °C孵育45 min。加入1%牛血清蛋白(BSA),22°C,I小時(shí),將板上剩余的活性位點(diǎn)進(jìn)行封閉并干燥。
3.將食品樣本進(jìn)行預(yù)處理,對(duì)樣品進(jìn)行過(guò)濾、增菌、活化等預(yù)處理,得到待檢樣本。 將第一步制得的免疫單克隆抗體磁珠加入后進(jìn)行充分震蕩5分鐘。上磁力架分離磁珠,力口 少量水得到磁珠的乳液。此時(shí),如果待檢樣本中有目標(biāo)大腸桿菌0157:H7,則通過(guò)免疫磁珠 的特異性反應(yīng)就達(dá)到了目標(biāo)菌富集的目的。將此富集的磁珠乳液加到第2步所制備的單克 隆抗體固定板上,則磁珠乳液中結(jié)合了大腸桿菌0157:H7的磁珠會(huì)進(jìn)一步與固定板上的單 克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合,形成雙抗夾心結(jié)構(gòu)。此時(shí)用無(wú)菌的去離子水清洗,就可以將未結(jié) 合大腸桿菌0157:H7的磁珠洗去。在固定板上剩下的就只有結(jié)合了大腸桿菌0157:H7的磁 珠。
4.用洗脫液將固定板上的結(jié)合了大腸桿菌0157:H7的磁珠洗脫下來(lái)。上磁力 架,分離磁珠并清洗1-2次,將離子洗去。得到的溶液,用核磁共振儀(NMR20,紐邁公司或 miniNMR華東師范大學(xué))測(cè)定溶液的Tl和T2,以去離子水為空白,得到去離子水的T1/T2, 溶液測(cè)得的T1/T2與空白比較,有顯著差異,說(shuō)明溶液中有磁珠存在,從而說(shuō)明樣本中有大 腸桿菌0157:H7,磁珠的量與T1/T2的下降值呈正比。下降的越多說(shuō)明磁珠越多,從而間接 說(shuō)明大腸桿菌0157:H7越多,通過(guò)加標(biāo)驗(yàn)證可以定量檢測(cè)樣本中目標(biāo)菌的數(shù)目。
權(quán)利要求
1.一種基于Fe3O4納米材料的食源性致病菌NMR檢測(cè)方法,其特征步驟如下:1)檢測(cè)目標(biāo)菌的特異性免疫磁珠的制備;2)將目標(biāo)菌特異性單克隆抗體的固定在固相載體上;3)免疫磁珠富集目標(biāo)菌株,并分離:將第I步制得的免疫磁珠加入待檢樣品,充分混合 震蕩,抓取目標(biāo)菌后通過(guò)施加外加磁場(chǎng),則磁珠就匯集到磁場(chǎng)一邊,吸走上清液則可以分離 出磁珠,若待檢樣本中有目標(biāo)菌,則被磁珠所富集,加少量水則形成目標(biāo)菌的磁珠懸濁液;4)將富集的磁珠懸濁液加到固定了單克隆抗體的固相載體上,若存在目標(biāo)菌則形成雙 抗夾心,用無(wú)菌的去離子水清洗,則沒(méi)有抓取到目標(biāo)菌的磁珠就被洗掉,若不存在目標(biāo)菌, 則所有磁珠都被洗掉;5)之后,用洗脫劑將固定板上的雙抗夾心的磁珠洗下來(lái),用外加磁場(chǎng)分離磁珠的方法 用無(wú)菌的去離子水清洗掉離子和溶劑,如果還存在磁珠就是抓到目標(biāo)菌的磁珠;6)這部分磁珠,加入無(wú)菌的去離子水形成磁珠的懸濁液,進(jìn)行核磁共振的弛豫時(shí)間測(cè) 定,以無(wú)菌的去離子水為空白,測(cè)得的懸濁液的弛豫時(shí)間T1/T2相比無(wú)菌的去離子水有顯 著降低,則說(shuō)明含有磁珠,從而間接證明樣本中有目標(biāo)致病菌,磁珠的量與T1/T2的下降呈 正比,可以通過(guò)定量磁珠而間接定量出目標(biāo)菌的量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于Fe3O4納米材料的食源性致病菌NMR檢測(cè)方法,其 特征是所述NMR納米探針為Fe3O4材料,納米粒徑小于1000納米。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于Fe3O4納米材料的食源性致病菌NMR檢測(cè)方法,其 特征是所述的目標(biāo)菌的最終檢出評(píng)價(jià)方法基于核磁共振技術(shù)的弛豫時(shí)間特性參數(shù)的變化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于Fe3O4納米材料的食源性致病菌NMR檢測(cè)方法,其 特征是所述弛豫時(shí)間特性,是指自旋-晶格弛豫時(shí)間(Tl)和自旋-自旋弛豫時(shí)間(T2)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于Fe3O4納米材料的食源性致病菌NMR檢測(cè)方法,其 特征是所述弛豫時(shí)間特性,Tl采用180° - τ -90°脈沖方法測(cè)定,Τ2采用CPMG序列方法測(cè) 定。
全文摘要
一種基于Fe3O4的NMR納米探針檢測(cè)食源性致病菌的快速檢測(cè)方法,屬于食品安全致病菌快速檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明依賴(lài)于建立的可以用于食品液體樣本中致病菌的核磁共振檢測(cè)方法,利用Fe3O4納米材料制備免疫磁珠針對(duì)性的富集目標(biāo)菌株,利用Fe3O4的順磁、超順磁特性對(duì)核磁共振弛豫時(shí)間的影響,檢測(cè)出樣本中是否含有目標(biāo)致病菌。不同的具體的對(duì)應(yīng)關(guān)系為超順磁免疫磁珠,在一定條件下顯示出線性關(guān)系,即免疫磁珠含量大,樣品的T2/T1值越小,在一定范圍能夠定量檢測(cè)目標(biāo)菌。該方法可以用于食品樣本中有害致病菌的快速檢測(cè),從而可以作為大批待檢樣品的快速篩選。
文檔編號(hào)G01N24/08GK103207198SQ20131002364
公開(kāi)日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2013年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月23日
發(fā)明者張錦勝, 唐群, 賴(lài)衛(wèi)華 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)
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