專利名稱：Psmd4蛋白在制備肝癌預(yù)后評估試劑盒中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種PSMD4蛋白的應(yīng)用，具體地說，涉及PSMD4蛋白在制備肝癌預(yù)后評估試劑盒中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率長期居高不下。我國是世界上肝癌發(fā)病最多的國家，每年新發(fā)病例約占全球50%。統(tǒng)計(jì)資料表明，肝癌術(shù)后高轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率(5年復(fù)發(fā)率達(dá)70%，小肝癌也達(dá)50%)已成為進(jìn)一步提高遠(yuǎn)期療效的瓶頸，肝癌預(yù)后判斷指標(biāo)匱乏。肝癌轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素參與并相互作用的復(fù)雜過程，即關(guān)乎癌細(xì)胞本身、又與癌細(xì)胞同癌周微環(huán)境及宿主免疫狀態(tài)的相互作用有關(guān)。目前至少有20余種基因異常表達(dá)被確定與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但已確定的肝癌相關(guān)基因在肝癌中異常表達(dá)率并不高，這些指標(biāo)的敏感性及特異性尚難以滿足臨床預(yù)測要求。本領(lǐng)域迫切需要尋找能預(yù)測肝癌病情及預(yù)后的相關(guān)基因和/或蛋白，這方面的研究對臨床治療肝癌及預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)具有重要意義。PSMD4蛋白(蛋白酶體26S非ATP酶亞基4，GeneID:5710)。PSMD4的功能目前仍不十分清楚。有研究顯示，PSMD4可能與細(xì)胞分化和機(jī)體發(fā)育有關(guān)(參見文獻(xiàn):Smalle，J.，etal., The pleiotropic role of the26S proteasome subunit RPNlOin Arabidopsisgrowth and development supports a substrate-specific function in abscisicacid signaling.Plant Cell, 2003.15(4):p.965-80.；Szlanka, T., et al., Deletion ofproteasomal subunit S5a/Rpnl0/p54causes lethality, multiple mitotic defectsand overexpression of proteasomal genes in Drosophila melanogaster.J CellSci, 2003.116(Pt6):p.1023-33.；Hamazaki, J.,et al.，RpnlO-mediated degradationof ubiquitinated proteins is essential for mouse development.Mol CellBiol, 2007.27(19):p.6629-38)目前為止，肝癌的發(fā)生的分子機(jī)制仍不清楚，有效的治療靶點(diǎn)和診斷標(biāo)志物也十分有限。目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道PSMD4與肝癌復(fù)發(fā)或預(yù)后判定相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供PSMD4蛋白的新應(yīng)用，特別是在制備肝癌預(yù)后評估試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次發(fā)現(xiàn)，采用免疫組化方法檢測PSMD4蛋白在肝癌組織中的相對表達(dá)量，能夠判斷肝癌患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)及術(shù)后狀況。基于PSMD4蛋白的相對表達(dá)量與肝細(xì)胞癌的這種相關(guān)性，以該蛋白作為分子標(biāo)記對其表達(dá)量進(jìn)行檢測可以用于指導(dǎo)肝癌的預(yù)后判斷。
本發(fā)明提供了 PSMD4蛋白在制備肝癌預(yù)后評估試劑盒中的應(yīng)用，該應(yīng)用是指將PSMD4蛋白作為分子標(biāo)記，利用PSMD4單克隆抗體或多克隆抗體， 以及免疫組化實(shí)驗(yàn)試劑，分析PSMD4蛋白在肝癌組織中的相對表達(dá)量。利用特異性抗PSMD4蛋白的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體，用于制備確定肝癌手術(shù)預(yù)后的制劑或試劑盒，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。所述的PSMD4多克隆抗體為商品化抗體，制備方法參見文獻(xiàn)Yokoyama, W.M.，Christensen, Μ.，Santos,G.D.and Miller, D.2006.Production of MonoclonalAntibodies.Current Protocols in Immunology.74:2.5.1 - 2.5.25。本發(fā)明還提供了使用上述試劑盒用于體外檢測PSMD4蛋白在肝癌組織中的表達(dá)量的方法，該方法包括以下步驟:Ca)利用本試劑盒中的免疫組化實(shí)驗(yàn)試劑(二甲苯，乙醇，3%H202甲醇液，1%BSA封閉液，DAB顯色試劑，蘇木素和辣根過氧化物酶)標(biāo)記羊抗兔IgG將肝癌組織切片進(jìn)行免疫組化染色；(b)利用顯微鏡和成像裝置拍攝為數(shù)碼照片；(c)利用生物圖像處理軟件分析腫瘤和瘤旁組織陽性信號強(qiáng)度，給出評分；(d)根據(jù)評分計(jì)算腫瘤組織中PSMD4蛋白分子表達(dá)量。所述的該方法具體步驟如下:(I)制備肝癌組織石蠟切`片，60°C烤箱過夜；(2)切片脫臘至水；(二甲苯① IOmin —二甲苯② IOmin —二甲苯③ IOmin — 100% 乙醇 5min — 95% 乙醇 5min — 85% 乙醇 5min — 75% 乙醇 5min —雙蒸水 5min)(3) 3%H202 甲醇液，室溫放置 20min ；(4)雙蒸水洗 5min X 3 ；(5)抗原修復(fù):切片放入0.0IM檸檬酸鹽緩沖液(ρΗ6.0)中煮沸5min，停火lOmin，再煮沸5min ；(6)自然冷卻至室溫，雙蒸水洗5minX3 ;(7) 1%BSA 封閉 30min，37 °C ；(8)甩去封閉液，不洗，直接加一抗(兔PSMD4多克隆抗體，購自ProteintechGroup公司，稀釋比例1:2000)。置入濕盒中30min，37°C，然后4°C冰箱過夜16小時(shí)；(9)4°〇取出，室溫復(fù)溫151^11，然后0.0謹(jǐn)PBS洗5minX4;(10)滴加二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，購自丹麥DAKO公司，即用型，無需稀釋)45min，37°C ；(11)0.0lM PBS 洗 5minX4，DAB 顯色 2-10min，鏡下觀察；(12)雙蒸水終止顯色，蘇木素復(fù)染10秒；(13)分化后自來水返藍(lán)，蒸餾水浸泡；(14)脫水透明，蓋玻片覆蓋；(15)顯微鏡下觀察陽性染色，分別于肝癌組織和癌旁組織各隨機(jī)選取3個(gè)視野，拍照；(16)采用Image Scope (Aperio公司)軟件對組織樣本進(jìn)行掃描，掃描后采用該軟件的Algorithms (Positive Pixel Count)程序?qū)γ總€(gè)樣本進(jìn)行“陽性Pixel ”計(jì)算,獲得計(jì)算數(shù)據(jù)如下表:
權(quán)利要求
1.SMD4蛋白在制備肝癌預(yù)后評估試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，該應(yīng)用是指將PSMD4蛋白作為分子標(biāo)記，利用PSMD4單克隆抗體或多克隆抗體，以及免疫組化實(shí)驗(yàn)試劑，分析PSMD4蛋白在肝癌組織中的相對表達(dá)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PSMD4蛋白在制備肝癌預(yù)后評估試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，其中的免疫組化實(shí)驗(yàn)試劑是指二甲苯、乙醇、3%H202甲醇液、1%BSA封閉液、DAB顯色試齊U、蘇木素和辣根過氧化物酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的PSMD4蛋白在制備肝癌預(yù)后評估試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，該應(yīng)用是使用所述的試劑盒在體外檢測PSMD4蛋白在肝癌組織中的表達(dá)量，其檢測方法包括以下步驟: Ca)利用本試劑盒中的二甲苯，乙醇，3%H202甲醇液，1%BSA封閉液，DAB顯色試劑，蘇木素和辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG將肝癌組織切片進(jìn)行免疫組化染色； (b)利用顯微鏡和成像裝置拍攝為數(shù)碼照片； (c)利用生物圖像處理軟件分析腫瘤和瘤旁組織陽性信號強(qiáng)度，給出評分； Cd)根據(jù)評分計(jì)算腫瘤組織中PSMD4蛋白分子表達(dá)量。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種PSMD4蛋白的應(yīng)用，具體地說，涉及PSMD4蛋白在制備肝癌預(yù)后評估試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明利用免疫組化技術(shù)、顯微鏡拍照和計(jì)算機(jī)圖像處理軟件測定腫瘤組織相對瘤旁組織中PSMD4蛋白相對表達(dá)量，并結(jié)合術(shù)后隨訪信息，確定PSMD4蛋白相對表達(dá)量與手術(shù)后肝細(xì)胞癌患者預(yù)后存在相關(guān)性，PSMD4蛋白能用于制備判斷肝癌患者預(yù)后的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記，對于肝細(xì)胞癌病人術(shù)后監(jiān)控和序貫治療也具有重要的指導(dǎo)意義。
文檔編號G01N33/577GK103091493SQ20131000549
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月8日
發(fā)明者王紅陽, 丁勁, 孫文, 李恒宇, 王雪, 向代民 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)