專利名稱：一種魚類鮮度k值測定樣品前處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析測試技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種改進(jìn)的魚類鮮度K值測定樣品前處
理方法。
背景技術(shù)：
鮮度是水產(chǎn)品價(jià)值的重要衡量指標(biāo)。K值是表示鮮度的一個(gè)指標(biāo)，自1959年提出這個(gè)概念后，測定K值所需的提取ATP關(guān)聯(lián)化合物的方法卻沒有很大改進(jìn)。魚死亡早期，其自身的酶活性仍在活動，魚的早期鮮度取決于自身的生物化學(xué)反應(yīng)。將肌苷和次黃嘌嶺之和對ATP各級降鮮產(chǎn)物之和的比值即K值作為評定魚類鮮度的重要化學(xué)指標(biāo)，該法對魚類鮮度進(jìn)行評定行之有效，目前已為世界各國采用。測定的關(guān)鍵在于對魚肉樣品中所含核苷酸不同階段的分解物進(jìn)行定量。而核苷酸及其分解產(chǎn)物的提取是否充分，提取過程是否迅速高效，對K值的測定精度具有極大的影響。傳統(tǒng)的樣品處理方法是將魚肉在高氯酸中勻漿，使得與ATP及其關(guān)聯(lián)產(chǎn)物分解相關(guān)的酶失活，同時(shí)抽提出酸可溶性核苷酸分解產(chǎn)物。離心分離上清液，沉淀多次重復(fù)抽提，最后合并上清液。為防止ATP在酸性條件下分解，抽提出的上清液應(yīng)盡快用KOH中和。另夕卜，采用KOH中和還能除去高氯酸，避免其阻礙ATP關(guān)聯(lián)產(chǎn)物在后續(xù)離子交換樹脂的吸附。以上操作，步驟較多，處理不便，多個(gè)步驟必然造成系統(tǒng)誤差，導(dǎo)致測定精度的低下；且處理時(shí)間長，有可能導(dǎo)致ATP關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的非生理性分解，導(dǎo)致測定誤差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種改進(jìn)的魚類鮮度K值測定樣品前處理方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種魚類鮮度K值測定樣品前處理方法，包括以下步驟
(1)取0.8-1. 2g魚肉樣品，放入容器中，添加質(zhì)量濃度為2. 5-10%的高氯酸的水溶液，魚肉樣品與高氯酸的水溶液的質(zhì)量體積比為0. l(g/mL)，在冰水浴條件下攪拌10-20分鐘；
(2)往容器中添加濃度為IM的K0H，調(diào)節(jié)pH值至2-3.5 ；
(3)加蒸餾水或去離子水定容至20mL，通過0.45微米的微濾膜過濾除去可能含有的雜質(zhì)。在濾液中添加0. 2-lmL的濃度為0. 1M、pH為7. 5的磷酸緩沖液，即得到K值分析用的預(yù)處理樣品。本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明的方法簡單易行，省時(shí)省力，降低對儀器的依賴，提高了處理效率，確保測定精度。
具體實(shí)施例方式一種魚類鮮度K值測定樣品前處理方法，包括以下步驟1、取0. 8-1. 2g魚肉樣品，放入容器中，添加質(zhì)量濃度為2. 5-10%的高氯酸的水溶液，魚肉樣品與高氯酸的水溶液的質(zhì)量體積比為0.1 (g/mL)，在冰水浴條件下攪拌10-20分鐘。高氯酸可使魚肉中含有的ATP及其關(guān)聯(lián)產(chǎn)物分解酶類失活，傳統(tǒng)方法為提高ATP及其關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的提取得率，采用勻漿的方法使得魚肉微細(xì)化。但是，附聚在勻漿機(jī)器件及容器皿上的樣品收集比較困難；樣本較多時(shí)，勻漿處理亦耗時(shí)耗力。研究發(fā)現(xiàn)，若樣品為0. 8-1. 2g,無論是直接在魚肉中添加高氯酸,還是把魚肉樣品切成若干小塊,或者經(jīng)過細(xì)致均勻的剁碎，添加高氯酸水溶液后抽提出的核苷酸關(guān)聯(lián)物的量測定結(jié)果沒有明顯的差異。故本發(fā)明略去細(xì)切、剁碎、勻漿的操作，直接在0. 8-1. 2g魚肉樣品中添加高氯酸，以玻璃棒攪拌，提取10-20分鐘。傳統(tǒng)方法為確保ATP及其關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的提取得率，至少重復(fù)抽提2次以上，即通過離心分離，將上清液轉(zhuǎn)移到其他容器中，所得沉淀繼續(xù)添加高氯酸勻漿后再離心，棄去沉淀，合并上清液。研究發(fā)現(xiàn)，一次提取所得上清液中ATP及其關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的得率最高，重復(fù)抽提液中亦能測定到很低含量的產(chǎn)物。考慮傳統(tǒng)方法中經(jīng)離心分離操作，這些少量可測定產(chǎn)物很可能是附著在離心管壁上的殘留物。另外，提取時(shí)間從5分鐘到30分鐘，所得結(jié)果大致相同。本發(fā)明結(jié)合后續(xù)步驟，省略多次離心轉(zhuǎn)移容器的操作，采用I次高氯酸提取10-20分鐘，無需離心，保留沉淀，直接進(jìn)入后續(xù)的中和操作。2、往容器中添加濃度為IM的K0H，調(diào)節(jié)pH值至2-3. 5。傳統(tǒng)方法在離心上清液中盡快添加KOH進(jìn)行中和反應(yīng)，以防止沉淀中的魚肉蛋白質(zhì)變性，在中和后復(fù)溶，影響核苷酸及其關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的測定。但是，因?yàn)樘砑拥腒OH為強(qiáng)堿，中和終點(diǎn)附近PH變化較快，很難迅速達(dá)到中和終點(diǎn)，且pH計(jì)或pH試紙必不可少，pH的測定與調(diào)節(jié)需要耗時(shí)耗力。研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)PH至2-3. 5之間，經(jīng)高氯酸溶解的核苷酸及其關(guān)聯(lián)產(chǎn)物在此酸堿度范圍內(nèi)測定值較穩(wěn)定，但PH4-6范圍內(nèi)，測定值不夠穩(wěn)定，有受變性蛋白影響的可能。故本發(fā)明用KOH中和不是到中性的pH7.0，而是調(diào)整反應(yīng)體系至pH3.0附近。另外，采用I次性添加高氯酸提取后保留沉淀，不離心處理，直接在提取體系中添加K0H。因?yàn)樘砑拥母呗人崃渴且阎?，可通過酸堿反應(yīng)方程式計(jì)算相應(yīng)添加的堿量，一次性添加堿液后，迅速達(dá)到預(yù)期PH值，無需依賴pH儀器或試紙，也省略了測定調(diào)節(jié)的操作，省時(shí)省力，特別有利于戶外采樣。采集樣本較多時(shí)，尤其具有優(yōu)勢。3、加蒸餾水或去離子水定容至20mL，通過0. 45微米的微濾膜過濾除去可能含有的雜質(zhì)。在濾液中添加0. 2-lmL的濃度為0. 1M、pH為7. 5的磷酸緩沖液，即得到K值分析用的預(yù)處理樣品。一般認(rèn)為ATP在酸性條件下不能長期穩(wěn)定存在，而高效液相色譜法測定時(shí)耗時(shí)3-4個(gè)小時(shí)，樣品較多時(shí)預(yù)處理樣品需較長時(shí)間保存。研究發(fā)現(xiàn)，在ATP溶液中添加1-5%的高氯酸，室溫下放置13小時(shí)后，5%的高氯酸可使60%的ATP分解；1%的高氯酸可使20%的ATP分解。不同pH范圍，ATP變性程度亦不相同。pHl. 0條件下，室溫放置13小時(shí)，15%左右的ATP分解，pH3. 0-pH7. 0范圍內(nèi)只有不到2%左右的ATP發(fā)生分解。通過高效液相色譜進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)PH1. 0條件下保藏13小時(shí)后，15%的ATP分解成ADP，但未繼續(xù)分解成AMP或MP。但是，在pH3. 0和pH7. 0的條件下，同樣保藏，則未檢測到顯著的ATP分解。K值的測定目前通用的方法為高效液相分離。使用的分離體系一般為酸性磷酸緩沖液。研究發(fā)現(xiàn)，將樣品體系PH調(diào)節(jié)至3. 0后，在濾液中添加pH7. 5磷酸緩沖液可有效使抽提出的ATP及其關(guān)聯(lián)產(chǎn)物混合體系達(dá)到pH7. 0，用于預(yù)處理樣品的長期保存，有助于戶外采樣和樣品的批量處理。另外，在樣品預(yù)處理時(shí)經(jīng)磷酸緩沖液處理，可有效防止預(yù)處理樣品中混有的蛋白質(zhì)上柱后在酸性條件下沉淀，堵塞高效液相分離柱。綜上可見，本發(fā)明在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上省去勻漿，離心，調(diào)節(jié)pH，建立了一個(gè)簡單可行的方法。下面根據(jù)實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，本發(fā)明的目的和效果將變得更加明顯。實(shí)施例1 :
取0. 8g魚肉，加入冷卻的5%高氯酸10mL，冰浴條件下混合物在50mL離心管中用玻璃棒擠壓攪拌15分鐘進(jìn)行提取。在提取液中加入IM K0H，使pH為2. O。加蒸餾水清洗玻璃棒，至20mL。靜置30分鐘，取上清液通過0. 45 ii m微濾膜過濾，取濾液0. 8mL,加0. 2mL0.1M磷酸緩沖液(pH 7. 5)，·得到ImL HPLC樣品。實(shí)驗(yàn)證明，本實(shí)例中通過以上預(yù)處理所得樣品經(jīng)高效液相分離，圖譜清晰，重復(fù)性較高。實(shí)施例2:
取1. Og魚肉，加入冷卻的2. 5%高氯酸10mL，冰浴條件下混合物在50mL離心管中用玻璃棒擠壓攪拌20分鐘進(jìn)行提取。在提取液中加入IM KOH,使pH為3. O。加去離子水清洗玻璃棒，至20mL。靜置30分鐘，取上清液通過0. 45 ii m微濾膜過濾，取濾液4mL，加ImL 0.1M磷酸緩沖液(pH 7.5)，得到5!!^ HPLC樣品。實(shí)驗(yàn)證明，本實(shí)例中通過以上預(yù)處理所得樣品經(jīng)高效液相分離，圖譜清晰，重復(fù)性較高。實(shí)施例3
取1. 2g魚肉，加入冷卻的10%高氯酸10mL，冰浴條件下混合物在50mL離心管中用玻璃棒擠壓攪拌10分鐘進(jìn)行提取。在提取液中加入IM K0H，使pH為3. 5。加蒸餾水清洗玻璃棒，至20mL。靜置35分鐘，取上清液通過0. 45 y m微濾膜過濾，取濾液4mL，加ImL 0.1M磷酸緩沖液(pH 7.5)，得到5!!^ HPLC樣品。實(shí)驗(yàn)證明，本實(shí)例中通過以上預(yù)處理所得樣品經(jīng)高效液相分離，圖譜清晰，重復(fù)性較高。上述實(shí)施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進(jìn)行限制，在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)，對本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種魚類鮮度K值測定樣品前處理方法，其特征在于，包括以下步驟(1)取O.8-1. 2g左右魚肉樣品，放入容器中，添加質(zhì)量濃度為2. 5-10%的高氯酸的水溶液，魚肉樣品與高氯酸的水溶液的質(zhì)量體積比為O.1 (g/mL)，在冰水浴條件下攪拌約10-20 分鐘；(2)往容器中添加濃度為IM的Κ0Η，調(diào)節(jié)pH值至2-3.5 ；(3)加蒸餾水或去離子水定容至20mL，通過O.45微米的微濾膜過濾除去可能含有的雜質(zhì)；在濾液中添加O. 2-lmL的濃度為O. 1Μ、ρΗ為7. 5的磷酸緩沖液，即得到K值分析用的預(yù)處理樣品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種魚類鮮度K值測定樣品前處理方法，該方法取0.8-1.2g魚肉樣品，放入容器中，添加質(zhì)量濃度為2.5-10%的高氯酸的水溶液，魚肉樣品與高氯酸的水溶液的質(zhì)量體積比為0.1，在冰水浴條件下攪拌10-20分鐘；然后往容器中添加濃度為1M的KOH，調(diào)節(jié)pH值至2-3.5；最后加蒸餾水或去離子水定容至20mL，通過0.45微米的微濾膜過濾除去可能含有的雜質(zhì)。在濾液中添加0.2-1mL的濃度為0.1M、pH為7.5的磷酸緩沖液，即得到K值分析用的預(yù)處理樣品；本發(fā)明的方法簡單易行，省時(shí)省力，降低對儀器的依賴，提高了處理效率，確保測定精度。
文檔編號G01N30/06GK103033581SQ20131000339
公開日2013年4月10日 申請日期2013年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月6日
發(fā)明者胡亞芹, 劉東紅, 陳士國, 葉興乾, 陳健初, 張佳琪, 丁甜, 吳丹 申請人:浙江大學(xué)