微流體裝置和使用其測定流體樣品的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了多方向微流體裝置及使用其的方法。本
【發(fā)明內(nèi)容】
的方面包括微流體裝置，其包括具有分離介質(zhì)、第一結(jié)合介質(zhì)和第二結(jié)合介質(zhì)的室。另外，所述裝置包括流場元件，其被配置成使所述室經(jīng)過兩種以上方向不同的流場。還提供使用所述裝置的方法、以及包括所述裝置的系統(tǒng)和試劑盒。所述裝置、系統(tǒng)和方法可用于各種各樣的應用，包括診斷、研究和驗證測定。
【專利說明】微流體裝置和使用其測定流體樣品的方法
[0001]引言
[0002]各種各樣的分析技術(shù)可以用來檢測給定樣品中的特定分析物。例如，Western印跡可以用來檢測樣品中的蛋白質(zhì)，其中通過凝膠電泳分離樣品中的蛋白質(zhì)，接著用對于靶蛋白質(zhì)特異性的抗體進行探測。Southern印跡結(jié)合電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移至過濾膜和隨后的通過探針雜交的片段檢測。Northern印跡涉及使用電泳通過尺寸分離RNA樣品，和用于部分或整個靶序列互補的雜交探針檢測。Eastern印跡可以用來檢測蛋白質(zhì)翻譯后修飾(PTM)，其中通過使用對于脂質(zhì)、糖、磷酸化或任何其他蛋白質(zhì)修飾是特異性的探針分析電泳分離的蛋白質(zhì)的翻譯后修飾。Far-Western印跡類似于Western印跡,但使用非抗體蛋白質(zhì)結(jié)合關(guān)注的蛋白質(zhì)，并因此可以用來檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用。Southwestern印跡是可以用來檢測DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的技術(shù)，其中通過使用凝膠電泳分離樣品中的蛋白質(zhì)，接著用染色體組DNA片段進行探測。
[0003]如上所述，常規(guī)的印跡技術(shù)，可能達不到要求高通過量樣品分析或在資源貧乏環(huán)境中操作的應用的性能需要。印跡技術(shù)可能要求勞動密集型、耗時、由受訓技術(shù)人員進行的多步驟程序，并因此可能對于臨床環(huán)境使用是不實用的。
[0004]概述
[0005]提供了多方向微流體裝置和使用其的方法。本公開內(nèi)容的方面包括微流體裝置，其包括具有分離介質(zhì)、第一結(jié)合介質(zhì)和第二結(jié)合介質(zhì)的室。另外，所述裝置包括流場元件(flow field element)，其被配置成使所述室經(jīng)過兩種以上方向不同的流場。還提供了使用所述裝置的方法、以及包括該裝置的系統(tǒng)和試劑盒。所述裝置、系統(tǒng)和方法可用于各種各樣的不同應用，包括診斷、研究和驗證測定。
[0006]附圖簡述
[0007]圖1示出了根據(jù)本公開內(nèi)容的實施方式的配置用于多種非變性蛋白質(zhì)印跡的微流體裝置的示意圖。圖1 (a)示出了具有編號為1-8的儲液槽的微通道和微室網(wǎng)絡設計的示意圖。圖1(a)插圖示出了室的亮場圖像，其顯示光圖樣化凝膠區(qū):大孔尺寸加載凝膠，PAGE分離區(qū)，Abl和Ab2指示離散的印跡區(qū)。圖1(b)顯示根據(jù)本公開內(nèi)容的實施方式的多分析物印跡方案的示意圖。步驟I =PAGE分離沿著分離軸(由“i”指示的電流)拆分蛋白質(zhì)。步驟2:拆分的蛋白質(zhì)側(cè)向電泳轉(zhuǎn)移至和通過引進區(qū)。步驟3:在每個印跡區(qū)中的結(jié)合至固定化抗體的蛋白質(zhì)被保留，而所有其他物質(zhì)移出所述室。
[0008]圖2示出了根據(jù)本公開內(nèi)容的實施方式的具有離散的印跡區(qū)的微流體裝置的示意圖，所述印跡區(qū)能夠使獨特靶標從單個樣品(a)分離、(b)轉(zhuǎn)移和(C)多種印跡。陰性對照(TI)顯示與印跡區(qū)或界面沒有相互作用。在注射/分離期間的E=95V/cm，分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至印跡區(qū)期間的E=50V/cm。(經(jīng)由熒光顯微鏡的圖像收集)
[0009]圖3示出了根據(jù)本公開內(nèi)容的實施方式的與印跡區(qū)中的結(jié)合的模型化相關(guān)的圖，其告知選擇操作條件以最大化結(jié)合效率。圖3(a)示出了作為側(cè)場強度的函數(shù)的帶分布的圖(實驗結(jié)果對刺激)。圖3(b)示出了對于給定的芯片幾何形狀(印跡區(qū)寬度和結(jié)合位點強度)，作為Da的函數(shù)變化的靶標捕獲效率的圖。[0010]圖4示出了顯示根據(jù)本公開內(nèi)容的實施方式使得共遷移物質(zhì)的選擇性蛋白質(zhì)印跡的蛋白質(zhì)免疫印跡的圖像。兩種顏色圖樣合成物顯示具有兩種共遷移物質(zhì)(這里的紅色標記的蛋白質(zhì)G(PG)和綠色標記的BSA)的非變性PAGE (27s)。綠色標記的TI充當快速移動陰性對照。最快的紅色峰不含染料。側(cè)向轉(zhuǎn)移移動所有物質(zhì)至單個印跡區(qū)(34s和43s)，容納對于蛋白質(zhì)G的固定抗體。紅色標記的蛋白質(zhì)G被選擇性地結(jié)合而BSA和TI移出室外(67s)。
[0011]圖5示出了根據(jù)本公開內(nèi)容的實施方式的允許檢測未標記樣品(SNR?38)的夾心測定。圖5(a)示出了用于拆分和檢測未標記樣品的芯片上技術(shù)的示意圖。圖5(b)和圖5(c)示出了 AF488綠色標記的固定化蛋白質(zhì)靶標在綠色熒光激發(fā)下是可見的；其初始在紅色波長下是不可見的直至其用德克薩斯紅(Texas Red) (TR)標記的一次抗體溫育。
[0012]圖6示出了根據(jù)本公開內(nèi)容的實施方式，能夠制造具有可變物理和功能性質(zhì)的多個PA凝膠區(qū)的多步驟光刻法的示意圖。該制造方法形成用于完全自動化的、低樣品損失、多分析物非變性Western印跡的裝置。
[0013]圖7示出了根據(jù)本公開內(nèi)容的實施方式在所述裝置內(nèi)的相應印跡區(qū)處取得的轉(zhuǎn)移后熒光顯微圖像。大熒光標記的非靶標分子由于孔徑排斥或非特異性結(jié)合相互作用而不被保持在印跡凝膠界面處。陽性對照揭示作為在相應印跡區(qū)的綠色熒光分布(參見蛋白質(zhì)G V.抗蛋白質(zhì)G凝膠和CRP V.抗-CRP凝膠)。陰性對照包括高分子量物質(zhì)如α -輔肌動蛋白和IgG(分別為100和150kDa)。
[0014]圖8顯示根據(jù)本公開內(nèi)容的實施方式，提出的模型刺激在一系列有限間隔內(nèi)的兩組不同元件之間的Langmuir結(jié)合反應。遷移速率決定保留時間步(At),其中每個祀標帶元件是與匹配凝膠元件共區(qū)域化的或“溫育的”。
[0015]詳述
[0016]提供了多方向微流體裝置和使用其的方法。本公開內(nèi)容的方面包括微流體裝置，其包括具有分離介質(zhì)、第一結(jié)合介質(zhì)和第二結(jié)合介質(zhì)的室。另外，所述裝置包括流場元件，其被配置成使所述室經(jīng)過兩種以上方向不同的流場。還提供了使用該裝置的方法、以及包括該裝置的系統(tǒng)和試劑盒。所述裝置、系統(tǒng)和方法可用于各種各樣的不同應用，包括診斷、研究和驗證測定。
[0017]以下，首先更詳細地描述主題微流體裝置。還公開了檢測流體樣品中的分析物的方法，其中主題微流體裝置發(fā)現(xiàn)用途。另外，還描述了包括主題微流體裝置的系統(tǒng)和試劑盒。
[0018]微流體裝置
[0019]本公開內(nèi)容的實施方式包括多方向微流體裝置?！岸喾较颉笔侵付嘤谝粋€方向，如兩個以上方向、三個以上方向、四個以上方向等。在某些實施方式中，在單個平面中包括兩個以上方向，以使兩個以上方向共面。在一些情況下，所述兩個以上方向不是共面的，使得兩個方向被包含在不同的、相交平面中。在這些情況下，所述兩個以上方向可以的多維度的。“多維度的”是指多于一個維度，如二維、三維等。多維度的方向可以占據(jù)三維空間的區(qū)域。例如，不是共面的兩個方向可以各自被包含在不同的、相交平面中，以使包含該兩個方向的相交平面占據(jù)三維空間的區(qū)域。
[0020]在某些實施方式中，所述微流體裝置被配置成在多于一個方向(例如，微流體裝置是多方向的)，如兩個以上方向，三個以上方向，四個以上方向等引導流體。例如，所述微流體裝置可以被配置成在兩個方向、三個方向、四個方向等引導流體。在一些情況下，所述微流體裝置是多維度的。例如，所述微流體裝置可以被配置成在兩個以上方向引導流體，其中所述兩個以上方向不是共面的，使得所述兩個以上方向被包含在兩個以上不同的、相交平面中。在這些情況下，包含兩個以上方向的相交平面可以占據(jù)三維空間的區(qū)域。例如，微流體裝置可以包含在基板中，使得所述微流體裝置是平面的。微流體裝置可以被配置成在該平面內(nèi)的多個方向上引導流體。在某些實施方式中，微流體裝置被配置成在多個維度如三個維度上引導流體。例如，微流體裝置可以被配置成在同一平面內(nèi)的多個方向上引導流體，以及在非共平面內(nèi)引導流體，以使所述微流體裝置被配置成是三維微流體裝置。
[0021]在某些實施方式中，微流體裝置包含分離介質(zhì)。所述分離介質(zhì)可以被配置成漿樣品中的分析物彼此分離開。在一些情況下，所述分離介質(zhì)被配置成基于分析物的物理性質(zhì)分離樣品中的分析物。例如，所述分離介質(zhì)可以被配置成基于分析物的分子量、尺寸、電荷(例如，荷質(zhì)比)、等電點等分離樣品中的分析物。在某些情況下，所述分離介質(zhì)被配置成基于分析物的分子量分離樣品中的分析物。在一些情況下，所述分離介質(zhì)被配置成基于分析物的等電點(例如，等電點聚焦)分離樣品中的分析物。分離介質(zhì)可以被配置成將樣品中的分析物分成分析物的不同可檢測帶?！皫А笔侵覆煌目蓹z測區(qū)，其中分析物的濃度顯著高于周圍區(qū)域。分析物的各個帶可以包括單個分析物或多個分析物，其中在分析物的單個帶中的每個分析物具有基本上類似的物理性質(zhì)，如上所述。
[0022]在某些實施方式中，分離介質(zhì)被配置成當樣品穿過該分離介質(zhì)時分離樣品中的分析物。在一些情況下，分離介質(zhì)被配置成當樣品流過該分離介質(zhì)時分離樣品中的分析物。分離介質(zhì)的方面包括所述分離介質(zhì)具有有取向軸的流路?！傲髀贰笔侵噶黧w樣品在其移動時行進的方向。在一些情況下，流路是樣品在其穿過介質(zhì)如分離介質(zhì)、結(jié)合介質(zhì)等時樣品行進的方向。如上所述，分離介質(zhì)可以具有有取向軸的流路。在一些實施方式中，分離流路的取向軸與分離介質(zhì)的長度成一直線。在這些實施方式中，樣品在分離介質(zhì)的分離流路的方向上穿過分離介質(zhì)(例如，樣品可以在分離介質(zhì)的長度穿過分離介質(zhì))。在一些情況下，分離介質(zhì)的長度大于分離介質(zhì)的寬度，如2倍，3倍，4倍，5倍，10倍，20倍，50倍，100倍等分離介質(zhì)的寬度。在一些情況下，分離介質(zhì)的分離流路由通道如微流體通道限定。分離介質(zhì)可以包含在微流體通道中，以使樣品在樣品流過該微流體通道時穿過該分離介質(zhì)。
[0023]在某些實施方式中，分離介質(zhì)包括聚合物，如聚合物凝膠。聚合物凝膠可以是適用于凝膠電泳的凝膠。聚合物凝膠可以包括但不限于聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂凝膠等。分離介質(zhì)的分辨率可以取決于各種因素，如但不限于孔徑、總聚合物含量(例如，總丙烯酰胺含量)、交聯(lián)劑的濃度、施加的電場、測定時間等。例如，分離介質(zhì)的分辨率可以取決于分離介質(zhì)的孔徑。在一些情況下，孔徑取決于分離介質(zhì)的總聚合物含量和/或分離介質(zhì)中交聯(lián)劑的濃度。在某些情況下，分離介質(zhì)被配置成利用分子量差異為10，OOODa以下，如7，OOODa以下，包括5，OOODa以下，或2，OOODa以下，或1，OOODa以下，例如500Da以下，或IOODa以下來拆分分析物。在一些情況下，分離介質(zhì)可以包括總丙烯酰胺含量范圍為1%至20%，如3%至15%，包括5%至10%的聚丙烯酰胺凝膠。
[0024]在一些情況下，微流體裝置包括位于分離介質(zhì)上游的濃縮介質(zhì)。“上游”是指最接近流體流來源定位。濃縮介質(zhì)可以被配置成在樣品接觸分離介質(zhì)之前濃縮該樣品。濃縮介質(zhì)可以包括聚合物凝膠，如具有小孔徑的聚合物凝膠.例如，濃縮介質(zhì)可以包括這樣的聚丙烯酰胺凝膠，其總丙烯酰胺含量的范圍為5%至10%，如5%至9%，包括5%至8%，或5%至7%。在一些情況下，濃縮介質(zhì)的總聚丙烯酰胺含量為6%。在某些實施方式中，濃縮介質(zhì)包括膜，如尺寸排阻膜。濃縮介質(zhì)的小孔徑可以減慢樣品電泳移動通過該濃縮介質(zhì)，有機在其接觸分離介質(zhì)之前濃縮所述樣品。在一些情況下，濃縮膜被配置成將樣品的濃度增大2倍以上，4倍以上，10倍以上，25倍以上，50倍以上，100倍以上，500倍以上，1000倍以上，2500倍以上等。
[0025]在某些實施方式中，主題微流體裝置包括位于分離介質(zhì)下游的結(jié)合介質(zhì)?！跋掠巍笔侵冈诹黧w流來源的遠側(cè)定位。例如，流體流可以首先接觸并流過分離介質(zhì)，接著是結(jié)合介質(zhì)。結(jié)合介質(zhì)可以具有有取向軸的標記流路。在一些情況下，標記流路是當樣品或分析物穿過結(jié)合介質(zhì)時樣品行進的方向。樣品或分析物可以在結(jié)合介質(zhì)的標記流路的方向上穿過結(jié)合介質(zhì)(例如，樣品可以沿著結(jié)合介質(zhì)的取向軸穿過分離介質(zhì))。結(jié)合介質(zhì)可以具有與分離介質(zhì)的取向軸相同或不同的取向軸。例如，分離介質(zhì)可以具有第一取向軸并且結(jié)合介質(zhì)可以具有第二取向軸。第一取向軸可以在與第二取向軸相同的方向成直線(對準，align)。在一些情況下，第一取向軸在與第二取向軸不同的方向上成直線。在其中第一取向軸在與第二取向軸不同的方向上成直線的情況下，微流體裝置是多維度的(例如，多方向的)微流體裝置，如上所述。例如，相對于第一取向軸，第二取向軸的角度可以為180度以下，如150度以下，135度以下，相對于第一取向軸的120度以下，90度以下，60度以下，45度以下，或30度以下。在某些實施方式中，第二取向軸與第一取向軸是正交的。
[0026]在某些情況下，結(jié)合介質(zhì)包括聚合物，如聚合物凝膠或聚合物巨石(polymericmonolith)。巨石是指單個的、連續(xù)結(jié)構(gòu)。巨石可以包括具有相同物理和化學組成的單個區(qū)域，或者可以包括兩個以上在其物理和化學組成方面不同的區(qū)域。聚合物凝膠可以是適用于凝膠電泳的凝膠。聚合物凝膠可以包括但不限于聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂凝膠等。在一些情況下，結(jié)合介質(zhì)可以包括這樣的聚丙烯酰胺凝膠，其總丙烯酰胺含量的范圍為1%至20%，如3%至15%，包括5%至10%。聚合物巨石可以是適用于色譜法的巨石。聚合物巨石可以包括但不限于丙烯酸酯聚合物、烷基丙烯酸酯聚合物、烷基丙烯酸酯烷基酯聚合物、其共聚物等。在一些情況下，結(jié)合介質(zhì)包括膜。所述膜可以包括硝基纖維素膜、聚合物膜等。在一些情況下，結(jié)合介質(zhì)包括珠子(bead)。所述珠子可以包括硝基纖維素珠子、聚合物珠子、其組
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[0027]在某些實施方式中，結(jié)合介質(zhì)可以被配置成結(jié)合至并保留關(guān)注的分析物。在一些情況下，結(jié)合至結(jié)合介質(zhì)的分析物有利于分析物的檢測。例如，結(jié)合介質(zhì)可以包括與支撐物穩(wěn)定聯(lián)合的結(jié)合成員?！胺€(wěn)定聯(lián)合”是指一個部分在標準條件下結(jié)合至另一部分或結(jié)構(gòu)或其他方式聯(lián)合。在某些情況下，支撐物是聚合物凝膠或膜，如上所述。鍵可以包括共價鍵和非共價相互作用，如但不限于離子鍵、疏水相互作用、氫鍵、范德華力(例如，London分散力)，偶極相互作用等。在某些實施方式中，結(jié)合成員可以共價結(jié)合至支撐物，如交聯(lián)或共聚合至支撐物。結(jié)合成員和支撐物之間的共價鍵包括牽涉反應性基團的共價鍵，如但不限于以下:戊二醛，其利用二官能連接物戊二醛與結(jié)合成員和支撐物的氨基/酰胺基形成共價鍵；甲基丙烯酸縮水甘油酯，其利用縮水甘油基官能團(即，環(huán)氧官能團)共價鍵接至結(jié)合成員并且利用甲基丙烯酸酯基團結(jié)合至支撐物；甲基丙烯酸4-硝基苯酯，其可以用來?；Y(jié)合成員的胺基以共價結(jié)合至支撐物；丙烯酸N-羥基琥拍酰亞胺酯(NHS-acrylate),其利用N-羥基琥珀酰亞胺基與結(jié)合成員上的氨基相互作用以并入到支撐物中。
[0028]結(jié)合成員可以是任何分子，其特異地結(jié)合至關(guān)注的靶分析物，例如，被靶向的蛋白質(zhì)或核酸序列或生物大分子(例如，關(guān)注的分析物)。在一些實施方式中，當它們在結(jié)合復合物中彼此特異地結(jié)合時，結(jié)合成員和其特異地結(jié)合的靶分析物之間的親和性的特征在于Kd(離解常數(shù))為1-5M以下，1-6M以下，如1-7M以下，包括10-8Μ以下，例如，10-9Μ以下，ΙΟ,Μ 以下，10-ηΜ 以下，10-12Μ 以下，10-13Μ 以下，10-14Μ 以下，10-15Μ 以下，包括 10-16Μ以下。"親和性"是指結(jié)合強度，增大的結(jié)合親和性與較低的Kd相聯(lián)合。
[0029]取決于分析物的性質(zhì)，結(jié)合成員可以是但不限于(a)與用于核酸檢測的靶DNA或RNA序列的獨特區(qū)域互補的DNA的單鏈；(b)針對用于檢測蛋白質(zhì)和肽的肽分析物的表位的抗體；(c)任何識別分子，如特異性結(jié)合對的成員。例如，合適的特異性結(jié)合對包括但不限于:受體/配體對的成員；受體的配體-結(jié)合部分；抗體/抗原對的成員；抗體的抗原結(jié)合片段；半抗原；凝集素/糖對的成員；酶/底物對的成員；生物素/抗生物素蛋白；生物素/抗生蛋白鏈菌素；地高辛/抗地高辛藥；DNA或RNA適體結(jié)合對的成員；肽適體結(jié)合對的成員等。
[0030]在某些實施方式中，結(jié)合成員包括抗體。結(jié)合成員抗體可以特異地結(jié)合至關(guān)注的分析物。在一些情況下，結(jié)合成員穩(wěn)定地與支撐物聯(lián)合，如上所述。支撐物-結(jié)合的結(jié)合成員可以被配置成特異地結(jié)合至關(guān)注的分析物。同樣，關(guān)注的分析物與支撐物-結(jié)合的結(jié)合成員的特異結(jié)合可以間接地將關(guān)注的分析物結(jié)合至所述支撐物。關(guān)注的分析物與支撐物的結(jié)合可以將分析物與支撐物穩(wěn)定地聯(lián)合并由此游離在于關(guān)注的分析物的檢測。
[0031]在某些實施方式中，兩個以上的不同結(jié) 合成員穩(wěn)定地與結(jié)合介質(zhì)聯(lián)合。所述兩個以上的不同結(jié)合成員可以特異地結(jié)合至相同或不同的分析物。在一些情況下，所述兩個以上的不同結(jié)合成員可以特異地結(jié)合至同一分析物。例如，所述兩個以上的不同結(jié)合成員可以包括對同一分析物上的不同表位特異的不同抗體。在其他情況下，所述兩個以上的不同結(jié)合成員可以特異地結(jié)合至不同分析物。例如，所述兩個以上的結(jié)合成員可以包括對于不同分析物上的表位特異的不同抗體。
[0032]在某些實施方式中，微流體裝置包括一種或多種結(jié)合介質(zhì)，如兩種以上結(jié)合介質(zhì)。例如，微流體裝置可以包括第一結(jié)合介質(zhì)和第二結(jié)合介質(zhì)。每種結(jié)合介質(zhì)可以相同組成，或在其他實施方式中可以具有不同組成。例如，第一結(jié)合介質(zhì)可以具有與第一結(jié)合介質(zhì)穩(wěn)定地聯(lián)合的第一結(jié)合成員，并且第二結(jié)合介質(zhì)可以具有與第二結(jié)合介質(zhì)穩(wěn)定地聯(lián)合的第二結(jié)合成員。在一些情況下，第一和第二結(jié)合成員可以特異地結(jié)合至不同分析物。在其他情況下，第一和第二結(jié)合成員可以特異地結(jié)合至同一分析物的不同表位。在實施方式中，在第一和第二結(jié)合成員特異地結(jié)合至不同分析物的情況下，微流體裝置可以被配置成檢測樣品中的兩種以上分析物的存在，其中第一分析物特異地被第一結(jié)合介質(zhì)的第一結(jié)合成員結(jié)合并且第二分析物特異地被第二結(jié)合介質(zhì)的第二結(jié)合成員結(jié)合。微流體裝置可以包括兩種以上的結(jié)合介質(zhì)，每一種配置成特異地結(jié)合樣品中的不同分析物，使得微流體裝置被配置成檢測樣品中的多個不同分析物。例如，微流體裝置可以包括2種以上，或3種以上，或4種以上，或5種以上，或6種以上，或7種以上，或8種以上，或9種以上，或10種以上的結(jié)合介質(zhì)。[0033]在某些實施方式中，微流體裝置被配置成在接觸第二結(jié)合介質(zhì)之前接觸第一結(jié)合介質(zhì)。例如，第一結(jié)合介質(zhì)可以位于分離介質(zhì)和第二結(jié)合介質(zhì)之間。另外的結(jié)合介質(zhì)可以串聯(lián)地提供在第二結(jié)合介質(zhì)之后。在某些情況下，結(jié)合介質(zhì)具有相同的取向軸，使得樣品沿著該相同取向軸從第一結(jié)合介質(zhì)流至第二結(jié)合介質(zhì)。如上所述，結(jié)合介質(zhì)的取向軸可以與分離介質(zhì)的取向軸成一個角度，如與分離介質(zhì)的取向軸正交。
[0034]微流體裝置的方面包括其中分離介質(zhì)與結(jié)合介質(zhì)流體聯(lián)通的實施方式。在某些實施方式中，結(jié)合介質(zhì)布置在分離介質(zhì)的下游。微流體裝置可以被配置成首先引導樣品通過分離介質(zhì)以產(chǎn)生分離的樣品。在某些實施方式中，微流體裝置被配置成使得分離介質(zhì)和結(jié)合介質(zhì)彼此直接流體聯(lián)通。例如，分離介質(zhì)可以與結(jié)合介質(zhì)直接接觸。在一些情況下，分離介質(zhì)和結(jié)合介質(zhì)彼此結(jié)合，如共聚合。其中分離介質(zhì)與結(jié)合介質(zhì)直接流體聯(lián)通的實施方式可以在多個部分最小損失下有利于各部分從分離介質(zhì)轉(zhuǎn)移至結(jié)合介質(zhì)或各部分從結(jié)合介質(zhì)轉(zhuǎn)移至分離介質(zhì)。在一些情況下，微流體裝置被配置成使得各部分定量地從一種介質(zhì)轉(zhuǎn)移至另一種介質(zhì)(例如，從分離介質(zhì)至結(jié)合介質(zhì)，或從結(jié)合介質(zhì)至分離介質(zhì))。
[0035]在某些實施方式中，微流體裝置被配置成引導分離的樣品通過結(jié)合介質(zhì)。在一些情況下，微流體裝置被配置成使得樣品或分析物從分離介質(zhì)移動至介入(intervening)通道或接枝，然后移動至結(jié)合介質(zhì)。在其他情況下，微流體裝置被配置成使得分離介質(zhì)和結(jié)合介質(zhì)彼此直接流體聯(lián)通，以使樣品或分析物可以直接從分離介質(zhì)移動至結(jié)合介質(zhì)。如上所述，結(jié)合介質(zhì)可以包括配置成結(jié)合至分析物的結(jié)合成員以檢測分離樣品中的關(guān)注的分析物。
[0036]在一些情況下，微流體裝置被配置成使樣品經(jīng)過兩種以上方向不同的流場?！傲鲌觥笔侵钙渲懈鞑糠忠曰旧贤环较蛲ㄟ^區(qū)域的區(qū)域。例如，流場可以包括其中流動部分以基本上同一方向移動通過介質(zhì)的區(qū)域。流場可以包括介質(zhì)，如分離介質(zhì)、結(jié)合介質(zhì)、加載介質(zhì)等，其中各部分如緩沖劑液、分析物、試劑等已基本上同一方向移動通過所述介質(zhì)。流場可以通過施加電場、壓力差、電滲透等誘導。在一些實施方式中，兩種以上流場可以在方向上不同。例如，第一流場可以與分離介質(zhì)的分離流路的取向軸成直線。第一流場可以被配置成沿著分離流路引導樣品或分析物通過分離介質(zhì)。第二流場可以與結(jié)合介質(zhì)的標記流路的取向軸成直線。在一些情況下，第二流場被配置成沿著標記流路引導樣品或分析物通過結(jié)合介質(zhì)。第二流場可以被配置成引導樣品或分析物通過結(jié)合介質(zhì)以使關(guān)注的分析物接觸器特異性結(jié)合成員。在一些情況下，第二流場被配置成沿著標記流路引導結(jié)合成員通過結(jié)合介質(zhì)。第二流場可以被配置成引導結(jié)合成員通過結(jié)合介質(zhì)以使結(jié)合成員接觸器特異性的關(guān)注的分析物。如上所述，在某些情況下，標記流路的取向軸與分離流路的取向軸正交。在這些情況下，第二流場可以與第一流場正交。
[0037]在某些實施方式中，微流體裝置被配置成使樣品經(jīng)過兩種以上方向不同的電場。電場可以有利于樣品移動通過微流體裝置(例如，樣品從微流體裝置的一個區(qū)域電動移動至微流體裝置的另一個區(qū)域)。電場也可以有利于樣品中的分析物通過電泳的分離(例如，聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE))，如上所述。例如，電場可以被配置成引導樣品中的分析物通過微流體裝置的分離介質(zhì)。電場可以被配置成基于分析物的物理性質(zhì)有利于樣品中的分析物的分離。例如，電場可以被配置成基于分析物的分子量、尺寸、電荷(例如，荷質(zhì)比)、等電點等有利于樣品中的分析物的分離。在某些情況下，電場被配置成基于分析物的分子量有利于樣品中的分析物的分離。在一些情況下，電場被配置成基于分析物的等電點有利于羊皮紙的分析物的分離。
[0038]在一些實施方式中，兩種以上的電場可以在方向上不同。例如,第一電場可以與分離介質(zhì)的分離流路的取向軸成直線。第一電場可以被配置成沿著分離流路引導樣品或分析物通過分離介質(zhì)。第二電場可以與結(jié)合介質(zhì)的標記流路的取向軸成直線。在一些情況下，第二電場被配置成沿著標記流路引導樣品或分析物通過結(jié)合介質(zhì)(例如，兩種以上結(jié)合介質(zhì)，如第一結(jié)合介質(zhì)和第二結(jié)合介質(zhì))。第二電場可以被配置成引導樣品或分析物通過第一結(jié)合介質(zhì)和第二結(jié)合介質(zhì)以使關(guān)注的分析物接觸其在第一和/或第二結(jié)合介質(zhì)中的特異性結(jié)合成員。
[0039]在一些情況下，第二電場被配置成沿著標記流路引導結(jié)合成員通過結(jié)合介質(zhì)。第二電場可以被配置成引導結(jié)合成員通過結(jié)合介質(zhì)以使結(jié)合成員接觸器關(guān)注的特異性分析物。如上所述，在某些情況下，標記流路的取向軸與分離流路的取向軸正交。在這些情況下，第二電場可以與第一電場正交。在一些情況下，兩種以上結(jié)合成員可以沿著標記流路被引導通過結(jié)合介質(zhì)(例如，第一結(jié)合介質(zhì)和第二結(jié)合介質(zhì))，以使結(jié)合成員(例如，第一結(jié)合成員和第二結(jié)合成員)接觸器各種關(guān)注的分析物。
[0040]在某些實施方式中，微流體裝置包括一個或多個被配置以產(chǎn)生電場的電場發(fā)生器。電場發(fā)生器可以被配置成將電場施加至微流體裝置的不同區(qū)域，如分離介質(zhì)、結(jié)合介質(zhì)、加載介質(zhì)等中的一種或多種。電場發(fā)生器可以被配置成電動地將樣品中的分析物和各部分傳輸通過微流體裝置中的各種介質(zhì)。在某些情況下，電場發(fā)生器可以在微流體裝置的近端，如布置在微流體裝置裝置上。在一些情況下，電場發(fā)生器位于距離微流體裝置一定距離。例如，電場發(fā)生器可以并入到用于檢測分析物的系統(tǒng)中，如以下更詳細描述的。
[0041]微流體裝置可以包括一個或多個通道，其包含分離介質(zhì)以及第一和第二結(jié)合介質(zhì)，如上所述。微流體裝置可以包括結(jié)合通道，其包含結(jié)合介質(zhì)，如上所述。在一些情況下，分離通道與結(jié)合通道流體聯(lián)通，使得分離通道中的分離介質(zhì)與結(jié)合通道中的結(jié)合介質(zhì)流體聯(lián)通。微流體裝置的一些實施方式包括分離通道和結(jié)合通道，其中分離通道具有第一取向軸并且結(jié)合通道具有第二取向軸。第一取向軸和第二取向軸可以彼此在相同方向成直線或者彼此在不同方向成直線。例如，分離通道的取向軸相對于結(jié)合通道的角度為180度以下，如150度以下，135度以下，包括相對于結(jié)合通道的120度以下，90度以下，60度以下，45度以下，或30度以下。在某些實施方式中，結(jié)合通道的取向軸與分離通道的取向軸正交。
[0042]微流體通道的實施方式可以由于微流體裝置相容且與微流體裝置中使用的樣品、緩沖液、試劑等相容的任何合適材料制成。在一些情況下，微流體通道由相對于主題微流體裝置和方法中使用的樣品、緩沖液、試劑等是惰性(例如，不會降解或反應)的材料制成。例如，微流體通道可以由這樣的材料制成，如但不限于玻璃、石英、聚合物、彈性體、紙、其組合
坐寸ο
[0043]在某些實施方式中，微流體通道的寬度范圍為I μ m至500 μ m，如5μπι至300μπι，包括10 μ m至200 μ m，例如50 μ m至150 μ m。在一些情況下，微流體通道的寬度為100 μ m。在某些實施方式中，微流體通道的深度范圍為Iym至200μπι，如從5μπι至10ym,包括10 μ m至50 μ m。在一些情況下,微流體通道的深度為25 μ m。
[0044]在一些情況下，微流體裝置包括一個或多個樣品入口。樣品入口可以被配置成允許樣品引入到微流體裝置中。樣品入口可以與分離介質(zhì)流體聯(lián)通。在一些情況下，樣品入口與分離介質(zhì)的上游端流體聯(lián)通。樣品入口可以進一步包括配置成防止流體從樣品入口出來的結(jié)構(gòu)。例如，樣品入口可以包括帽、閥門、密封件等，其可以例如被刺破或打開以允許樣品引入到微流體裝置中，然后再密封或封閉以基本上防止流體包括樣品和/或緩沖液從樣品入口出來。
[0045]在一些方面，分離和結(jié)合介質(zhì)提供在單個共用室中。在這些實施方式中，微流體裝置包括室。所述室可以包括分離介質(zhì)和結(jié)合介質(zhì)。如上所述，分離介質(zhì)可以與結(jié)合介質(zhì)流體聯(lián)通，如直接物理接觸。在一些情況下，分離介質(zhì)結(jié)合至結(jié)合介質(zhì)，如共聚合或交聯(lián)至結(jié)合介質(zhì)。同樣，所述室可以被配置成含有彼此流體聯(lián)通的分離介質(zhì)和結(jié)合介質(zhì)二者。所述室可以被配置成含有分離介質(zhì)和結(jié)合介質(zhì)以使分離介質(zhì)的分離流路是從結(jié)合介質(zhì)的標記流路的上游。
[0046]除了分離介質(zhì)和結(jié)合介質(zhì)，所述室還可以包括加載介質(zhì)。加載介質(zhì)可以與分離介質(zhì)流體聯(lián)通。在一些情況下，加載介質(zhì)與分離介質(zhì)直接接觸。例如，加載介質(zhì)可以結(jié)合至分離介質(zhì)，如與分離介質(zhì)交聯(lián)或共聚合。加載介質(zhì)可以位于分離介質(zhì)的上游，以使樣品在接觸分離介質(zhì)之前接觸加載介質(zhì)。在某些實施方式中，加載介質(zhì)有利于樣品與分離介質(zhì)接觸。例如，加載介質(zhì)可以被配置成在樣品接觸分離介質(zhì)之前濃縮樣品。在某些實施方式中，加載介質(zhì)可以包括具有不同物理和/或化學性質(zhì)的兩個以上區(qū)域。例如，加載介質(zhì)可以包括加載區(qū)域和堆積區(qū)域。加載介質(zhì)可以被配置成包括在堆積區(qū)域上游的加載區(qū)域。
[0047]在某些實施方式中，加載介質(zhì)包括聚合物，如聚合物凝膠。聚合物凝膠可以是適用于凝膠電泳的凝膠。聚合物凝膠可以包括但不限于聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂凝膠等。在一些情況下，加載區(qū)域包括具有大孔徑的聚合物凝膠。例如，加載區(qū)域可以包括聚丙烯酰胺凝膠，其具有的總丙烯酰胺含量為5%以下，如4%以下，包括3%以下，或2%以下。在一些情況下，加載區(qū)域具有的總聚丙烯酰胺含量為3%。在一些情況下，加載介質(zhì)的堆積區(qū)域可以被配置成在樣品接觸分離介質(zhì)之前濃縮樣品。堆積區(qū)域可以包括具有小孔徑的聚合物凝膠(例如，堆積區(qū)域可以具有小于加載區(qū)域的孔徑的孔徑)。例如，堆積區(qū)域可以包括聚丙烯酰胺凝膠，其具有的總丙烯酰胺含量范圍為5%至10%，如5%至9%，包括5%至8%，或5%至7%。例如，堆積區(qū)域可以具有比加載區(qū)域更大的總聚丙烯酰胺含量。在一些情況下，堆積區(qū)域具有的總聚丙烯酰胺含量為6%。堆積區(qū)域的小孔徑可以減慢樣品電泳移動通過堆積區(qū)域，由此在樣品接觸分離介質(zhì)之前濃縮樣品。
[0048]在某些情況下，所述室含有加載介質(zhì)、分離介質(zhì)和結(jié)合介質(zhì)。所述室可以被配置成含有加載介質(zhì)、分離介質(zhì)和結(jié)合介質(zhì)以使加載介質(zhì)、分離介質(zhì)和結(jié)合介質(zhì)彼此流體聯(lián)通，如上所述。例如，所述室可以包括具有各種區(qū)域的連續(xù)聚合物凝膠。連續(xù)聚合物凝膠的各個區(qū)域可以可以具有不同物理和/或化學性質(zhì)。連續(xù)聚合物凝膠可以包括具有加載介質(zhì)的第一區(qū)域、具有分離介質(zhì)的第二區(qū)域和具有結(jié)合介質(zhì)第三區(qū)域。聚合物凝膠的各個區(qū)域的流路可以被配置成使得樣品首先接觸加載介質(zhì)，然后接觸分離介質(zhì)，并且最后接觸結(jié)合介質(zhì)。
[0049]在某些實施方式中，聚合物凝膠具有的寬度范圍為0.1mm至5mm，如0.2mm至
2.5mm,包括0.5mm至1.5mm。在一些情況下,聚合物凝膠具有的寬度為1.0mm。在一些情況下，聚合物凝膠具有的長度范圍為0.5mm至5mm,如0.5mm至3mm,包括Imm至2mm。在某些情況下，聚合物凝膠具有的長度為1.5mm。在某些實施方式中，包括加載介質(zhì)的聚合物凝膠的第一區(qū)域具有的寬度范圍為0.1mm至5mm,如0.2mm至2.5mm,包括0.5mm至1.5mm。在一些情況下，包括加載介質(zhì)的聚合物凝膠的第一區(qū)域具有的寬度為0.9mm。在一些情況下，包括加載介質(zhì)的聚合物凝膠的第一區(qū)域具有的長度范圍為0.1mm至2mm,如0.1mm至Imm,包括0.1mm至0.5mm.在某些實施方式中，包括加載介質(zhì)的聚合物凝膠的第一區(qū)域具有的長度為0.2mm。在某些情況下，包括分離介質(zhì)的聚合物凝膠的第二區(qū)域具有的寬度范圍為0.1mm至5mm,如0.2mm至2.5mm,包括0.5mm至1.5mm。在一些情況下，包括分離介質(zhì)的聚合物凝膠的第二區(qū)域具有的寬度為0.9mm。在一些情況下，包括分離介質(zhì)的聚合物凝膠的第二區(qū)域具有的長度范圍為0.5mm至5mm,如0.5mm至3mm,包括Imm至2mm。在某些實施方式中，包括分離介質(zhì)的聚合物凝膠的第二區(qū)域具有的長度為1.3mm。在某些情況下，包括結(jié)合介質(zhì)的聚合物凝膠的第三區(qū)域具有的寬度范圍為0.0lmm至2mm,如0.0lmm至lmm,包括0.05mm至0.5mm。在一些情況下,包括結(jié)合介質(zhì)的聚合物凝膠的第三區(qū)域具有的寬度為0.1mm0在一些情況下,包括結(jié)合介質(zhì)的聚合物凝膠的第三區(qū)域具有的長度范圍為0.5mm至5mm,如0.5mm至3mm,包括Imm至2mm。在某些實施方式中，包括結(jié)合介質(zhì)的聚合物凝膠的第三區(qū)域具有的長度為1.5mm。
[0050] 在某些實施方式中，微流體裝置具有的寬度范圍為IOcm至lmm,如5cm至5mm,包括Icm至5mm。在一些情況下,微流體裝置具有的長度范圍為IOOcm至lmm,如from50cm至lmm,包括IOcm至5mm,或Icm至5mm。在某些方面,微流體裝置具有的面積為IOOOcm2以下，如IOOcm2以下，包括50cm2以下，例如，IOcm2以下，或5cm2以下，或3cm2以下，或Icm2以下，或0.5cm2以下，或0.25cm2以下，或0.1cm2以下。
[0051 ] 在某些實施方式中，微流體裝置基本上透明?！巴该鳌笔侵肝镔|(zhì)允許可見光通過該物質(zhì)。在一些實施方式中，透明微流體裝置有利于檢測結(jié)合至結(jié)合介質(zhì)的分析物，例如包括可檢測標記如熒光標記的分析物。在一些情況下，微流體裝置基本上不透明?！安煌该鳌笔侵肝镔|(zhì)不允許可見光通過該物質(zhì)。在某些情況下，不透明微流體裝置可以有利于對光敏感的分析物，如在光存在下反應或降解的分析物的分析。
[0052]方法
[0053]方法的實施方式涉及確定分析物釋放在樣品中存在，例如，確定樣品中是否存在一種或多種分析物。在方法的某些實施方式中，樣品中的一種或多種分析物的存在可以定性或定量地確定。定性確定包括其關(guān)于樣品中分析物存在的是/否結(jié)果提供給使用者的確定。定量確定包括其中關(guān)于樣品中的分析物的量的粗略范圍結(jié)果例如低、中、高提供給使用者并且其中分析物的濃度的數(shù)量測量的精細范圍結(jié)果提供給使用者的半定量確定。
[0054]在某些實施方式中，微流體裝置被配置成檢測樣品中一種或多種分析物的存在?？梢杂弥黝}微流體裝置進行測定的樣品可以變化，并且包括簡單和復雜樣品。簡單樣品是包括關(guān)注的分析物的樣品，并且可以包括或可以不包括不是關(guān)注的一種或多種分子實體，其中這些非關(guān)注分子實體的數(shù)量可以低，例如，10以下，5以下等。簡單樣品可以包括已以某種方式處理，例如，以從樣品除去潛在干擾分子實體的初始生物樣品或其他樣品?！皬碗s樣品”是指可以具有或可以不具有關(guān)注的分析物而且包括不是關(guān)注的許多不同蛋白質(zhì)和其他分子的樣品。在一些情況下，在主題方法中測定的復制樣品是這樣的樣品，其包括10個以上，如20個以上，包括100個以上，例如，IO3個以上，IO4個以上(如15，000; 20, 000或25，000以上)不同(即，不同的)分子實體，其彼此在分子結(jié)構(gòu)或物理性質(zhì)(例如，分子量、大小、電荷、等電點等)不同。
[0055]在某些實施方式中，關(guān)注的樣品是生物樣品(又稱樣本)，如，但不限于尿液、血液、血清、血漿、唾液、精液、前列腺液、乳頭抽出液、淚液、糞便、面頰擦洗液、腦脊髓液、細胞溶解產(chǎn)物樣品、羊膜液、胃腸液、生物活檢組織(例如，獲自激光捕獲顯微解剖(LCM))等的樣品。樣品可以是生物樣品或使用用于成功提取DNA、RNA、蛋白質(zhì)和肽的常規(guī)方法可以提取自來源于人、動物、植物、真菌、酵母菌、細菌、組織培養(yǎng)物、病毒培養(yǎng)物及其組合的生物樣品。在某些實施方式中，樣品是流體樣品，如在流體中的分析物的溶液。流體可以是含水流體，如，但不限于水、緩沖液等。
[0056]如上所述，可以在主題方法中測定的樣品可以包括一種或多種關(guān)注的分析物?？蓹z測分析物的實例包括但不限于:核酸，例如，雙鏈或單鏈DNA、雙鏈或單鏈RNA、DNA-RNA雜交體、DNA適體、RNA適體等；蛋白質(zhì)和肽，有或沒有修飾，例如抗體、雙體、Fab片段、DNA或RNA結(jié)合蛋白、磷酸化蛋白質(zhì)(磷酸化蛋白質(zhì)組學)、肽適體、表位等；小分子如抑制劑、激活齊U、配體等；寡糖或多糖；其混合物等。
[0057]在一些實施方式中，關(guān)注的分析物可以被鑒定使得然后關(guān)注的分析物的存在可以被檢測。例如，所述方法可以包括評價結(jié)合介質(zhì)(例如，第一和第二結(jié)合介質(zhì))的兩種以上分析物的存在。分析物可以通過本文中描述的任何方法鑒定。例如，可以采用標記試劑，如包括可檢測標記的分析物特異的結(jié)合成員。可檢測標記包括但不限于熒光標記、比色標記、化學發(fā)光標記、酶聯(lián)試劑、多色試劑、抗生物素蛋白-抗生蛋白鏈菌素聯(lián)合檢測試劑、非可見的可檢測標記(例如，放射標記、金粒子、磁性標記、電讀出、密度信號等)等。在某些實施方式中，可檢測標記是熒光標記。熒光標記是通過熒光檢測器可檢測的標記部分。例如，熒光標記與關(guān)注的分析物的結(jié)合可以允許關(guān)注的分析物通過熒光檢測器檢測。熒光標記的實例包括但不限于在接觸試劑時發(fā)熒光的熒光分子、當用電磁輻射(例如，UV，可見光，X-射線等)照射時發(fā)熒光的熒光分子等。
[0058]合適的熒光分子(熒光團)包括但不限于熒光素、異硫氰酸熒光素、羧基熒光素的琥珀酰酯、熒光素的琥珀酰酯、熒光素二氯三唑的5-異構(gòu)體、籠狀羧基熒光素-丙氨酸-羧酸胺、Oregon Green488、Oregon Green514 ;突光黃(Lucifer Yellow)、卩丫唳澄、羅丹明、四甲基羅丹明、德克薩斯紅(Texas Red)、碘化丙啶、JC_1(5，5，，6，6，-四氯_1，I，，3，3，-四乙基苯并咪唑基碘化羰化青)、四溴若羅丹明123、羅丹明6G、TMRM(四甲基羅丹明甲酯)、TMRE (四甲基羅丹明乙酯)、四甲基玫瑰胺(tetramethy Irosamine)、羅丹明B和4- 二甲基氨基四甲基玫瑰胺、綠色熒光蛋白、藍移的綠色熒光蛋白、藍綠移的綠色熒光蛋白、紅移的綠色熒光蛋白、黃移的綠色熒光蛋白、4-乙酰胺基-4’ -異氰酸芪-2，2’ 二硫酸；吖啶和衍生物，如吖啶、異硫氰酸吖啶;5-(2’ -氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS) ;4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘-酰亞胺-3，5 二硫酸酯；N-(4-苯胺基-1-萘基)馬來酰亞胺；蒽酰亞胺；4，4- 二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼雜_3a, 4a 二氮雜_5_引達省_3_丙酸BODIPY ;級聯(lián)藍(cascade blue);燦爛黃(Brilliant Yellow);香豆素和衍生物:香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC, Coumarinl20)、7_氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151);酞菁染料；焰紅染料(cyanosine) ;4’，6_ 二脒基_2_苯基吲哚(DAPI) ; 5’，5”-二溴鄰苯三酚-磺酞(溴鄰苯三酚紅)；7- 二乙基氨基-3- (4’ -異硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素；五乙酸二亞甲基三胺乙酯；4，4’ - 二異硫氰酸二氫-芪-2-，2’ - 二磺酸；4，4’ - 二異硫氰酸芪-2，2’- 二磺酸；5-( 二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹酰氯)；4_ 二甲基氨基苯基偶氮苯基-4’-異硫氰酸酯(DABITC);曙紅和衍生物:曙紅，異氰酸曙紅，赤蘚紅和衍生物:赤蘚紅B，赤蘚紅異硫氰酸酯；胡米胺；熒光素和衍生物:5_羧基熒光素(FAM)、5-(4，6-二氯三嗪-2-基)氨基一熒光素(DTAF)，2’，7’ 二甲氧基-4’ 5’ - 二氯-6-羧基熒光素(JOE)、熒光素、異硫氰酸熒光素、QFITC、(XRITC);熒光胺；IR144; IR1446;孔雀綠異硫氰酸酯(Malachite Green isothiocyanate) ；4~甲基傘形酮-ferone鄰甲酌.酜酞；硝基酪氨酸；副玫瑰苯胺(pararosaniline);苯酹紅；B_藻紅蛋白；鄰酹二醒;花和衍生物:芘，丁酸芘，琥珀酰1-芘；丁酸量子點；反應紅4(Cibacron? Brilliant Red3B_A)羅丹明和衍生物:6-羧基-X-羅丹明(ROX)，6-羧基羅丹明(R6G)，麗絲胺羅丹明B磺酰氯羅丹明(Rhod)，羅丹明B，羅丹明123，羅丹明X異硫氰酸酯，磺基羅丹明B，磺基羅丹明101，羅丹明101的磺酰氯衍生物(德克薩斯紅)；N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA);四甲基羅丹明；四甲基羅丹明異氰酸酯(TRITC);核黃素；5-(2’ -氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)，4- (4’ - 二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)，玫紅酸；CAL Fluor 0range560;鋱螯合物衍生物；Cy3;Cy5;Cy5.5;Cy7;IRD700;IRD800;La Jolla Blue;酞菁;和萘酞菁，香豆素和相關(guān)染料，咕噸染料如對甲氨基酚，試鹵靈，單溴(bimanes)，吖啶類，異吲哚類，丹磺酰染料，氨基鄰苯二甲酰肼如魯米諾，和異魯米諾衍生物，氨基酞酰亞胺，氨基萘酰亞胺，氨基苯并呋喃，氨基喹啉，二氰基氫醌，熒光銪和鋱配合物；其組合等。合適的熒光蛋白和發(fā)色蛋白包括但不限于綠色熒光蛋白(GFP)，包括但不限于來源于多管水母(Aequoria victoria)的GFP活期衍生物,例如人源化”衍生物如增強的GFP ;來自另一物種的GFP,如海洋腔腸(Renilla reniformis)、瑞尼拉穆勒里(Renillamulleri),或波利羅薩克斯戈恩依(Ptilosarcus guernyi); “人源化”重組GFP (hrGFP);來自珊瑚蟲物種的各種各樣的熒光和有色蛋白的任一種；其組合等。
[0059]在某些實施方式中，所述方法包括包括將流體樣品引入到微流體裝置中。將流體樣品引入到微流體裝置中可以包括引導樣品通過分離介質(zhì)以產(chǎn)生分離的樣品。在一些情況下，分離的樣品在樣品如上所述經(jīng)過分離介質(zhì)時通過凝膠電泳產(chǎn)生。分離的樣品可以包括分析物的不同可檢測帶，其中每個帶包括一種或多種基本上具有類似性質(zhì)的分析物，如分子量，大小，電荷(例如，荷質(zhì)比)，等電點等，這取決于進行凝膠電泳的類型。
[0060]所述方法的方面也可以包括將分離的樣品轉(zhuǎn)移到結(jié)合介質(zhì)(例如，第一結(jié)合介質(zhì)和第二結(jié)合介質(zhì))。在某些實施方式中，所述方法包括引導分離的樣品通過結(jié)合介質(zhì)(例如，第一和第二結(jié)合介質(zhì))。在其他實施方式中，分離的樣品中的分析物的具體帶可以被選擇性地轉(zhuǎn)移至結(jié)合介質(zhì)。在一些情況下，所述方法包括使關(guān)注的分析物或多種分析物與結(jié)合介質(zhì)中的結(jié)合成員接觸。結(jié)合成員可以特異地結(jié)合至分析物，由此將分析物保持在結(jié)合介質(zhì)中。不是關(guān)注的部分不會被結(jié)合介質(zhì)中的結(jié)合成員特異地結(jié)合。例如，微流體裝置可以包括如上所述的第一結(jié)合介質(zhì)和第二結(jié)合介質(zhì)。在這些實施方式中，所述方法可以包括使關(guān)注的第一分析物與第一結(jié)合介質(zhì)中的第一結(jié)合成員接觸和使關(guān)注的第二分析物與第二結(jié)合介質(zhì)中的第二結(jié)合成員接觸。
[0061]在某些實施方式中，所述方法包括評價結(jié)合介質(zhì)(例如，第一和第二結(jié)合介質(zhì))的關(guān)注的分析物或多種分析物的存在(例如，關(guān)注的兩種以上分析物)。例如，在一些情況下，所述方法包括引導結(jié)合至結(jié)合介質(zhì)的分析物。關(guān)注的分析物與結(jié)合介質(zhì)中的結(jié)合成員的可介質(zhì)可以包括與結(jié)合介質(zhì)穩(wěn)定地聯(lián)合的一卜析物被結(jié)合成員特異地結(jié)合至結(jié)合介質(zhì)。
I包括使標記劑流過結(jié)合介質(zhì)。標記劑可以上所述。標記劑可以特異地結(jié)合至并由此毛兩種以上的標記劑，例如第一標記劑和第以特異地結(jié)合至關(guān)注的第一分析物和關(guān)注每種以上分析物的存在。
合至不是關(guān)注的部分所致的假陽性信號被的非特異結(jié)合可以被最小化并且不是關(guān)注I結(jié)合至結(jié)合成員下穿過結(jié)合介質(zhì)。因此，
丨合成員僅特異結(jié)合至關(guān)注的分析物可以有
[樣品引導通過分離介質(zhì)之前濃縮、稀釋或與分離介質(zhì)接觸之前使樣品與濃縮介質(zhì)接？凝膠、膜(例如，尺寸排阻膜〉、其組合等。利于分離的樣品中的分析物的帶之間的分作用。在一些情況下，釋放劑是破壞分析物和結(jié)合成員之間的結(jié)合相互作用的試劑、緩沖等，引起結(jié)合成員釋放分析物。在從結(jié)合成員釋放分析物之后，所述方法可以包括將分析物轉(zhuǎn)移離開結(jié)合介質(zhì)。例如，所述方法可以包括從結(jié)合介質(zhì)的下游引導釋放的分析物用于利用二次分析裝置進行二次分析，如但不限于UV分光計、和IR分光計、質(zhì)譜儀、HPLC、親和性測定裝置等。
[0068]在一些實施方式中，所述方法包括樣品中的分析物的單工分析?！皢喂し治觥笔侵笜悠繁环治鲆褭z測樣品中的一種分析物的存在。例如，樣品可以包括關(guān)注的分析物和不適關(guān)注的其他分子實體的混合物。在一些情況下，所述方法包括樣品的單工分析已確定樣品混合物中關(guān)注的分析物的存在。
[0069]某些實施方式包括樣品中的兩種以上分析物的多任務分析?！岸嗳蝿辗治?multiplex analysis) ”是指確定存在兩種以上不同的分析物,其中該兩種以上分析物彼此不同。例如，分析物可以包括它們的分子量、大小、電荷(例如，質(zhì)荷比)等電點等的可檢測差異。在一些情況下，分析物的數(shù)量大于2，如4以上，6以上，8以上等，多至20以上，例如，50以上，包括100以上不同的分析物。在某些實施方式中，所述方法包括2至100種不同分析物，如4至50不同分析物，包括4至20種不同分析物的多任務分析。
[0070]在某些實施方式中，所述方法是自動化方法。同樣，所述方法可以包括在將樣品引入到微流體裝置中后最少的與微流體裝置和系統(tǒng)的使用者相互作用。例如，引導樣品通過分離介質(zhì)以產(chǎn)生分離的樣品和將分離的樣品轉(zhuǎn)移至結(jié)合介質(zhì)的步驟可以通過微流體裝置和系統(tǒng)進行，使得使用者不需要手動進行這些步驟。在一些情況下，所述自動化方法可以有利于減少總測定時間。例如，所述方法的實施方式包括樣品中的分析物的分離和檢測，可以在30min以下，如20min以下，包括15min以下，或1min以下，或5min以下，或2min以下，或Imin以下內(nèi)進行。
[0071]系統(tǒng)
[0072]某些實施方式的方面包括用于檢測樣品中的分析物的系統(tǒng)。在一些情況下，所述系統(tǒng)包括如本文中所述的微流體裝置。所述系統(tǒng)還可以包括檢測器。在一些情況下，檢測器是配置成檢測可檢測標記的檢測器。如上所述，可檢測標記可以是熒光標記。例如，熒光標記可以接觸電磁輻射(例如，可見光，UV，X-射線等)，其激發(fā)熒光標記并且引起熒光標記發(fā)射可檢測電磁輻射(例如，可見光等)。發(fā)射的電磁輻射可以利用適當檢測器檢測以確定結(jié)合至結(jié)合成員的分析物的存在。
[0073]在一些情況下，檢測器可以被配置成檢測來自如上所述的熒光標記的發(fā)射。在某些情況下，檢測器包括光電倍增管(PMT)、電荷耦合器件(CCD)、增強型電荷耦合器件(ICCD)、互補金屬氧化物半導體(CMOS)傳感器、視覺色度讀出器、光電二極管等。
[0074]本發(fā)明的系統(tǒng)可以包括所需的各種其他部件。例如，所述系統(tǒng)可以包括流體處理部件，如微流體流體處理部件。流體處理部件可以被配置成引導一種或多種流體通過微流體裝置。在一些情況下，流體處理部件被配置成引導流體，如，但不限于樣品溶液、緩沖液(例如，釋放緩沖液，洗滌緩沖液、電泳緩沖液等)等。在某些實施方式中，微流體流體處理部件被配置成將流體遞送至微流體裝置的分離介質(zhì)，使得流體接觸分離介質(zhì)。流體處理部件可以包括微流體泵。在一些情況下，微流體泵被配置用于壓力驅(qū)動微流體處理并且給定流體通過本文中公開的微流體裝置和系統(tǒng)的路線。在某些情況下，微流體流體處理部件被1 0
壓成形部件。在一些情況下，電壓成形部件.場強度橫過分離介質(zhì)和/或結(jié)合介質(zhì)基本品中的分析物的分辨率。例如，電壓成形部丨勺減少。另外，電壓成形部件可以有利于當%0
片(例如，生物傳感芯片“生物芯片”或充，該微流體系統(tǒng)在基底表面上顯示兩種以系統(tǒng)包括具有微流體裝置陣列的基底表面。-址區(qū)域的任何二維或基本上二維(以及三蘭位置(例如“地址”)的多個裝置時是“可、空間分開。任何給定的基底可以帶有設置電于用途，任何或所有陣列可以彼此相同或陣列可以含有一個或多個，包括兩個以:100個以上的微流體裝置。在某些實施方I'的面積小于10(302以下，小于50！112，例如，5nM以下，或InM以下，如500pM以下，包括10pM以下，或50pM以下，例如，或1pM以下，或IpM以下，或500fM以下，或250fM以下，如10fM以下，包括50fM以下，或25fM以下，或1fM以下。在一些情況下，系統(tǒng)被配置成能夠檢測濃度為I μ g/mL以下，如500ng/mL以下，包括100ng/mL以下，例如，10mg/mL以下，或5ng/mL以下，如Ing/mL以下，或0.1ng/mL以下，或0.01ng/mL以下，包括lpg/mL以下的分析物。在某些實施方式中，系統(tǒng)具有的動態(tài)范圍為KT18M至10M，如KT15M至1-3M,包括10-12Μ至10-6Μ。
[0081]在某些實施方式中，微流體裝置在以下溫度范圍運行，1°C至100°C，如5°C至750C，包括10°C至50°C，或20°C至40°C。在一些情況下，微流體裝置在溫度范圍為35°C至40°C運行。
[0082]應用
[0083]主題裝置、系統(tǒng)和方法可用于各種各樣的不同應用，其中樣品中一種或多種分析物的存在與否的確定和/或定量是所需的。在某些實施方式中，所述方法涉及檢測樣品中的核酸、蛋白質(zhì)或其他生物分子。所述方法可以包括檢測樣品中的一組生物標記，例如，兩種以上不同蛋白生物標記。例如，所述方法可以用于生物樣品中的兩種以上疾病生物標記物的快速、臨床檢測，例如如可以用于受試者的疾病病癥的診斷，用于受試者的疾病病癥的正在進行的管理或治療等。另外，主題裝置、系統(tǒng)和方法可以用于用于檢測樣品中的分析物的檢測的方案，如但不限于Western印跡，SOUTHERN印跡，NORTHERN印? , Eastern, Far-ffestern , Southwestern ￡口?等。
[0084]在某些實施方式中，主題裝置、系統(tǒng)和方法可用于檢測生物標記物。在一些情況下，主題裝置、系統(tǒng)和方法可以用來檢測是否存在特定的生物標記物，以及特定生物標記物在血液、血漿、血清或其他體液或分泌物，如但不限于尿液、血液、血清、血漿、唾液、精液、前列腺液、乳頭抽出液、淚液、糞便、面頰擦洗液、腦脊髓液、細胞溶解產(chǎn)物樣品、羊膜液、胃腸液、生物活檢組織(例如，獲自激光捕獲顯微解剖(LCM))等中的濃度的增加或降低。
[0085]是否存在生物標記物或生物標記物的濃度的顯著變化可以用來診斷疾病風險，個體中疾病的存在，或調(diào)整個體疾病的治療。例如，特定生物標記物或生物標記物組的存在可以影響向個體提供的藥物治療或施用方案的選擇。在評價潛在的藥物療法中，生物標記物可以用作非變性終點如存活或不可逆發(fā)病的替代。如果一種治療改變生物標記物，其具有改善健康的直接關(guān)聯(lián)，則該生物標記物可以用作用于評價特定治療或施用方案的臨床益處的替代終點。因此，基于在個體中檢測的特定標記物或標記物組的個性化診斷和治療由主題裝置、系統(tǒng)和方法促進。此外，與疾病相關(guān)的生物標記物的早期檢測由如上所述的主題裝置和系統(tǒng)的高靈敏度促進。由于在單個芯片上檢測多個生物標記物的能力，連同靈敏度、可規(guī)模化和易于使用，本發(fā)明公開的微流體裝置、系統(tǒng)和方法可用于便攜式和醫(yī)療點或接近患者的分子診斷。
[0086]在某些實施方式中，主題裝置、系統(tǒng)和方法可用于檢測疾病或疾病狀態(tài)的生物標記物。在一些情況下，疾病是細胞增殖性疾病，如但不限于癌癥、腫瘤、乳頭狀瘤、肉瘤或癌瘤等。在某些情況下，主題裝置、系統(tǒng)和方法可用于檢測用于表征細胞轉(zhuǎn)導路徑的生物標記物和用于藥物發(fā)現(xiàn)和疫苗開發(fā)的胞內(nèi)通信。例如，主題裝置、系統(tǒng)和方法可用于檢測疾病的存在，如細胞增殖性疾病，如但不限于癌癥、腫瘤、乳頭狀瘤、肉瘤或癌瘤等。在某些情況下，關(guān)注的用于檢測癌癥或細胞增殖性疾病指示的特定生物標記物包括但不限于以下:前列腺。(11868868 或(1186886 8七已1:68
蘭疾病或疾病狀態(tài)包括但不限于細菌感染、:例如，缺失或插入)等。例如，主題裝置、系6菌性腦膜炎、食物中毒、霍亂、大腸桿菌感寒、小兒麻痹、細菌性痢疾、傷寒、弧菌性敗法可以用來檢測呼吸道感染，如但不限于，溝鼠疫、白喉、流感、麻疹、腦膜炎球菌性腦I，哮咳)、肺炎、肺炎型鼠疫、呼吸道合胞體？吸器官綜合征、肺結(jié)核等。另外，主口但不限于，克雅氏病(06111:2^61(11:-381^013II。印1121101)211:117)(即，瘋牛病)，帕金森病—11161'’ 8 (11865186)、狂犬病等。另外，主題裝，如但不限于，八103，軟下疳，衣原體，尖銳木病，性病淋巴肉芽腫，非淋菌性尿道炎，:測病毒性肝炎病，如但不限于，甲型肝炎，另外，主題裝置、系統(tǒng)和 方法可以用來檢測I，包括關(guān)注的分析物的分離、轉(zhuǎn)移、標記和:下，沒有單獨的用于關(guān)注的分析物的分離、置可以由無醫(yī)學培訓的人員在家庭環(huán)境用:681:1118)，以檢測樣品中的一種或多種分析在床側(cè)，用于快速診斷，或用于其中由于成I的環(huán)境。
蘆述的微流體裝置的試劑盒。所述試劑盒進沖液，如電泳緩沖液、樣品緩沖液等。試劑放齊0、變性劑、重折疊劑、去污劑、可檢測標；色試劑，酶聯(lián)試劑，抗生物素蛋白-抗生蛋標記等)等。
步包括用于實施主題方法的說明書。這些一種或多種可以存在于試劑盒中。其中這塞底上的印刷信息，例如，在試劑盒包裝中、氏等。另一種方式是計算機可讀介質(zhì)，例如實施例
[0095]1.概述
[0096]進行實驗以證實以快速、自動化且統(tǒng)一的微流體形式的多任務非變性Western印跡。測定和微裝置設計利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳集成針對多個抗體結(jié)合區(qū)域的蛋白結(jié)合(例如，印跡)。這種微流體集成策略克服了對于常規(guī)再印跡技術(shù)典型地需要的抗體脫離步驟所固有的非特異性材料損失，其可限制分析物定量。為了通知多任務微流體裝置的合理設計，開發(fā)了分析模型用于在結(jié)合區(qū)域上的分析物捕獲。相比于經(jīng)驗，報告了觀察結(jié)果，經(jīng)驗85%以上的捕獲效率。無標記檢測室的同時和定量的多任務測量在不需要樣品的預先標記下成為可能。測定線性動力學范圍的范圍為8nM至800nM,測定在5min內(nèi)完成。
[0097]I1.實驗
[0098]A.芯片上多分析物免疫印跡。多任務免疫印跡測定封裝在單個ImmXl.5mm微室和微流體通道網(wǎng)絡(圖1 (a))。為了制造多任務裝置，微室用聚丙烯酰胺(PA)凝膠圖案化，具有用于PAGE (加載和分離凝膠)的特定區(qū)域和與PAGE分離軸平行的離散抗體圖案化PA凝膠結(jié)合區(qū)域。為了將蛋白質(zhì)加載到中央室中，~2 μ L體積首先移液到樣品儲罐(圖1 (a)，儲罐2)。橫跨儲罐2和4保持的電勢導致在交叉通道交叉點處形成的~0.5nL大小的蛋白塞。如圖1(b)所示，蛋白質(zhì)然后在所述室的非變性PAGE區(qū)域中注射和分離。分離區(qū)域由疊加界面(大至小孔徑不連續(xù)性，3%T-至-6%T，w/v)和分離凝膠^%T)構(gòu)成。隨著電泳進行，蛋白質(zhì)由于荷質(zhì)比差異而溶解(圖1(b)，步驟I)。在電極I和5處的電壓控制最小化樣品擴散并且保持高分辨率分析物分離(參見電壓程序，表1)。
[0099]表1.用于高電壓電源的芯片上免疫印跡電壓控制程序
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測流體樣品中的兩種以上分析物的微流體裝置，其中所述微流體裝置包括: 室，其包含: 分離介質(zhì)； 第一結(jié)合介質(zhì)；和 第二結(jié)合介質(zhì)；以及 流場元件，其被配置成使所述室經(jīng)過兩種以上方向不同的流場。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中所述兩種以上方向不同的流場包括兩種以上方向不同的電場。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微流體裝置，其中所述兩種以上方向不同的電場是正交電場。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中所述分離介質(zhì)包括聚合物凝膠。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中所述室還包括與所述分離介質(zhì)接觸的堆疊介質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所 述的微流體裝置，其中所述第一結(jié)合介質(zhì)位于所述分離介質(zhì)和所述第二結(jié)合介質(zhì)之間。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中所述第一和第二結(jié)合介質(zhì)各自包括與聚合物凝膠穩(wěn)定聯(lián)合的結(jié)合成員。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的微流體裝置，其中所述結(jié)合成員包含蛋白質(zhì)或其結(jié)合片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的微流體裝置，其中所述蛋白質(zhì)是抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中所述兩種以上分析物未被標記。
11.一種測定流體樣品的兩種以上分析物的方法，所述方法包括: (a)將所述流體樣品引入到微流體裝置中，所述微流體裝置包括: (i)室，其包含: 分離介質(zhì)； 第一結(jié)合介質(zhì)；和 第二結(jié)合介質(zhì)；及 (?)流場元件，其被配置成使所述室經(jīng)過兩種以上方向不同的流場； (b)將所述樣品引導通過所述分離介質(zhì)以產(chǎn)生分離的樣品； (c)將所述分離的樣品引導通過所述第一和第二結(jié)合介質(zhì)；以及 (d)對所述第一和第二結(jié)合介質(zhì)評價所述兩種以上分析物的存在。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述兩種以上方向不同的流場包括兩種以上方向不同的電場。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述室還包含堆疊介質(zhì)并且所述方法還包括在將所述樣品引導通過所述分離介質(zhì)之前濃縮所述樣品。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述方法還包括在對所述第一和第二結(jié)合介質(zhì)評價所述兩種以上分析物的存在之前，使第一和第二標記試劑流過所述第一和第二結(jié)合介質(zhì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述方法是診斷方法。
16.一種用于測定流體樣品的兩種以上分析物的存在的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括: (a)微流體裝置，所述微流體裝置包括: (i)室，其包含: 分離介質(zhì)； 第一結(jié)合介質(zhì)；和 第二結(jié)合介質(zhì)；及 (?)流場元件，其配置成使所述室經(jīng)過兩種以上方向不同的流場；以及 (b)檢測器。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的系統(tǒng)，其中所述檢測器是光電倍增管、電荷耦合器件、增強型電荷耦合器件、互補式金屬氧化物半導體傳感器、視覺色度讀出器或光電二極管。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的系統(tǒng)，還包括配置成引導流體通過所述微流體裝置的微流體部件。
19.一種試劑盒,所述試劑盒包括: (a)微流體裝置，所述微流體裝置包括: (i)室，其包含: 分離介質(zhì)； 第一結(jié)合介質(zhì)； 第二結(jié)合介質(zhì)；和 (?)流場元件，其配置成使所述室經(jīng)過兩種以上方向不同的流場；以及 (b)緩沖液。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中所述試劑盒包括第一和第二標記試劑，其分別特異性地結(jié)合第一和第二分析物。
【文檔編號】G01N21/00GK104040358SQ201280048093
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月30日
【發(fā)明者】塞繆爾·蒂亞, 艾米·E·海爾, 何梅, 金東鉉 申請人:加利福尼亞大學董事會