人類血液和血液制品中非典型抗體的鑒定的制作方法
【專利摘要】本文描述了用于鑒定血液或血液制品制造過程中非典型抗體的方法，所述非典型抗體可在對中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物的質(zhì)量控制測試中產(chǎn)生假陽性。
【專利說明】人類血液和血液制品中非典型抗體的鑒定
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本文描述了用于鑒定血液和血液制品(blood product)中非典型抗體的方法。
[0002]背景
[0003]在USP熱原測試中已經(jīng)鑒定出導(dǎo)致致熱反應(yīng)(pyrogenic response)的天然人類抗體。一些人類供體天然地產(chǎn)生這些“非典型抗體”，可能是暴露于兔、嚙齒類動物、或獵食此類宿主動物的寄生昆蟲(即，跳蚤)導(dǎo)致的。非典型抗體是異常和不常見的，但對人類無害。非典型抗體可與兔白血細(xì)胞抗原交叉反應(yīng)并在兔熱原測試中導(dǎo)致致熱反應(yīng)。然而，致熱反應(yīng)是“假陽性”結(jié)果，因為其他方法諸如鱟阿米巴樣細(xì)胞溶解物檢驗(LAL)顯示，在兔檢驗中給出致熱反應(yīng)的可疑血漿樣品并不包含內(nèi)毒素。此外，體外熱原測試(又稱單核細(xì)胞活化測試)的結(jié)果指示不存在非內(nèi)毒素?zé)嵩?。因此，人類血液或血漿中的非典型抗體導(dǎo)致錯誤的兔熱原測試結(jié)果，并可導(dǎo)致丟棄被錯誤地測試為“致熱的(pyrogenic)”陽性的單獨或匯集的血液或血漿。
[0004]本文描述的方法允許鑒定包含在熱原檢驗中導(dǎo)致假陽性的非典型抗體的血液或血漿樣品。這一方法是有利的，因為包含非典型抗體的樣品可在與其他血液或血漿匯集并污染池之前被清除。因此，該方法通過阻止血液或血漿池被由于存在非典型抗體而表現(xiàn)“致熱的”樣品的不必要的污染，減少制造成本。本文描述的高通量測試方法允許鑒定可疑的假陽性樣品。此類樣品可在與其他樣品匯集之前被丟棄并阻止池被非典型抗體污染。
[0005]概述
[0006]本文描述了用于鑒定血液和血液制品中非典型抗體的方法。
[0007]本文描述的一個方面是用于鑒定血液制品制造過程中非典型反應(yīng)性抗體的方法，所述方法包括:(a)獲得血液或血漿的樣品；(b)利用以下的任何一種或多種測試所述樣品和對照:細(xì)胞凝集、熒光顯微術(shù)、免疫沉淀、免疫擴(kuò)散、免疫熒光法、ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、FACS或蛋白質(zhì)印跡法；(c)比較所述樣品和對照的測試結(jié)果；(d)確定所述樣品是否包含反應(yīng)性非典型抗體；和；(e)如果所述樣品包含反應(yīng)性非典型抗體，則阻斷(interdicting)為所述樣品來源的血液或血漿裝置(unit)。
[0008]本文描述的另一方面是用于鑒定血液制品制造過程中非典型反應(yīng)性抗體的方法，所述方法包括:(a)獲得血液或血漿的樣品；(b)利用細(xì)胞凝集檢驗測試所述樣品和對照；(C)比較所述樣品和對照的測試結(jié)果；(d)確定所述樣品是否包含反應(yīng)性非典型抗體；和；
(e)如果所述樣品包含反應(yīng)性非典型抗體，則阻斷為所述樣品來源的血液或血漿裝置。
[0009]本文描述的另一方面是用于鑒定血液制品制造過程中非典型反應(yīng)性抗體的方法，所述方法包括:(a)獲得血液或血漿的樣品；(b)利用流式細(xì)胞術(shù)測試所述樣品和對照；(C)比較所述樣品和對照的測試結(jié)果；(d)確定所述樣品是否包含反應(yīng)性非典型抗體；和；(e)如果所述樣品包含反應(yīng)性非典型抗體，則阻斷為所述樣品來源的血液或血漿裝置。
[0010]本文描述的另一方面是用于鑒定血液或血衆(zhòng)制品(plasma product)制造過程中非典型反應(yīng)性抗體的方法，所述方法包括:(a)獲得血液或血漿的樣品；(b)利用蛋白質(zhì)印跡法測試所述樣品和對照；(C)比較所述樣品和對照的測試結(jié)果；(d)確定所述樣品是否包含反應(yīng)性非典型抗體；和；(e)如果所述樣品包含反應(yīng)性非典型抗體，則阻斷為所述樣品來源的血液或血漿裝置。
[0011]本文描述的另一方面是用于評價血液制品制造過程中可能的假陽性熱原測試結(jié)果的方法，所述方法包括:(a)獲得血液或血液制品的樣品；(b)利用以下測試所述樣品和對照:熒光顯微術(shù)、免疫沉淀、免疫擴(kuò)散、免疫熒光法、ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、FACS或蛋白質(zhì)印跡法；(C)利用鱟阿米巴樣細(xì)胞溶解物(LAL)或類似的檢驗測試所述樣品和對照；(d)比較兩種檢驗中所述樣品和對照的測試結(jié)果；(e)評價所述樣品是否給出假陽性熱原測試結(jié)果；和(f)如果所述樣品包含反應(yīng)性非典型抗體，則阻斷為所述樣品來源的血液或血漿裝置。
[0012]附圖簡述
[0013]圖1:兔WBC凝集檢驗的顯微術(shù)。將供體X和對照血漿與兔WBC —起培養(yǎng)，且然后利用顯微術(shù)觀察。用供體X血漿(A、c)或?qū)φ昭獫{(B、D)培養(yǎng)的兔白血細(xì)胞的光(A、B)和相差(C、D)顯微照片。用供體X血漿觀察到凝集(A、C)，但用血漿對照未觀察到(B、D)。
[0014]圖2:人類WBC凝集檢驗的顯微術(shù)。將供體X和對照血漿與人類WBC —起培養(yǎng)，且然后利用顯微術(shù)觀察。用供體X血漿(A、C)或?qū)φ昭獫{(B、D)培養(yǎng)的人類白血細(xì)胞的光(A、B)和相差(C、D)顯微照片。用供體X血漿(A、C)或血漿對照(B、D)未觀察到凝集。
[0015]圖3:供體X兔WBC凝集的相差和熒光顯微術(shù)。將供體X和對照血漿與兔WBC —起培養(yǎng)，與熒光素標(biāo)記的抗人類IgG反應(yīng)，且然后利用相差或熒光顯微術(shù)觀察。圖(A)顯示用供體X血漿培養(yǎng)的兔WBC的相差顯微照片。圖(B)顯示用供體X血漿培養(yǎng)且然后用熒光素標(biāo)記的抗人類IgG處理的兔WBC的熒光顯微照片。在凝集的細(xì)胞簇中觀察到強(qiáng)熒光，說明來自供體X血漿的人類IgG負(fù)責(zé)細(xì)胞凝集。
[0016]圖4:兔WBC凝集檢驗的熒光顯微術(shù)。將供體X和對照血漿與兔WBC —起培養(yǎng)且然后與熒光素標(biāo)記的抗人類IgG反應(yīng)。圖(A)顯示兔WBC的陽性熒光。圖(B)顯示對照血漿的結(jié)果。
[0017]圖5:兔WBC凝集檢驗的熒光顯微術(shù)。將供體X和對照血漿與兔WBC —起培養(yǎng)，與熒光素標(biāo)記的抗人類IgG反應(yīng)，且然后利用熒光顯微術(shù)觀察。圖(A)顯示用熒光素標(biāo)記的抗人類IgG培養(yǎng)的兔WBC的陽性熒光和凝集的細(xì)胞的40X圖(底圖)。這些結(jié)果說明，供體X的血漿包含與兔WBC細(xì)胞表面抗原反應(yīng)性的IgG。圖(B)顯示用對照血漿觀察的弱熒光和兔WBC的相差顯微照片，未顯示凝集(底圖)。
[0018]圖6:人類WBC凝集檢驗的熒光顯微術(shù)。將供體X和對照血漿與人類WBC —起培養(yǎng)，與熒光素標(biāo)記的抗人類IgG反應(yīng)，且然后利用熒光顯微術(shù)觀察。(A，供體X)和(B，對照血漿)都不具有強(qiáng)熒光或凝集(底圖)，說明供體X的血漿包含不與人類WBC細(xì)胞表面抗原反應(yīng)性的IgG。
[0019]圖7:熒光流式細(xì)胞術(shù)柱狀圖。用供體X或?qū)φ昭獫{培養(yǎng)兔WBC，與熒光素標(biāo)記的抗人類IgG反應(yīng)，且然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析。柱狀圖顯示觀察的相對熒光。圖A和B顯示兩個分別的實驗。供體X血漿給出最大信號，相對熒光是對照血漿的至少三倍。參見表4和5的定量結(jié)果。
[0020]圖8:熒光流式細(xì)胞術(shù)柱狀圖。用供體X或?qū)φ昭獫{培養(yǎng)人類WBC，與熒光素標(biāo)記的抗人類IgG反應(yīng)，且然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析。柱狀圖顯示觀察的相對熒光。圖A和B顯示兩個分別的實驗。供體X血漿與對照血漿無顯著不同。參見表6和7的定量結(jié)果。
[0021]圖9:包含致熱的IGIV-C的供體X血漿分離物樣品的電泳和蛋白質(zhì)印跡法分析。泳道1:麗標(biāo)志；泳道2:致熱的IGIV-C (供體X);泳道3:無熱原IGIV-C ;泳道4:兔血清；泳道5:胎牛血清；泳道6:馬血清。(A)速藍(lán)(Instant Blue)染色的凝膠。(B)用抗人類IgG堿性磷酸酶免疫共軛物(IgG-AP)探測的蛋白質(zhì)印跡對照(無一抗)。(C)利用包含致熱的IGIV-C的供體X血漿分離物作為一抗和抗人類IgG-AP的蛋白質(zhì)印跡。(D)利用無熱原IGIV-C作為一抗和抗人類IgG-AP的蛋白質(zhì)印跡。
[0022]圖10:包含致熱的IGIV-C的供體X血漿分離物樣品的電泳和蛋白質(zhì)印跡法分析。泳道1:麗標(biāo)志；泳道2:胎牛血清；泳道3:兔血清；泳道4:1:5稀釋的兔血清；泳道5:1:10稀釋的兔血清；泳道6:1:50稀釋的兔血清。(A)用抗人類IgG堿性磷酸酶免疫共軛物(IgG-AP)探測的蛋白質(zhì)印跡對照(無一抗)。(B)利用包含致熱的IGIV-C的供體X血漿分離物作為一抗和抗人類IgG-AP的蛋白質(zhì)印跡。(C)利用無熱原IGIV-C作為一抗和抗人類IgG-AP的蛋白質(zhì)印跡。(D)速藍(lán)染色的凝膠。
[0023]圖11:供體X的血漿與大鼠WBC交叉反應(yīng):大鼠WBC凝集檢驗的熒光顯微術(shù)。用供體X或?qū)φ昭獫{培養(yǎng)大鼠WBC，與熒光素標(biāo)記的抗人類IgG反應(yīng)，且然后利用熒光顯微術(shù)觀察。圖(A)顯示用熒光素標(biāo)記的抗人類IgG培養(yǎng)的大鼠WBC的陽性熒光和凝集，和凝集的細(xì)胞的40X圖(底圖)。這些結(jié)果說明，供體X的血漿包含與大鼠WBC細(xì)胞表面抗原反應(yīng)性的IgG。圖(B)顯示用對照血漿觀察的弱熒光和大鼠WBC的40X圖，未顯示凝集(底圖)。
[0024]詳述
[0025]本文描述了用于鑒定血液和血液制品中非典型抗體的方法。在本文稱為“供體X”的個體捐贈與其他裝置匯集的血漿，用于制造生物治療蛋白制品。在加工期間，利用USP致熱原性兔檢驗來檢驗匯集的血漿的致熱原性。意外地，匯集的血漿在USP兔測試中被測試為致熱陽性的。進(jìn)一步的檢驗追蹤致熱因素到供體X的血漿。鱟阿米巴樣細(xì)胞溶解物(LAL)檢驗顯示，供體X血漿未被細(xì)菌內(nèi)毒素污染。相反，本文描述的檢驗證明，供體X的血漿包含負(fù)責(zé)致熱反應(yīng)的非典型抗體。具體地，光和熒光顯微鏡檢查顯示，供體X血漿使得兔和大鼠WBC而非人類WBC凝集。兔WBC交叉反應(yīng)性是對供體X特異性的，因為來自供體X的父母、同胞和子女的血漿不反應(yīng)。熒光流式細(xì)胞術(shù)實驗顯示，供體X血漿包含與兔WBC細(xì)胞表面抗原反應(yīng)性的IgG抗體且蛋白質(zhì)印跡實驗證實該IgG與兔血清的反應(yīng)性?？傊@些結(jié)果說明，供體X可能已經(jīng)被暴露于可具有與兔WBC的誘導(dǎo)的體液免疫交叉反應(yīng)性的嚙齒類動物或嚙齒類動物的蟲媒。如此，來自一些個體的血漿在USP兔熱原測試可被測試為陽性，不是因為它們被細(xì)菌污染，而是因為它們包含與兔WBC抗原交叉反應(yīng)性的非典型抗體。
實施例[0026]實施例1
[0027]美國藥典(USP)熱原檢驗
[0028]現(xiàn)有的美國藥典§ 151概述了熱原檢驗。測試包括在靜脈注射測試溶液后測量兔體溫的升高。這一檢驗旨在確定產(chǎn)物(product)以在不多于10分鐘的時間段內(nèi)靜脈注射不超過10mL/kg的劑量是否可被測試兔耐受。最初注射三只兔。如果任何兔顯示單獨的體溫升高≥0.5°C，則利用五只另外的兔繼續(xù)測試。如果八只兔中的三只或更多顯示單獨的體溫升高≥ 0.5°C和/或八個單獨的體溫升高的總和超過3.3°C，則認(rèn)為所檢查的材料是致熱的。
[0029]將供體X血漿或無任何供體X血漿的匯集樣品的樣品1:100稀釋到IOmL氯化鈉溶液(0.9%NaCl)中，并注射到三只健康成年兔的耳靜脈中。在注射10分鐘內(nèi)直腸測量兔的體溫。體溫數(shù)據(jù)顯示在表1中。無供體X的血漿樣品在任何兔中都不引起體溫增加。與之相比，當(dāng)測試供體X血漿時，測量到1.1 - 1.2°C之間的體溫增加。因為3只兔的總體溫增加是3.4°C，認(rèn)為供體X血漿是致熱的，且不需要擴(kuò)展測試到另外5只兔。
[0030]利用蛋白A柱捕獲包含0%或10%供體X血漿的池中的免疫球蛋白并測試致熱原性。無供體X的血漿樣品未引起體溫增加，但包含供體X血漿的樣品是高度致熱的。這些結(jié)果說明，兔中的致熱反應(yīng)可與供體X血漿中的免疫球蛋白關(guān)聯(lián)。
[0031]
【權(quán)利要求】
1.一種用于鑒定血液制品制造過程中非典型反應(yīng)性抗體的方法，所述方法包括: (a)獲得血液或血漿的樣品； (b)利用以下的任何一種或多種測試所述樣品和對照:細(xì)胞凝集、熒光顯微術(shù)、免疫沉淀、免疫擴(kuò)散、免疫熒光法、ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、FACS或蛋白質(zhì)印跡法； (c)比較所述樣品和對照的測試結(jié)果； (d)確定所述樣品是否包含反應(yīng)性非典型抗體；和； (e)如果所述樣品包含反應(yīng)性非典型抗體，則阻斷為所述樣品來源的血液或血漿裝置。
2.一種用于鑒定血液制品制造過程中非典型反應(yīng)性抗體的方法，所述方法包括: (a)獲得血液或血漿的樣品； (b)利用細(xì)胞凝集檢驗測試所述樣品和對照； (C)比較所述樣品和對照的測試結(jié)果； (d)確定所述樣品是否包含反應(yīng)性非典型抗體；和； (e)如果所述樣品包含反應(yīng)性非典型抗體，則阻斷為所述樣品來源的血液或血漿裝置。
3.一種用于鑒定血液制品制造過程中非典型反應(yīng)性抗體的方法，所述方法包括: (a)獲得血液或血漿的樣品； (b)利用流式細(xì)胞術(shù)測試所述樣品和對照； (C)比較所述樣品和對照的測試結(jié)果； (d)確定所述樣品是否包含反應(yīng)性非典型抗體；和； (e)如果所述樣品包含反應(yīng)性非典型抗體，則阻斷為所述樣品來源的血液或血漿裝置。
4.一種用于鑒定血液或血漿制品制造過程中非典型反應(yīng)性抗體的方法，所述方法包括: (a)獲得血液或血漿的樣品； (b)利用蛋白質(zhì)印跡法測試所述樣品和對照； (C)比較所述樣品和對照的測試結(jié)果； (d)確定所述樣品是否包含反應(yīng)性非典型抗體；和； (e)如果所述樣品包含反應(yīng)性非典型抗體，則阻斷為所述樣品來源的血液或血漿裝置。
5.一種用于評價血液制品制造過程中可能的假陽性熱原測試結(jié)果的方法，所述方法包括: (a)獲得血液或血液制品的樣品； (b)利用以下測試所述樣品和對照:熒光顯微術(shù)、免疫沉淀、免疫擴(kuò)散、免疫熒光法、ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、FACS或蛋白質(zhì)印跡法； (c)利用鱟阿米巴樣細(xì)胞溶解物(LAL)或類似檢驗測試所述樣品和對照； (d)比較兩種檢驗中所述樣品和對照的測試結(jié)果； (e)評價所述樣品是否給出假陽性熱原測試結(jié)果；和 (f)如果所述樣品包含反應(yīng)性非典型抗體，則阻斷為所述樣品來源的血液或血液制品>j-U ρ?α裝直。
【文檔編號】G01N33/80GK103814296SQ201280046051
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月21日
【發(fā)明者】克拉克·塞沃斯, 約安·霍塔 申請人:基立福有限公司