熒光粒子的檢測方法
【專利摘要】一種熒光粒子的檢測方法，其包括：調(diào)制包含熒光粒子和促進(jìn)前述熒光粒子從三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)的試樣溶液；以及計(jì)數(shù)調(diào)制的試樣溶液中存在的熒光粒子的分子數(shù)。計(jì)數(shù)前述熒光粒子的分子數(shù)包括如下工序：使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)，在前述試樣溶液內(nèi)移動前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置；一邊在前述試樣溶液內(nèi)移動前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置，一邊檢測由前述光檢測區(qū)域中的前述熒光粒子發(fā)出的光信號，逐個(gè)檢測前述熒光粒子；和將前述逐個(gè)檢測到的熒光粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)而計(jì)數(shù)前述光檢測區(qū)域的位置的移動中檢測到的前述熒光粒子的個(gè)數(shù)的工序。
【專利說明】熒光粒子的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及使用共聚焦顯微鏡、或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠檢測來自溶液中的微小區(qū)域的光的光學(xué)體統(tǒng)而檢測熒光粒子的方法。
[0002]本申請基于2011年8月12日在日本提交的日本特愿2011-176699號主張優(yōu)先權(quán)，本文援引其內(nèi)容。
【背景技術(shù)】
[0003]隨著近年來光學(xué)測量技術(shù)的發(fā)展，使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和能夠進(jìn)行光子計(jì)數(shù)(單光子檢測)的超高靈敏度的光檢測技術(shù)，能夠檢測/測定單光子或單分子熒光水平的微弱光。因此，提出了使用這樣的微弱光的檢測技術(shù)，進(jìn)行生物分子等分子間相互作用或者分子間的結(jié)合/解離反應(yīng)的檢測的各種裝置或方法。例如，熒光相關(guān)分光分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy:FCS。例如，參見專利文獻(xiàn) 1、2、非專利文獻(xiàn)I?3)中，使用激光共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)，對于進(jìn)出試樣溶液中的微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子或被熒光標(biāo)記的分子所發(fā)出的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測定。由該測定的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)的值確定微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等的平均滯留時(shí)間(平移擴(kuò)散時(shí)間)以及滯留的分子個(gè)數(shù)的平均值。基于微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等的平均滯留時(shí)間以及滯留的分子個(gè)數(shù)的平均值，實(shí)現(xiàn)取得熒光分子等的運(yùn)動速度或大小、濃度這類信息，或者檢測到分子的結(jié)構(gòu)或大小的變化、分子的結(jié)合/解離反應(yīng)或分散/聚集的各種現(xiàn)象。需要說明的是，前述微小區(qū)域是指顯微鏡的激光束被聚光的焦點(diǎn)區(qū)域，被稱為共焦體積。另外，熒光強(qiáng)度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribution Analysis:FIDA。例如，專利文獻(xiàn) 3)、光子計(jì)數(shù)直方圖(Photon Counting Histogram:PCH。例如，專利文獻(xiàn)4),與FCS同樣地，生成檢測到的出入共焦體積內(nèi)的熒光分子等的熒光強(qiáng)度的直方圖。通過對該直方圖的分布擬合統(tǒng)計(jì)學(xué)模型式，算出熒光分子等固有的明亮度的平均值和共焦體積內(nèi)滯留的分子個(gè)數(shù)的平均值。根據(jù)上述信息，推測分子結(jié)構(gòu)或大小的變化、結(jié)合/解離狀態(tài)、分散/聚集狀態(tài)等。此夕卜，專利文獻(xiàn)5、6中提出了:基于使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)測定出的試樣溶液的熒光信號的時(shí)程來檢測熒光性物質(zhì)的方法。專利文獻(xiàn)7中提出了一種信號運(yùn)算處理技術(shù)，其用于:使用光子計(jì)數(shù)技術(shù)，測量在流式細(xì)胞儀內(nèi)流過的熒光微?；蚬潭ㄔ诨迳系臒晒馕⒘Ｋl(fā)出的微弱光，檢測液流中或基板上存在的熒光粒子。
[0004]特別是，通過應(yīng)用FCS、FIDA等、使用了共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)的微小區(qū)域的熒光測定技術(shù)的方法，測定所必需的試樣的濃度比以前低得多且可以是微量(每次測定使用的量最多數(shù)十UL左右)，測定時(shí)間也大幅地縮短(每次測定中可重復(fù)進(jìn)行數(shù)次的秒數(shù)量級時(shí)間的測定。)。因此，特別在對于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的研究開發(fā)領(lǐng)域中經(jīng)常使用的稀少或高價(jià)的試樣進(jìn)行分析的情況下或者在疾病的臨床診斷、生理活性物質(zhì)的篩選等被檢體多的情況下，這些技術(shù)與現(xiàn)有的生物化學(xué)的方法相比較，可以期待能夠成為低廉或迅速地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或檢測的強(qiáng)有力的工具。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)[0006]專利文獻(xiàn)
[0007]專利文獻(xiàn)1:日本特開2005-098876號公報(bào)
[0008]專利文獻(xiàn)2:日本特開2008-292371號公報(bào)
[0009]專利文獻(xiàn)3:日本專利第4023523號公報(bào)
[0010]專利文獻(xiàn)4:國際公開第08/080417號公報(bào)
[0011]專利文獻(xiàn)5:日本特開2007-20565號公報(bào)
[0012]專利文獻(xiàn)6:日本特開2008-116440號公報(bào)
[0013]專利文獻(xiàn)7:日本特開平4-337446號公報(bào)
[0014]非專利文獻(xiàn)
[0015]非專利文獻(xiàn)1:金城政孝、蛋白質(zhì)核酸酵素、1999年、第44卷、第9號、第1431?1438 頁。
[0016]非專利文獻(xiàn)2:Meyer-Alms、Fluorescence Correlation Spectroscopy>R.Rigler編、Springer、柏林、2000 年、第 204 ?224 頁。
[0017]非專利文獻(xiàn)3:加藤則子等4名、遺伝子醫(yī)學(xué)、2002年、第6卷、第2號、第271?277 頁。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018]發(fā)明要解決的問題
[0019]上述FCS、FIDA、PCH等光分析技術(shù)簡而言之是通過統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)算所測量的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間波動的大小，根據(jù)該波動的大小確定在試樣溶液中的微小區(qū)域內(nèi)出入的熒光分子等的各種特性。因此，為了在上述的光分析技術(shù)中得到有意義的結(jié)果，作為試樣溶液中的觀測對象的熒光分子等的濃度或數(shù)密度優(yōu)選調(diào)整成在平衡狀態(tài)下在秒數(shù)量級長度的一次檢測時(shí)間內(nèi)有能夠統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的個(gè)數(shù)的熒光分子等出入微小區(qū)域內(nèi)。作為試樣溶液中的觀測對象的熒光分子等的濃度或數(shù)密度優(yōu)選調(diào)制成在平衡狀態(tài)下、在微小區(qū)域內(nèi)經(jīng)常地存在有一個(gè)左右的熒光分子等。典型地，共焦體積的體積成為IfL左右，所以，熒光分子等的濃度優(yōu)選為InM左右或其以上。換言之，試樣溶液中的觀測對象粒子的濃度或數(shù)密度大幅低于能夠統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的程度時(shí)，例如，大幅地低于InM時(shí)，產(chǎn)生檢測時(shí)間內(nèi)只有稀少的觀測對象物進(jìn)入微小區(qū)域內(nèi)的狀態(tài)，熒光強(qiáng)度的檢測結(jié)果中長期包括著觀測對象物在微小區(qū)域內(nèi)完全不存在的狀態(tài)。并且，顯著的熒光強(qiáng)度的觀測量變少，通過如上述的基于熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)學(xué)波動的光分析技術(shù)難以獲得有意義的或精度良好的分析結(jié)果。
[0020]專利文獻(xiàn)5、6中所述的、使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的熒光性物質(zhì)的檢測方法中公開有:不進(jìn)行如上述的涉及熒光強(qiáng)度波動的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，根據(jù)數(shù)秒的測量時(shí)間內(nèi)有無顯著強(qiáng)度的熒光信號的產(chǎn)生，判斷試樣中的觀測對象的熒光分子等的有無，而得到顯著強(qiáng)度的熒光信號的頻率與試樣中的熒光分子等的粒子數(shù)的相關(guān)性。特別是在專利文獻(xiàn)6中，提出了產(chǎn)生攪拌試樣溶液的隨機(jī)流動時(shí)，檢測靈敏度提高。然而，即便這些方法，也只停留在檢測通過擴(kuò)散或隨機(jī)的流動概率地進(jìn)入微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等的存在，不能把握微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等的粒子行為，并沒有實(shí)現(xiàn)例如:粒子的計(jì)數(shù)、定量地算出粒子的濃度或數(shù)密度。另外，專利文獻(xiàn)7中記載的技術(shù)是逐個(gè)檢測流式細(xì)胞儀的液流中的熒光微?；蚬潭ㄔ诨迳系臒晒馕⒘５拇嬖诘募夹g(shù)。專利文獻(xiàn)7中記載的技術(shù)不是用于檢測試樣溶液中在通常的狀態(tài)下溶解或分散的分子或膠體等粒子，即，不是用于對于在試樣溶液中隨機(jī)運(yùn)動的粒子進(jìn)行檢測的技術(shù)。因此，并沒有實(shí)現(xiàn)定量地算出在試樣溶液中溶解或分散的粒子的濃度或數(shù)密度。另外，專利文獻(xiàn)7的技術(shù)包含流式細(xì)胞儀中的測量或者熒光粒子向基板上的固定化處理的過程，因此可以認(rèn)為，檢測所需要的試樣量遠(yuǎn)大于FCS、FIDA、PCH等的光分析技術(shù)的情況，并且對實(shí)施者要求復(fù)雜的高難度的操作技術(shù)。
[0021]從而，本發(fā)明的方式不包含如FCS、FIDA、PCH等光分析技術(shù)中實(shí)行的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。因此，目的在于提供通過對于觀測對象粒子的濃度或數(shù)密度低于這些光分析技術(shù)中處理水平的試樣溶液中的觀測對象粒子的狀態(tài)或特性能夠進(jìn)行檢測的新型的光分析技術(shù)，更靈敏地檢測熒光粒子的方法。
[0022]用于解決問題的方案
[0023]為了解決上述問題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檢測試樣溶液中分散并隨機(jī)地運(yùn)動的熒光粒子的情況下，通過使用掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行熒光粒子的檢測，即便在試樣溶液中的觀測對象的粒子的濃度非常低的情況下也能夠靈敏度良好地檢測熒光粒子；進(jìn)而，通過在三重激發(fā)態(tài)猝滅劑的存在下進(jìn)行利用掃描分子計(jì)數(shù)法的檢測，能夠更高靈敏度地檢測熒光粒子。
[0024]此處，掃描分子計(jì)數(shù)法是日本特愿2010-044714中提出的新型光分析技術(shù)。
[0025]即，本發(fā)明的一方式提供:
[0026](I) 一種在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動的熒光粒子的檢測方法，其包括:
[0027](a)調(diào)制包含熒光粒子和促進(jìn)前述熒光粒子從三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)的試樣溶液的工序；和
[0028](b)算出前述工序(a)中調(diào)制的試樣溶液中存在的熒光粒子的分子數(shù)的工序，
[0029]前述工序(b)中的熒光粒子的分子數(shù)的計(jì)算包括:
[0030]使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)，在前述試樣溶液內(nèi)移動前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置的工序；
[0031]在前述試樣溶液內(nèi)移動前述光檢測區(qū)域的位置的同時(shí)，通過檢測由前述光檢測區(qū)域中存在的前述熒光粒子發(fā)出的光信號，逐個(gè)檢測前述熒光粒子的工序；和
[0032]通過將前述逐個(gè)檢測到的熒光粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)而計(jì)數(shù)前述光檢測區(qū)域的位置的移動期間檢測到的前述熒光粒子的個(gè)數(shù)的工序。
[0033](2)根據(jù)前述(I)所述的熒光粒子的檢測方法，前述試樣溶液中的前述促進(jìn)由三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)的濃度為0.1mM?20mM。
[0034](3)根據(jù)前述(I)所述的熒光粒子的檢測方法，前述試樣溶液中的前述促進(jìn)由三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)的濃度為0.3mM?10mM。
[0035](4)根據(jù)前述(I)所述的熒光粒子的檢測方法，前述試樣溶液中的前述促進(jìn)由三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)的濃度為0.5mM?5mM。
[0036](5)根據(jù)前述⑴?⑷的任一項(xiàng)所述的熒光粒子的檢測方法，前述促進(jìn)由三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)為選自碘化鉀和半胱胺的一種以上。
[0037](6)根據(jù)前述(I)?(5)的任一項(xiàng)所述的熒光粒子的檢測方法，前述移動光檢測區(qū)域的位置的工序包括以規(guī)定的速度移動前述光檢測區(qū)域的位置。
[0038](7)根據(jù)前述(I)?(6)的任一項(xiàng)所述的熒光粒子的檢測方法，前述移動光檢測區(qū)域的位置的工序包括以比前述熒光粒子的擴(kuò)散移動速度更快的速度移動前述光檢測區(qū)域的位置。
[0039](8)根據(jù)前述⑴?(7)的任一項(xiàng)所述的熒光粒子的檢測方法，通過檢測來自每個(gè)前述熒光粒子的光信號來逐個(gè)檢測前述熒光粒子的工序包括根據(jù)檢測到的按照時(shí)間順序的光信號的形狀來檢測單個(gè)前述熒光粒子向前述光檢測區(qū)域中的進(jìn)入。
[0040]發(fā)明的效果
[0041]本發(fā)明的熒光粒子的檢測方法中應(yīng)用的掃描分子計(jì)數(shù)法不實(shí)行計(jì)算熒光強(qiáng)度波動這樣的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。因此，通過本發(fā)明的方式的熒光粒子的檢測方法，即便試樣中僅極微量地存在作為解析對象的熒光粒子時(shí)，也能夠檢測試樣中的前述熒光粒子。進(jìn)而，本發(fā)明的方式的熒光粒子的檢測方法中，由于利用掃描分子計(jì)數(shù)法在三重激發(fā)態(tài)猝滅劑的存在下進(jìn)行檢測，所以能夠非常高靈敏度地檢測熒光粒子。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]圖1A是用于掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析裝置的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的示意圖。
[0043]圖1B是共焦體積(共聚焦顯微鏡的觀察區(qū)域)的示意圖。
[0044]圖1C是改變鏡7的方向，在試樣溶液內(nèi)部移動光檢測區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)的示意圖。
[0045]圖2A是說明基于用于掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)的光檢測原理的示意圖。
[0046]圖2B是利用用于掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)的光檢測中測量的光強(qiáng)度的時(shí)間變化的示意圖。
[0047]圖3A是觀測對象粒子一邊進(jìn)行布朗運(yùn)動一邊橫穿光檢測區(qū)域時(shí)的示意圖。
[0048]圖3B是表示觀測對象粒子邊進(jìn)行布朗運(yùn)動邊橫穿光檢測區(qū)域時(shí)的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化的例子的圖。
[0049]圖4A是以快于觀測對象粒子的擴(kuò)散移動速度的速度移動試樣溶液內(nèi)的光檢測區(qū)域的位置、從而觀測對象粒子橫穿光檢測區(qū)域時(shí)的示意圖。
[0050]圖4B是以快于觀測對象粒子的擴(kuò)散移動速度的速度移動試樣溶液內(nèi)的光檢測區(qū)域的位置、從而觀測對象粒子橫穿光檢測區(qū)域時(shí)的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化的例子的圖。
[0051]圖5是以流程圖的形式顯示根據(jù)掃描分子計(jì)數(shù)法測量的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化進(jìn)行粒子的計(jì)數(shù)的處理次序的圖。
[0052]圖6A是說明在根據(jù)通過掃描分子計(jì)數(shù)法測量的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化進(jìn)行粒子計(jì)數(shù)的處理次序中的、檢測信號的信號處理工序的例子的圖。
[0053]圖6B是說明在根據(jù)通過掃描分子計(jì)數(shù)法測量的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化進(jìn)行粒子計(jì)數(shù)的處理次序中的、檢測信號的信號處理工序的例子的圖。
[0054]圖7表示通過掃描分子計(jì)數(shù)法測量的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的實(shí)測例(柱狀圖)、和將數(shù)據(jù)平滑化后獲得的曲線(虛線)、和峰存在區(qū)域中擬合的高斯函數(shù)(實(shí)線)。圖中，帶有“噪音”的信號作為由噪音或雜質(zhì)帶來的信號被無視。
[0055]圖8A是表不參考例I中包含Rhodamine Green(注冊商標(biāo))的各試樣溶液中的突光分子中的三重激發(fā)態(tài)的比例的圖。[0056]圖8B是表不參考例I中包含Rhodamine Green(注冊商標(biāo))的各試樣溶液中的突光分子的每一分子的明亮度的圖。
[0057]圖9A是表示參考例I中包含Alexa Fluor (注冊商標(biāo))488的各試樣溶液中的熒光分子中的三重激發(fā)態(tài)的比例的圖。
[0058]圖9B是表示參考例I中包含Alexa Fluor (注冊商標(biāo))488的各試樣溶液中的熒光分子中的三重激發(fā)態(tài)的比例、以及熒光分子的每一分子的明亮度CPP的圖。
[0059]圖1OA是表示參考例2中包含Alexa Fluor (注冊商標(biāo))488的各試樣溶液中的熒光分子中的三重激發(fā)態(tài)的比例的圖。
[0060]圖1OB是表示參考例2中包含Alexa Fluor (注冊商標(biāo))488的各試樣溶液中的熒光分子的每一分子的明亮度的圖。
[0061]圖1lA是表不參考例2中包含TAMRA(注冊商標(biāo))的各試樣溶液中的突光分子中的三重激發(fā)態(tài)的比例的圖。
[0062]圖1lB是表不參考例2中包含TAMRA (注冊商標(biāo))的各試樣溶液中的突光分子的每一分子的明亮度CPP的圖。
[0063]圖12是表不實(shí)施例1中對于包含Alexa Fluor (注冊商標(biāo))488的各試樣溶液的峰數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的結(jié)果的圖。
[0064]圖13是表不實(shí)施例2中對于包含Alexa Fluor (注冊商標(biāo))488的各試樣溶液的峰數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的結(jié)果的圖。
[0065]圖14是表示實(shí)施例2中對于包含TAMRA (注冊商標(biāo))的各試樣溶液的峰數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的結(jié)果的圖。
[0066]圖15是表不實(shí)施例3中對于Alexa Fluor (注冊商標(biāo))488的濃度為IpM的各試樣溶液的峰數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的結(jié)果的圖。
[0067]圖16是表示實(shí)施例3中對于Alexa Fluor (注冊商標(biāo))488的濃度為IOOpM的各試樣溶液的峰數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的結(jié)果的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0068]首先，對掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行說明。掃描分子計(jì)數(shù)法為如下技術(shù):一邊通過微小區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)，一邊當(dāng)在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動的發(fā)出光的粒子(以下，稱為“發(fā)光粒子”。)橫穿微小區(qū)域內(nèi)時(shí)，檢測由微小區(qū)域中的發(fā)光粒子發(fā)出的光。由此，掃描分子計(jì)數(shù)法能夠一個(gè)一個(gè)逐個(gè)檢測試樣溶液中的發(fā)光粒子，獲得與發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)、試樣溶液中的發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度的相關(guān)信息。與FIDA等光分析技術(shù)同樣地，檢測所需的試樣可以是微量(例如，數(shù)十μ L左右)，另外測定時(shí)間短。并且與FIDA等光分析技術(shù)的情況相t匕，對于更低濃度或數(shù)密度的發(fā)光粒子，可以定量檢測其濃度或數(shù)密度等特性。
[0069]需要說明的是，發(fā)光粒子是指通過熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、光散射等發(fā)出光的粒子。本實(shí)施方式的熒光粒子的檢測方法中，以發(fā)光粒子中的熒光粒子作為檢測對象。
[0070]本實(shí)施方式中，共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的“光檢測區(qū)域”是指在共焦顯微鏡或多光子顯微鏡中檢測到光的微小區(qū)域，當(dāng)由物鏡照射照明光時(shí)，相當(dāng)于該照明光聚光的區(qū)域。需要說明的是，在共聚焦顯微鏡中，該區(qū)域尤其根據(jù)物鏡與小孔之間的位置關(guān)系確定。[0071]邊在試樣溶液內(nèi)移動光檢測區(qū)域的位置、即通過光檢測區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)邊逐次地進(jìn)行光的檢測。于是，當(dāng)移動的光檢測區(qū)域包含了與隨機(jī)運(yùn)動的粒子結(jié)合或締合的發(fā)光探針時(shí)，檢測到來自發(fā)光探針的光。由此，檢測到一個(gè)粒子的存在。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的方式，也可以存在如下情況:發(fā)光探針與希望檢測到的粒子暫時(shí)結(jié)合后，在光的檢測時(shí)，從粒子解離。接著，在逐次檢測到的光中逐個(gè)檢測來自發(fā)光探針的光信號。由此，一個(gè)一個(gè)地逐個(gè)逐次地檢測粒子或與發(fā)光探針結(jié)合的粒子的存在，能夠得到關(guān)于粒子在溶液內(nèi)的狀態(tài)的各種信息。具體而言，例如，在上述構(gòu)成中，可以計(jì)數(shù)逐個(gè)檢測到的粒子，從而計(jì)數(shù)在光檢測區(qū)域的位置移動中檢測到的粒子的個(gè)數(shù)(粒子的計(jì)數(shù))。根據(jù)該構(gòu)成，通過組合粒子的個(gè)數(shù)與光檢測區(qū)域的位置的移動量，能夠獲得與試樣溶液中的粒子的數(shù)密度或濃度相關(guān)的信息。特別是通過任意手法例如以規(guī)定速度移動光檢測區(qū)域的位置等來確定光檢測區(qū)域的位置移動軌跡的總體積，就能夠具體計(jì)算粒子的數(shù)密度或濃度。當(dāng)然，并不是直接確定絕對數(shù)密度值或濃度值，也可以計(jì)算相對于多個(gè)試樣溶液、或者相對于成為濃度或數(shù)密度基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液的相對的數(shù)密度或濃度之比。另外，掃描分子計(jì)數(shù)法中，通過采用改變光學(xué)系統(tǒng)的光路而移動光檢測區(qū)域的位置的構(gòu)成，光檢測區(qū)域的移動是迅速的，并且在試樣溶液中實(shí)質(zhì)上不產(chǎn)生機(jī)械振動、流體力學(xué)的作用。因此，作為檢測對象的粒子能夠不受力學(xué)的作用的影響而以穩(wěn)定的狀態(tài)進(jìn)行光的測量(在試樣溶液中有振動或流動作用時(shí)，有粒子的物理性質(zhì)變化的可能性。)。并且，由于流通試樣溶液這樣的構(gòu)成不是必需的，因此能夠用與FCS、FIDA等情況下同樣微量(IyL?數(shù)十μ L左右)的試樣溶液進(jìn)行測量和分析。
[0072]在上述的逐個(gè)地檢測粒子的工序中，由逐次檢測到的光信號判定與一個(gè)粒子結(jié)合的發(fā)光探針是否進(jìn)入光檢測區(qū)域時(shí)，可以根據(jù)按照時(shí)間順序檢測到的光信號的形狀而進(jìn)行。本實(shí)施方式中，典型地，當(dāng)檢測到具有比規(guī)定閾值大的強(qiáng)度的光信號時(shí)，能夠檢測到與一個(gè)粒子結(jié)合的發(fā)光探針進(jìn)入了光檢測區(qū)域。需要說明的是，本實(shí)施方式中，與一個(gè)粒子結(jié)合的發(fā)光探針包括:一個(gè)發(fā)光探針與一個(gè)粒子結(jié)合的情況；多個(gè)發(fā)光探針與一個(gè)粒子結(jié)合的情況；以及根據(jù)實(shí)驗(yàn)方式的、與一個(gè)粒子結(jié)合之后從粒子解離的發(fā)光探針的情況。
[0073]此外，在上述移動光檢測區(qū)域的位置的工序中，可以根據(jù)與粒子結(jié)合的發(fā)光探針的特性或試樣溶液中的數(shù)密度或濃度，適當(dāng)改變試樣溶液內(nèi)部的光檢測區(qū)域的位置的移動速度。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，由與粒子結(jié)合的發(fā)光探針?biāo)鶛z測到的光的形態(tài)，可能會根據(jù)其特性或試樣溶液中的數(shù)密度或濃度而改變。特別是，光檢測區(qū)域的移動速度過快時(shí)，由與一個(gè)粒子結(jié)合的發(fā)光探針得到的光量降低，所以為了精度良好或靈敏度良好地測量來自與一個(gè)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的光，優(yōu)選適當(dāng)?shù)馗淖児鈾z測區(qū)域的移動速度。
[0074]進(jìn)一步，在上述移動光檢測區(qū)域的位置的工序中，適當(dāng)?shù)氖菍⒃嚇尤芤簝?nèi)的光檢測區(qū)域的位置的移動速度設(shè)定為高于與作為檢測對象的粒子結(jié)合的發(fā)光探針的擴(kuò)散移動速度(由布朗運(yùn)動造成的粒子的平均移動速度)。如上述說明，通過掃描分子計(jì)數(shù)法，當(dāng)光檢測區(qū)域通過存在有與一個(gè)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的位置時(shí)，檢測由該發(fā)光探針發(fā)出的光而逐個(gè)檢測發(fā)光探針。然而，當(dāng)與粒子結(jié)合的發(fā)光探針在溶液中由于布朗運(yùn)動而隨機(jī)移動，在光檢測區(qū)域中出入多次時(shí)，多次檢測到來自一個(gè)發(fā)光探針的(表示希望檢測的粒子存在)光信號，難以將檢測到的光信號與一個(gè)希望檢測的粒子的存在對應(yīng)起來。因此，如上述，將光檢測區(qū)域的移動速度設(shè)定為高于與粒子結(jié)合的發(fā)光探針的擴(kuò)散移動速度，由此，能夠使與一個(gè)粒子結(jié)合的發(fā)光探針對應(yīng)于一個(gè)(表示粒子的存在的)光信號。本實(shí)施方式中，具體而言，將光檢測區(qū)域的移動速度設(shè)定為快于作為檢測對象的熒光粒子的擴(kuò)散移動速度。需要說明的是，擴(kuò)散移動速度隨著與粒子結(jié)合的發(fā)光探針而改變，所以優(yōu)選如上述那樣根據(jù)與粒子結(jié)合的發(fā)光探針的特性(特別是擴(kuò)散常數(shù))適當(dāng)改變光檢測區(qū)域的移動速度。
[0075]可以以任意方式，進(jìn)行用于移動光檢測區(qū)域的位置的光學(xué)系統(tǒng)的光路改變。
[0076]例如，可以利用激光掃描型光學(xué)顯微鏡中采用的檢流計(jì)鏡改變光路，使光檢測區(qū)域的位置發(fā)生變化。光檢測區(qū)域的位置的移動軌跡可以任意地設(shè)定，也可以選自例如圓形、橢圓形、矩形、直線和曲線。
[0077]掃描分子計(jì)數(shù)法中，其光檢測機(jī)理自身與FIDA等光分析技術(shù)的情況相同，采取對來自共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光檢測區(qū)域的光進(jìn)行檢測的構(gòu)成，所以試樣溶液的量同樣地可以是微量的。然而，掃描分子計(jì)數(shù)法中，不實(shí)施計(jì)算熒光強(qiáng)度的波動這樣的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所以掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)可以適用于粒子的數(shù)密度或濃度比FIDA等光分析技術(shù)所需要的水平大幅地低的試樣溶液。
[0078]另外，掃描分子計(jì)數(shù)法中，在溶液中分散或溶解的每個(gè)粒子被逐個(gè)檢測出。因此，使用該信息，可以定量地進(jìn)行粒子的計(jì)數(shù)、試樣溶液中的粒子的濃度或數(shù)密度的計(jì)算、或者取得與濃度或數(shù)密度相關(guān)的信息。即，通過掃描分子計(jì)數(shù)法，使通過光檢測區(qū)域的粒子與檢測到的光信號一一對應(yīng)，一個(gè)一個(gè)地檢測出粒子，所以能夠進(jìn)行溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動的粒子的計(jì)數(shù)。因此，通過掃描分子計(jì)數(shù)法，與以前相比，能夠精度良好地確定試樣溶液中的粒子的濃度或數(shù)密度。實(shí)際上，根據(jù)逐個(gè)檢測熒光粒子并計(jì)數(shù)其數(shù)目而確定粒子濃度的本實(shí)施方式的熒光粒子的檢測方法，即使試樣溶液中的熒光粒子的濃度是比基于通過熒光分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀測量的熒光強(qiáng)度能夠確定的濃度更低的濃度，也能夠檢測目標(biāo)粒子。
[0079]進(jìn)一步，利用改變光學(xué)系統(tǒng)的光路、利用光檢測區(qū)域掃描試樣溶液中的方式，在不對試樣溶液產(chǎn)生機(jī)械振動或流體力學(xué)作用、試樣溶液內(nèi)部均勻的狀態(tài)或試樣溶液機(jī)械上穩(wěn)定的狀態(tài)下進(jìn)行觀察。因此，例如，與試樣中發(fā)生流動的情況相比較，定量檢測結(jié)果的可靠性提高，另外，對于試樣溶液中的成為檢測對象的粒子，能夠在沒有力學(xué)作用的影響下或沒有人為影響的狀態(tài)下進(jìn)行測量。需要說明的是，對于試樣引起流動時(shí)通常難以引起均勻的流速，并且裝置結(jié)構(gòu)復(fù)雜化。另外，需要的試樣量大幅地增大。進(jìn)而，由流動導(dǎo)致的流體力學(xué)的作用，溶液中的粒子、發(fā)光探針或結(jié)合體或者其他的物質(zhì)存在變質(zhì)或變性的可能性。
[0080]<用于掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析裝置的構(gòu)成>
[0081]可以通過在基本的構(gòu)成中如圖1A中示意性的示例那樣組合能夠?qū)嵤〧CS、FIDA等的共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光檢測器而構(gòu)成的光分析裝置實(shí)施掃描分子計(jì)數(shù)法。參照圖1A，光分析裝置I是由光學(xué)系統(tǒng)2?17、和用于控制光學(xué)系統(tǒng)的各部分的行為并獲得、分析數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)18構(gòu)成的。光分析裝置I的光學(xué)系統(tǒng)可以與通常的共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)同樣，此處，自光源2放射的在單模光纖3內(nèi)傳播的激光(Ex)在光纖的射出端以固有的NA (Numerical Aperture)規(guī)定的角度放射為發(fā)散的光,通過準(zhǔn)直儀4成為平行光,在分色鏡5、反射鏡6、7處發(fā)生反射，入射至物鏡8。在物鏡8的上方，典型地配置有分注了 I μ L?數(shù)十μ L的試樣溶液的試樣容器或排列有孔10的微孔板9。自物鏡8射出的激光在試樣容器或孔10內(nèi)的試樣溶液中聚集為焦點(diǎn)，形成光強(qiáng)度強(qiáng)的區(qū)域(激發(fā)區(qū)域)。試樣溶液中，分散或溶解有作為觀測對象物的粒子、與前述粒子結(jié)合的發(fā)光探針、帶有發(fā)光標(biāo)記(典型地為熒光色素等)的分子。與發(fā)光探針結(jié)合或締合的粒子(根據(jù)實(shí)驗(yàn)的方式，與粒子暫時(shí)結(jié)合后從粒子解離的發(fā)光探針)進(jìn)入激發(fā)區(qū)域時(shí)，發(fā)光探針就在其間被激發(fā)而發(fā)出光。發(fā)出的光(Em)通過物鏡8、分色鏡5，在鏡11處反射，在聚光鏡12處聚光，通過小孔13，透過二次濾片14(此處，只選擇特定的波長范圍的光成分。)被導(dǎo)入至多模光纖15而到達(dá)光檢測器16，轉(zhuǎn)換成按照時(shí)間順序的電信號之后，輸入至計(jì)算機(jī)18，按照后面說明的方式實(shí)施用于光分析的處理。需要說明的是，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，在上述的構(gòu)成中，小孔13配置于與物鏡8的焦點(diǎn)位置共軛的位置上。由此，僅自圖1B中示意地所示的激光的焦點(diǎn)區(qū)域即激發(fā)區(qū)域內(nèi)發(fā)出的光通過小孔13，而來自激發(fā)區(qū)域以外的光被擋住。圖1B所例示的激光的焦點(diǎn)區(qū)域通常是具有IfL?IOfL左右的實(shí)際體積的、位于本光分析裝置中的光檢測區(qū)域(典型地，光強(qiáng)度呈現(xiàn)以區(qū)域的中心為頂點(diǎn)的高斯型分布或洛倫茲型分布。實(shí)際體積是以光強(qiáng)度為l/e2的面為界面的略橢球體的體積。)，被稱為共焦體積。另外，掃描分子計(jì)數(shù)法中，檢測到來自一個(gè)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或來自發(fā)光探針的光，例如，來自一個(gè)或數(shù)個(gè)熒光色素分子的微弱光，所以光檢測器16優(yōu)選使用能夠用于光子計(jì)數(shù)的超高靈敏度的光檢測器。此外，為了改變欲進(jìn)行觀察的孔10，在顯微鏡的平臺(沒有圖示)上可以設(shè)有用于移動微孔板9的水平方向位置的平臺位置變化裝置17a?？梢酝ㄟ^計(jì)算機(jī)18控制平臺位置變化裝置17a的動作。通過所述的構(gòu)成，即使被檢體為多個(gè)，也能夠?qū)崿F(xiàn)快速的測量。
[0082]進(jìn)一步，上述的光分析裝置的光學(xué)系統(tǒng)中，設(shè)置有改變光學(xué)系統(tǒng)的光路、通過光檢測區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)部的、即用于在試樣溶液內(nèi)移動焦點(diǎn)區(qū)域(即，光檢測區(qū)域)的位置的機(jī)構(gòu)。該用于移動光檢測區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)，例如如圖1C示意性示例的，也可以采用改變反射鏡7的方向的鏡轉(zhuǎn)向器17。所述的鏡轉(zhuǎn)向器17也可以與裝備在普通的激光掃描型顯微鏡中的檢流計(jì)鏡裝置相同。另外，為了實(shí)現(xiàn)預(yù)期的光檢測區(qū)域的位置移動模式，鏡轉(zhuǎn)向器17是在計(jì)算機(jī)18的控制下，與通過光檢測器16的光檢測協(xié)調(diào)而被驅(qū)動的。光檢測區(qū)域的位置的移動軌跡可任意地選自圓形、橢圓形、矩形、直線、曲線或它們的組合(可以從計(jì)算機(jī)18的程序中的各種移動模式中選擇。)。需要說明的是，圖中沒有顯示但也可以通過上下移動物鏡8而使光檢測區(qū)域的位置沿上下方向移動。如上所述，若利用的是不移動試樣溶液而是改變光學(xué)系統(tǒng)的光路從而移動光檢測區(qū)域的位置的構(gòu)成，試樣溶液內(nèi)實(shí)質(zhì)上不發(fā)生機(jī)械振動或流體力學(xué)的作用，能夠排除對于觀測對象物的力學(xué)作用的影響，能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定的測量。
[0083]當(dāng)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針通過吸收多光子而發(fā)光時(shí)，上述光學(xué)系統(tǒng)作為多光子顯微鏡使用。在此情況下，僅在激發(fā)光的焦點(diǎn)區(qū)域(光檢測區(qū)域)中發(fā)出光，所以可以去除小孔13。此外，當(dāng)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針通過化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光現(xiàn)象而不依賴激發(fā)光發(fā)光時(shí)，可以省略用于產(chǎn)生激發(fā)光的光學(xué)系統(tǒng)2?5。當(dāng)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針通過磷光或散射發(fā)光時(shí)，直接使用上述共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)。另外，在光分析裝置I中，可以如圖1A所示那樣設(shè)置多個(gè)激發(fā)光源2，可以根據(jù)用于將粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針激發(fā)的光的波長，選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光的波長。同樣地，可以具備多個(gè)光檢測器16，當(dāng)試樣中包含波長不同的多種粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針時(shí)，可以根據(jù)波長分別檢測來自它們的光。
[0084]<掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)的原理>
[0085]FIDA等分光分析技術(shù)與以前的生物化學(xué)分析技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)是必需的試樣量非常少，并且可以快速實(shí)施檢查。然而，在FIDA等分光分析技術(shù)中，原理上根據(jù)熒光強(qiáng)度波動計(jì)算觀測對象粒子的濃度或特性。為了獲得精度良好的檢測結(jié)果，要求試樣溶液中的觀測對象粒子的濃度或數(shù)密度是如下水平:在熒光強(qiáng)度測量中，在光檢測區(qū)域CV內(nèi)總是存在一個(gè)左右的觀測對象粒子，在測量時(shí)間內(nèi)總是檢測到顯著的光強(qiáng)度(光子計(jì)數(shù))。如果當(dāng)觀測對象粒子的濃度或數(shù)密度低于上述時(shí)，例如，當(dāng)觀測對象粒子只是偶爾進(jìn)入光檢測區(qū)域CV內(nèi)的水平時(shí)，僅在一部分測量時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)顯著的光強(qiáng)度(光子計(jì)數(shù))，因而難以以良好的精度計(jì)算光強(qiáng)度的波動。此外，在觀測對象粒子的濃度大幅地低于測量中通常在光檢測區(qū)域內(nèi)存在一個(gè)左右的觀測對象粒子的水平時(shí)，光強(qiáng)度波動的運(yùn)算易受背景的影響，用于獲得對運(yùn)算而言為充分量的顯著的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的測量時(shí)間延長。與此相對，即使當(dāng)觀測對象粒子的濃度低于FIDA等分光分析技術(shù)要求的水平時(shí)，用掃描分子計(jì)數(shù)法也能夠檢測觀測對象粒子的數(shù)密度或濃度等特性。
[0086]掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)中，作為實(shí)行的處理，直接了當(dāng)?shù)卣f，驅(qū)動用于移動光檢測區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)(鏡偏向器17)而改變光路，如圖2A中示意地描述，一邊在試樣溶液內(nèi)移動光檢測區(qū)域CV的位置即利用光檢測區(qū)域CV掃描試樣溶液內(nèi)，一邊實(shí)施光檢測。
[0087]如此一來，例如，如圖2A所示，在光檢測區(qū)域CV移動期間(圖中，時(shí)間t0?t2)，當(dāng)通過存在有I個(gè)粒子(圖中，發(fā)光探針結(jié)合有熒光色素)的區(qū)域時(shí)(tl)，檢測到如圖2B所述的顯著的光強(qiáng)度(Em)。如此，實(shí)行上述的光檢測區(qū)域CV的位置的移動和光檢測，通過一個(gè)一個(gè)地檢測在此期間出現(xiàn)的如圖2B所例示的顯著的光強(qiáng)度。由此，逐個(gè)檢測出與發(fā)光探針結(jié)合的粒子，通過將其個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，能夠得到與存在于所測量的區(qū)域內(nèi)的粒子的個(gè)數(shù)或者濃度或數(shù)密度相關(guān)的信息。所述掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)的原理中，粒子一個(gè)一個(gè)地被檢測出且不進(jìn)行如熒光強(qiáng)度波動的計(jì)算這類統(tǒng)計(jì)學(xué)運(yùn)算處理。由此，可以認(rèn)為即便是欲觀測粒子濃度低至無法用FIDA等以充分精度分析程度的試樣溶液，也能夠得到關(guān)于粒子的濃度或數(shù)密度的信息。
[0088]另外，通過掃描分子計(jì)數(shù)法這類逐個(gè)檢測、計(jì)數(shù)試樣溶液中的粒子的方法，與由通過熒光分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀測量的熒光強(qiáng)度來檢測被熒光標(biāo)記的粒子的濃度時(shí)相比，能夠測定至更低的濃度。當(dāng)通過熒光分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀來檢測某被熒光標(biāo)記的粒子的濃度時(shí)，通常假設(shè)熒光強(qiáng)度與被熒光標(biāo)記的粒子的濃度成比例。然而，該情況下，被熒光標(biāo)記的粒子的濃度充分地降低時(shí)，噪音信號的量相對于由被熒光標(biāo)記的粒子發(fā)出的光的信號量變大(S/N比惡化)，被熒光標(biāo)記的粒子的濃度與光信號量之間的比例關(guān)系瓦解。結(jié)果，確定的濃度值的精度變得惡化。另一方面，掃描分子計(jì)數(shù)法在由被檢測的光信號檢測對應(yīng)于各個(gè)粒子的信號的工序中，從檢測結(jié)果中排除了噪音信號，只將對應(yīng)于各個(gè)粒子的信號進(jìn)行計(jì)數(shù)而計(jì)算濃度。由此，與通過假設(shè)熒光強(qiáng)度與被熒光標(biāo)記的粒子的濃度成比例而檢測濃度時(shí)相比較，能夠檢測至更低的濃度。
[0089]進(jìn)而還有，當(dāng)一個(gè)觀測對象粒子結(jié)合有多個(gè)發(fā)光探針時(shí)，與傳統(tǒng)的假定熒光強(qiáng)度與被熒光標(biāo)記的粒子的濃度成比例而確定濃度的方法相比，掃描分子計(jì)數(shù)法這類對試樣溶液中的粒子逐個(gè)檢測、計(jì)數(shù)的方法的情況下，粒子濃度高一側(cè)的粒子濃度的測量精度提高。在一個(gè)觀測對象粒子結(jié)合有多個(gè)發(fā)光探針的情況下，向試樣溶液添加某一量的發(fā)光探針時(shí)，觀測對象粒子的濃度升高時(shí)，相對而言與粒子結(jié)合的發(fā)光探針的個(gè)數(shù)降低。在此情況下，由于每一個(gè)觀測對象粒子的熒光強(qiáng)度降低，因此，被熒光標(biāo)記的粒子的濃度與光量之間的比例關(guān)系瓦解，所確定的濃度值的精度惡化。另一方面，掃描分子計(jì)數(shù)法在由檢測到的光信號檢測對應(yīng)于各個(gè)粒子的信號的工序中，每個(gè)粒子的熒光強(qiáng)度的降低的影響少，由粒子數(shù)計(jì)算濃度。因此，與通過假設(shè)熒光強(qiáng)度與被熒光標(biāo)記的粒子的濃度成比例而檢測濃度時(shí)相比較，能夠檢測至更高的濃度。
[0090]<通過掃描分子計(jì)數(shù)法的試樣溶液的光強(qiáng)度的測定>
[0091]就掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析中的光強(qiáng)度的測定而言，除了在檢測中驅(qū)動鏡轉(zhuǎn)向器17，在試樣溶液內(nèi)移動光檢測區(qū)域的位置(試樣溶液內(nèi)部的掃描)以外，可以以與FCS或FIDA中的光強(qiáng)度檢測工序相同的方式實(shí)施光強(qiáng)度檢測。在操作處理中，典型地，在微孔板9的孔10中注入試樣溶液而載置于顯微鏡的平臺上之后，使用者對計(jì)算機(jī)18輸入測定開始的指示。接著，計(jì)算機(jī)18根據(jù)存儲裝置(沒有圖示)存儲的程序(將用于在試樣溶液內(nèi)移動光檢測區(qū)域的位置的光路進(jìn)行改變的次序、和在光檢測區(qū)域的位置的移動中檢測來自光檢測區(qū)域的光的次序)，開始試樣溶液內(nèi)光檢測區(qū)域中的激發(fā)光的照射以及光強(qiáng)度的測量。該測量中，在根據(jù)計(jì)算機(jī)18的程序的處理操作的控制下，鏡偏向器17驅(qū)動鏡7(檢電鏡)，在孔10內(nèi)進(jìn)行光檢測區(qū)域的位置的移動。與此同時(shí)，光檢測器16將逐次檢測到的光轉(zhuǎn)換為電信號，傳送給計(jì)算機(jī)18。計(jì)算 機(jī)18以任意方式由送達(dá)的光信號生成按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)并保存。需要說明的是，典型地光檢測器16為能夠檢測到單光子到達(dá)的超高靈敏度光檢測器。由此，光的檢測是以如下方式進(jìn)行的光子計(jì)數(shù):在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，間隔規(guī)定的單位時(shí)間(ΒΙΝ--ΜΕ)如每10 μ秒逐次地測量到達(dá)光檢測器的光子的個(gè)數(shù)，按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度的數(shù)據(jù)可以為按照時(shí)間順序的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。
[0092]光強(qiáng)度測量中的光檢測區(qū)域的位置移動速度可以是任意的，可以為按照適合例如實(shí)驗(yàn)或分析目的的方式設(shè)定的規(guī)定速度。當(dāng)根據(jù)所檢測到的觀測對象粒子的個(gè)數(shù)獲得與其數(shù)密度或濃度相關(guān)的信息時(shí)，光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域的大小或體積是必需的。因此，以移動距離受掌握的方式進(jìn)行光檢測區(qū)域的位置移動。需要說明的是，測量中的經(jīng)過時(shí)間與光檢測區(qū)域的位置的移動距離成比例關(guān)系的方式，能夠容易地解釋測定結(jié)果，因此，移動速度基本上優(yōu)選為恒定速度，但并非僅限于此。
[0093]此外，為了由測量的按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)逐個(gè)檢測觀測對象粒子，或以良好的精度定量實(shí)施觀測對象粒子數(shù)的計(jì)數(shù)，優(yōu)選將光檢測區(qū)域的位置的移動速度設(shè)定為比觀測對象粒子(更嚴(yán)密地，粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或者與粒子結(jié)合后分解而游離的發(fā)光探針、本實(shí)施方式中為熒光粒子)的隨機(jī)運(yùn)動即布朗運(yùn)動導(dǎo)致的移動速度更快的值。掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)的觀測對象粒子是分散或溶解在溶液中的自由地隨機(jī)運(yùn)動的粒子，由于布朗運(yùn)動，位置伴隨著時(shí)間而移動。因此，光檢測區(qū)域的位置的移動速度比粒子的布朗運(yùn)動導(dǎo)致的移動慢時(shí)，如圖3Α示意地描述，粒子在區(qū)域內(nèi)隨機(jī)地移動。由此，光強(qiáng)度如圖3Β所示隨機(jī)地變化(如已知，光檢測區(qū)域的激發(fā)光強(qiáng)度以區(qū)域的中心為頂點(diǎn)向外側(cè)降低。)，難以確定對應(yīng)于各個(gè)觀測對象粒子的顯著的光強(qiáng)度的變化。
[0094]此處，將光檢測區(qū)域的位置的移動速度優(yōu)選設(shè)定為快于粒子的布朗運(yùn)動導(dǎo)致的平均的移動速度(擴(kuò)散移動速度)，從而如圖4Α所示使粒子略直線地橫穿光檢測區(qū)域。因此，按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，如圖4Β例示，對應(yīng)于各個(gè)粒子的光強(qiáng)度變化的分布圖大致一致，能夠容易地確定各個(gè)觀測對象粒子與光強(qiáng)度的對應(yīng)。粒子略直線地通過光檢測區(qū)域的情況下，光強(qiáng)度變化的曲線與激發(fā)光強(qiáng)度分布幾乎相同。
[0095]具體而言，由于布朗運(yùn)動，具有擴(kuò)散系數(shù)D的觀測對象粒子(更嚴(yán)密的是，粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體，或與粒子結(jié)合后再分解、游離的發(fā)光探針)通過半徑Wo的光檢測區(qū)域(共焦體積)時(shí)所需的時(shí)間At是由均方位移的關(guān)系式如下所示。
[0096](2Wo)2 = 6D.At...(I)
[0097]根據(jù)
[0098]At = (2ffo)2/6D— (2) [0099]觀測對象粒子通過布朗運(yùn)動移動的速度(擴(kuò)散移動速度)Vdif大約如下所示。
[0100]Vdif = 2ffo/ At = 3D/Wo…(3)
[0101]此處，光檢測區(qū)域的位置的移動速度可以參考前述Vdif而設(shè)定為比之更快的值。例如，假定觀測對象粒子的擴(kuò)散系數(shù)為D = 2.0X10-V/S左右的情況下，當(dāng)設(shè)定Wo為0.62 μ m左右時(shí)，則Vdif為1.0X 10_3m/s。因此，光檢測區(qū)域的位置的移動速度設(shè)定為其大約10倍的15mm/s即可。此外，當(dāng)觀測對象粒子的擴(kuò)散系數(shù)未知時(shí)，為了找到使在光檢測區(qū)域的位置移動速度的各種設(shè)定下的光強(qiáng)度變化曲線成為預(yù)期曲線(典型的是與激發(fā)光強(qiáng)度分布幾乎相同)的條件，可以重復(fù)進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)，確定適當(dāng)?shù)墓鈾z測區(qū)域的位置的移動速度。
[0102]<通過掃描分子計(jì)數(shù)法的光強(qiáng)度的分析>
[0103]經(jīng)上述處理獲得試樣溶液的按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)時(shí)，可以在計(jì)算機(jī)18中，根據(jù)存儲在存儲裝置中的程序進(jìn)行處理(由檢測到的光逐個(gè)檢測來自各個(gè)發(fā)光粒子的光信號的次序)，由此實(shí)施如下所述的光強(qiáng)度的分析。
[0104](i) 一個(gè)觀測對象粒子的檢測
[0105]在按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，當(dāng)一個(gè)觀測對象粒子通過光檢測區(qū)域時(shí)的軌跡是如圖4A所示幾乎直線狀時(shí)，與該粒子相對應(yīng)的光強(qiáng)度變化如圖6A示意性地描述，具有反映(由光學(xué)系統(tǒng)確定的)光檢測區(qū)域的光強(qiáng)度分布的曲線(通常略呈鐘形)。因此，觀測對象粒子的檢測的手法之一中，對于光強(qiáng)度設(shè)定閾值Ιο，超過該閾值的光強(qiáng)度持續(xù)的時(shí)間寬度Λ τ在規(guī)定的范圍時(shí)，判定為該光強(qiáng)度的分布圖與一個(gè)粒子通過光檢測區(qū)域相對應(yīng)，可以視為檢測到一個(gè)觀測對象粒子。針對光強(qiáng)度的閾值1以及針對時(shí)間寬度△ τ的規(guī)定的范圍是根據(jù)觀測對象粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體(或者與粒子結(jié)合后再分解而游離的發(fā)光探針)所發(fā)出的光的強(qiáng)度而預(yù)想的曲線確定的；所述觀測對象粒子相對于光檢測區(qū)域以規(guī)定的速度相對地移動。其具體的值可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)任意地設(shè)定，也可以根據(jù)觀測對象粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體(或者與粒子結(jié)合后分解而游離的發(fā)光探針)的特性而選擇確定。
[0106]此外，作為觀測對象粒子的檢測的其他方法，光檢測區(qū)域的光強(qiáng)度分布假定為高斯分布:
[0107]I=A- exp(-2t2/a2)...⑷時(shí)，對顯著的光強(qiáng)度曲線(可以明確判斷為非背景的曲線)，根據(jù)式(4)擬合計(jì)算的強(qiáng)度A和寬度a落入規(guī)定范圍內(nèi)時(shí)，該光強(qiáng)度曲線可判斷為對應(yīng)一個(gè)觀測對象粒子通過了光檢測區(qū)域，可以視為檢測到一個(gè)觀測對象粒子。當(dāng)強(qiáng)度A和寬度a落在規(guī)定范圍之外時(shí)，可以在分析中作為噪音或異物而無視。
[0108](ii)觀測對象粒子的計(jì)數(shù)
[0109]觀測對象粒子的計(jì)數(shù)可以如下進(jìn)行:通過任意方法計(jì)數(shù)通過上述觀測對象粒子的檢測方法檢測到的粒子的個(gè)數(shù)。然而，當(dāng)粒子的個(gè)數(shù)較多時(shí)，也可以通過例如圖5和圖6B所示例的處理來進(jìn)行。[0110]參照圖5和圖6B，根據(jù)按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度(光子計(jì)數(shù))數(shù)據(jù)計(jì)數(shù)粒子數(shù)的方法的一個(gè)例子為上述說明的光強(qiáng)度的測定。即，用光檢測區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)和進(jìn)行光子計(jì)數(shù)，獲得按照時(shí)間順序的光信號數(shù)據(jù)(光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù))后(步驟100)。對該按照時(shí)間順序的光信號數(shù)據(jù)(圖6B最上部分“檢測結(jié)果(未處理)”)，進(jìn)行SMOOTHING (平滑化)處理(步驟110，圖6B中上部分“SMOOTHING”)。粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針發(fā)出的光是概率地發(fā)出的，所以在微小的時(shí)間內(nèi)存在數(shù)據(jù)值的欠缺。因此，通過所述平滑化處理，可以無視如前述的數(shù)據(jù)值的欠缺。平滑化處理可以例如通過移動平均法而進(jìn)行。需要說明的是，可以根據(jù)獲得光信號數(shù)據(jù)時(shí)的光檢測區(qū)域的位置移動速度(掃描速度)、BIN TIME，適當(dāng)設(shè)定實(shí)施平滑化處理時(shí)的參數(shù)，例如，在移動平均法中一次取平均的數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)或移動平均的次數(shù)等。
[0111]然后，為了檢測在平滑化處理后的按照時(shí)間順序的光信號數(shù)據(jù)中存在顯著信號的時(shí)間區(qū)域(峰存在區(qū)域)，對平滑化處理后的按照時(shí)間順序的光信號數(shù)據(jù)對時(shí)間進(jìn)行一階微分值運(yùn)算(步驟120)。按照時(shí)間順序的光信號數(shù)據(jù)的時(shí)間微分值，如圖6B中下部分的“時(shí)間微分”所示，信號值變化時(shí)間點(diǎn)處的值的變化變大，因此通過參考所述時(shí)間微分值可以有利地確定顯著的信號(峰信號)的起點(diǎn)和終點(diǎn)。
[0112]之后，在按照時(shí)間順序的光信號數(shù)據(jù)中，逐次檢測顯著的信號(峰信號)，判斷檢測到的峰信號是否是與觀測對象粒子相對應(yīng)的信號。
[0113]具體而言，首先，在按照時(shí)間順序的光信號數(shù)據(jù)的按照時(shí)間順序的時(shí)間微分值數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，逐次地參照時(shí)間微分值，搜索、確定一個(gè)峰信號的始點(diǎn)和終點(diǎn)，從而確定峰存在區(qū)域(步驟130)。一旦確定了一個(gè)峰存在區(qū)域，就對該峰存在區(qū)域中的平滑化的按照時(shí)間順序的光信號數(shù)據(jù)進(jìn)行鐘形函數(shù)擬合(圖6B下部分的“鐘形函數(shù)擬合”)。由此，計(jì)算鐘形函數(shù)的峰強(qiáng)度Imax、峰寬度(半高全寬(full width half maximum))W、擬合中的(最小二乘法的)相關(guān)系數(shù)等參數(shù)(步驟140)。需要說明的是，擬合的鐘形函數(shù)典型的是高斯函數(shù)，也可以是洛倫茲型函數(shù)。由此，判斷計(jì)算的鐘形函數(shù)的參數(shù)是否落在一個(gè)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針通過光檢測區(qū)域時(shí)檢測到的光信號所描述的鐘形曲線參數(shù)的規(guī)定范圍內(nèi)，即，峰強(qiáng)度、峰寬度、相關(guān)系數(shù)是否分別落在規(guī)定范圍內(nèi)等(步驟150)。這樣，如圖7左側(cè)所示，計(jì)算的鐘形函數(shù)的參數(shù)被判斷為落在與一個(gè)粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體或者與發(fā)光探針對應(yīng)的光信號規(guī)定的范圍內(nèi)時(shí)，則該信號判定為與一個(gè)觀測對象粒子對應(yīng)的信號。由此，判斷為檢測到一個(gè)觀測對象粒子，計(jì)數(shù)為一個(gè)粒子(粒子數(shù)的計(jì)數(shù)增加。工序160)。另一方面，如圖7右側(cè)所示，將計(jì)算的鐘形函數(shù)的參數(shù)沒有在預(yù)定范圍內(nèi)的峰信號作為噪音而無視。
[0114]上述的步驟130?160的處理中的峰信號的搜索和判定可以在按照時(shí)間順序的光信號數(shù)據(jù)的整個(gè)領(lǐng)域內(nèi)重復(fù)地進(jìn)行，每檢測到一個(gè)觀測對象粒子，則作為粒子而計(jì)數(shù)。因此，在結(jié)束對按照時(shí)間順序的光信號數(shù)據(jù)全部區(qū)域的峰信號搜索后(步驟170)，將所獲得的粒子計(jì)數(shù)值作為在按照時(shí)間順序的光信號數(shù)據(jù)中檢測到的觀測對象粒子的個(gè)數(shù)。
[0115](iii)觀測對象粒子的數(shù)密度或濃度的確定
[0116]進(jìn)行了觀測對象粒子的計(jì)數(shù)后，使用在獲得按照時(shí)間順序的光信號數(shù)據(jù)的過程中光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域的總體積，確定觀測對象粒子的數(shù)密度或濃度。然而，光檢測區(qū)域的實(shí)際體積依賴于激發(fā)光或檢測光的波長、透鏡的開口數(shù)、光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)整狀態(tài)而改變，所以由設(shè)計(jì)值計(jì)算通常是困難的。因此，計(jì)算光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域的總體積也不簡單。在本文中，典型的是，可以在與所要檢查的試樣溶液的測定相同的條件下，對已知粒子濃度的溶液(參照溶液)進(jìn)行上文說明的光強(qiáng)度測定、粒子的檢測和計(jì)數(shù)，根據(jù)檢測到的粒子的個(gè)數(shù)和參照溶液的粒子的濃度，確定光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域的總體積，即確定觀測對象粒子的檢測數(shù)和濃度之間的關(guān)系。
[0117]作為參照溶液的粒子，可以優(yōu)選為與觀測對象粒子所形成的粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體(或與觀測對象粒子結(jié)合后再游離的發(fā)光探針)具有相同發(fā)光特性的發(fā)光標(biāo)記(熒光色素等)。具體而言，例如，對于粒子濃度為C的參照溶液，其粒子的檢測數(shù)為N時(shí)，光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域總體積Vt則根據(jù)以下的式子求出。
[0118]Vt = N/C— (5)
[0119]另外，準(zhǔn)備多個(gè)不同濃度的溶液作為參照溶液，分別對其實(shí)施測定，將計(jì)算的Vt的平均值作為光檢測區(qū)域所通過區(qū)域的總體積Vt而采用即可。因此，一旦獲得Vt值，粒子的計(jì)數(shù)結(jié)果為η的試樣溶液的粒子的數(shù)密度c就根據(jù)以下的式子求出。
[0120]c = n/Vt…(6)，需要說明的是，可以不通過上述方法，而利用任意方法例如FCS、FIDA等得到光檢測區(qū)域的體積、光檢測區(qū)域所通過區(qū)域的總體積。此外，本實(shí)施方式的光分析裝置也可以如下構(gòu)成，對于規(guī)定的光檢測區(qū)域的移動模式，將各種標(biāo)準(zhǔn)粒子的濃度C和粒子的個(gè)數(shù)N之間的關(guān)系(式(5))的信息預(yù)先存儲在計(jì)算機(jī)18的存儲裝置中，裝置的使用者在實(shí)施光分析時(shí)可以適當(dāng)利用存儲的關(guān)系信息。
[0121]<熒光粒子的檢測方法>
[0122]本實(shí)施方式的熒光粒子的檢測方法為檢測試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動的熒光粒子的方法，在促進(jìn)熒光粒子由三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)的存在下，通過掃描分子計(jì)數(shù)法對熒光粒子進(jìn)行計(jì)數(shù)而檢測。掃描分子計(jì)數(shù)法為能夠在分子離散的狀況下測定每一粒發(fā)光粒子的測定方法，所以對于PM級以下的濃度比較低的發(fā)光粒子也能夠進(jìn)行測定。因此，通過本實(shí)施方式的熒光粒子的檢測方法，即使當(dāng)試樣溶液中的解析對象的目標(biāo)粒子的濃度非常低時(shí)，也能夠高靈敏度地計(jì)數(shù)熒光粒子。進(jìn)而，本實(shí)施方式的熒光粒子的檢測方法在促進(jìn)由三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)(三重激發(fā)態(tài)猝滅劑)的存在下進(jìn)行通過掃描分子計(jì)數(shù)法的測定，由此能夠非常高靈敏度地檢測熒光粒子。
[0123]對處于基態(tài)的分子照射光時(shí)，成為單重激發(fā)狀態(tài)，之后再恢復(fù)至基態(tài)。由單重激發(fā)狀態(tài)恢復(fù)至基態(tài)的路徑有2個(gè)。一個(gè)為:由單重激發(fā)狀態(tài)直接恢復(fù)至基態(tài)的路徑，此時(shí)發(fā)出的光為熒光。剩下的一個(gè)為:由單重激發(fā)狀態(tài)通過三重激發(fā)態(tài)恢復(fù)至基態(tài)的路徑，通過前述路徑恢復(fù)至基態(tài)的分子不能發(fā)出熒光。已知，熒光的壽命在多個(gè)分子中為納秒數(shù)量級。另一方面，由單重激發(fā)狀態(tài)通過三重激發(fā)態(tài)恢復(fù)至基態(tài)的(不產(chǎn)生熒光)路徑通常需要微秒數(shù)量級以上。
[0124]即，從熒光發(fā)光的觀點(diǎn)出發(fā)，被激發(fā)至單重激發(fā)狀態(tài)的分子中的一部分通過三重激發(fā)態(tài)恢復(fù)至基態(tài)，由此產(chǎn)生浪費(fèi)。
[0125]本實(shí)施方式中，根據(jù)單重激發(fā)狀態(tài)的壽命和三重激發(fā)態(tài)的壽命的長度不同，相比于與單重激發(fā)狀態(tài)的分子，三重激發(fā)態(tài)猝滅劑與三重激發(fā)態(tài)的分子更高頻地碰撞而使熒光亮度提高。具體而言，通過在三重激發(fā)態(tài)猝滅劑的存在下進(jìn)行利用掃描分子計(jì)數(shù)法的測定，試樣溶液中的處于三重激發(fā)態(tài)的熒光粒子通過三重激發(fā)態(tài)猝滅劑恢復(fù)至基態(tài)。恢復(fù)至基態(tài)的熒光粒子通過光照射再次被激發(fā)成單重激發(fā)狀態(tài)。即，通過迅速地消除不產(chǎn)生熒光的三重激發(fā)態(tài)而提高熒光亮度，結(jié)果能夠更高靈敏度地檢測熒光粒子。
[0126]作為本實(shí)施方式中使用的三重激發(fā)態(tài)猝滅劑，只要是具有使處于三重激發(fā)態(tài)的分子恢復(fù)至基態(tài)作用的物質(zhì)，就沒有特別地限定。作為三重激發(fā)態(tài)猝滅劑，可以考慮熒光粒子的種類、激發(fā)光的波長、熒光的波長等從公知的三重激發(fā)態(tài)猝滅劑中適宜選擇而使用。作為三重激發(fā)態(tài)粹滅劑，可列舉出例如:碘化鉀(Potassium 1dide、KI)、半胱胺(2-aminoethanethiol)、環(huán)辛四烯(Cyclo-octatetraene)等。本實(shí)施方式中，優(yōu)選使用碘化鉀或半胱胺。需要說明的是，三重激發(fā)態(tài)猝滅劑可以僅使用一種，也可以組合使用兩種以上。
[0127]例如，熒光粒子的檢測中，檢測熒光波長包含510nm?560nm至少一部分的情況下，優(yōu)選使用選自碘化鉀和半胱胺的一種以上作為三重激發(fā)態(tài)猝滅劑。在熒光粒子的檢測中，檢測突光波長包含510nm?620nm的至少一部分的情況下,優(yōu)選使用半胱胺作為三重激發(fā)態(tài)猝滅劑。作為熒光波長包含510nm?560nm的至少一部分的熒光粒子，可列舉出例如:Rhodamine Green (注冊商標(biāo))、Alexa Fluor (注冊商標(biāo))488、fluorescein、FITC、5-carboxyfluorescein (5-FAM)、Cy2 (注冊商標(biāo))等突光物質(zhì)、以及結(jié)合有這些突光物質(zhì)的粒子等。作為熒光波長包含560nm?620nm的至少一部分的熒光粒子，可以列舉例如 TAMRA (注冊商標(biāo))、Rhodamine> Cy3 (注冊商標(biāo))、Alexa Fluor (注冊商標(biāo))546、AlexaFluor (注冊商標(biāo))555等熒光物質(zhì)、以及結(jié)合有這些熒光物質(zhì)的粒子等。
[0128]具體而言，本實(shí)施方式的目標(biāo)粒子的定量方法具有下述工序(a)?(b)。
[0129](a)調(diào)制包含熒光粒子和促進(jìn)前述熒光粒子從三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)的試樣溶液的工序；
[0130](b)算出前述工序(a)中調(diào)制的試樣溶液中存在的熒光粒子的分子數(shù)的工序
[0131]以下，對于每個(gè)工序進(jìn)行說明。
[0132]本實(shí)施方式中，“在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動的粒子”是指在試樣溶液中分散或溶解的原子、分子或者它們的聚集體等粒子(可以為發(fā)光的或不發(fā)光的的任一者。)，是指非固定于基板等而在溶液中自由地進(jìn)行布朗運(yùn)動的粒子。
[0133]作為本實(shí)施方式的熒光粒子的檢測方法的檢測對象的熒光粒子，只要是通過放射特定波長的光而發(fā)出熒光的物質(zhì)就沒有特別地限定，可列舉出:熒光色素、量子點(diǎn)等熒光物質(zhì)等。另外，本實(shí)施方式的熒光粒子的檢測方法還可以通過使用熒光探針而檢測非熒光物質(zhì)。具體而言，使用如下熒光探針:具有與作為檢測對象的目標(biāo)粒子(非熒光物質(zhì))特異地或非特異地結(jié)合或吸附的部位，并且在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下發(fā)出熒光。向包含目標(biāo)粒子的試樣溶液中添加熒光探針而使兩者結(jié)合。與形成的目標(biāo)粒子結(jié)合的熒光探針為熒光粒子，能夠通過本實(shí)施方式的熒光粒子的檢測方法進(jìn)行檢測。
[0134]目標(biāo)粒子為試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動的粒子，可列舉出例如:蛋白質(zhì)、肽、核酸、核酸類似物質(zhì)、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚集體等生物分子、病毒、細(xì)胞等粒子狀的生物學(xué)的對象物或非生物學(xué)的粒子(例如:原子、分子、膠束、金屬膠體等)等。核酸可以為DNA，也可以為RNA，也可以為cDNA這樣的人工擴(kuò)增的核酸。核酸類似物質(zhì)可列舉DNA或RNA這類天然類型核苷酸(天然存在的核苷酸)的側(cè)鏈等被氨基等官能團(tuán)修飾的物質(zhì)、用蛋白質(zhì)或低分子化合物等標(biāo)記的物質(zhì)等。更具體而言，可列舉出例如:橋式核酸(BNA, Bridgednucleic acid)、天然型核苷酸的4’位氧原子被硫原子置換的核苷酸、天然型核糖核苷酸的2’位輕基被甲氧基取代的核苷酸、己糖醇核酸(HNA, Hexitol Nucleic Acid)、肽核酸(PNA)
坐寸ο
[0135]另外，作為用于與目標(biāo)粒子結(jié)合的熒光探針，優(yōu)選為在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)和單獨(dú)存在的狀態(tài)下發(fā)出的光的發(fā)光特性不同的物質(zhì)。在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)以及單獨(dú)存在的狀態(tài)下熒光探針的發(fā)光特性不同是指:在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)以及單獨(dú)存在的狀態(tài)下，特定的波長的光強(qiáng)度不同。使熒光探針單獨(dú)存在的狀態(tài)以及與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下特定波長的光的強(qiáng)度不同(例如，使熒光強(qiáng)度不同)，由此能夠在掃描分子計(jì)數(shù)法中區(qū)別地檢測出兩者。
[0136]例如，目標(biāo)粒子為核酸或核酸類似物質(zhì)的情況下，熒光探針可列舉出:使與目標(biāo)粒子雜交的寡核苷酸結(jié)合熒光物質(zhì)等發(fā)光物質(zhì)而成的物質(zhì)、結(jié)合有熒光物質(zhì)等核酸結(jié)合性蛋白質(zhì)、與核酸結(jié)合的熒光色素分子等。作為前述寡核苷酸，可以為DNA，也可以為RNA，也可以為cDNA這樣的人工擴(kuò)增物質(zhì)?？梢詾榘糠只蛉亢怂犷愃莆镔|(zhì)的物質(zhì)；所述核酸類似物質(zhì)能夠與天然的核酸堿基同樣地形成核苷酸鏈或堿基對。
[0137]另外，目標(biāo)粒子為蛋白質(zhì)的情況下，作為熒光探針，可以使用將目標(biāo)粒子的抗原或抗體、目標(biāo)粒子的配體或受體用熒光物質(zhì)標(biāo)記了的物質(zhì)。需要說明的是，熒光物質(zhì)與核酸、蛋白質(zhì)等目標(biāo)粒子特異或非特異地結(jié)合或吸附的物質(zhì)的結(jié)合可以通過常規(guī)方法進(jìn)行。
[0138]與目標(biāo)粒子結(jié)合的熒光探針也可以為與目標(biāo)粒子非特異地結(jié)合等的物質(zhì)，從目標(biāo)粒子的檢測、定量的精度的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選特異地結(jié)合等的物質(zhì)。需要說明的是，作為與目標(biāo)粒子特異地結(jié)合的熒光探針，只要是與物理或化學(xué)的性質(zhì)與目標(biāo)粒子類似的其他物質(zhì)相比更優(yōu)先與目標(biāo)粒子結(jié)合的物質(zhì)即可，不需要與除了目標(biāo)粒子以外的物質(zhì)完全地不結(jié)合的物質(zhì)。例如，目標(biāo)粒子為核酸的情況下，被作為熒光探針使用的熒光物質(zhì)標(biāo)記的寡核苷酸既可以具有與前述目標(biāo)粒子的堿基序列完全地互補(bǔ)的堿基序列，也可以具有與前述目標(biāo)粒子的堿基序列包含錯配的堿基序列。
[0139]目標(biāo)粒子為蛋白質(zhì)的情況下，與蛋白質(zhì)結(jié)合且改變周圍環(huán)境時(shí)熒光強(qiáng)度、熒光波長變化的色素(例如，疏水性探針ANS、MANS、TNS這類的熒光色素)可以作為熒光探針使用。另外，熒光探針自身也可以不發(fā)光。例如，目標(biāo)粒子為核酸或核酸類似物質(zhì)的情況下，使用與前述目標(biāo)粒子雜交的寡核苷酸作為熒光探針，即便在試樣溶液中與前述熒光探針一起添加與雙鏈結(jié)構(gòu)特異地結(jié)合的熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)，也能夠在發(fā)光探針單獨(dú)存在的狀態(tài)以及在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下使發(fā)光特性不同。作為與雙鏈結(jié)構(gòu)特異地結(jié)合的熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)，可列舉出熒光性嵌入劑或結(jié)合了熒光物質(zhì)的溝結(jié)合劑等。
[0140]其他的，可以使用例如:由至少兩個(gè)構(gòu)成要素形成的、通過與目標(biāo)粒子結(jié)合而使前述的至少兩個(gè)構(gòu)成要素的相互位置變化而發(fā)出熒光的物質(zhì)作為熒光探針。作為這樣的物質(zhì)的例子，可列舉出:與某粒子結(jié)合時(shí)結(jié)構(gòu)變化而發(fā)出強(qiáng)的熒光的熒光性蛋白質(zhì)、或者與某粒子結(jié)合時(shí)聚集而形成熒光性金屬絡(luò)合物的分子(絡(luò)合物的配體)。通過所述的構(gòu)成，在所有情況下，單獨(dú)的熒光探針或不與目標(biāo)粒子結(jié)合的熒光探針均幾乎不發(fā)光，或者即便發(fā)光也與目標(biāo)粒子和熒光探針的結(jié)合體的波長不同，所以能夠選擇地檢測由目標(biāo)粒子和熒光探針的結(jié)合體發(fā)出的光。
[0141]另外，通過利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象(FRET)，能夠使試樣溶液中單獨(dú)存在的熒光探針、和與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)的熒光探針的發(fā)光特性不同。例如，作為發(fā)光探針可以使用如下物質(zhì):使在FRET中成為能量供體的熒光物質(zhì)和成為能量受體的物質(zhì)(熒光物質(zhì)、猝滅物質(zhì))按照在熒光探針單獨(dú)存在的狀態(tài)下產(chǎn)生FRET、在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下不產(chǎn)生FRET的方式在與目標(biāo)粒子結(jié)合的物質(zhì)上結(jié)合而形成的物質(zhì)。與目標(biāo)粒子結(jié)合后的熒光探針不再產(chǎn)生FRET，所以由成為能量供體的熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。另外，從單獨(dú)存在的熒光探針中，檢測不到由成為能量供體的熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光，或檢測到的熒光是減弱的。因此，通過檢測由成為能量供體的熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光，能夠與單獨(dú)存在的熒光探針區(qū)別地檢測到與突光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子。
[0142]例如，目標(biāo)粒子為核酸或核酸類似物質(zhì)的情況下，可以優(yōu)選使用分子信標(biāo)探針作為熒光探針；該分子信標(biāo)探針如下形成:使FRET中成為能量供體的熒光物質(zhì)和成為能量受體的物質(zhì)，按照單鏈核酸分子的狀態(tài)下產(chǎn)生FRET、與其他單鏈核酸分子雜交形成締合體的狀態(tài)下不產(chǎn)生FRET的方式，在當(dāng)為單鏈核酸分子的狀態(tài)時(shí)形成分子內(nèi)結(jié)構(gòu)體的寡核苷酸上結(jié)合。本實(shí)施方式中優(yōu)選的是:3’末端側(cè)結(jié)合有成為能量供體的熒光物質(zhì)或成為能量受體的物質(zhì)、5’末端側(cè)結(jié)合有剩余的另一者并且3’末端側(cè)區(qū)域和5’末端側(cè)具有彼此互補(bǔ)的堿基序列，這些堿基序列形成堿基對由此形成分子內(nèi)結(jié)構(gòu)(所謂的莖-環(huán)結(jié)構(gòu))的物質(zhì)。需要說明的是，分子信標(biāo)探針的形成分子內(nèi)堿基對的彼此互補(bǔ)的區(qū)域，可以夾著與目標(biāo)粒子雜交的區(qū)域而存在；3’末端側(cè)的區(qū)域和5’末端側(cè)的區(qū)域既可以為分別包含3’末端或5’末端的區(qū)域，也可以為不包含3’末端或5’末端的區(qū)域。此外，就形成堿基對的區(qū)域的堿基數(shù)或堿基序列而言，為所形成的堿基對的穩(wěn)定性低于與目標(biāo)粒子的締合體的穩(wěn)定性、且在檢測條件下能夠形成堿基對的程度即可。
[0143]另外，使用與雙鏈結(jié)構(gòu)特異地結(jié)合的熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)，即便前述熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)與標(biāo)記了熒光探針的熒光物質(zhì)之間產(chǎn)生FRET，也能夠區(qū)別單獨(dú)存在的熒光探針和與目標(biāo)粒子結(jié)合的熒光探針。即，熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)和標(biāo)記了熒光探針的熒光物質(zhì)中的任一者成為FRET的能量供體，另一者成為前述FRET的能量受體。由單獨(dú)存在的熒光探針，檢測到由標(biāo)記前述熒光探針的熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光。與此相對，與目標(biāo)粒子結(jié)合的熒光探針和熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)結(jié)合，所以由結(jié)合體能夠檢測到由FRET發(fā)出的熒光，結(jié)果能夠與單獨(dú)存在的熒光探針區(qū)別而檢測。
[0144]此外，當(dāng)進(jìn)入熒光探針與目標(biāo)粒子的締合體的堿基對之間的熒光性嵌入劑的量過多時(shí)，檢測自FRET發(fā)出的熒光時(shí)的背景變得過高，存在影響檢測精度的擔(dān)心。因此，優(yōu)選將發(fā)光探針設(shè)計(jì)成在熒光探針與目標(biāo)粒子的締合體中形成雙鏈的區(qū)域?yàn)?00bp以下。
[0145]其他的，本實(shí)施方式中，也可以使用兩種熒光探針。例如，在目標(biāo)粒子為核酸或核酸類似物質(zhì)的情況下，將兩種熒光探針設(shè)計(jì)成相對于目標(biāo)粒子相互鄰接而雜交，將一種熒光探針用在FRET中成為能量供體的熒光物質(zhì)標(biāo)記，將另一種熒光探針用在前述FRET中成為能量受體的物質(zhì)標(biāo)記。該情況下，單獨(dú)存在的熒光探針不產(chǎn)生FRET，而通過與目標(biāo)粒子結(jié)合，前述兩種熒光探針相互接近而產(chǎn)生FRET。因此，通過檢測由于前述FRET而發(fā)出的熒光，能夠檢測出與熒光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子。
[0146]首先，作為工序(a)，調(diào)制包含熒光粒子、和與前述熒光粒子的三重激發(fā)態(tài)猝滅劑進(jìn)行結(jié)合的熒光探針的試樣溶液。具體而言，向適當(dāng)溶劑中添加熒光粒子和三重激發(fā)態(tài)猝滅劑而調(diào)制試樣溶液。該溶劑，只要是不阻礙由熒光粒子發(fā)出的光的檢測、以及不阻礙利用掃描分子計(jì)數(shù)法檢測熒光粒子的溶劑，就沒有特別的限定；可以從前述【技術(shù)領(lǐng)域】中通常使用的緩沖液中適宜選擇而使用。作為該緩沖液，有例如:PBS(磷酸緩沖生理鹽水、pH7.4)等磷酸緩沖液、Tris緩沖液等。
[0147]三重激發(fā)態(tài)猝滅劑可以以用于起到使三重激發(fā)態(tài)恢復(fù)至基態(tài)的作用(以下，猝滅作用)所需的充分濃度添加至試樣溶液中。起到猝滅作用的濃度可以通過實(shí)驗(yàn)求出。具體而言，向包含規(guī)定量的熒光粒子(可以為包含與作為檢測對象的熒光粒子同種的熒光物質(zhì)的粒子。)的測定溶液中，以各種各樣的濃度添加三重激發(fā)態(tài)猝滅劑，檢測各測定溶液中的熒光探針中的處于三重激發(fā)態(tài)的分子的比例。處于三重激發(fā)態(tài)的分子的比例相比于沒有添加三重激發(fā)態(tài)猝滅劑的測定溶液顯著地降低的濃度為通過前述三重激發(fā)態(tài)猝滅劑起到猝滅作用的濃度。處于三重激發(fā)態(tài)的分子的比例通過FCS測定而求出。
[0148]具體而言，使用碘化鉀或半胱胺作為三重激發(fā)態(tài)猝滅劑的情況下，通過掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢測時(shí)的試樣溶液的三重激發(fā)態(tài)猝滅劑的濃度優(yōu)選為0.1mM?20禮，更優(yōu)選為0.3mM?10mM，進(jìn)而優(yōu)選為0.5mM?5mM。組合使用碘化鉀和半胱胺的情況下，優(yōu)選兩者的合計(jì)濃度在上述范圍內(nèi)。
[0149]將非熒光性的目標(biāo)粒子與熒光探針的結(jié)合體制成為熒光粒子作為檢測對象的情況下，可以向包含預(yù)先使目標(biāo)粒子與熒光探針結(jié)合的熒光粒子的溶液中添加三重激發(fā)態(tài)猝滅劑而調(diào)制試樣溶液。另外，也可以在調(diào)制了添加了目標(biāo)粒子、熒光探針和三重激發(fā)態(tài)猝滅劑的試樣溶液之后，在前述試樣溶液中使目標(biāo)粒子和熒光探針結(jié)合而形成熒光粒子。
[0150]只是使目標(biāo)粒子與熒光探針共存于相同的溶液中就能夠使兩者結(jié)合的情況下，調(diào)制試樣溶液之后，只需根據(jù)需要以規(guī)定時(shí)間孵育前述試樣溶液，就能使目標(biāo)粒子與熒光探針在前述試樣溶液中結(jié)合。
[0151]另一方面，目標(biāo)粒子、熒光探針為雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸或者核酸類似物質(zhì)的情況下，優(yōu)選使試樣溶液中的核酸等變性之后使兩者締合。需要說明的是，“使核酸或核酸類似物質(zhì)變性”是指使堿基對解離。例如，使分子信標(biāo)探針中彼此互補(bǔ)的堿基序列所形成的堿基對解離，解開分子內(nèi)結(jié)構(gòu)成為單鏈結(jié)構(gòu)，或使雙鏈核酸分子成為單鏈核酸分子。當(dāng)熒光探針是包含PNA等核酸類似物質(zhì)的寡核苷酸時(shí)，即使目標(biāo)粒子是雙鏈核酸分子，有時(shí)不進(jìn)行特別的變性處理也可以形成包含前述熒光探針和目標(biāo)粒子的締合體。
[0152]作為變性處理，可列舉出:利用高溫處理的變性(熱變性)或利用低鹽濃度處理的變性等。其中，由于對于熒光物質(zhì)的影響比較小且操作簡便而優(yōu)選進(jìn)行熱變性。具體而言，熱變性通過將前述試樣溶液進(jìn)行高溫處理而使前述試樣溶液中的核酸等變性。通常地，DNA在90°C下、RNA在70°C下保溫?cái)?shù)秒至2分鐘左右即可以變性；但根據(jù)目標(biāo)粒子的堿基的長度等進(jìn)行變性的溫度千差萬別，只要能夠變性，就對其溫度沒有限定。另一方面，通過低鹽濃度處理進(jìn)行變性可以是例如利用純水等稀釋，將前述試樣溶液的鹽濃度調(diào)整至足夠低，從而進(jìn)行。
[0153]根據(jù)需要使之變性之后，使前述試樣溶液中的目標(biāo)粒子與熒光探針締合。
[0154]當(dāng)進(jìn)行熱變性時(shí)，在高溫處理后，使前述試樣溶液的溫度降至目標(biāo)粒子能夠與發(fā)光探針特異地雜交的溫度，由此能夠使前述試樣溶液中的兩者適當(dāng)締合。另外，當(dāng)通過低鹽濃度處理進(jìn)行變性時(shí)，通過添加鹽溶液等，使前述試樣溶液的鹽濃度升高至目標(biāo)粒子能夠與熒光探針特異地雜交的濃度，能夠使前述試樣溶液中的兩者適當(dāng)締合。[0155]需要說明的是，可以根據(jù)兩者的締合體的熔解曲線，求出兩條單鏈核酸分子能夠特異地雜交的溫度。例如可以使僅含有兩者的溶液的溫度從高溫向低溫變化，測定前述溶液的吸光度或熒光強(qiáng)度來求出熔解曲線。根據(jù)所獲得的熔解曲線，從變性的兩條單鏈核酸分子開始形成締合體的溫度，至幾乎全部成為締合體的溫度這一范圍內(nèi)的溫度，都可以作為兩者能夠特異地雜交的溫度。也可以用使溶液中的鹽濃度自低濃度向高濃度變化來代替溫度，同樣地確定熔解曲線，能夠求出兩條單鏈核酸分子能夠特異地雜交的濃度。
[0156]通常可以用Tm值(熔解溫度)，代替兩條單鏈核酸分子能夠特異地雜交的溫度。例如，利用普遍使用的引物/探針設(shè)計(jì)軟件等，根據(jù)熒光探針的堿基序列信息，能夠計(jì)算與目標(biāo)粒子雜交的區(qū)域的Tm值(雙鏈DNA的50%解離為單鏈DNA的溫度)。
[0157]此外，為了抑制非特異雜交，在形成締合體時(shí)，優(yōu)選使試樣溶液的溫度較緩慢地下降。例如，使試樣溶液溫度為70°C以上而使核酸分子變性后，可以按0.05°C /秒以上的降溫速度，降低前述試樣溶液的液溫。
[0158]此外，為了抑制非特異地雜交，優(yōu)選預(yù)先在試樣溶液中添加表面活性劑、甲酰胺、二甲亞砜或尿素等。這些化合物可以只添加一種，也可以組合添加2種以上。通過添加這些化合物，在較低溫度環(huán)境下也能夠使非特異的雜交難以發(fā)生。
[0159]之后，作為工序(b)，算出調(diào)制的試樣溶液中存在的熒光粒子的分子數(shù)。具體而言，將包含熒光粒子和三重激發(fā)態(tài)猝滅劑的試樣溶液設(shè)置于前述用于掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析裝置，通過前述的手法檢測由熒光粒子發(fā)出的光并解析，由此計(jì)數(shù)熒光粒子的個(gè)數(shù)。計(jì)數(shù)的粒子數(shù)為測定試樣中所含的熒光粒子的個(gè)數(shù)。
[0160]實(shí)施例
[0161]接著，以下示出實(shí)施例等，進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明的方式，但本發(fā)明的方式不限于下列實(shí)施例。
[0162][參考例I]
[0163]通過FCS檢測確認(rèn)碘化鉀(KI)具有猝滅作用。
[0164]< Rhodamine Green (注冊商標(biāo))的情況>
[0165]通過FCS檢測確認(rèn)碘化鉀(KI)對于Rhodamine Green(注冊商標(biāo))具有粹滅作用。
[0166]具體而言，調(diào)制試樣溶液，在InM Rhodamine Green (注冊商標(biāo))(AnaSpec公司制)中添加KI以終濃度計(jì)成為0mM、0.03mM、0.3mM、3mM、30mM。對于各試樣溶液，使用能夠測定每一分子的熒光強(qiáng)度和三重激發(fā)態(tài)的比例的單分子熒光測定裝置MF20(01ympUSCorporation)進(jìn)行FCS檢測。FCS檢測條件中，將激發(fā)波長設(shè)為488nm，激光強(qiáng)度設(shè)為lmW，檢測時(shí)間設(shè)為10秒鐘。測定對于各試樣進(jìn)行5次，算出其平均和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0167]將測定結(jié)果不于圖8A和圖8B。圖8A為表不各試樣溶液中的Rhodamine Green分子的三重激發(fā)態(tài)的比例(Frac.Triplet (%))的圖。圖8B為表示各試樣溶液中的RhodamineGreen分子的每一分子的明亮度CPP (Countrate Per Particle)的圖。如圖8A所示,KI濃度為3mM的試樣溶液中，三重激發(fā)態(tài)的比例為最低。由該結(jié)果可以確認(rèn),KI對于RhodamineGreen起到三重激發(fā)態(tài)猝滅劑的作用。另外，KI濃度為3mM的試樣溶液中，與不添加KI的試樣溶液相比較CPP變明亮1.3倍左右(參照圖8B。)。由此，可以確認(rèn)通過三重激發(fā)態(tài)猝滅劑的添加，熒光亮度提高。另一方面，KI濃度為30mM的試樣溶液中，三重激發(fā)態(tài)的比例低于沒有添加KI的試樣溶液但CPP幾乎沒有變化。推測由于以高濃度添加KI，KI與熒光色素接近的頻率提高，所以甚至單重激發(fā)狀態(tài)的Rhodamine Green也恢復(fù)至基態(tài)。
[0168]< Alexa Fluor (注冊商標(biāo))488 的情況>
[0169]通過FCS檢測確認(rèn)碘化鉀(KI)對于Alexa Fluor (注冊商標(biāo))488具有猝滅作用。
[0170]具體而言，使用Alexa Fluor (注冊商標(biāo))488 (Invitrogen公司制)代替RhodamineGreen (注冊商標(biāo))(AnaSpec公司制)，除此以外，與Rhodamine Green (注冊商標(biāo))的情況同樣地,對于添加了 KI以終濃度計(jì)為0mM、0.03mM、0.3mM、3mM、30mM的包含Alexa Fluor (注冊商標(biāo))488的試樣溶液，進(jìn)行FCS檢測。
[0171]將測定結(jié)果示于圖9A和圖9B。圖9A為表示各試樣溶液中的Alexa Fluor488分子的三重激發(fā)態(tài)的比例的圖。圖9B為表示各試樣溶液中的Alexa Fluor488分子的每一分子的明亮度的圖。如圖9A所示，KI濃度為0.3mM和3mM的試樣溶液中，三重激發(fā)態(tài)的比例與沒有添加KI的試樣溶液相比較明顯降低。由該結(jié)果可以確認(rèn)，KI對于Alexa Fluor488起到三重激發(fā)態(tài)猝滅劑的作用。另外，三重激發(fā)態(tài)的比例最低的KI濃度為3mM的試樣溶液中，與沒有添加KI的試樣溶液相比較CPP成為1.8倍左右，產(chǎn)生非常大的效果(參照圖9B ο )。
[0172]由這些結(jié)果可以確認(rèn)，KI對于各種各樣的熒光物質(zhì)具有猝滅作用，具有熒光亮度提聞效果。
[0173][參考例2]
[0174]通過FCS檢測確認(rèn)半胱胺具有猝滅作用。
[0175]< Alexa Fluor (注冊商標(biāo))488 的情況>
[0176]通過FCS檢測確認(rèn)半胱胺對于Alexa Fluor (注冊商標(biāo))488具有粹滅作用。
[0177]具體而言，調(diào)制試樣溶液，向InM Alexa Fluor (注冊商標(biāo))488 (Invitrogen公司制)中添加半胱胺(Sigma Corporation制)以終濃度計(jì)為0mM、0.3mM、3mM、30mM。對于各試樣溶液，使用單分子熒光測定裝置MF20 (Olympus Corporation)進(jìn)行FCS檢測。FCS檢測條件中，將激發(fā)波長設(shè)為488nm，激光強(qiáng)度設(shè)為lmW，檢測時(shí)間設(shè)為10秒鐘。測定對于各試樣進(jìn)行5次，算出其平均。
[0178]將測定結(jié)果示于圖1OA和圖10B。圖1OA為表示各試樣溶液中的Alexa Fluor488分子的三重激發(fā)態(tài)的比例的圖。圖1OB為表示各試樣溶液中的Alexa Fluor488分子的每一分子的明亮度的圖。如圖1OA所示，半胱胺濃度為3mM的試樣溶液中，三重激發(fā)態(tài)的比例最低。由該結(jié)果可知，半胱胺對于Alexa Fluor488起到三重激發(fā)態(tài)粹滅劑的作用。另外，半胱胺濃度為3mM的試樣溶液中，與沒有添加半胱胺的試樣溶液相比較，CPP變明亮1.5倍左右(參照圖10B。)。由此可以確認(rèn)，通過半胱胺的添加熒光亮度提高。
[0179]< TAMRA (注冊商標(biāo))的情況>
[0180]通過FCS檢測確認(rèn)半胱胺對于TAMRA (注冊商標(biāo))具有猝滅作用。
[0181]具體而言，調(diào)制試樣溶液，向InM TAMRA (注冊商標(biāo))(AnaSpec公司制)中添加半胱胺(Sigma Corporation制)以終濃度計(jì)為0mM、0.3mM、3mM、30mM。對于各試樣溶液，使用單分子熒光測定裝置MF20 (Olympus Corporation)進(jìn)行FCS檢測。FCS檢測條件中，將激發(fā)波長設(shè)為543nm，激光強(qiáng)度設(shè)為0.5mW，檢測時(shí)間設(shè)為10秒鐘。測定對于各試樣進(jìn)行5次，算出其平均。
[0182]將測定結(jié)果示于圖1lA和圖11B。圖1lA為表示各試樣溶液中的TAMRA分子的三重激發(fā)態(tài)的比例的圖。圖1lB為表示各試樣溶液中的TAMRA分子的每一分子的明亮度的圖。如圖1lA所示，半胱胺濃度為3mM的試樣溶液中，三重激發(fā)態(tài)的比例最低。由該結(jié)果可確認(rèn)，半胱胺對于TAMRA起到三重激發(fā)態(tài)猝滅劑的作用。另外，半胱胺濃度為3mM的試樣溶液中，與沒有添加半胱胺的試樣溶液相比較，CPP變明亮1.4倍左右(參照圖11B。)。由此可以確認(rèn)，通過半胱胺的添加，熒光亮度提高。
[0183]由這些結(jié)果可以確認(rèn)，半胱胺對于各種熒光物質(zhì)具有猝滅作用，具有熒光亮度的提聞效果。
[0184][實(shí)施例1]
[0185]使用KI作為三重激發(fā)態(tài)猝滅劑，通過掃描分子計(jì)數(shù)法檢測熒光粒子。
[0186]首先，調(diào)制試樣溶液，向IOpM Alexa Fluor (注冊商標(biāo))488 (Invitrogen公司制)中添加KI以終濃度計(jì)為0mM、0.lmM、0.3mM、lmM、3mM、10mM、30mM。對于各試樣溶液，使用具備共聚焦熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)的單分子熒光測定裝置MF20 (OlympusCorporation)，通過掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢測，獲得按照時(shí)間順序的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。此時(shí)，激發(fā)光使用488nm的激光以ImW進(jìn)行照射，檢測光波長使用帶通濾波器，設(shè)為510nm~560nm。將試樣溶液中的光檢測區(qū)域的位置的移動速度設(shè)為15mm/秒，BIN --ΜΕ設(shè)為IOy秒，測定時(shí)間設(shè)為2秒鐘。另外，測定對于各試樣進(jìn)行5次，算出其平均和標(biāo)準(zhǔn)偏差。光強(qiáng)度測定后，對于各試樣溶液，由獲得的按照時(shí)間順序的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)按照時(shí)間順序的數(shù)據(jù)中檢測到的光信號。在數(shù)據(jù)的利用移動平均法的平滑化中，將一次平均的數(shù)據(jù)點(diǎn)設(shè)為9個(gè)，重復(fù)5次移動平均處理。另外，在擬合中，對于按照時(shí)間順序的數(shù)據(jù)通過最小二乘法擬合出高斯函數(shù)，確定(高斯函數(shù)中的)峰強(qiáng)度、峰寬(半高全寬)、相關(guān)系數(shù)。進(jìn)而，峰的判定處理中，只將滿足下述的條件:[0187]20 μ 秒<峰寬< 400 μ 秒、
[0188]峰強(qiáng)度> I (光子/10 μ秒)、
[0189]相關(guān)系數(shù)>0.95、
[0190]的峰信號判定為與觀測對象分子對應(yīng)的光信號。另一方面，不滿足上述的條件的峰信號作為噪音而無視，將判定為與觀測對象分子對應(yīng)的光信號的信號的個(gè)數(shù)作為“峰數(shù)”而計(jì)數(shù)。
[0191]圖12為表示將各試樣溶液的峰數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的結(jié)果的圖。結(jié)果確認(rèn)，KI濃度為
0.1mM~IOmM時(shí)，相比于沒有添加KI的試樣溶液峰數(shù)增大，熒光粒子的檢測能力提高。更詳細(xì)而言，KI濃度為0.1mM~3mM時(shí)，伴隨著KI的添加量變多，計(jì)數(shù)到的峰數(shù)也變多。峰數(shù)最多的KI濃度為3mM的試樣溶液中，與沒有添加KI的試樣溶液相比較，增加30%以上?？梢哉J(rèn)為這是因?yàn)?，由KI導(dǎo)致熒光亮度變高的Alexa Fluor488被重新檢測到。
[0192]由這些結(jié)果可知，通過在KI存在下進(jìn)行利用掃描分子計(jì)數(shù)法的熒光粒子的計(jì)數(shù)，能夠提高熒光粒子的檢測能力、更高靈敏度地檢測熒光粒子。
[0193][實(shí)施例2]
[0194]使用半胱胺作為三重激發(fā)態(tài)猝滅劑，通過掃描分子計(jì)數(shù)法檢測熒光粒子。
[0195]< Alexa Fluor (注冊商標(biāo))488 的情況>
[0196]首先，調(diào)制試樣溶液，向IOpM Alexa Fluor (注冊商標(biāo))488 (Invitrogen公司制)中添加半胱胺(Sigma Corporation 制)以終濃度計(jì)為 0mM、0.lmM、0.3mM、lmM、3mM、10mM、30mM。對于各試樣溶液，與實(shí)施例1同樣地，通過掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢測，獲得按照時(shí)間順序的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)熒光粒子的個(gè)數(shù)。[0197]圖13為表示將各試樣溶液的峰數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的結(jié)果的圖。結(jié)果，半胱胺濃度為
0.3mM~3mM時(shí)，伴隨著半胱胺的添加量變多，計(jì)數(shù)到的峰數(shù)也變多。峰數(shù)最多的半胱胺濃度為3mM的試樣溶液中，與沒有添加半胱胺的試樣溶液相比較增加20%以上。
[0198]< TAMRA (注冊商標(biāo))的情況>
[0199]首先，調(diào)制試樣溶液，向IOpM TAMRA(注冊商標(biāo))(AnaSpec公司制)中添加半胱胺(Sigma Corporation 制)以終濃度計(jì)為 0mM、0.lmM、0.3mM、3mM、10mM、30mM。對于各試樣溶液，激發(fā)光使用543nm的激光以0.5mff進(jìn)行照射，檢測光波長使用帶通濾波器設(shè)為560nm~620nm，除此以外，與實(shí)施例1同樣地，通過掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢測，獲得按照時(shí)間順序的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)熒光粒子的個(gè)數(shù)。
[0200]圖14為表示將各試樣溶液的峰數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的結(jié)果的圖。結(jié)果，半胱胺濃度為
0.3mM~3mM時(shí)，伴隨著半胱胺的添加量變多，計(jì)數(shù)到的峰數(shù)也變多。峰數(shù)最多的半胱胺濃度為3mM的試樣溶液中，與沒有添加半胱胺的試樣溶液相比較增加10%以上。
[0201]由這些結(jié)果可知，通過在半胱胺存在下進(jìn)行利用掃描分子計(jì)數(shù)法的熒光粒子的計(jì)數(shù)，能夠提高熒光粒子的檢測能力、更高靈敏度地檢測熒光粒子。
[0202][實(shí)施例3]
[0203]調(diào)查熒光粒子的濃度與三重激發(fā)態(tài)猝滅劑具有猝滅作用的濃度的關(guān)系。具體而言，在熒光粒子的濃度為IpM的情況下和IOOpM的情況下，對于三重激發(fā)態(tài)猝滅劑起到猝滅作用的濃度進(jìn)行了調(diào)查。
[0204]首先，調(diào)制試樣溶液，向IpM或IOOpM Alexa Fluor (注冊商標(biāo))488 (Invitrogen公司制)中添加KI以終濃度計(jì)為0mM、0.lmM、0.3mM、lmM、3mM、10mM、30mM。對各試樣溶液，對于Alexa Fluor488的濃度為IpM的試樣溶液將測定時(shí)間設(shè)為20秒鐘，對于IOOpM的試樣溶液設(shè)為2秒鐘，除此以外，與實(shí)施例1同樣地，通過掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢測，獲得按照時(shí)間順序的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)熒光粒子的個(gè)數(shù)。
[0205]圖15是表示將Alexa Fluor488的濃度為IpM的各試樣溶液的峰數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的結(jié)果的圖；圖16是表示將Alexa Fluor488的濃度為IOOpM的各試樣溶液的峰數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的結(jié)果的圖。Alexa Fluor488的濃度為IpM的試樣溶液和IOOpM的試樣溶液中，均與實(shí)施例1 (Alexa Fluor488的濃度為IOpM的試樣溶液的情況)同樣地，通過添加KI，利用掃描分子計(jì)數(shù)法檢測時(shí)的峰檢測能力(熒光粒子的檢測能力)提高。另外可知，KI濃度為ImM~3mM時(shí)檢測到的峰數(shù)均最多，所以KI具有猝滅作用的濃度不怎么受熒光粒子的濃度影響，向試樣溶液中添加KI以使終濃度成為0.1mM~20mM，能夠更高靈敏度地檢測熒光粒子。
[0206]產(chǎn)業(yè)h的可利用件
[0207]通過本發(fā)明的方式的熒光粒子的檢測方法，能夠通過掃描分子計(jì)數(shù)法非常高靈敏度地檢測試樣溶液中的僅以非常低的濃度存在的目標(biāo)粒子的濃度。因此，本發(fā)明的方式中的熒光粒子的檢測方法能夠利用于臨床被檢體等解析對象物質(zhì)的濃度為微量的試樣的解析、檢查等領(lǐng)域中。
[0208]附圖標(biāo)記說明
[0209]I…光分析裝置(共聚焦顯微鏡)[0210]2…光源
[0211]3…單模光纖
[0212]4…準(zhǔn)直儀透鏡
[0213]5…分色鏡
[0214]6、7、11…反射鏡
[0215]8…物鏡
[0216]9…微孔板
[0217]10…孔(試樣溶液容器)
[0218]12…聚光鏡
[0219]13…小孔
[0220]14…二次濾片
[0221]15…多模光纖
[0222]16…光檢測 器
[0223]17…鏡轉(zhuǎn)向器
[0224]17a…平臺位置變化裝置
[0225]18…計(jì)算機(jī)
【權(quán)利要求】
1.一種在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動的熒光粒子的檢測方法，其包括: (a)調(diào)制包含熒光粒子和促進(jìn)所述熒光粒子從三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)的試樣溶液的工序；和 (b)計(jì)算出所述工序(a)中調(diào)制的試樣溶液中存在的熒光粒子的分子數(shù)的工序，其中， 所述工序(b)中的熒光粒子的分子數(shù)的計(jì)算包括: 使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)，在所述試樣溶液內(nèi)移動所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置的工序； 在所述試樣溶液內(nèi)移動所述光檢測區(qū)域的位置的同時(shí)，通過檢測由所述光檢測區(qū)域中存在的所述熒光粒子發(fā)出的光信號，逐個(gè)檢測所述熒光粒子的工序；和 通過將所述逐個(gè)檢測到的熒光粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)而計(jì)數(shù)所述光檢測區(qū)域的位置的移動期間檢測到的所述熒光粒子的個(gè)數(shù)的工序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光粒子的檢測方法，其中，所述試樣溶液中的所述促進(jìn)由三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)的濃度為0.1mM?20mM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光粒子的檢測方法，其中，所述試樣溶液中的所述促進(jìn)由三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)的濃度為0.3mM?10mM。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光粒子的檢測方法，其中，所述試樣溶液中的所述促進(jìn)由三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)的濃度為0.5mM?5mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1?4的任一項(xiàng)所述的熒光粒子的檢測方法，其中，所述促進(jìn)由三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)為選自碘化鉀和半胱胺的一種以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1?5的任一項(xiàng)所述的熒光粒子的檢測方法，其中，所述移動光檢測區(qū)域的位置的工序包括以規(guī)定的速度移動所述光檢測區(qū)域的位置。
7.根據(jù)權(quán)利要求1?6的任一項(xiàng)所述的熒光粒子的檢測方法，其中，所述移動光檢測區(qū)域的位置的工序包括以比所述熒光粒子的擴(kuò)散移動速度更快的速度移動所述光檢測區(qū)域的位置。
8.根據(jù)權(quán)利要求1?7的任一項(xiàng)所述的熒光粒子的檢測方法，其中，通過檢測來自每個(gè)所述熒光粒子的光信號來逐個(gè)檢測所述熒光粒子的工序包括根據(jù)檢測到的按照時(shí)間順序的光信號的形狀來檢測單個(gè)所述熒光粒子向所述光檢測區(qū)域中的進(jìn)入。
【文檔編號】G01N21/64GK103718023SQ201280038085
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2012年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月12日
【發(fā)明者】中田秀孝, 田邊哲也 申請人:奧林巴斯株式會社