專利名稱：：凝集分析法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及檢測樣品中的分析物的ー種凝集分析法。特別是，本發(fā)明涉及基于多孔載體的分析和分析裝置，包含用于進行此類分析的器的試劑盒，以及用于檢測樣品中分析物的分析方法。
背景技術(shù)：
：免疫分析是用于檢測和定量樣品中分析物的成熟技木。它們特別適用于作為疾病診斷和預后的輔助用于檢測和/或測量生物樣品中的物質(zhì)，以及用于預測患者對治療的反應。給診斷醫(yī)學帶來了革命的技術(shù)如放射免疫分析和酶免疫分析，建立在檢測抗體-抗原相互反應的基礎(chǔ)之上。許多檢測系統(tǒng)是可行的，包括使用放射性或者酶標記的抗原、抗體或其復合物。很多需要與特異性底物孵育，以通過比色或熒光測量終點。盡管這些分析是靈敏的，但檢測系統(tǒng)經(jīng)常是復雜的，并且因而是昂貴的。通常，檢測系統(tǒng)需要若干洗脫步驟，意味著傳統(tǒng)分析通常不適合用于及時護理現(xiàn)場(point-of-care)型的評估。凝集免疫分析在現(xiàn)有技術(shù)中眾所周知，并且依賴于結(jié)合了抗原或抗體的顆粒的凝集以指示樣品中相應抗體或抗原的存在。在凝集分析的ー種較簡單的形式中，針對特定分析物的抗體結(jié)合到珠子或其它可見的材料上(例如，乳膠凝集反應中的聚苯こ烯微粒)。通常，抗體是ニ價的，因此在分析物的存在下會導致乳膠珠形成團塊。這樣的團塊指示陽性結(jié)果，并且肉眼可見。W004/83859描述了ー種基于毛細管的凝集分析，包括一種毛細管通路，所述毛細管通路含有能夠引起與分析物的凝集的試劑系統(tǒng)。所述試劑系統(tǒng)包含結(jié)合到毛細管壁預定位置的抗體，或者結(jié)合到放置在毛細管系統(tǒng)預定位置的珠子上的抗體。使用該毛細管通路吋，樣品沿著通路流動直到其到達凝集試劑系統(tǒng)。若分析物存在，則發(fā)生凝集，阻礙樣品沿管子的進ー步流動。施加樣品預定的時間后，如果沒有樣品可以檢測，而通路下游用于樣品存在的檢測器受到影響，則存在分析物，從而顯示ー個陽性的結(jié)果。該裝置使用乳膠珠作為凝集器。對于更加接近患者進行分析的需求正在增長，主要是為了縮短提供結(jié)果所花的時間。此類分析譽為護理現(xiàn)場分析，并且通常需要牢靠和簡單地實施，因為它們在非實驗室的環(huán)境、通常由非專業(yè)人員進行。理想地，它們應該是自足式的并且不需要輔助設(shè)備(除了可能的讀數(shù)器的例外)。如果護理現(xiàn)場分析要有任何臨床用途，它們需要與基于實驗室的分析的靈敏度相似。然而，傳統(tǒng)的免疫分析通常包含復雜的操作規(guī)范和檢測系統(tǒng)，這就意味著它們通常不適合用于護理現(xiàn)場型的應用。特定的護理現(xiàn)場分析已被開發(fā)出來。最常見的是側(cè)流分析。通常，它們基于標記的移動組分(例如，有色彩的顆粒標記的抗體)、固定組分(例如，抗體條或點)以及膜，通過該膜導致樣品在毛細作用下移動。在分析物存在下，在固定的抗體捕獲區(qū)形成“夾心”，從而產(chǎn)生彩色的線或點。傳統(tǒng)的側(cè)流分析在例如UnileverPatentHoldingsB.Vd(US5,656,503)中舉例說明。這些分析規(guī)定了固定的抗體捕獲區(qū)，雖然是側(cè)流的形式而不是Gelgel等人教示的放射形式(ClinChem28(9)ppl894-8,1982)。側(cè)流分析提供了諸多優(yōu)點，包括速度、便捷性以及較低的成本。但是，它們有幾個缺點。抗體通常通過吸附到膜上而被固定，因此膜和/或抗體批次的變化會導致所固定的抗體量的變化。而且，ー些抗體可能僅僅是松散結(jié)合的，當流體正面經(jīng)過時可能會移動，從而導致信號的丟失。并且，由于ー種抗體是固定的，它和分析物反應的僅有時間是樣品流經(jīng)的時間，因此會由于孵育時間短而降低靈敏度。還需要為每ー分析物生產(chǎn)特定的包被膜，因而增加了制造成本。為了解決這些缺點，已經(jīng)嘗試避免使用固定的捕獲抗體。例如，Miles(EP297292)、HygeiaSciences(EP310872)和Mizuho(EP0962771)描述的系統(tǒng)，包括帶有捕集區(qū)的膜，所述捕集區(qū)連接有2種抗體包被的顆粒，一種沒有標記但是大，因此能夠被該區(qū)捕集，另ー個小并且被標記，能夠通過該區(qū)。在分析物存在吋，小珠子變成與被捕集的大珠子結(jié)合，從而形成彩色線。盡管這些方法避免了使用固定的捕獲抗體，但除了捕集區(qū)之外，它們還需要兩組抗體包被的顆粒。通常此類顆粒是疏水的性質(zhì)，并且在生物流體的存在下能夠引起非異性方式的凝聚。其他人嘗試了較簡單的形式，藉此包被抗體的顆粒能夠透膜自由移動，當分析物存在時產(chǎn)生凝集，使得移動被停止。此類基于凝集的免疫分析在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，并且依賴于結(jié)合抗原或抗體的顆粒的凝集以指示樣品中相應抗原或抗體的存在。在凝集分析一種較簡單的形式中，針對特定分析物的抗體與珠子或其它可視材料結(jié)合。特別是，Amersham(US4,666，863)公開了ー種通過色譜手段將游離和結(jié)合的標記分離的方法。在ー種變體中，他們教導了使用沿著膜的流動，分離凝集和非凝集的抗體包被的彩色顆粒。在分離之前，反應混合物與交聯(lián)試劑混合反應，使凝集穩(wěn)定化。Daiichi(EP293779)也公開了ー種有色彩的乳膠凝集反應，其中凝集的和非凝集的顆粒通過毛細管分離，所述毛細管容許非凝集的乳膠通過但是捕集聚集體。Kodak(EP280559)描述了ー種多價分析物的分析法，藉此分析物標記不存在時能夠通過過濾器，但是當分析物存在時形成凝集物而被捕集。Akers(EP556202)描述了ー個體系，其中通過樣品與表面上有分析物特異性受體的彩色顆粒接觸，形成測試混合物。測試混合物通過帶孔的過濾器，所述過濾器的孔大于彩色顆粒但是小于顆粒-分析物的聚集體，因此產(chǎn)生聚集體的捕集?；旌衔镏芯奂w的存在通過檢查濾出液的色彩確定。Genosis(US6，472，226)描述了ー種沒有固定的抗體的側(cè)流分析，用于非常大的分析物。他們描述了ー個2-區(qū)域體系，ー個有大孔，一個有小孔，使得分析物能夠通過大孔但是到達小孔區(qū)域時被捕集。這個與能通過兩個區(qū)域的小標記物(如膠體金)聯(lián)用。分析物存在時，膠體金的一部分變得結(jié)合到分析物并且變得在小孔區(qū)域被捕集。常見的護理現(xiàn)場分析是膜側(cè)流分析，通常用于尿樣。尿包含的分析物數(shù)目有限，因此這類測定法的應用受限制。要用于含有分析物范圍大得多的全血，通常必需過濾去除血細胞，否則會發(fā)生膜的堵塞和脫色。因此，已經(jīng)開發(fā)了用于全血的分析系統(tǒng)，其不需要過濾血液。在美國專利N0.4，433，059中，Chang公開了ー種非毛細管凝集免疫分析法，其中兩種抗體“尾對尾”地共價連接，利用對樣品屬于內(nèi)源性的顆粒時，有利于自體凝集反應。ー種抗體對于指示劑物質(zhì)如紅細胞攜帯的抗原有特異性。所述抗體是單價的，因而避免了非特異性的凝集。另ー種抗體是ニ價的并且對分析物有特異性。分析物存在吋，結(jié)合的抗體與分析物和紅細胞交聯(lián)，發(fā)生紅細胞的凝集。Agen在多個專利申請(US5,413，913，US4,894，347,W093/24630以及EP308242)中描述了ー種用于全血的非毛細管凝集系統(tǒng)，其中血樣的紅細胞被用作凝集顆粒。所述系統(tǒng)需要使用一種偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物包含兩種抗體或抗體片段，一種直接抗紅細胞抗原，另ー種直接抗多表位分析物。分析物存在時，抗體將凝集紅細胞。使用全血作為樣品的基于毛細管的凝集系統(tǒng)之前已有公開，例如US3，951，606和W099/35497。它們都給出了通過測定凝集的位置或哪種毛細管被堵塞來指示分析物的存在/量。這些分析都依賴于導致的毛細管完全堵塞的凝集。當前的大多數(shù)凝集分析中，顆粒的凝集是視覺檢測的。然而，視覺終點是主觀的并且難以電子記錄數(shù)據(jù)。ー個重要的考慮是，大體上，這些基于凝集的分析被限制于檢測能夠形成大而穩(wěn)定的凝集物的有多個表位的大分析物上。對于表位較少的較小分析物，或者使用可利用的表位數(shù)量有限的分析物，由于結(jié)合事件的數(shù)目減少，可能導致聚集體減弱和靈敏度損失，它們的效力會受損。本發(fā)明的目的是對現(xiàn)有技術(shù)的分析系統(tǒng)有關(guān)的上述問題的一部分或全部進行處理和改進。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的基礎(chǔ)是在分析物存在時產(chǎn)生穩(wěn)定的、可檢測的凝集反應。對于護理現(xiàn)場分析，該方法能夠便捷地在多孔載體或者含有毛細管路徑的裝置內(nèi)進行，盡管替代方法是可能的，特別是用于實驗室分析。實際上，對于此類應用，可以使用基于例如比濁法的完全液相形式。盡管使用其中可能發(fā)生多重結(jié)合事件的大的多表位分析物，可以實現(xiàn)適當?shù)哪?，但是當用可能僅含有幾個表位的較小分析物時，可能難以實現(xiàn)穩(wěn)定的凝集。實際上，由于特異性的原因，通常理想的是只使用分析物上的2個表位。為克服它，本發(fā)明提供了ー個中心(hub)，其包含結(jié)合到載體上的多個結(jié)合伴侶。產(chǎn)生的中心能夠結(jié)合若干分析物分子，有效地使分析物呈現(xiàn)多表位性并且增強了它的有效結(jié)合能力。通過這種方式，對于小的分析物和/或使用分析物上有限數(shù)目的表位的情形下，可能獲得強而穩(wěn)定的凝集，減少了對外部穩(wěn)定劑的需求。與現(xiàn)有技術(shù)中的基于膜的分析相比，通過使用用于增強分析物有效結(jié)合能力的特定試劑組合，并且能夠產(chǎn)生更強更穩(wěn)定的凝集反應本發(fā)明提供了一種靈敏度增強且制造簡化的分析。本發(fā)明提供了ー種分析，其避免或改善了對于要預先固定到膜上的結(jié)合伴侶提的需要。在樣品中的分析物存在下，將會發(fā)生中心、分析物和第二結(jié)合伴侶的凝集，其優(yōu)選可在裝置內(nèi)檢測。本發(fā)明還適用于單個樣品內(nèi)的兩個或更多個分析物的檢測，優(yōu)選地在單次分析內(nèi)。在這樣的具體實施方式中，可能提供有兩個或更多個第一結(jié)合伴侶，每ー個都能結(jié)合不同的分析物。它們可以提供在一個載體上，因而產(chǎn)生可以結(jié)合兩個或更多個分析物的中心?；蛘?，并且優(yōu)選地，兩個或更多個第一結(jié)合伴侶可以各自提供在分開的載體上，因而產(chǎn)生兩個或更多個中心，每ー個對不同的表位具有特異性。此外，提供有相應數(shù)目的第二結(jié)合伴侶，每ー個對不同的表位具有特異性，并且每一個與可以檢測的顆粒結(jié)合或能夠結(jié)合。優(yōu)選地，對每ー個待檢測的表位提供不同的可檢測顆粒，使得其存在與否能夠被測定。分析物可以是任何部分，優(yōu)選能夠與結(jié)合伴侶結(jié)合的。為使中心與第二結(jié)合伴侶的凝集能夠形成，本發(fā)明中可以檢測的分析物有至少兩個能與結(jié)合伴侶結(jié)合的結(jié)合位點或表位。非限制性的分析物的選擇包括核酸、抗原、抗體、寡核苷酸、激素、激素受體、維生素、類固醇、代謝物、適配體、糖、肽、多肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、有機體(例如真菌、細菌、病毒、原生動物和多細胞寄生蟲)、治療性或非治療性的藥物，或任何聯(lián)合或其片段。優(yōu)選地，分析物可以是免疫活性蛋白或多肽，例如抗原多肽或蛋白。通過本發(fā)明檢測的最優(yōu)選的分析物包括hCG，LH,FSH以及針對HIV的抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的是，抗體在測量免疫反應的證據(jù)中是特別重要的分析物。因此，精確測量特定抗體的血清滴度是本發(fā)明的ー個重要方面。在此類分析中，將會體會，使用的分析物結(jié)合試劑通常是被測量的抗體特異性結(jié)合的抗原。分析物的有效結(jié)合能力的增強通過中心的使用得以實現(xiàn)，所述中心結(jié)合有能夠結(jié)合分析物的第一個表位的兩個或更多個第一結(jié)合伴侶。中心可以是任何適宜的材料形成，所述材料優(yōu)選是均一穩(wěn)定的并且結(jié)合伴侶能夠與其連接。中心可以是可溶的或不可溶的，盡管前者是優(yōu)選的。中心的例子包括聚苯こ烯乳膠珠、玻璃珠、膠體金、細胞例如血紅細胞、纖維材料如纖維素、大分子如多糖和蛋白質(zhì)。優(yōu)選的中心是多糖，包括葡聚糖優(yōu)選氨基葡聚糖、瓊脂糖、微晶纖維素、淀粉。其它適宜的材料包括聚こ烯亞胺、聚こ烯基甲苯、或者苯こ烯丁ニ胺共聚物、聚丙烯醛微球體、聚氨酯、花粉顆粒、孢子花粉素、被甲基丙烯酸多縮水甘油酷、微晶纖維素或其組合的殼包裹的聚苯こ烯或聚こ烯基萘核心、聚こ烯醇、甲基丙烯酸羥こ酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物、有機硅和硅石、玻璃、橡膠、尼龍、硅藻土、硅石等。可溶性的中心優(yōu)勢在于非特異性結(jié)合低和柔性增強，并且對共價交聯(lián)抗體或其它結(jié)合上去的分子的基團可利用性增強。優(yōu)選的可溶性中心是可溶性蛋白和多糖，包括上文中描述的那些，特別是氨基葡聚糖及其衍生物。中心的尺寸由因素如要容納到表面上的結(jié)合伴侶的數(shù)目、確保分析期間中心穩(wěn)定性的原子空間排列的因素，以及其中要進行分析的多孔載體的性質(zhì)所規(guī)定。例如，優(yōu)選中心足夠小，用于在沒有凝集事件時穿過膜上最小的孔。當中心由不溶性的珠子構(gòu)成時，它們的直徑在0.03-10um的范圍，優(yōu)選的是0.05-8um。對于可溶性的中心，它們可以在250-2，500kDa的范圍，更加優(yōu)選的是500-2，500kDa，例如對氨基葡聚糖分子。在中心的表面上是能夠結(jié)合分析物的第一個表位的第一結(jié)合伴侶。因此，分析物存在吋，中心可以通過其表面上的第一結(jié)合伴侶與其結(jié)合。這就有效地集合起了許多分析物分子用于呈遞給第二結(jié)合伴侶。因此，使用中心和第二結(jié)合伴侶的分析有著更高靈敏度和更廣泛應用的潛力。為使中心有效，因而優(yōu)選的是其表面上存在至少兩個直接對抗分析物的特定表位的第一結(jié)合伴侶。但是，對抗中心表面上任何特定表位的結(jié)合伴侶的數(shù)目越大，則與分析物和第二結(jié)合伴侶的可能的相互作用的數(shù)量將會越大，因而凝集體的可能的尺寸就越大。因此，中心表面上結(jié)合伴侶的最佳數(shù)目是保持分析靈敏度的同時將結(jié)合伴侶之間或者中心和第二結(jié)合伴侶之間原子空間排列的干擾最小化。與中心結(jié)合的第一結(jié)合伴侶可能能夠結(jié)合或直接對抗分析物的任何表位，條件是該表位與第二結(jié)合伴侶靶定的表位不同。當分析是用于檢測單個分析物時，可能優(yōu)選的是結(jié)合到中心的所有第一結(jié)合伴侶能夠結(jié)合分析物的同一表位，并且優(yōu)選基本上相同。但是，在本發(fā)明的實施方式中，當需要在單個樣品或單次分析中檢測的兩個或更多個分析物時，能夠結(jié)合每個待測表位的第一結(jié)合伴侶可以提供到同一個中心或不同的中心中。第二結(jié)合伴侶能夠結(jié)合分析物的第二表位并且結(jié)合或能夠結(jié)合可以檢測的顆粒，優(yōu)選同時結(jié)合。優(yōu)選第二結(jié)合伴侶靶定分析物上不同于相應的第一結(jié)合伴侶所靶定的表位。第二結(jié)合伴侶可以通過許多直接或間接的方式與可檢測顆粒結(jié)合。在一個實施方式中，第二結(jié)合伴侶結(jié)合雙官能結(jié)合物中的第三結(jié)合伴侶，能夠以特異或非特異的方式與分析物的表位和可檢測顆粒結(jié)合。當結(jié)合伴侶是抗體或功能片段或其衍生物時，第三結(jié)合伴侶可以直接特異地結(jié)合可檢測顆粒表面所存在的表位。在一個實施方式中，可檢測的顆粒是血紅細胞，因而第三結(jié)合伴侶可以是對血紅細胞表面抗原具有特異性的抗體。在本發(fā)明的內(nèi)容中，表位是結(jié)合伴侶能夠結(jié)合的分析物上的單獨的位點。因此，這里描述的被結(jié)合伴侶結(jié)合的表位可以設(shè)想是在相同或不同的分子上。優(yōu)選為了空間排列的原因，優(yōu)選分別被第一和第二結(jié)合伴侶識別的分析物上的第一和第二表位，位于空間分離的位點上。如果分析物有兩個或更多個結(jié)構(gòu)域，則為了避免空間位阻，最優(yōu)選第二結(jié)合伴侶識別的表位位于與中心的第一結(jié)合伴侶的結(jié)構(gòu)域不同的結(jié)構(gòu)域上。例如，在hCG的情況下，第二結(jié)合伴侶直接對抗3鏈上的表位，而中心直接對抗a鏈上的表位。被第一和/或第ニ結(jié)合伴侶靶定的分析物表位優(yōu)選對該分析物是特異性的，因此第一和第二結(jié)合伴侶對分析物的結(jié)合都只有在分析物存在時才發(fā)生。為了使中心、分析物和第二結(jié)合伴侶之間的凝集能夠被檢測，優(yōu)選第二結(jié)合伴侶能夠與分析物和可檢測顆粒同時結(jié)合。因此，當分析期間可檢測顆粒變得被結(jié)合，優(yōu)選第二結(jié)合伴侶上對于可檢測顆粒的結(jié)合位點與分析物結(jié)合位點有充分的距離，以促使與分析物和可檢測顆粒同時結(jié)合。在測定之前第二結(jié)合伴侶與可檢測顆粒結(jié)合的情況下，優(yōu)選結(jié)合伴侶附著到可檢測顆粒上，因此仍然能夠結(jié)合分析物?？蓹z測顆?？梢酝ㄟ^任何合適的方式與第二結(jié)合伴侶結(jié)合，如下文所描述。結(jié)合伴侶可以以任何適宜的方式，共價或非共價地，被結(jié)合或固定到非靶部分，例如中心或可檢測顆粒。尤其在可檢測顆粒在分析期間變得結(jié)合到第二結(jié)合伴侶的情況下，通常，結(jié)合會在結(jié)合伴侶上的結(jié)合位點與中心或可檢測顆粒上的表位(或決定簇)之間形成。此類決定簇優(yōu)選地是中心或可檢測顆粒上固有存在的，但也可以是外來的。優(yōu)選它是表面蛋白，優(yōu)選血型糖蛋白。合適的手段包括共價連接例如化學連接，或通過非共價連接例如抗體-抗原相互作用、生物素-鏈霉親和素、蛋白-蛋白相互作用、G蛋白或A蛋白相互作用、或被動吸附。當采用共價連接時，這通常是在結(jié)合位點遠端的結(jié)合分子的合適殘基和中心分子的適于接近部分之間。優(yōu)選共價連接在氨基酸之間形成，通常是氨基酸側(cè)鏈，例如氨基、巰基、羧基、酚基或其它雜芳族或芳香族側(cè)鏈。為實現(xiàn)上文所述的非共價連接，結(jié)合伴侶可以作為偶聯(lián)物提供，其中上文中所述的結(jié)合伴侶進ー步偶聯(lián)能夠結(jié)合中心/可檢測顆粒的其它結(jié)合伴侶。該結(jié)合優(yōu)選通過它們的分析物結(jié)合位點遠端的位點，因而避免了與分析物結(jié)合的任何干擾。當結(jié)合伴侶是抗體時，此類位點可以是結(jié)合伴侶的尾部，使得偶聯(lián)以尾對尾的方式進行。該偶聯(lián)可以是共價的，例如通過結(jié)合伴侶的氨基酸的氨基、巰基、羧基、酚基或其它雜芳族或芳香族側(cè)基，或優(yōu)選通過硫醇基團?；蛘?，交聯(lián)可以是非共價的，如上文所述。本發(fā)明的結(jié)合伴侶可以是能夠結(jié)合預定靶標(例如分析物或可檢測顆粒)的任何物質(zhì)，并優(yōu)選其對所述預定靶標有優(yōu)先的親和カ(即對該靶標有特異性)。因此，結(jié)合伴侶包括單克隆或多克隆抗體，抗原，包括酶或其它結(jié)合蛋白的蛋白質(zhì)，受體，適配體，寡核苷酸，糖，及其片段。根據(jù)分析物和凝集顆粒的性質(zhì)，結(jié)合伴侶從上述中選出，使得它們能夠按需與每ー個結(jié)合。優(yōu)選地，結(jié)合伴侶可以是抗體，例如已知的免疫球蛋白如IgG，IgM等等，或單價或ニ價的IgG抗體片段，通常分別被稱為Fab和Fab’與(Fab’)2，或其片段。優(yōu)選地，抗體通常是ニ價的抗體片段[(Fab’)2]，或更優(yōu)選單價的抗體片段(Fab或Fab’)。盡管優(yōu)選結(jié)合伴侶直接與它們的靶標結(jié)合，但這并非嚴格必須的，并且結(jié)合可以通過媒介發(fā)生，如結(jié)合分析物的分子。所述媒介可以是樣品中自然存在的，或者可以是單獨提供的。它們包括受體、抗體、抗原、結(jié)合分子、激素受體、寡核苷酸、糖或者適配體，如上述與結(jié)合伴侶等等相關(guān)的敘述。可檢測顆?？梢允巧锏幕蚍巧锏?，并且對于待分析的樣品是外來的，或自然存在于樣品中。“可檢測”的意思是，使用任何適當?shù)氖侄危谀嬖诨虿淮嬖谙?，它在多孔載體內(nèi)的存在和/或位置是可以確定的。優(yōu)選地，顆粒是固有可檢測的顆粒，即它的檢測基于顆粒的固有特征(如顔色)而非它對外部因素的作用。因此，該可檢測顆粒使凝集的存在和位置能夠被觀察到，而不需要測量或評價凝集的外部因素如流速或吸光度。檢測可以通過例如視覺或比色進行，或通過任何其它適宜的方法?？蓹z測顆粒的例子包括微生物、細胞(如血紅細胞)、大分子、金屬膠體顆粒(如金或銀)、珠子(優(yōu)選聚苯こ烯乳膠)、炭、高嶺土或膨潤土。當顆粒是生物的并且對樣品是外來的，那么它可以得自任何適宜的來源，并且在使用之前可以任選經(jīng)過任何必要的預處理如洗滌、固定、防腐。在血紅細胞的情況下，它們可以得自任何適宜的來源，優(yōu)選的是動物如豚鼠或火雞。血紅細胞可以被抗體包覆，和/或用任何適當?shù)姆椒ǚ栏?，或固定。使抗體能夠被檢測的標記可以是顆粒的固有部分，或可以用在此描述的方法附著到可凝集的顆粒上。對于全血測定，優(yōu)選可檢測顆粒是樣品(適當處理以防止凝結(jié)，如用檸檬酸鹽)本身的血紅細胞。優(yōu)選地,可檢測顆粒也能夠凝集,意味著它會凝集，或與其它(優(yōu)選的是相似或等同的)可檢測顆粒形成聚集體。可檢測顆粒的凝集能力促使較大凝集物的形成，優(yōu)選地包含2個或多個中心，因而有利于檢測和增強穩(wěn)定性?？紤]到使用本發(fā)明的試劑提高凝集復合物的穩(wěn)定性，本發(fā)明的第一個實施方式是在毛細管裝置內(nèi)進行反應。每ー種試劑可以放置在裝置中一個或多個預定的位置上，并且可以再次優(yōu)選試劑放置在相同的位置，或它們應用在不同的位置上。在后一種情況中，優(yōu)選中心在偶聯(lián)物的上游。在分析物存在下，凝集的發(fā)生導致阻止了流體沿通路的流動或降低了流速。這個可以通過流體到達ー個或多個設(shè)定點所花去的時間或流體在設(shè)定的時間內(nèi)通過的距離來檢測。流體在設(shè)定點的存在可以通過任意手段檢測，包括但不限于，視覺檢測流動，團塊的形成，顔色的變化等等；光學手段例如反射計，測量光散射；流體檢測；濁度法；電學手段和比濁法。優(yōu)選的是非視覺檢測手段，意味著在檢測區(qū)域樣品的有無不是由肉眼確定。這減少了人為誤差的影響，并且在護理現(xiàn)場的環(huán)境下，意味著不需要使用者在進行分析期間持續(xù)監(jiān)測。此外，結(jié)果是持久的和穩(wěn)定的。優(yōu)選的檢測手段包括光電檢測手段，意味著其可以，例如，包括光敏ニ極管(LDD)或光敏電阻陣列。要體會的是，根據(jù)由分析來確定的分析物，某些光敏元件將接收光(即樣品沿其流動沒有受阻的毛細管的檢測區(qū)域的元件)。光電探測器連有軟件，這使得從光電探測器提供的特定信號來確定分析物。便利地，優(yōu)選的光電探測器是用于通過光透射閱讀條形碼的類型(與光線反射相對)。在這樣的實施方式中，反應裝置中預定的區(qū)域(檢測區(qū)域)可以是透光的，因而檢測區(qū)域樣品的存在與否可以通過在反應裝置的ー側(cè)提供照明源和在裝置的另ー側(cè)提供光電探測器來確定。便利地，反應裝置可以用透光材料生產(chǎn)(例如聚碳酸酷)。檢測器可以被設(shè)置用來檢測到達檢測區(qū)域的樣品的存在，作為確認裝置運轉(zhuǎn)正常。換言之，如果樣品沒有在毛細管通路的檢測區(qū)域被檢測到，通常是對照毛細管，那么它必須假定反應裝置沒有正確運轉(zhuǎn)，因此測試將需要用新的裝置重復。還優(yōu)選包含檢測裝置，用于檢測在毛細管通路的上游區(qū)域存在的樣品，以確保樣品進入了這些通路，再次作為確認裝置正常運轉(zhuǎn)。如上文所述，進行本發(fā)明的分析的反應裝置是ー個容器，并且通常是手持的。優(yōu)選是一次性使用類型的裝置，因此它用于進行一次分析，然后丟棄。裝置可以包含ー個或多個其中進行測定是毛細管通路。優(yōu)選提供2個毛細管通路，一個作為分析通路，另ー個作為控制通路。但是，只要需要或有必要，可以設(shè)象提供另外的通路，用于檢測單個樣品的多個分析物。每ー個毛細管通路有上游和下游端，優(yōu)選在上游端有用來接受樣品/試劑的區(qū)域或孔。該區(qū)域可以包含施加樣品/試劑的襯墊，樣品/試劑從其進入毛細管通路。所述襯墊可以由吸收性材料構(gòu)成，優(yōu)選纖維材料，如纖維素。纖維襯墊可以對毛細管道施加反毛細管力，并且襯墊材料的選擇取決于毛細管道的尺寸，因為這些決定了毛細管力?；蛘?，可以在毛細管通路的入口出區(qū)域設(shè)置單向閥，因而施加到所述區(qū)域的樣品/試劑可以經(jīng)閥的開ロ進入通路，但不能從該開ロ出去?；蛘?，可以用移液管或其它適當?shù)难b置將液體直接加到通路中。如同一些已知的基于毛細管的凝集分析，例如W004/083859，所述通路可以在通路的預定位點包含凝集試劑。優(yōu)選裝置的任一部分與樣品接觸，并且因此可以是整個或部分的區(qū)域或毛細管通路，優(yōu)選流體將被檢測的任一位點的上游。所有的試劑可以被混合并放置在毛細管的ー個或多個位點，或被分別放置在不同的位點。分析物存在吋，當流體到達最下游的試劑時，將開始阻滯流動。通常，沿毛細管通路的流速對照相鄰毛細管通路中的對照樣品測量，所述對照樣品不能夠凝集(例如由于缺少分析物)。在一個替代的方法中，試劑可以加在毛細管通路的上游端，與樣品在同一個位置，與樣品在一起或在樣品之前。所述試劑可以預先混合，或分別加入。優(yōu)選所述試劑包含中心，所述中心放置在包含偶聯(lián)物的試劑的毛細管上游。為確定是否存在分析物，監(jiān)測與標準比較的流速變化。優(yōu)選反應裝置的通路是毛細管。它可以由任何適宜的材料制成，優(yōu)選與反應裝置的其余部分相同，如聚碳酸酷，聚苯こ烯，或注射成型的塑料，任選是透明的。優(yōu)選毛細管通路在單元表面形成為上端開ロ的通道，并且通過固定膜(如聚酷)或優(yōu)選親水性質(zhì)封條對其封閉。其可以用任何適宜的方式，例如親水性粘合剤，固定到裝置主體上，最優(yōu)選的是不“釋氣”和“蠕變”的。優(yōu)選地，使用的任何手段不含有使蛋白質(zhì)變性的成分(如氰化物)，否則裝置的功能會受到損害。模制該裝置的塑料材料可以是疏水的，毛細管通路任選在制造期間用親水試劑處理，如在0.1-10%的Tween20洗滌。凝集劑和其它試劑可以供到上端開ロ的通路中。反應裝置可以包含檢測器和/或解讀檢測器提供的信號的器。通常，這些包括處理顯示的結(jié)果的信號處理器，以及顯示器。因此，可以提供ー種整合的裝置，包括測定、信號處理和顯示所需要的所有器?；蛘?，可以提供一個單獨的讀數(shù)器，包含信號處理和/或顯示器，并且任選用于確定反應裝置中預定位置處樣品存在與否的檢測裝置，在此定義為檢測區(qū)域。因此，雖然反應裝置需要棄置，但信號處理/顯示裝置能夠再次使用。這減少了分析的成本以及廢棄物。當提供単獨的讀數(shù)器吋，它可以是可拆卸的，并且用任何適宜的手段、以允許來自每ー個檢測裝置的結(jié)果能夠被獲取和分析的方式，與反應裝置可操作地連接。優(yōu)選地，反應裝置可松脫地安裝在讀數(shù)器上，使得進行分析吋，讀數(shù)器和反應裝置成為ー個臨時整合的裝置。因此，讀數(shù)器和/或反應裝置包含的器或布置使得安裝時，檢測器可以與反應裝置中的檢測區(qū)域連通，優(yōu)選通過接觸。盡管不是絕對必不可少，反應裝置和讀數(shù)器之一或二者上的器可以令組件接合，如緊固或鎖定機構(gòu)。在一個簡單的實施方式中，測試裝置中所述器包含構(gòu)造(例如步驟構(gòu)造)，用于將單元定位到讀數(shù)器中的協(xié)同步驟上。當提供檢測器作為反應裝置的一部分時，它們可以放置在一個或多個預定的合適位置。如上所述，在基于毛細管的反應裝置中，每ー個毛細管通路可以配置適合分析所使用的檢測方法的檢測器。檢測器可以設(shè)在沿毛細管通路的ー個或多個位置，并且至少在通路的下游區(qū)域，如此通過測量沿毛細管的流速獲得關(guān)于樣品中分析物的定量結(jié)果。因此，樣品中分析物的量越大，凝集反應將越強烈，而沿通路的流速越慢。通過沿通路設(shè)兩個或更多個檢測器(means)，并且測量樣品到達每ー個所花的時間，能夠確定流速。通過將流速跟標準曲線進行比較可以估計分析物的量。檢測器將檢測在檢測區(qū)域中任何液體的有無。液體通常是在此所描述的試劑和/樣品，但是可以包括其它用于對照目的或驗證單元可操作性的測試液體。檢測裝置與毛細管通路的一個或多個檢測區(qū)域連通，以確定液體的存在與否。獲得的結(jié)果對每個檢測區(qū)域以是/否的形式指示，形成的圖案通過電子器來解讀為分析物的存在和/或量。毛細管通路的長度由凝集反應的時間比例，結(jié)合因素如通路的內(nèi)橫截面積以及樣品和試劑的性質(zhì)和流速來指示。它必須具有最小足夠長度，若分析物存在時，有時間使凝集反應發(fā)生。通常，通路長度在30-500mm的范圍內(nèi)，更優(yōu)選35-45mm。根據(jù)制造和流動的準則，毛細管通路可以有任何橫截面，例如圓形，方形或三角形。通路的截面可以是，邊長50-1000um的等邊三角形的形式。為方便起見，通路不一定是線型，而是可以采用任何適合反應裝置尺寸和形狀的形式。因此，通路沿其長度可以采用一系列彎曲或曲線。盡管任何容許試劑/樣品流過的形式都是可以接受的，但優(yōu)選的形式包括一系列以180度彎曲連接的平行的線型通路。當有兩個或更多個通路吋，它們可以彼此并排平行地運行，使流動易于視覺監(jiān)測，或可以設(shè)置成裝置上的單獨構(gòu)造?？梢蕴峁┮后w以輔助試劑/樣品沿毛細管通路的流動，或増加反應體積，或提供額外的試劑，如前文提到電解質(zhì)。緩沖液可以與試劑/樣品一同或分開加入，包括在反應開始之后(追加緩沖液)。適宜的液體包括緩沖液如PBSpH7.4，以及生理鹽水。當分析的液體沒有傳導性時，可以在檢測器的上游加入電解質(zhì)。它可以是固體的，溶解之后使液體變得有傳導性，或可以是預溶解的，例如以緩沖液的形式。信號處理和顯示器可以任選配備電源或用于連接電源的器。如W004/85389中描述，電源可以是使用時被啟動的電源。或者電源可以是傳統(tǒng)的電池。信號處理器能夠?qū)碜苑磻b置中檢測器的結(jié)果轉(zhuǎn)換成顯示器上的可讀輸出。優(yōu)選，信號處理器還包括計時器，其在測試中合適的點啟動。因此，通過與反應裝置連接，信號處理器與檢測器連通，將結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)字或其它信號。然后該信號被傳送至顯示裝置，其將信號以可讀的形式呈遞。這可以是是/否類型的結(jié)果，語言或符號的形式，或可以是定量結(jié)果，提供指示分析物存在量的值。優(yōu)選在后一種情形下，提供一個數(shù)值，致使不需要再對結(jié)果進行解讀。優(yōu)選該裝置如PCT申請N0.PCT/GB2005/004166中所描述。在第二個實施方式中，本發(fā)明的分析是基于膜的，意味著試劑被導入到多孔載體上，并且任何凝集都在載體內(nèi)發(fā)生。優(yōu)選地，中心和可檢測顆粒是不同的實體，優(yōu)選由不同的材料或試劑構(gòu)成。本發(fā)明的一個優(yōu)點是試劑和樣品可以以任意順序以及任何組合施加到多孔載體，并且不要求將試劑固定在ー個固定的位點，不像現(xiàn)有技術(shù)中的側(cè)流分析，通常有將樣品和試劑分別和以固定的順序施加的限制。任何一種或多種試劑和/或樣品可以在分析開始之前混合，或在單獨的容器中(例如毛細管或孔)，或在多孔載體本身內(nèi)(例如在有大孔的多孔載體的區(qū)域中，所述大孔允許凝集和非凝集的顆粒自由移動)。尤其是，優(yōu)選在分析之前，它可以與中心、第二結(jié)合伴侶、和/或可檢測顆粒結(jié)合。在施加到多孔載體之前，任何混合物可以短時間孵育，例如1-6分鐘，優(yōu)選2-5分鐘。本發(fā)明的分析可以以各種形式進行。在ー個“離線的”形式中，試劑和樣品可以在導入到用于分離凝集和非凝集顆粒的多孔載體之前一起反應?；蛘?，試劑和樣品可以分別施加到多孔載體，或二者聯(lián)合使得反應在載體內(nèi)進行。在一個“濕的”形式中，在分析開始或即將開始時將試劑和樣品施加到多孔載體?；蛘?，分析可以是“干的”，其中在分析開始之前，一種或多種試劑已經(jīng)被預先施加到多孔載體，方式是在例如通過潤濕再次激活之前阻止它們在多孔載體內(nèi)自由移動。優(yōu)選，任何預先施加的試劑在通過多孔載體時會被樣品或其它流體重溶。因此，如上面關(guān)于第二個方面的敘述，本發(fā)明的裝置可以包含帶有中心的多孔載體、第二結(jié)合伴侶、可檢測顆粒、和/或其它預先施加到其中的試劑，優(yōu)選是干的、可復水的形式。此類試劑可以在多孔載體內(nèi)的相同或不同位置一起或分開施加。預先施加到多孔載體上可以避免在先技術(shù)的缺點，因為(i)位置不必精確(與傳統(tǒng)的側(cè)流測定中的固定捕獲線相比較，精確定位對使它可讀并避免彌散或不清晰的結(jié)果是關(guān)鍵的)以及(ii)在已知的側(cè)流分析中，固定捕獲線和標記的抗體必需施加到不同的位置，需要兩次通過施加裝置，或更復雜的設(shè)備。在本發(fā)明中，試劑可以預混合，因此只需施加I次。將試劑預先施加到多孔載體的方法在現(xiàn)有技術(shù)中廣為所知，并且包括干燥，脫水，空氣干燥，真空干燥，凍干。通常地，這需要將試劑施加到膜上，然后在2530°C溫度范圍內(nèi)干燥18個小吋。因此，每ー試劑和樣品可以以任何組合同時或依次添加。當依次添加時，可以優(yōu)選樣品在試劑之后加入，并且更優(yōu)選第二結(jié)合伴侶在中心之后添加。任何試劑，尤其是預先施加的試劑，可以放置在多孔載體中的ー個或多個預定位置，并且此外，可以優(yōu)選兩個或更多個試劑放置在相同的位置，或?qū)⑺鼈兪┘拥椒珠_的位置。在后一種情況中，優(yōu)選中心在第二結(jié)合伴侶的上游。試劑和/或樣品可以用任何適宜的手段施加到多孔載體，例如通過將多孔載體放置到盛有一個或多個試劑和/或樣品的容器中，或通過直接將試劑/樣品移取到載體上。在單次分析中可以使用施加方法的任意組合。樣品中有分析物存在吋，試劑發(fā)生凝集。分析期間形成的任何凝集將會沿著多孔載體朝向遠端流動，直至在膜內(nèi)的預定位點(檢測區(qū)域)處移動被阻止或減弱。通常，這是由于存在捕集凝集物的器，例如孔徑減小或現(xiàn)有技術(shù)中技術(shù)人員已知的不依賴于預固定的特定結(jié)合試劑的任何其它合適的方法。因此，分析物存在時，凝集物在檢測區(qū)域的位置積聚，從而允許檢測。優(yōu)選，凝聚的檢測是通過捕集凝集物實現(xiàn)的，例如，用色譜器。因此，為使發(fā)明有效果，有必要形成強的凝集反應，使得檢測中固有的強剪切不會破壞凝集物。本發(fā)明中中心的使用使其能夠?qū)崿F(xiàn)。反應裝置的通路是多孔載體，其是使試劑和流體從中通過的任何適宜的材料。優(yōu)選的是固體基質(zhì)，優(yōu)選纖維性的。優(yōu)選還是柔韌性，能夠結(jié)合其它多孔的或無孔的材料，允許信號可視化，并且優(yōu)選是吸水的，因而有利于流體通過毛細作用移動通過。適宜的材料包括紙，玻璃纖維，多孔塑料，燒結(jié)的(scintered)玻璃或塑料，纖維素顆粒，硝酸纖維素，瓊脂凝膠或其它聚合物，或織造材料如布、尼龍或其它聚合的網(wǎng)狀材料，或其它天然或合成的纖維材料。単一的條帶內(nèi)載體的孔徑可以變化，例如為了捕集凝集物。優(yōu)選地，任何檢測區(qū)域上游的載體的孔徑足以容許試劑、樣品和凝集物的自由移動。在檢測區(qū)域，為了阻止凝集物沿載體的進ー步移動，孔徑可以減小，從而使其可以檢測。因此，檢測區(qū)域的孔徑可以小于可能在存在的待檢測分析物中特異形成的任何凝集物，但又大到足夠容許任何非凝集的試劑或樣品自由移動。無疑地，這個可以根據(jù)因素如使用的中心、分析物和結(jié)合伴侶的性質(zhì)而變化。整個或部分多孔載體可以用物質(zhì)預處理以阻止或減少試劑和/或樣品與載體的非特異性結(jié)合。合適的物質(zhì)包括清潔劑如Tween20TM，TritonX-lOOTM，或十二烷基硫酸鈉(SDS)，載體蛋白如牛血清白蛋白，糖例如蔗糖、海藻糖等等。這些可以添加到載體，優(yōu)選在分析之前，或添加到一個或多個試劑和樣品中。多孔載體可以是適宜的尺寸和形狀，與要進行的分析相適應。優(yōu)選地，載體可以是條帶狀，有施加試劑和樣品的近端，以及它們可以流向的遠端。載體的尺寸通常取決于分析的性質(zhì)和要施加的樣品的多少，以及分析所需的持續(xù)時間。載體的厚度優(yōu)選使得任何可視信號能夠被檢測并且不會“埋沒”在載體中。優(yōu)選地，載體的尺寸使得它可以設(shè)置在護理現(xiàn)場使用的手持裝置里面。因此，當載體是條帶狀時，可以優(yōu)選不超過大約20_寬，優(yōu)選寬約1.0mm和12mm之間，并且更優(yōu)選寬約3.0mm到8.0mm之間，并且最優(yōu)選5mm寬。載體的長度可能由凝集反應的時間范圍、結(jié)合因素如載體的橫截面積以及樣品和試劑的性質(zhì)和流速規(guī)定。它必須至少有足夠的長度以容許若存在分析物的話凝集反應的有時間發(fā)生。通過延長分離/檢測區(qū)域之前的部分，能夠增加反應的時間(并且因此潛在提高了靈敏度)，通過縮短條帶可以加速分析。長度通?？梢栽诖蠹s2.0cm和40cm之間，優(yōu)選長約4.0cm和25cm之間，更優(yōu)選長約6.0cm和20cm之間，并且最優(yōu)選長6cm和15cm之間。如果需要，分析速度可以通過添加粘度改變劑如淀粉甲基纖維素聚こニ醇白蛋白等進行調(diào)節(jié)。如在此所述，本發(fā)明中的多孔載體可以包含不同的區(qū)域。例如，其可以包括施加區(qū)域，在此試劑和樣品可以施加到載體；在施加區(qū)域下游的檢測區(qū)域，在此檢測任何凝集；和/或預先施加一種或多種試劑的區(qū)域，其將在施加區(qū)域的下游但在檢測區(qū)域的上游。優(yōu)選地，每ー個區(qū)域都是物理上區(qū)分明顯的部分。為適合每種目的，這些區(qū)域可以全部由単一的連續(xù)載體形成，或可以由物理上區(qū)分明顯的載體形成。在后一種情形中，物理上區(qū)分明顯的載體可以沿載體的長度設(shè)置或以層的形式層壓，優(yōu)選有小的重疊，優(yōu)選在Imm的區(qū)域中。優(yōu)選地，施加區(qū)域(或試劑釋放墊)起著材料支撐體的作用，并且可以由任何適宜的材料構(gòu)成，優(yōu)選孔徑為0.05iim到500um,更優(yōu)選0.1ym到100um,并且最優(yōu)選0.2ym到30ym。檢測區(qū)域的捕集膜可以是類似的材料，但與施加區(qū)域相比，孔徑減小。載體還可以在檢測區(qū)域的上游包括毛細芯或槽，用于通過毛細作用吸引流體通過多孔載體。為防止多孔載體弄污或試劑的泄漏，優(yōu)選在至少ー側(cè)并且優(yōu)選兩側(cè)包上防水密封條。為使能夠通過視覺檢測凝集物，優(yōu)選密封條是透明的。更優(yōu)選，它可以粘貼到載體上而不會妨礙其性質(zhì)。優(yōu)選的密封條包括塑料多層涂層，優(yōu)選本身有粘性。為提供剛性，優(yōu)選將多孔載體放置在固體的無孔支撐體上?？梢圆捎萌魏芜m宜的支撐材料，其不會妨礙載體的功能屬性。適宜的支撐材料包括聚こ烯，聚丙烯，聚(4-甲基丁烯)，聚苯こ烯，聚(對苯ニ甲酸こニ酷)，尼龍，聚(丁酸こ烯酷)，玻璃，陶瓷，金屬，等等。優(yōu)選地，并且尤其是本發(fā)明g在由非專業(yè)人員使用的情況下，多孔載體可以容納在裝置或容器中，優(yōu)選是手持的。裝置優(yōu)選全方位包圍載體，同時容許試劑/樣品施加到載體并且使任何凝集可見。因此，優(yōu)選裝置包含至少I個，優(yōu)選2個或多個孔，容許看到檢測區(qū)域并且能夠暴露施加區(qū)域的載體。在ー些優(yōu)選實施方式中，載體可以從裝置的施加區(qū)域延伸，因此有利于試劑/樣品的施加。該裝置還可以包含孔，或其它樣品接受容器，與施加區(qū)域流體連通?；蛘?，該裝置可以包含容許與単獨的容器接合的器。該裝置可以由任何適宜的材料制成，優(yōu)選是剛性的，防水的，不可滲透的，輕質(zhì)的，和/或不包含使蛋白質(zhì)變性的成分(如氰化物)，否則裝置的功能可能會受到損害。優(yōu)選地，該裝置由塑料材料制成。優(yōu)選地，該裝置是一次性使用類型的裝置，因此它用于進行一次分析，之后丟棄。該裝置可以包含一種或多種執(zhí)行分析的多孔載體，例如當需要在單個裝置中檢測多個分析物吋。當提供有兩種或更多種載體時，它們可以相互并排平行運行，使得容易視覺監(jiān)測流動，或從共同的樣品施加區(qū)域呈放射狀布置，等等。可以提供ー種或多種額外的載體作為對照通路。檢測優(yōu)選通過看到(即用肉眼)由于含有可檢測顆粒的凝集物的聚集引起的在檢測區(qū)域的條帶或信號。這能夠快速閱讀結(jié)果，并且避免了對輔助設(shè)備例如讀數(shù)器和信號處理器的需要。也可以采用非視覺檢測手段，并且包括分光光度測定法，熒光測定法，等等。后者減少了人為錯誤的影響，并且在護理現(xiàn)場的環(huán)境下，意味著不需要使用者在分析進行期間持續(xù)監(jiān)測。此外，結(jié)果是永久的和穩(wěn)定的。當采用非視覺檢測方法吋，則可能會需要檢測器(如反射計，熒光計，等等)和信號處理器。當采用視覺檢測手段時，結(jié)果可以提供為有色彩的信號(例如以檢測區(qū)域中的線的形式，優(yōu)選是肉眼可見的)。當然，信號的性質(zhì)取決于使用的標記和/或可檢測顆粒。還提供是/否的指示，信號的強度和大小可以用于對結(jié)果定量，例如通過使用讀數(shù)器(電子的或別的方式，帶有任何相關(guān)的信號處理器)或，更簡單地，通過參考標準曲線。合適的方法包括測量信號的反射比或吸收度，或?qū)⑿盘柵c標準曲線比較，例如給出了任何給定色彩的強度范圍的色彩曲線，并且所述色彩曲線可能夠根據(jù)存在的分析物的量進行分級?？梢蕴峁┝黧w以輔助試劑/樣品沿多孔載體的流動，或増加反應體積，或提供額外的試劑如電解質(zhì)。緩沖液可以與試劑/樣品一同加入，或単獨加入，包括在反應開始之后(追加緩沖液)。適宜的流體包括緩沖液如PBSpH7.4，以及生理鹽水。相應地，本發(fā)明提供ー種用于進行凝集分析的試劑盒，供檢測樣品中分析物用，該試劑盒包含:1.結(jié)合兩個或更多個第一結(jié)合伴侶的中心，每ー個第一結(jié)合伴侶能夠結(jié)合分析物的第一個表位；i1.包含第二結(jié)合伴侶的部分，所述第二結(jié)合伴侶結(jié)合或能夠結(jié)合第二個表位，其中所述部分也結(jié)合或能夠結(jié)合可檢測顆粒。在本發(fā)明的一個實施方式中，包含第二結(jié)合伴侶的部分進ー步包含能夠結(jié)合可檢測顆粒的第三結(jié)合伴侶。優(yōu)選地，所述部分由第二結(jié)合伴侶的偶聯(lián)物組成，所述第二結(jié)合伴侶能夠結(jié)合分析物的第二表位和能夠結(jié)合可檢測顆粒的第三結(jié)合伴侶。在一個優(yōu)選的實施方式中，第二和第三結(jié)合伴侶是經(jīng)修飾的抗體，或其有功能的抗原結(jié)合片段。在一個可選擇的實施方式中，第二結(jié)合伴侶直接結(jié)合可檢測顆?；蛩軌蛉绱?。因此這種情況下該試劑盒包含i)兩個或更多個第一結(jié)合伴侶結(jié)合的中心，每個第一結(jié)合伴侶能夠結(jié)合分析物的第一個表位；ii)能夠結(jié)合分析物的第二表位并結(jié)合或能夠結(jié)合可檢測顆粒的第二結(jié)合伴侶。在一個優(yōu)選的實施方式中，分析物的第一和第二個表位是不同的，更優(yōu)選表位位于分析物的不同結(jié)構(gòu)域上。還優(yōu)選第二結(jié)合伴侶將分析物的不同表位與被相應的第一結(jié)合伴侶靶定的表位相結(jié)合。優(yōu)選第二表位對分析物有特異性。在第一個高度優(yōu)選的實施方式中，試劑盒是側(cè)流的形式并且包含多孔載體。進ー步優(yōu)選多孔載體是固體基質(zhì)，最優(yōu)選纖維性基質(zhì)。有利的是，多孔載體包含的檢測區(qū)域的孔徑阻止凝集物向所述檢測區(qū)域的下游移動。優(yōu)選所述檢測區(qū)域上游的孔徑足以容許中心、第二結(jié)合伴侶、樣品和任何凝集物的自由移動。優(yōu)選地，該試劑盒用于檢測單個樣品內(nèi)的第一、第二和其它的分析物，包含兩個或更多個第一結(jié)合伴侶，每ー個都能夠結(jié)合第一、第二和其它分析物中的ー個，以及兩個或更多個第二結(jié)合伴侶，每ー個都能夠結(jié)合所述第一、第二和其它分析物中的一個并且每個第ニ結(jié)合伴侶結(jié)合或能夠結(jié)合可檢測顆粒。更優(yōu)選每個第二結(jié)合伴侶結(jié)合或能夠結(jié)合不同的可檢測顆粒。優(yōu)選前述的中心包含第一結(jié)合伴侶能夠結(jié)合的穩(wěn)定的載體，并且在高度優(yōu)選的實施方式中，該中心是可溶的。更優(yōu)選該中心由蛋白質(zhì)或多糖構(gòu)成，并且最優(yōu)選它含有氨基葡聚糖或其衍生物?；蛘?，中心是ー個不溶的部分，優(yōu)選血紅細胞，聚苯こ烯乳膠珠，膠體金，或不溶的大分子。優(yōu)選前述的結(jié)合伴侶選自單克隆或多克隆抗體，抗原，蛋白質(zhì)，酶，受體，適配體，寡核苷酸，糖，及其片段。高度優(yōu)選可檢測顆粒是可凝集的顆粒并且進ー步優(yōu)選所述可凝集的顆粒包括在該試劑盒中。在一個優(yōu)選的試劑盒的實施方式中，所述部分包含能夠結(jié)合分析物的ー個表位的第二結(jié)合伴侶，還包含能夠結(jié)合可凝集顆粒(優(yōu)選血紅細胞)上的血型糖蛋白分子的第三結(jié)合伴侶?；蛘?，可檢測顆粒是微生物，細胞，大分子，金屬膠體顆粒，珠子，炭，高嶺土或膨潤土。優(yōu)選是膠體金顆粒。在一個可選擇的實施方式中，該試劑盒進一歩包含反應裝置。優(yōu)選該反應裝置是毛細管檢測裝置，并且可進ー步優(yōu)選包含2個通路。還優(yōu)選每ー個通路包含上游和下游端，并且其中在上游端提供有ー個區(qū)域用于施加樣品和試劑。一種或這兩種試劑可以在制造期間預先施加到毛細管設(shè)備的通路中。該試劑盒可以進一歩包含一種或多種檢測器、信號處理器、顯示器和電源，其可以是反應裝置的整合部分。本發(fā)明的另ー個方面，提供了ー種分析方法，其中，如前文所述，樣品與中心和偶聯(lián)結(jié)合分子接觸，并且檢測流動的阻滯。如果試劑組不是在毛細管通路中預先放置并且干燥的，它們和樣品可以作為混合物或分別加入到反應裝置。在前ー種情形，在將混合物加入到毛細管通路之前，混合物可以短時間孵育，例如1-6分鐘，優(yōu)選2-5分鐘。當使用追加緩沖液時，它可以在另ー個短的時間間隔如2分鐘后加入。為了確定流速，反應的計時優(yōu)選地從加入緩沖液時開始。經(jīng)過一段預定的時間之后，假定任何的凝集反應已經(jīng)發(fā)生并且任何對照都已經(jīng)到達毛細管通路的下游端。此時可以獲取顯示裝置上的讀數(shù)。相應地，提供了用于檢測樣品中分析物的凝集分析，所述分析包含的步驟是:i樣品接觸a)結(jié)合兩個或更多個第一結(jié)合伴侶的中心，每個結(jié)合伴侶能夠結(jié)合分析物的第一個表位；b)包含能夠結(jié)合分析物的第二個表位的第二結(jié)合伴侶的部分，其中所述部分結(jié)合或能夠結(jié)合可凝集的顆粒；和c)可檢測顆粒；ii使所述中心、包含第二結(jié)合伴侶的部分、樣品和可檢測的顆粒反應；和iii檢測中心、偶聯(lián)物、可凝集顆粒和分析物的凝集。優(yōu)選，能夠結(jié)合第二表位的所述部分結(jié)合可檢測顆粒?；蛘咚诙Y(jié)合伴侶并且進一歩包含一個能夠結(jié)合可檢測顆粒的第三結(jié)合伴侶。在這種情況下，優(yōu)選包含所述第二和第三結(jié)合伴侶的偶聯(lián)物。在一個實施方式中，可凝集顆粒天然存在于樣品中并且優(yōu)選是血紅細胞。試劑和樣品可以在加入反應裝置之前混合，并且在預定時間后接著施加緩沖液。此外優(yōu)選地是通過顯示裝置顯示結(jié)果，所述結(jié)果在預定時間段后讀出。在一個示范的實施方式中，本發(fā)明提供了用于檢測樣品中分析物的凝集分析，該分析包含的步驟是:i將多孔載體與結(jié)合有兩個或更多個第一結(jié)合伴侶的中心，每個第一結(jié)合伴侶能夠結(jié)合分析物的第一個表位；能夠結(jié)合分析物的第二個表位并且結(jié)合或能夠結(jié)合可檢測顆粒的第二結(jié)合伴侶；樣品；和/或任選的可檢測顆粒接觸；ii使所述中心、第二結(jié)合伴侶、樣品和任選的所述可檢測顆粒反應；和iii檢測中心、第二結(jié)合伴侶和分析物在多孔載體中的凝集，其中凝集指示了樣品中分析物的存在和/或量。優(yōu)選地，在分析開始之前，將中心、第二結(jié)合伴侶、樣品和/或可檢測顆粒施加到多孔載體。高度優(yōu)選通過看到條帶或信號來檢測凝集。本發(fā)明的第三個方面，提供了用于凝集分析的裝置，包含的多孔載體具有用于接受樣品的近端以及樣品沿著多孔載體流向的遠端，其中多孔載體包含干的可復水(reconstitutable)形式的中心,其結(jié)合有兩個或更多個第一結(jié)合伴侶,姆個第一結(jié)合伴侶能夠結(jié)合分析物的第一個表位。本發(fā)明的試劑盒可以作為ー個包裝提供，其可包含一個單獨的反應裝置和單次分析用的充足試劑，例如用于護理現(xiàn)場的環(huán)境。或者，可以提供多個裝置和用于相同數(shù)目的分析的充足的試劑。優(yōu)選，在這種情況下，毎次分析的試劑單獨包裝。任選上述提到的材料和器械可以包含在試劑盒中，例如緩沖液，可檢測顆粒，施加器(如移液管)，說明書，記錄紙，干燥劑，對照樣品，染料，電池和/或信號處理/顯示器。最后，本發(fā)明提供了用于凝集分析以檢測樣品中分析物的裝置，該裝置包含的多孔載體具有用于接受樣品的近端以及樣品沿著多孔載體流向的遠端，其中多孔載體包含干的可復水形式的中心，所述中心結(jié)合有兩個或更多個第一結(jié)合伴侶，每個第一結(jié)合伴侶能夠結(jié)合分析物的第一個表位。優(yōu)選該裝置包含第二結(jié)合伴侶、可檢測顆粒、和/或其它預先施加到多孔載體中的其它試劑，優(yōu)選以干的可復水的形式，并且容納在優(yōu)選能夠手持的裝置或容器中。本發(fā)明適于檢測體液樣品，例如尿液，全血，血液成分如血漿,精液,汗液,唾液,羊膜液，腦脊液，胸膜液，齒齦液，囊腫提取物，以及組織提取物。優(yōu)選的是尿液和血液樣品。當分析血液樣品時，血液必需處理以防止凝固。整個本說明書的說明部分和權(quán)利要求，詞匯“包含(comprise)”和“含有(contain)”及所述詞匯的變化形式，例如“包含(comprising)”和“包含(comprises)”,意思是“包括但不限干”，并且不是為了(也沒有)排除其它的部分，添加剤，成分，整數(shù)或步驟。整個本說明書中說明部分和權(quán)利要求，除非文中另有要求，単數(shù)包含有復數(shù)。特別是，當使用不定的物品時，除非文中另有要求，說明書應當理解為慮及復數(shù)和単數(shù)。結(jié)合本發(fā)明的具體方面具體實施方式或?qū)嵤├枋龅奶卣鳌⒄麛?shù)、特點、化合物、化學部分或基團應理解為可適于這里所述的任何其它方面具體實施方式或?qū)嵤├?，除非其不相客。附圖簡要說明本發(fā)明將通過如下的非限定性實施例，并且參考附圖進行說明，其中:圖1顯示了使用濕試劑的測試用膜條帶的組件。標記的部分是:1，吸液芯；2，凝集物捕集膜；3，吸收槽；4，粘貼面朝上的自粘性塑料。圖2顯示了使用干燥的試劑的測試用膜條帶的組件。標記的部分是:1，吸液芯；2，凝集物捕集膜；3，吸收槽；4，粘貼面朝上的自粘性塑料；5，含有干燥的試劑的墊子。圖3展示了一個膜條帶的示例。標記的部分是:1，覆蓋整個膜條帶的多層密封條；2，用Tween處理過的吸收芯GFD;3，吸液芯(Ahlstromgrade8964);4，F(xiàn)usion5捕獲膜；5，含有干燥的試劑的試劑釋放墊。圖4顯示了本發(fā)明的ー個方面的示意圖，基于中心(I)的凝集分析，展示第一結(jié)合伴侶(2，例如抗人絨毛膜促性腺激素或抗hCG)，能夠結(jié)合分析物(3，例如hCG，包括a和運亞單位)的第一個抗原表位，部分(4)包含能夠結(jié)合分析物的第二表位的第二結(jié)合伴侶以及能夠結(jié)合可檢測顆粒的第三結(jié)合伴侶在一起的偶聯(lián)物，在這種情況下，血紅細胞(5)帶有第三結(jié)合伴侶特異結(jié)合的血型糖蛋白抗原決定簇。所有部分于是構(gòu)成了穩(wěn)定的凝集產(chǎn)物。圖5顯示了來自如實施例15所詳細描述的使用可溶性中心和抗體結(jié)合物的分析結(jié)果。實施例實施例1.可溶性中心試劑I的制備1.使用1.6X15cm的G25M葡聚糖凝膠柱，將抗hCG(a亞單位)脫鹽到pH7.5的0.1M磷酸鹽緩沖液中，并測定濃度和收率。2.使用8摩爾當量的NHS-PEG-MAL激活抗hCG抗體。將反應混合物在20°C孵育2小吋。用100摩爾當量的甘氨酸淬滅反應，并用兩次過1.6X15cm的G50F葡聚糖凝膠柱，將馬來酰亞胺激活的抗hCG脫鹽到pH7.3的5mMEDTA，PBS緩沖液中。測定激活的抗體的濃度和收率。3.用1000摩爾當量的2-亞氨硫醇(2-1T)活化500KD的氨基葡聚糖。將反應混合物在20°C孵育110分鐘。用G25M葡聚糖凝膠介質(zhì)，將硫醇激活的氨基葡聚糖脫鹽到pH7.3的5mMEDTA,PBS緩沖液中。用Ellman分析測定硫醇:氨基葡聚糖的摻入率。4.將25摩爾當量的馬來酰亞胺活化的抗hCG抗體加入到硫醇激活的氨基葡聚糖中，并將反應混合物在15°C孵育16小吋。用1000當量的N-こ基馬來酰亞胺淬滅反應。在2.6X50cm的superdex200柱上用pH7.2的50mMPBS緩沖液作為洗脫液純化偶聯(lián)物。測定偶聯(lián)物的濃度和收率，然后用0.2iim的Ministar過濾器進行過濾。實施例2.可溶性中心試劑2的制備1.使用1.6X15cm的G25M葡聚糖凝膠柱，將抗hCG(a亞單位)脫鹽到pH7.5的0.1M磷酸鹽緩沖液中，并測定濃度和收率。。2.使用8摩爾當量的NHS-PEG-MAL激活抗-hCG抗體。將反應混合物在20°C孵育2小吋。用100摩爾當量的甘氨酸淬滅反應，并用兩次過1.6X15cm的G50F葡聚糖凝膠柱，將馬來酰亞胺激活的抗hCG脫鹽到pH7.3的5mMEDTA,PBS緩沖液中。測定激活的抗體的濃度和收率。3.用1000摩爾當量的2-亞氨硫醇(2-1T)激活ー個500KD的氨基葡聚糖。將反應混合物在20°C孵育110分鐘。用G25M葡聚糖凝膠介質(zhì)，將硫醇激活的氨基葡聚糖脫鹽到PH7.3的5mMEDTA,PBS緩沖液中。用Ellman分析測定硫醇:氨基葡聚糖的摻入率。4.將25摩爾當量的馬來酰亞胺激活的抗hCG抗體加入到硫醇激活的氨基葡聚糖中并將反應混合物在15°C孵育16小吋。5.使用8摩爾當量的mPEG-SMB(lOKD)，以“PEG”基團包覆偶聯(lián)體。將反應混合物在20°C孵育2小時。用甘氨酸和N-こ基馬來酰亞胺淬滅反應。在2.6X50cn^々superdex200柱子上用PH7.2的50mMPBS作為洗脫液純化偶聯(lián)物。測定偶聯(lián)物的濃度和收率，然后過濾通過0.2um的Ministar過濾器。實施例3.使用濕試劑制備用于測試的膜條帶膜材料被切成如下尺寸:(i)吸液芯，例如SurewickG028-14(Millipore),30mmX60mm。(ii)凝集物捕集膜，例如Fusion5(Whatman),5_X60mm。(iii)吸收槽，例如AbsorbentPad222(Ahlstrom),55mmX60mm。(iv)自粘性塑料(X2)例如具有D/C親水性PSA的0.04”Clear聚酯(G&L)70mmX100mm。由上述材料的復合“卡片”組裝成如圖1所示。為確保條帶的連續(xù)部分之間良好的液體運送，紙鄰的膜材料重疊大約1_。第二片自粘性塑料被牢固地施加到上表面。顯示結(jié)果的“卡片”被切片成5_的條帶并且塑料被修整以容許試劑和樣品進入到吸液芯。實施例4.含有干燥的試劑的膜條帶的制備下列試劑混合物被移液到偶聯(lián)物釋放墊的條帶(例如Ahlstrom8964)上,所述條帶據(jù)測為6mmX50mm。75U1抗1^6免疫金(8.六.^^640，881)50ill抗hCG中心試劑(制備如實施例1或2所描述)4211MTris-HClpH8.2，20%海藻糖條帶在28°C下干燥過夜。吸收槽材料(GF/D，Whatman)在0.1%的tween20溶液中浸泡。過量的流體通過吸收紙之間的排放和吸出去除，然后經(jīng)處理的槽在28。C下干燥過夜。膜材料被切成如下尺寸:(1)吸液芯(父2)，例如偶聯(lián)物釋放墊8964(Ahlstrom),7_X50_。(ii)凝集物捕集膜，例如Fusion5(Whatman),5_X50mm。(iii)吸收槽，例如Tween處理的GF/D(Ahlstrom),50mmX50mm。(iv)自粘性塑料(X2)例如含有D/C親水性PSA的0.04”Clear聚酯(G&L)，80_X60_。上述材料的復合“卡片”如圖2所示組裝。為確保條帶的連續(xù)部分之間良好的液體運送，紙鄰的膜材料重疊大約1_。第二片自粘性塑料被牢固施加在上表面。顯示結(jié)果的“卡片”被切片成5_的條帶并且塑料被修整以容許試劑和樣品進入到吸液芯。_5]實施例5.用濕試劑的hCG測試下列試劑混合物在微量離心管中混合，然后施加到膜條帶的吸液芯端(制備如實施例3所描述)。5U1抗1^6免疫金(8^.^^640，881)5ill抗hCG中心試劑(制備如實施例1所描述)條帶的吸液芯端被浸入到250u10.0lMPBSpH7.4，含有0_25IU/mlhCG的0.1%BSA中，條帶方向垂直(hCG濃度值對照第四版1.S.，NIBSC指定)。當測試完成，即流體已經(jīng)到達條帶的頂部，將凝集物捕集膜的彩色信號與標準彩色曲線(Dulux色彩范圍FR4,50RR83/040-62RR21/444)比較并且在+/-到+++++的尺度上賦予信號一個值。獲取數(shù)碼照片，以記錄剛剛進行的測試的外觀。獲得下列結(jié)果:表I權(quán)利要求1.一種用于進行凝集分析以檢測樣品中分析物的試劑盒，該試劑盒包含:合兩個或更多個第一結(jié)合伴侶的中心，每個第一結(jié)合伴侶能夠結(jié)合分析物的第一個表位；ii包含結(jié)合或能夠結(jié)合第二個表位的第二結(jié)合伴侶的部分，其中所述部分也能夠結(jié)合可檢測的顆粒。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中包含第二結(jié)合伴侶的所述部分進ー步包含能夠結(jié)合可檢測顆粒的第三結(jié)合伴侶。3.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項所述的試劑盒，其中第二結(jié)合伴侶將分析物上的不同表位與受相應的第一結(jié)合伴侶靶定的表位相結(jié)合。4.根據(jù)前述的任一項權(quán)利要求所述的用于檢測單個樣品內(nèi)的第一、第二以及其它分析物的試劑盒，所述試劑盒包含兩個或更多個第一結(jié)合伴侶，每ー個都能夠結(jié)合第一、第二和其它分析物之一，以及兩個或更多個第二結(jié)合伴侶，每ー個都能夠結(jié)合所述的第一、第二和其它分析物之一，并且每ー個第二結(jié)合伴侶結(jié)合或能夠結(jié)合可檢測顆粒。5.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項所述的試劑盒，其中中心包含第一結(jié)合伴侶能夠附加的穩(wěn)定的載體。6.根據(jù)前述的任一項權(quán)利要求所述的試劑盒，其中所述中心是可溶的。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中所述中心是蛋白質(zhì)或多糖，例如氨基葡聚糖或其衍生物。8.根據(jù)前述的任一項權(quán)利要求所述的試劑盒，其中結(jié)合伴侶選自單克隆或多克隆抗體，抗原，蛋白質(zhì)，酶，受體，適配體，寡核苷酸，糖，及其片段。9.根據(jù)前述的任一項權(quán)利要求所述的試劑盒，其中可檢測顆粒是可凝集顆粒。10.根據(jù)前述的任一項權(quán)利要求所述的試劑盒，進一歩包含多孔載體。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，其中所述多孔載體是纖維性的。12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的試劑盒，其中所述多孔載體包含檢測區(qū)域，其孔徑阻止凝集物向所述檢測區(qū)域的下游移動。13.根據(jù)前述的任一項權(quán)利要求所述的試劑盒，進ー步包含一種或多種檢測器，信號處理器，顯不器以及電源。14.關(guān)于凝集分析以檢測樣品內(nèi)分析物的裝置，所述裝置包含的多孔載體具有用于接受樣品的近端以及樣品可以沿著多孔載體流向的遠端，其中多孔載體包含干的可復水形式的中心，其結(jié)合有兩個或更多個第一結(jié)合伴侶，每ー個第一結(jié)合伴侶能夠結(jié)合分析物的第ー個表位。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的裝置，進ー步包含第二結(jié)合伴侶，可檢測顆粒，和/或其它預先施加到多孔載體的試劑，優(yōu)選干的、可復水的形式。16.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的裝置，其中所述中心、結(jié)合伴侶、可檢測顆粒和分析物如權(quán)利要求1到9所限定。17.關(guān)于檢測樣品中分析物的凝集分析法，所述分析法包含下列步驟:樣品與下列物質(zhì)接觸:a)結(jié)合兩個或更多個第一結(jié)合伴侶的中心，每ー個結(jié)合伴侶能夠結(jié)合分析物的第一個表位；b)包含第二結(jié)合伴侶的部分，所述第二結(jié)合伴侶能夠結(jié)合分析物的第二個表位，其中所述部分也能夠結(jié)合可凝集顆粒；和C)可檢測顆粒。i1.使所述中心、包含第二結(jié)合伴侶的所述部分，樣品和可檢測顆粒反應；和ii1.檢測中心、偶聯(lián)物、可凝集顆粒和分析物的凝集。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的分析法，其中能夠結(jié)合第二個表位的部分與可檢測顆粒結(jié)合.19.一種用于檢測樣品中分析物的凝集分析法，所述分析法包含下列步驟:多孔載體與下列物質(zhì)接觸:結(jié)合有兩個或更多個第一結(jié)合伴侶的中心，每ー個第ー結(jié)合伴侶能夠結(jié)合分析物的第一個表位；能夠結(jié)合分析物的第二個表位并且結(jié)合或能夠結(jié)合可檢測顆粒的第二結(jié)合伴侶；樣品；和/或任選的可檢測顆粒；ii使所述中心、第二結(jié)合伴侶、樣品和任選的所述可檢測顆粒反應；和ii1.檢測中心、第二結(jié)合伴侶和分析物在多孔載體中的凝集，其中凝集指示樣品中分析物的存在和/或量。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的凝集分析法，其中所述中心、結(jié)合伴侶、可檢測顆粒和分析物如權(quán)利要求1到9所限定。21.一種包裝，包含權(quán)利要求14-16任一項所述的ー個或多個裝置以及用于相同次數(shù)分析的充足的試劑。全文摘要本發(fā)明涉及凝集分析法，及相關(guān)試劑盒、試劑和裝置。特別是公開了分析擁有不多的表位的小分析物的方法，所述方法使用了多個分析物可能通過第一個表位結(jié)合的中心部分，以及能夠結(jié)合的第二個分析物表位并且也能夠結(jié)合可檢測顆粒的另外的部分。由此可能會形成穩(wěn)定的凝集復合物，其可以作為各種分析形式的基礎(chǔ)。文檔編號G01N33/543GK103091487SQ201210574729公開日2013年5月8日申請日期2006年11月13日優(yōu)先權(quán)日2005年11月12日發(fā)明者卡羅林·珍妮弗·拉德爾,杰拉德·約翰·阿蘭,道格拉斯·羅伯特·艾文斯,伊麗莎白·加納爾申請人:平臺診斷有限公司