專利名稱：一種檢測活性細菌含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測活性細菌含量的方法，特別涉及一種通過聯(lián)合使用CTC染料染色和流式細胞儀來檢測活性細菌含量的方法。
背景技術(shù)：
細菌總數(shù)是指ImL水樣中的好氧菌、兼性厭氧菌和異養(yǎng)菌在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)24h后，所生長細菌菌落的總數(shù)(《水和廢水監(jiān)測分析方法》(第三版))。細菌總數(shù)作為我國《生活飲用水衛(wèi)生標準》(GB5749-2006)規(guī)定的水質(zhì)常規(guī)指標之一，在評價水質(zhì)方面具有很大的參考價值。
營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)法具有一定的局限性，自然環(huán)境中只有一小部分的細菌可以在平板上被計數(shù)，有研究表面，海水中可被培養(yǎng)法檢測到的細菌只占細菌總數(shù)的O. 8%。此外，很多厭氧菌和兼性菌無法利用平板培養(yǎng)法檢測。不同細菌對溫度、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基等培養(yǎng)條件十分敏感，營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)法難以對各種菌同時進行有效的檢測。并且，營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)法通常需要的檢測時間較長(需24h)。同時，大量研究表明，很多細菌在外界環(huán)境壓力(如高溫)下，可進入“具有活性但無法培養(yǎng)” (Viablebut not culturable, VBNC)的狀態(tài)，致使某些病原菌無法在平板培養(yǎng)基上形成菌落，但仍然保持一定代謝能力和致病性，VBNC狀態(tài)病原菌能夠在適宜條件下恢復其感染性。此外，在平板中的細菌不會全部以相同的速度生成菌落，形成的菌落大小也不同，如果生成了一些微小的菌落，在計數(shù)過程中可能被漏掉。因此，平板培養(yǎng)法不能夠準確反映水中活性細菌總量。CTC染料(一種氧化還原性染料，英文名稱為5-cyano_2, 3-ditolyltetrazoliumchloride,中文名稱為5-氰基-2，3- 二甲苯基氯化四氮唑,結(jié)構(gòu)式見式(I )。Cl式 U)。
ΧχCTC染料是一種無色的可滲透細胞膜的物質(zhì)，可以被細菌細胞通過電子傳遞鏈還原，在細胞內(nèi)形成紅色熒光沉淀物質(zhì)CTF (CTC-Formazan,在450/630nm下被激發(fā))，生成CTF的含量與CTC濃度、孵育時間有關(guān)?？梢赃€原CTC并產(chǎn)生熒光的細胞即具有呼吸活性的細胞(CTC+)。同時，CTC染料相比與其它氧化還原染料還具有一個獨特的優(yōu)勢，即其可以與好氧菌、厭氧菌以及兼性細菌反應。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測活性細菌含量的方法，特別涉及一種通過聯(lián)合使用CTC染料染色和流式細胞儀來檢測活性細菌含量的方法(簡稱CTC-流式細胞儀法或CTC-FCM 法)。本發(fā)明提供的第一種檢測活性細菌含量的方法，是將CTC染料與待測液體樣本共孵育，然后通過流式細胞儀檢測所述待測液體樣本中的活性細菌含量。所述“通過流式細胞儀檢測所述待測液體樣本(如水樣)中的活性細菌含量”的實現(xiàn)方法如下采用流式細胞儀，在450/630nm的激發(fā)光下計數(shù)可發(fā)出紅色熒光的物質(zhì)，每個可發(fā)出紅色熒光的物質(zhì)代表一個活性細菌。所述方法中，所述共孵育的初始體系具體可由CTC水溶液、待測液體樣本(或待測液體樣本的稀釋液)和NaCl水溶液組成。所述方法中，所述共孵育的初始體系具體可由20 μ L CTC水溶液、10 μ L待測液體樣本(或待測液體樣本的稀釋液)和70 μ L0. 85g/100mLNaCl水溶液組成。所述方法中，所述共孵育的初始體系中，所述CTC染料的濃度具體可為 2mmol/L。所述共孵育的時間具體可為3小時。所述細菌具體可為大腸桿菌。上述方法中，流式細胞儀參數(shù)設置可為FL1:4. 11;FL2:6. 29;FL3:5. 47 ;每次測量的體積為可50 μ L。本發(fā)明提供的另一種檢測活性細菌含量的方法，是將CTC染料與待測固體樣本在液相體系中共孵育，然后通過流式細胞儀檢測所述待測固體樣本中的活性細菌含量。所述“通過流式細胞儀檢測所述待測固體樣本中的活性細菌含量”的實現(xiàn)方法如下采用流式細胞儀，在450/630nm的激發(fā)光下計數(shù)可發(fā)出紅色熒光的物質(zhì)，每個可發(fā)出紅色熒光的物質(zhì)代表一個活性細菌。所述方法中，所述共孵育的初始體系具體可由CTC水溶液、待測固體樣本的懸浮液和NaCl水溶液組成。所述方法中，所述共孵育的初始體系具體可由20 μ L CTC水溶液、10 μ L待測固體樣本的懸浮液和70 μ L O. 85g/100mL NaCl水溶液組成。所述方法中，所述共孵育的初始體系中，所述CTC染料的濃度具體可為2mmol/L。所述共孵育的時間具體可為3小時。所述細菌具體可為大腸桿菌。上述方法中，流式細胞儀參數(shù)設置可為FL1:4. 11;FL2:6. 29;FL3:5. 47 ;每次測量的體積為可50 μ L。根據(jù)不同的研究目的，CTC染料可以與其它技術(shù)相結(jié)合，如將CTC染料染色與掃描隧道電子顯微鏡結(jié)合，將CTC染料染色與共聚焦激光電子顯微鏡結(jié)合等。如果采用CTC染料染色與共聚焦激光電子顯微鏡結(jié)合來檢測活細胞，會存在如下局限性由于細胞自身的代謝特點，使得一些細胞只能在細胞內(nèi)積累少量的CTF，達不到熒光顯微鏡檢測的最小量，而使得檢測結(jié)果低于樣品中實際活性細菌數(shù)；CTC染料染色方法的不同(主要包括CTC染料的終濃度與樣品混合后的孵育時間)，對實驗結(jié)果也會有較大的影響。本發(fā)明提供的方法的檢測原理如下以細胞的呼吸代謝活性作為活性細菌的評判標準；CTC染料可滲透細菌細胞膜，與具有呼吸代謝活性的細菌內(nèi)的電子傳遞鏈反應，在細胞內(nèi)形成紅色熒光沉淀，進而可通過流式細胞儀檢測；流式細胞儀可記錄樣品中單個顆粒的側(cè)向散射光(side light scatter, SS)、綠突光(green fluorescence, FLl, 53015nm)、澄突光(orange fluorescence, FL2, 58521nm)和紅突光(redfluorescence, FL3, >650nm);本發(fā)明中，采用FL3為檢測器時，活性細菌和CTC染料反應產(chǎn)生的紅色熒光物質(zhì)被激發(fā)，從而實現(xiàn)細菌計數(shù)。本發(fā)明提供的方法的檢測原理和流程如圖I所示。本發(fā)明中采用靈敏的檢測儀器(流式細胞儀)檢測微弱標記的細胞以及確定最佳實驗條件，可以大大提高所測定的活性細菌的準確度，以達到準確、快速檢測活性病原菌的目的。本發(fā)明所采用的方法快速、簡便，具有廣譜識別性，能夠準確、快速檢測到活性病原菌，可以用于環(huán)境樣品中活性病原菌的檢測。


圖I為CTC-流式細胞儀法檢測活性菌流程圖。圖2為不同CTC染料濃度及孵育時間下的結(jié)果。圖3為大腸桿菌的平板培養(yǎng)法與CTC-流式細胞儀法計數(shù)結(jié)果比較。 圖4為實際水樣的平板培養(yǎng)法與CTC-流式細胞儀法分析結(jié)果比較。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結(jié)果取平均值。實施例中所用的PBS緩沖液均為pH 7.2,0. IM的PBS緩沖液。實施例中所用的大腸桿菌，又稱大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli):中國普通微生物菌種保存管理中心(網(wǎng)址為 http://www. cgmcc. net/),CGMCC 編號為 1.2385。CTC 染料購自 Molecular Probes,貨號為 B34956。實施例I、CTC-FCM方法的最佳濃度及孵育時間的優(yōu)化I、將大腸桿菌菌液接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37°C、160rpm振蕩培養(yǎng)16h。2、取100 μ L步驟I得到的菌液，用PBS緩沖液稀釋至lmL，然后4°C、12000rpm離心5min，收集菌體沉淀并重懸于IOOmL PBS緩沖液，得到活菌濃度為105CFU/mL的菌懸液。3、用無菌水將CTC染料配置成濃度為lOmmol/L的CTC儲備溶液。4、分別配制如下反應體系反應體系甲由10 μ L步驟3制備的CTC儲備溶液、IOyL步驟2制備的菌懸液和80 μ L 0. 85g/100mL NaCl 水溶液組成；反應體系乙由20 μ L步驟3制備的CTC儲備溶液、IOyL步驟2制備的菌懸液和70 μ L 0. 85g/100mL NaCl 水溶液組成；反應體系丙由50 μ L步驟3制備的CTC儲備溶液、IOyL步驟2制備的菌懸液和40 μ L 0. 85g/100mL NaCl 水溶液組成；將上述各個反應體系37°C避光(即黑暗條件)孵育，分別于孵育0. Ih,0. 5h、lh、2h、3h、4h、6h、10h和24h后取樣，利用流式細胞儀計數(shù)可發(fā)出紅色熒光的物質(zhì)，每個可發(fā)出紅色熒光的物質(zhì)代表一個活性細菌。計算細菌濃度時，先將可發(fā)出紅色熒光的物質(zhì)的數(shù)量除以用于流式細胞儀計數(shù)的溶液的體積(0. 05mL)，然后再乘以10 (因為步驟2的菌懸液與反應體系的體積比為1:10)，得到步驟2得到的菌懸液中的活性細菌濃度，單位為“個/mL”。進行三次重復實驗，結(jié)果取平均值。結(jié)果見表I和圖2。圖2中，橫坐標為孵育時間，縱坐標為菌懸液中的活性細菌濃度。表I各個反應體系孵育各個時間后檢測出來的菌懸液中的活性細菌濃度(個/mL)
孵育時間反應體系甲反應體系乙反應體系丙O. Ih168003420033800
0.5h22000109200 34800
Th68200233400 130000
2h379000
3h412400
4h140000 322000 149000
6h232000
Toh628008760063800
24h3100068003000注表示無相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果表明當孵育時間相同時，反應體系甲(CTC染料的初始濃度為lmmol/L)和反應體系丙(CTC染料的初始濃度為5mmol/L)中可以由流式細胞儀檢測出的活性細胞數(shù)量遠小于反應體系乙(CTC染料的初始濃度為2mmol/L)。分析原因如下當CTC染料濃度過小時，不能與全部的具有活性的細菌細胞結(jié)合；當CTC染料濃度過高時，對細菌細胞產(chǎn)生一定的毒性。由此，本發(fā)明確定的CTC染料的最佳使用濃度為2mmol/L。結(jié)果表明當CTC染料濃度相同時，隨著孵育時間的增加，可由流式細胞儀檢測出的細胞數(shù)量先增加后減少，當孵育時間為3h時檢測結(jié)果達到最大值。分析原因如下CTC染料剛剛與細菌細胞進行孵育時，需要一定的適應期適應環(huán)境的改變，之后進行呼吸代謝；當CTC染料與細胞反應時間過長時，細胞代謝活性下降，且長時間的反應使CTC染料對細胞產(chǎn)生毒害作用。由此，本發(fā)明確定的CTC染料對活性細菌染色的最佳的孵育時間為3h。實施例2、采用CTC-FCM方法檢測活性細菌含量的檢測效果一、CTC-FCM 方法I、將大腸桿菌菌液接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37°C、160rpm振蕩培養(yǎng)16h。2、取100 μ L步驟I得到的菌液，用PBS緩沖液稀釋至lmL，然后4°C、12000rpm離心5min，收集菌體沉淀并重懸于IOOmL PBS緩沖液，得到活菌濃度為105CFU/mL的菌懸液(菌懸液甲)。3、用無菌水將CTC染料配置成濃度為lOmmol/L的CTC儲備溶液。4、將菌懸液甲在70°C、300rpm振蕩滅活I(lǐng)Omin (本步驟的目的是熱滅活細菌)，得到的菌懸液命名為菌懸液乙。5、分別配制如下樣本液樣本液I :菌懸液乙；樣本液II : 2體積份菌懸液甲+8體積份菌懸液乙；樣本液III 4體積份菌懸液甲+6體積份菌懸液乙； 樣本液IV 6體積份菌懸液甲+4體積份菌懸液乙；樣本液V 8體積份菌懸液甲+2體積份菌懸液乙；樣本也VI:菌懸液甲。6、分別配制各個樣本液的反應體系由20 μ L步驟3制備的CTC儲備溶液、10 μ L步驟5制備的樣本液和70 μ L O. 85g/100mL NaCl水溶液組成。將反應體系37°C避光(即黑暗條件)孵育3h后取樣，利用流式細胞儀計數(shù)可發(fā)出紅色熒光的物質(zhì)，每個可發(fā)出紅色熒光的物質(zhì)代表一個活性細菌。計算細菌濃度時，先將可發(fā)出紅色熒光的物質(zhì)的數(shù)量除以用于流式細胞儀計數(shù)的溶液的體積(O. 050mL)，然后再乘以10(因為步驟2的菌懸液與反應體系的體積比為1:10)，得到步驟5得到的樣本液中的活性細菌濃度，單位為“個/mL”。二、對照方法(平板培養(yǎng)計數(shù)法)同時，將步驟一的5得到的各個樣本液分別涂布于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基平板上，37°C避光培養(yǎng)48小時，通過計數(shù)CFU計算樣本液中的活性細菌濃度。進行三次重復實驗，結(jié)果取平均值。結(jié)果見表2和圖3。圖3中，橫坐標表示培養(yǎng)法計數(shù)所得結(jié)果的對數(shù)值，縱坐標表示CTC-FCM檢測方法所得結(jié)果的對數(shù)值。表2通過流式細胞儀檢測得到的各個樣本液中的活性細菌濃度(Iog10活性細菌濃度)
權(quán)利要求
1.一種檢測活性細菌含量的方法，是將CTC染料與待測液體樣本共孵育，然后通過流式細胞儀檢測所述待測液體樣本中的活性細菌含量。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述“通過流式細胞儀檢測所述待測液體樣本中的活性細菌含量”的實現(xiàn)方法如下采用流式細胞儀，在450/630nm的激發(fā)光下計數(shù)可發(fā)出紅色熒光的物質(zhì)，每個可發(fā)出紅色熒光的物質(zhì)代表一個活性細菌。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述共孵育的時間為3小時。
4.如權(quán)利要求I至3中任一所述的方法，其特征在于所述CTC染料的初始工作濃度為 2mmol/L。
5.如權(quán)利要求I至4中任一所述的方法，其特征在于所述細菌為大腸桿菌。
6.一種檢測活性細菌含量的方法，是將CTC染料與待測固體樣本的在液相體系中共孵育，然后通過流式細胞儀檢測所述待測液體固體樣本中的活性細菌含量。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述“通過流式細胞儀檢測所述待測固體樣本中的活性細菌含量”的實現(xiàn)方法如下采用流式細胞儀，在450/630nm的激發(fā)光下計數(shù)可發(fā)出紅色熒光的物質(zhì)，每個可發(fā)出紅色熒光的物質(zhì)代表一個活性細菌。
8.如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述共孵育的時間為3小時。
9.如權(quán)利要求6至8中任一所述的方法，其特征在于所述CTC染料的初始工作濃度為 2mmol/L。
10.如權(quán)利要求6至9中任一所述的方法，其特征在于所述細菌為大腸桿菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測活性細菌含量的方法，特別涉及一種通過聯(lián)合使用CTC染料染色和流式細胞儀來檢測活性細菌含量的方法(簡稱CTC-流式細胞儀法或CTC-FCM法)。本發(fā)明提供的第一種檢測活性細菌含量的方法，是將CTC染料與待測液體樣本共孵育，然后通過流式細胞儀檢測所述待測液體樣本中的活性細菌含量。本發(fā)明中采用靈敏的檢測儀器(流式細胞儀)檢測微弱標記的細胞以及確定最佳實驗條件，可以大大提高所測定的活性細菌的準確度，以達到準確、快速檢測活性病原菌的目的。本發(fā)明所采用的方法快速、簡便，具有廣譜識別性，能夠準確、快速檢測到活性病原菌，可以用于環(huán)境樣品中活性病原菌的檢測。
文檔編號G01N15/14GK102967545SQ20121043884
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月6日
發(fā)明者何苗, 李丹, 林怡雯, 楊天 申請人:清華大學