專利名稱：一種快速檢測(cè)銅離子的膠體金增敏層析試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種快速檢測(cè)銅離子的膠體金增敏層析試紙條及其制備方法和用途，屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
銅是全球用量比較大的重金屬之一，現(xiàn)代化工業(yè)以及農(nóng)藥化肥的使用、高銅動(dòng)物添加劑所伴生的銅對(duì)環(huán)境的污染日益嚴(yán)重。銅在自然界中分布極廣，在動(dòng)植物和人類生活中起到重要作用。高濃度的銅對(duì)水生生物和生態(tài)系統(tǒng)都有負(fù)面影響，抑制河流的自凈能力和破壞水的生物平衡系統(tǒng)。當(dāng)水中銅含量達(dá)0.01mg/L時(shí)，對(duì)水體自凈有明顯的抑制作用；超過3. Omg/L會(huì)產(chǎn)生異味；超過15mg/L就無法飲用，水生生物不能存活。工業(yè)廢水的排放是銅污染農(nóng)業(yè)土壤的主要來源。由于生物富集作用，銅在土壤和農(nóng)作物中累積，會(huì)造成農(nóng)作 物特別是水稻和大麥根系生長(zhǎng)不良，抑制植物的光合作用，并會(huì)污染糧食籽粒，嚴(yán)重的可造成植物的死亡。過量銅在人體內(nèi)富集，會(huì)出現(xiàn)惡心、嘔吐、上腹疼痛、急性溶血和腎小管變形等中毒現(xiàn)象，嚴(yán)重者還可導(dǎo)致急性腎衰等危害。銅粉塵可引起咽痛、咳嗽和咯痰，嚴(yán)重會(huì)導(dǎo)致胸悶氣憋，發(fā)冷發(fā)燒。我國(guó)地下水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB/T14848-93)中規(guī)定，主要適用于集中式生活飲用水水源及工、農(nóng)業(yè)用水的銅離子限量< I mg/L。因此對(duì)環(huán)境及農(nóng)產(chǎn)品中的銅含量的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)非常重要。目前，檢測(cè)銅離子的方法主要是儀器分析法。目前常用的重金屬儀器分析檢測(cè)方法包括電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)、石墨爐原子吸收法、紫外-可見分光光度法、原子熒光分析法等。以上這些檢測(cè)方法雖然能精確測(cè)量樣品中單種金屬的總量，但檢測(cè)相對(duì)費(fèi)力、費(fèi)時(shí)、費(fèi)用昂貴，需要進(jìn)行大量的樣品預(yù)處理，且樣品的檢測(cè)需在大型分析設(shè)備的室內(nèi)進(jìn)行，不能用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。另外，比色檢測(cè)方法靈敏度達(dá)不到要求，生物傳感器結(jié)合便攜式儀器仍處于研究階段。免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立為重金屬污染物的檢測(cè)提供了一種新的途徑。ELISA方法具有檢測(cè)速度較快、費(fèi)用低廉、簡(jiǎn)單易攜、高度的靈敏度和選擇性的特點(diǎn)。這種方法理論上能應(yīng)用于能產(chǎn)生合適抗體的任何污染物質(zhì)。近幾十年，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過選擇或合成雙功能鰲合劑鰲合重金屬離子并與載體蛋白偶聯(lián)制備出完全抗原，進(jìn)一步制備出金屬特異性單抗。目前，抗Hg(II)、In(III)、Cd(II)、Pb(II)、Cu(II)和Cr(III)等金屬鰲合劑復(fù)合物抗體相繼被研制出來。重金屬離子單克隆抗體的制備是免疫學(xué)檢測(cè)方法的基礎(chǔ)和關(guān)鍵因素。本發(fā)明在制備的銅完全抗原基礎(chǔ)上，采用雜交瘤技術(shù)制備了特異性抗重金屬銅的單克隆抗體，并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了鑒定，為免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。Paulk和Taylor自1971年首次將膠體金引入了免疫化學(xué),建立以膠體金標(biāo)記抗原(或抗體)檢測(cè)相應(yīng)抗體(或抗原)的免疫學(xué)新方法，為研制特異、敏感、快速(5 10 min出結(jié)果)和便捷的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)和臨床診斷方法奠定了基礎(chǔ)。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和食品安全快速檢測(cè)等領(lǐng)域，特別是膠體金免疫層析試紙條以其便捷、快速、準(zhǔn)確和無污染等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，成為目前進(jìn)行快速診斷的主要方法之一。膠體金標(biāo)記免疫層析技術(shù)具有敏感、特異、便捷、快速的特點(diǎn)，非常適合在基層和現(xiàn)場(chǎng)使用。目前應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)和試紙條技術(shù)檢測(cè)環(huán)境中的重金屬離子還處于實(shí)驗(yàn)室的試驗(yàn)階段。如果能夠應(yīng)用這些抗體在重金屬污染地區(qū)進(jìn)行的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和常規(guī)檢測(cè)，這對(duì)于重金屬污染地區(qū)的補(bǔ)救和恢復(fù)工作具有很大的意義，因而發(fā)展和普及應(yīng)用重金屬快速檢測(cè)技術(shù)潛力很大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)銅離子的技術(shù)的不足和缺陷，提供一種快速檢測(cè)銅離子的金標(biāo)增敏層析試紙條及其制備方法，使其能更加快速、簡(jiǎn)便、超靈敏檢測(cè)銅離子殘
&3甶O本發(fā)明的技術(shù)方案一種銅離子膠體金增敏層析檢測(cè)試紙條，由襯板I和在襯板 上依次銜接的樣品墊2、增敏墊4、金標(biāo)結(jié)合墊3、包被膜5和吸水墊6組成金標(biāo)結(jié)合墊3為吸附小金標(biāo)記銅離子抗體的玻璃纖維棉，增敏墊4為吸附大金標(biāo)記羊抗鼠IgG的玻璃纖維棉，在包被膜5上依次有用銅離子偶聯(lián)載體蛋白的溶液印制的直線式隱形檢測(cè)線T線7，同時(shí)用可以與銅單克隆抗體結(jié)合的羊抗鼠IgG溶液印制的直線式隱形對(duì)照線C線8，兩條線平行排列。所述小金標(biāo)記銅離子抗體為IOnm粒徑膠體金溶液標(biāo)記的銅離子抗體；
所述大金標(biāo)記羊抗鼠IgG為35nm粒徑膠體金溶液標(biāo)記的羊抗鼠IgG。所述的試紙條所述的襯板為不吸水的硬質(zhì)塑膠條，或不吸水硬紙條；所述的樣品墊為玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜、或聚酯膜；所述的包被膜為硝酸纖維素膜、純纖維素膜、或羧化纖維素膜；所述的吸水墊為吸水濾紙或?yàn)V油紙。所述的銅離子抗體為銅離子單克隆抗體；所述的金標(biāo)結(jié)合墊吸附小金標(biāo)記銅離子單克隆抗體；增敏墊吸附大金標(biāo)記羊抗鼠IgG，并能夠與銅離子抗體特異性結(jié)合；所述的偶聯(lián)銅離子的載體蛋白為匙孔血藍(lán)蛋白KLH，或?yàn)榕Ｑ灏椎鞍譈SA，雙功能偶聯(lián)劑為I-(4-異硫氰芐基)_乙烯基二胺-見N，IT，四乙酸(ITCBE)，螯合劑為乙二胺四乙酸(EDTA)。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的檢測(cè)試紙條具有下列優(yōu)點(diǎn)
①特異性強(qiáng)，敏感性高。該膠體金增敏層析檢測(cè)試紙條具有兩個(gè)金標(biāo)墊，金標(biāo)結(jié)合墊是小金標(biāo)記高親和力的銅離子單克隆抗體，金標(biāo)抗體中金顆粒與抗體分子之間無共價(jià)鍵形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金標(biāo)記對(duì)抗體的特異性和親和力影響很小，且具有較高的標(biāo)記率。增敏墊是大金標(biāo)記羊抗鼠IgG，可以和銅離子單克隆抗體特異性結(jié)合，目的是在減少小金標(biāo)記銅離子單克隆抗體的工作濃度，提高檢測(cè)靈敏度的同時(shí)，又保證陰性結(jié)果的空白值，避免假陽性。因此，該試紙條對(duì)其他重金屬離子沒有交叉，具有較強(qiáng)的特異性和較高的敏感性，檢出最低限量可達(dá)到10ng/mL。②簡(jiǎn)便、快速、時(shí)效性強(qiáng)。使用膠體金層析檢測(cè)試紙條，無需任何其它試劑和儀器，可現(xiàn)場(chǎng)操作，試紙條加入被檢樣品液后，在IOmin內(nèi)即可判定檢測(cè)結(jié)果。③結(jié)果顯示形象、直觀、準(zhǔn)確。檢測(cè)試紙條均以顯示紅色線T線和C線作為檢測(cè)結(jié)果陽性和陰性標(biāo)記，即在包被膜上顯示一條紅色線C線時(shí)，表示在被檢樣品中被檢物濃度高于檢測(cè)線；顯示兩條紅色線T線和C線時(shí)，表示在被檢樣品中被檢物濃度低于檢測(cè)線。結(jié)果判定形象、直觀、準(zhǔn)確，簡(jiǎn)單明了，不易出現(xiàn)假陽性和假陰性等人為誤判。④節(jié)省費(fèi)用，適用范圍廣，便于推廣。使用檢測(cè)試紙條，比用儀器分析和ELISA試劑盒的費(fèi)用大幅下降。另外，試紙條的適用范圍廣，可滿足不同層次人員需要，包括專業(yè)檢驗(yàn)，海關(guān)檢疫，衛(wèi)生檢疫，質(zhì)量監(jiān)測(cè)，加工企業(yè)和養(yǎng)殖場(chǎng)戶等，便于推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場(chǎng)前景和明顯的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益。


圖I銅離子膠體金增敏層析檢測(cè)試紙條剖面結(jié)構(gòu)示意圖。I、襯板，2、樣品墊，3、金標(biāo)結(jié)合墊，4、增敏墊，5、包被膜，6、吸水墊，7、隱形檢測(cè)線T線，8、隱形對(duì)照線C線。圖2銅離子膠體金增敏層析檢測(cè)試紙條俯視結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式要制成銅離子檢測(cè)試紙條，首先需要制備偶聯(lián)銅離子的載體蛋白，用于制備相應(yīng)的檢測(cè)線(T線)和免疫原制備抗體。I、銅與載體蛋白偶聯(lián)
免疫抗原銅-I- (4-異硫氰芐基)-乙烯基二胺-N，N，N，’ -四乙酸_匙孔血藍(lán)蛋白(Cu-EDTA-KLH)的制備。先將2mg的I- (4-異硫氰芐基)_乙烯基二胺-N，N, N\ -四乙酸(ITCBE)和4. 5mg的KLH蛋白在pH 9. 4的2-[4_(2_羥乙基)_1_哌嗪]乙磺酸(HEPES)緩沖液中反應(yīng)24h后，在4°C、8000r/min的條件下，超濾IOmin去除未偶聯(lián)上的ITCBE，再用pH7. 4的HEPES緩沖液洗取截留物，然后逐滴加入I mg/mL的Cu2+標(biāo)準(zhǔn)溶液1000 μ L反應(yīng)Ih后，使用超濾離心管去除未鰲合上的Cu2+，再用HEPES緩沖液稀釋截留物，最終得到2mL的溶液。使用前，用100 mmol/L EDTA和O. lmol/L pH 7. 4的HEPES緩沖液對(duì)超濾離心管預(yù)處理。 檢測(cè)抗原銅_1_ (4-異硫氛節(jié)基)_乙稀基二胺-N, N, Nf, f -四乙酸_牛血清白蛋白(Cu-EDTA-BSA)的制備，用BSA代替KLH，方法同上。無Cu2+檢測(cè)抗原I-(4_異硫氛節(jié)基)-乙稀基二胺四乙酸_牛血清白蛋白(ITCBE-BSA)的制備，用三蒸水替代Cu2+的標(biāo)準(zhǔn)溶液即可，用BSA替代KLH，其余步驟同上。2、抗銅離子單克隆抗體的制備
單抗制備用銅離子載體蛋白結(jié)合的免疫抗原(Cu-EDTA-KLH)免疫6_8周齡雌性BALB/c小鼠，免疫劑量為IOOyg/次，采用快速佐劑，腿部肌肉注射。首免，用銅離子載體蛋白免疫抗原與等體積快速佐劑I: I混合，充分混勻；首免3周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，方法同上，連續(xù)免疫3-4次,每次間隔3周,最后一次免疫后10 15天。完全抗原金屬離子-螯合劑-載體蛋白與螯合劑-載體蛋白同時(shí)包被酶標(biāo)板，以間接ELISA檢測(cè)小鼠血清效價(jià)，結(jié)果顯示小鼠血清效價(jià)可達(dá)I : 8000 I : 128000，并金屬離子-螯合劑-載體蛋白的OD值遠(yuǎn)大于螯合劑-載體蛋白檢測(cè)值，說明制備的抗原具有較好的免疫原性。免疫3-4次后對(duì)小鼠進(jìn)行尾靜脈加強(qiáng)免疫。3、單克隆抗體的制備和腹水純化取免疫小鼠脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選出穩(wěn)定分泌抗銅離子與EDAT螯合劑絡(luò)合物的單克隆抗體的陽性細(xì)胞株并擴(kuò)大培養(yǎng)，注射細(xì)胞進(jìn)小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)腹水；收集的腹水用辛酸硫酸銨法純化。4、膠體金制備
由于氯化金極易吸濕，因此使用小劑量封裝的氯化金時(shí)，必須一次配完。將Ig的氯化金一次溶解于雙蒸水中配成1%的水溶液。放在4°c冰箱內(nèi)保存，保存時(shí)間長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)月至I年左右。大粒徑膠體金的制備取1%的氯金酸溶液10mL，配制成濃度為O. lg/L的氯金酸溶液。取O. lg/L氯金酸溶液200 mL放入錐形瓶，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰并持續(xù)2min,在100r/min磁力攪拌下，加入1%檸檬酸三鈉水溶液2. 8mL,保持溫度和攪拌速度不變，繼續(xù)攪拌加熱6min，直至溶液呈透亮的酒紅色。室溫冷卻，4°C保存?zhèn)溆?。獲得直徑約為35nm的大粒徑膠體金溶液用于標(biāo)記羊抗鼠IgG。 小粒徑膠體金的制備潔凈的三口燒瓶中加入79mL超純水，ImL 1%氯金酸溶液作為A液；取一潔凈的小瓶子，加入4mL 1%檸檬酸三鈉溶液，O. ImL, 1%單寧酸溶液，O. ImL25mM碳酸鉀溶液和15. 8mL超純水作為B液；A、B液均加熱到60°C，然后在高速攪拌下把B液迅速加入A液中，最終反應(yīng)液在60 V下繼續(xù)攪拌40min形成深紅色溶液，然后將溶液加熱回流3min形成亮紅色溶液，最后冷卻到室溫形成檸檬酸穩(wěn)定的金納米粒子。獲得直徑約為IOnm的小粒徑膠體金溶液用于標(biāo)記銅離子抗體。5、銅離子抗體標(biāo)記的小金結(jié)合墊和羊抗鼠IgG標(biāo)記的大金增敏墊的制備
用O. I mo I/L K2CO3或O. I mo I/L HCl調(diào)節(jié)膠體金溶液為pH 9. 0，將10 mL膠體金(10nm)溶液加入50 mL燒杯中，用電磁攪拌器250 rpm攪拌,逐滴加入150 μ L 0. 2mg/mL的銅離子單克隆抗體溶液，平衡過夜。逐滴加入5% BSA，使BSA的終濃度為1%，持續(xù)攪拌5min，用以飽和游離的膠體金。再將金標(biāo)抗體溶液常溫低速(3000 rpm)離心15 min，棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀。取紅色上清溶液于4°C以11000 rpm離心20 min。溶液分為二層上層透明上清，下層為管底可流動(dòng)的暗紅色沉淀。輕吸并棄去上清液，將可流動(dòng)的暗紅色沉淀用重懸液(0. OlM硼酸鹽緩沖液，pH8. 0)混懸，恢復(fù)原體積后再離心，所用重懸液為0. 05M的CBS緩沖液。如此重復(fù)2 4次，以徹底除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。最后用重懸液將沉淀混懸為原體積的I /10，4 °C保存?zhèn)溆茫@得小金標(biāo)記銅離子抗體。用0. 05M的CBS緩沖液以1:100 500稀釋的膠體金標(biāo)記抗體吸附于精制玻璃纖維棉中，37°C干燥，制得銅離子抗體標(biāo)記的小金結(jié)合墊。羊抗鼠IgG標(biāo)記的大金增敏墊的制備過程同上。膠體金溶液用35nm的金溶液，離心轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)為8000 rpm離心20 min。用0. 05M的CBS緩沖液以1:100 500稀釋的膠體金標(biāo)記羊抗鼠IgG吸附于精制玻璃纖維棉中，37°C干燥，制得羊抗鼠IgG標(biāo)記的大金增敏墊。6、銅離子膠體金層析試紙條檢測(cè)反應(yīng)原理
銅(Cu)原子量?jī)H為64，屬于小分子物質(zhì)。制備的銅離子單克隆抗體對(duì)游離銅不能捕獲，但是可以識(shí)別Cu和乙二胺四乙酸(EDTA)形成的Cu-EDTA絡(luò)合物。本發(fā)明采用競(jìng)爭(zhēng)法，即樣品中的Cu-EDTA絡(luò)合物和固定在包被膜上的包被抗原Cu-EDTA-BSA競(jìng)爭(zhēng)膠體金標(biāo)記的抗Cu-EDTA單克隆抗體。
為了提高試紙條的靈敏度，制備了銅離子抗體標(biāo)記小金(10 nm)結(jié)合墊和羊抗鼠IgG標(biāo)記大金(35 nm)增敏墊，小金結(jié)合墊置于大金增敏墊之下。小金標(biāo)記的銅離子抗體能夠特異性識(shí)別樣品溶液中的Cu-EDTA，并能夠與大金標(biāo)記羊抗鼠IgG結(jié)合。當(dāng)試紙條以樣品墊末端浸入樣本后，樣品溶液沿著試紙條通過毛細(xì)作用從下往上泳動(dòng)，溶解金標(biāo)墊上干燥的銅離子抗體標(biāo)記小金結(jié)合墊和羊抗鼠IgG標(biāo)記大金增敏墊。若待測(cè)樣品中沒有Cu存在，則小金標(biāo)銅離子抗體會(huì)直接泳動(dòng)到檢測(cè)線(T)和硝酸纖維膜上的Cu-EDTA-BSA發(fā)生免疫反應(yīng)，從而膠體金顆粒發(fā)生聚集，形成紅色的線條，然后其他未與Cu-EDTA-BSA結(jié)合的金標(biāo)抗體繼續(xù)通過毛細(xì)管作用向前泳動(dòng)，與控制線(C)的羊抗鼠二抗發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，同樣形成紅色線條，這樣包被膜上就會(huì)有兩條紅色線條，表示樣品為陰性。隨著樣品中Cu離子含量的增加，部分抗 體和樣品中的Cu-EDTA結(jié)合，不能與檢測(cè)線(T)的Cu-EDTA-BSA結(jié)合，所以檢測(cè)線(T)上的顏色深度逐漸變淺。若待測(cè)樣品中銅含量超過10ng/mL,金標(biāo)抗體全部和樣品中的Cu-EDTA發(fā)生免疫結(jié)合，就不會(huì)再有抗體與T線包被原結(jié)合，從而T線上紅色線條消失，表示樣品為陽性。C線是為檢驗(yàn)金標(biāo)免疫層析方法本身是否有效而設(shè)定的，所以無論樣品中是否存在Cu，控制線C都應(yīng)該顯色。如果控制線C不顯色，則說明試紙條失效。由于大金標(biāo)記的羊抗鼠IgG在硝酸纖維膜上的流動(dòng)性比小金標(biāo)記的銅離子抗體慢，故在小金標(biāo)銅離子抗體和硝酸纖維膜上的Cu-EDTA-BSA發(fā)生免疫反應(yīng)后，增敏墊上的大金標(biāo)記的羊抗鼠IgG涌動(dòng)到硝酸纖維膜上的Cu-EDTA-BSA處和小金標(biāo)銅離子抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，紅色線條的顏色進(jìn)一步加深，所以隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，T線和C線上的顏色(紅色)越深。所以通過添加一個(gè)增敏墊可以減少小金標(biāo)記銅離子單克隆抗體的工作濃度，提高了檢測(cè)靈敏度，增加的大金標(biāo)記增敏墊可以保證陰性結(jié)果的空白值，避免假陽性。7，實(shí)施舉例
(I)把選定濃度的包被抗原及羊抗鼠IgG噴在包被膜上，分別作為檢測(cè)線(T)和控制線(C)，在37°C烘箱干燥lOmin。將一定濃度的金標(biāo)銅離子單克隆抗體包被在金標(biāo)結(jié)合墊上，將金標(biāo)記羊抗鼠IgG包被在增敏墊上。試紙條組成為一個(gè)襯板，在其上按順序粘上樣品墊、增敏墊、金標(biāo)結(jié)合墊、包被膜和吸水墊。將貼好的板切割成3mm寬的條，然后將試紙條與干燥劑一起裝入鋁箔袋內(nèi)密封保存。(2)檢測(cè)固體樣品前處理成消化液小麥在70°C干燥72h，研磨徹底，小麥和萃取液(O. 2 mo I /L HCl)按照I : 10(w/v)振蕩萃取2h。新鮮的茄子切成片狀，與相同質(zhì)量的超純水混合壓榨成汁狀，IOg茄子汁和IOmL的超純水混合然后和5mL的I mol/L的HCl混合均勻，振蕩萃取2h。(3)操作方法將樣品萃取液和EDTA螯合劑溶液按9 l(v/v)比例混合均勻，37°C反應(yīng)O. 5 h使銅離子和EDTA充分螯合，得到樣品溶液。(4)將銅離子膠體金層析檢測(cè)試紙條樣品墊端插入100 μ L待測(cè)樣品液中，插入深度不超過標(biāo)記線，約5-10min讀取試紙條檢測(cè)結(jié)果，讀取時(shí)，試紙條水平放置，正面觀察。(5)結(jié)果判定如果在包被膜上僅有C線一條紅線顯色，表示檢測(cè)結(jié)果為陽性，說明在待測(cè)樣品中銅離子濃度大于10ng/mL ;如果在包被膜上C線和T線兩條紅線都顯色，表示檢測(cè)結(jié)果為陰性，說明在待測(cè)樣品中銅離子濃度低于10ng/mL ;如果在包被膜上C線紅線不顯色，則表明試紙條已失效。
權(quán)利要求
1.一種銅離子膠體金增敏層析檢測(cè)試紙條，其特征在于由襯板(I)和在襯板上依次銜接的樣品墊(2)、增敏墊(4)、金標(biāo)結(jié)合墊(3)、包被膜(5)和吸水墊(6)組成；金標(biāo)結(jié)合墊(3)為吸附小金標(biāo)記銅離子抗體的玻璃纖維棉，增敏墊(4)為吸附大金標(biāo)記羊抗鼠IgG的玻璃纖維棉，在包被膜(5)上依次有用銅離子偶聯(lián)載體蛋白的溶液印制的直線式隱形檢測(cè)線T線(7)，用可以與銅單克隆抗體結(jié)合的羊抗鼠IgG溶液印制的直線式隱形對(duì)照線C線(8)，兩條線平行排列； 所述小金標(biāo)記銅離子抗體為IOnm粒徑膠體金溶液標(biāo)記的銅離子抗體； 所述大金標(biāo)記羊抗鼠IgG為35nm粒徑膠體金溶液標(biāo)記的羊抗鼠IgG。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試紙條，其特征在于所述的銅離子抗體為銅離子單克隆抗·體；所述的金標(biāo)結(jié)合墊吸附小金標(biāo)記銅離子抗體；增敏墊吸附大金標(biāo)記羊抗鼠IgG，并能夠與銅離子抗體特異性結(jié)合；所述的偶聯(lián)銅離子的載體蛋白為匙孔血藍(lán)蛋白KLH，或?yàn)榕Ｑ灏椎鞍譈SA，雙功能偶聯(lián)劑為I-(4-異硫氰芐基)-乙烯基二胺-N，N，IT，f -四乙酸ITCBE,重金屬螯合劑為乙二胺四乙酸EDTA。
全文摘要
一種快速檢測(cè)銅離子的膠體金增敏層析試紙條，屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明由襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、增敏墊、包被膜和吸水墊組成金標(biāo)結(jié)合墊為吸附小金標(biāo)記銅離子抗體的玻璃纖維棉，增敏墊為吸附大金標(biāo)記羊抗鼠IgG的玻璃纖維棉，在包被膜上依次有用銅離子偶聯(lián)載體蛋白的溶液印制的直線式隱形檢測(cè)線T線，同時(shí)用羊抗鼠IgG溶液印制的直線式隱形控制線C線，兩條線平行排列。所提供的快速檢測(cè)銅離子的金標(biāo)層析試紙條特異性強(qiáng)，敏感性高；能更加快速、靈敏、簡(jiǎn)便地檢測(cè)銅離子殘留；結(jié)果判定形象、直觀、準(zhǔn)確，簡(jiǎn)單明了，不易出現(xiàn)假陽性和假陰性等人為誤判；節(jié)省費(fèi)用，適用范圍廣，便于推廣；具有廣闊的市場(chǎng)前景和明顯的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102879571SQ201210359920
公開日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月25日
發(fā)明者馮民, 邢常瑞, 匡華, 王小晉, 王利兵, 胥傳來, 劉麗強(qiáng), 朱臻怡, 何健, 唐政, 戴建平 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)淮安出入境檢驗(yàn)檢疫局, 江南大學(xué)