不水洗的革蘭染色方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種不水洗的革蘭染色方法，包括：在室溫下，將待檢材料均勻涂在玻片上，干燥，固定，再將初染劑滴加到涂片上，染色，傾去初染劑后直接滴加復(fù)染劑，染色后，傾去復(fù)染劑，干后鏡檢，在涂片中央是染成紫色的革蘭陽性菌和染成紅色的革蘭陰性菌，與現(xiàn)有的革蘭染色法相比，本發(fā)明的方法省去了水洗的步驟，簡化了操作步驟，節(jié)約了大量的水資源，并且該方法大大減少了染料的用量，并且縮短了染色時間，提高染色效率的同時節(jié)約了50%的染料，減少了對環(huán)境的污染。
【專利說明】不水洗的革蘭染色方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種革蘭染色法，特別是涉及不水洗的革蘭染色方法。
【背景技術(shù)】
[0002]革蘭染色法是細菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。細菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶染色，而經(jīng)碘液媒染后，用酒精脫色，在一定條件下有的細菌此色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細菌分為兩大類，前者叫革蘭氏陽性菌(G+)，后者叫革蘭氏陰性菌(G-)。為了觀察方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅等進行復(fù)染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。有芽孢的桿菌和絕大多數(shù)和球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應(yīng)；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽胞桿菌都呈現(xiàn)負(fù)反應(yīng)。
[0003]革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在化學(xué)組成和生理性質(zhì)上有很多差別，染色反應(yīng)不一樣?，F(xiàn)在一般認(rèn)為革蘭氏陽性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合很牢，不易脫色，陰性菌復(fù)合物結(jié)合程度低，吸附染料差，易脫色，這是染色反應(yīng)的主要依據(jù)。另外，陽性菌菌體等電點較陰性菌為低，在相同PH條件下進行染色，陽性菌吸附堿性染料很多，因此不易脫去，陰性菌則相反。所以染色時的條件要嚴(yán)格控制。例如，在強堿的條件下進行染色，兩類菌吸附堿性染料都多，都可呈正反應(yīng)；PH很低時，則可都呈負(fù)反應(yīng)。此外，兩類菌的細胞壁等對結(jié)晶紫-碘復(fù)合物的通透性也不一致，陽性菌透性小，故不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色。所以脫色時間，脫色方法也應(yīng)嚴(yán)格控制。
[0004]傳統(tǒng)的革蘭染色四步法一般主要包括初染、媒染、脫色、復(fù)染四個步驟，具體操作方法是:1)涂片固定，2)草酸銨結(jié)晶紫染1分鐘，3)水沖洗，4)加碘液覆蓋涂面染1分鐘，5)水洗，用吸水紙吸除水分，6)加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進行脫色，30秒后水洗，吸去水分，7)蕃紅染色液染10秒鐘后，自來水沖洗，干燥鏡檢。其中在初染、媒染、脫色、復(fù)染每一步驟之后都需要水洗除去染料，避免附著的染料對染色效果的影響。革蘭染色四步法效果好，但操作比較復(fù)雜，質(zhì)量控制不易進行，難以做到標(biāo)準(zhǔn)化，同時消耗較多的染料和水，容易造成資源的浪費和環(huán)境的污染。
[0005]目前開發(fā)了一種革蘭染色三步法，該方法主要包括初染、媒染和復(fù)染三個步驟，其中在初染、媒染和復(fù)染每一步驟之后都需要水洗除去染料，避免附著的染料對染色效果的影響，革蘭染色三步法雖然相比四步法，步驟減少一步，縮短了染色時間，但該方法仍然包括三次水洗的步驟，同樣消耗大量水，另外傳統(tǒng)的革蘭染色三步法仍需要消耗較多的染料，容易造成資源的浪費和環(huán)境的污染。
[0006]目前在專利CN101126689B中公開了一種水洗兩次的革蘭染色二步法，主要包括初染和復(fù)染兩步，在每一步驟之后同樣需要水洗除去附著的染料，該方法較傳統(tǒng)的革蘭氏染色四步法，操作更簡便且方法可靠，但此方法同樣消耗大量的染料和水，并且初染和復(fù)染的時間較長，不適于大批量的檢驗操作。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的目的是針對目前革蘭染色三步法和革蘭染色二步法中因包含水洗的步驟而導(dǎo)致消耗大量的水，同時使用的染料量大，染色時間長的問題，提供一種不水洗的革蘭染色方法，該方法省去了水洗的步驟，節(jié)約了水資源，同時減少了染料使用量，降低了對環(huán)境的污染。
[0008]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0009]不水洗的革蘭染色方法，包括:
[0010]在室溫下，將待檢材料均勻涂在玻片上，干燥，固定，再將初染劑滴加到涂片上，染色，傾去初染劑后直接滴加復(fù)染劑，染色后，傾去復(fù)染劑，干后鏡檢，在涂片中央是染成紫色的革蘭陽性菌和染成紅色的革蘭陰性菌，
[0011]其中所述初染劑為含有質(zhì)量百分?jǐn)?shù)0.03125%結(jié)晶紫的水溶液。
[0012]在現(xiàn)有的革蘭染色方法中，水洗被認(rèn)為是不可缺少的一步，因為通過水洗可除去附著在涂片上的染料，避免對染色效果的影響，然而發(fā)明人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，在革蘭染色方法中，使用稀釋的染色液，減少染料的用量，省去水洗步驟對染色效果沒有影響，染色效果仍與已知的方法一樣好。
[0013]在本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述復(fù)染劑為含有以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)組分的乙醇溶液，其中
0.0625%堿性品紅、0.005%碘化鉀、0.001%碘。
[0014]在本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述初染劑的滴加量為I?4ml，初染劑染色時間為10?50秒；所述復(fù)染劑的滴加量為0.8?2ml，復(fù)染劑染色時間為I?5秒。本發(fā)明更優(yōu)選為所述初染劑的滴加量為2ml，初染劑染色時間為30秒，所述復(fù)染劑的滴加量為1ml，復(fù)染劑染色時間為2秒。
[0015]在本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述復(fù)染劑分為復(fù)染劑A和復(fù)染劑B，其中復(fù)染劑A為含有質(zhì)量百分?jǐn)?shù)0.005%碘化鉀、0.001%碘的溶液，復(fù)染劑B為含有質(zhì)量百分?jǐn)?shù)0.0625%堿性品紅的乙醇溶液；所述復(fù)染劑A和復(fù)染劑B分兩步滴加。
[0016]在本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述初染劑的滴加量為I?3ml，初染劑染色時間為10?50秒，所述復(fù)染劑A的滴加量為0.8?2ml，復(fù)染劑A染色時間為I?5秒，所述復(fù)染劑B的滴加量為0.8?2ml，復(fù)染劑B染色時間為I?5秒。本發(fā)明更優(yōu)選為所述初染劑的滴加量為2ml，初染劑染色時間為30秒，所述復(fù)染劑A的滴加量為1ml，復(fù)染劑A染色時間為2秒，所述復(fù)染劑B的滴加量為1ml，復(fù)染劑B染色時間為2秒。
[0017]在本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述涂在玻片上的待檢材料的直徑為1.0?2.0cm0
[0018]在本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述待檢材料包括細菌培養(yǎng)物、送檢分泌物。
[0019]本發(fā)明的不水洗革蘭染色法具有以下優(yōu)點:
[0020]1.與現(xiàn)有的革蘭染色法相比，本發(fā)明的方法省去了水洗的步驟，簡化了操作步驟，節(jié)約了大量的水資源，并且染色效果與現(xiàn)有的革蘭染色法一樣，該方法與現(xiàn)有技術(shù)相比可節(jié)約100%的水。
[0021]2.該方法大大減少了染料的用量，并且縮短了染色時間，提高染色效率的同時節(jié)約了 50%的染料，減少了對環(huán)境的污染。
【具體實施方式】
[0022]下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0023]本發(fā)明中所使用的玻片、初染劑、媒染劑、復(fù)染劑以及用于鏡檢的儀器均采用常規(guī)的材料和設(shè)備，鏡檢的方法采用現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)檢測方法。
[0024]實施例1
[0025]取潔凈的玻片，在室溫下，將細菌培養(yǎng)物均勻涂在玻片上，干燥，固定，其中涂片的直徑為1.0cm，再滴加4ml由含有0.03125%結(jié)晶紫水溶液配成的初染劑到涂片上，染色10秒，傾去初染劑后不水洗，直接滴加0.8ml由含有0.0625%堿性品紅、0.005%碘化鉀、0.001%碘的乙醇溶液配成的復(fù)染劑，染色5秒后，傾去復(fù)染劑，干后鏡檢，在涂片中央可見到染成紫色的革蘭陽性菌和染成紅色的革蘭陰性菌，對比鮮明。
[0026]實施例2
[0027]取潔凈的玻片，在室溫下，將送檢分泌物均勻涂在玻片上，干燥，固定，其中涂片的直徑為1.5cm,再滴加2ml由含有0.03125%結(jié)晶紫水溶液配成的初染劑到涂片上，染色30秒，傾去初染劑后不水洗，直接滴加1ml由含有0.0625%堿性品紅、0.005%碘化鉀、0.001%碘的乙醇溶液配成的復(fù)染劑，染色2秒后，傾去復(fù)染劑，干后鏡檢，在涂片中央可見到染成紫色的革蘭陽性菌和染成紅色的革蘭陰性菌，對比鮮明。
[0028]實施例3
[0029]取潔凈的玻片，在室溫下，將送檢分泌物均勻涂在玻片上，干燥，固定，其中涂片的直徑為2.0cm，再滴加1ml由含有0.03125%結(jié)晶紫水溶液配成的初染劑到涂片上，染色50秒，傾去初染劑后不水洗，直接滴加2ml由含有0.0625%堿性品紅、0.005%碘化鉀、0.001%碘的乙醇溶液配成的復(fù)染劑，染色1秒后，傾去復(fù)染劑，干后鏡檢，在涂片中央可見到染成紫色的革蘭陽性菌和染成紅色的革蘭陰性菌，對比鮮明。
[0030]實施例4
[0031]取潔凈的玻片，在室溫下，將細菌培養(yǎng)物均勻涂在玻片上，干燥，固定，其中涂片的直徑為1.0cm，再滴加4ml由含有0.03125%結(jié)晶紫水溶液配成的初染劑到涂片上，染色10秒，傾去初染劑后不水洗，直接滴加0.8ml由含有0.005%碘化鉀和0.001%碘的溶液配成的復(fù)染劑A，染色5秒，傾去復(fù)染劑A后不水洗，直接滴加0.8ml由含有0.0625%堿性品紅的乙醇溶液配成的復(fù)染劑B，染色5秒后，傾去復(fù)染劑B不水洗，干后鏡檢，在涂片中央可見到染成紫色的革蘭陽性菌和染成紅色的革蘭陰性菌，對比鮮明。
[0032]實施例5
[0033]取潔凈的玻片，在室溫下，將送檢分泌物均勻涂在玻片上，干燥，固定，其中涂片的直徑為1.5cm，再滴加2ml由含有0.03125%結(jié)晶紫水溶液配成的初染劑到涂片上，染色30秒，傾去初染劑后不水洗，直接滴加1ml由含有0.005%碘化鉀和0.001%碘的溶液配成的復(fù)染劑A，染色4秒，傾去復(fù)染劑A后不水洗，直接滴加1ml由含有0.0625%堿性品紅的乙醇溶液配成的復(fù)染劑B，染色2秒后，傾去復(fù)染劑B不水洗，干后鏡檢，在涂片中央可見到染成紫色的革蘭陽性菌和染成紅色的革蘭陰性菌，對比鮮明。
[0034]實施例6
[0035]取潔凈的玻片，在室溫下，將細菌培養(yǎng)物均勻涂在玻片上，干燥，固定，其中涂片的直徑為2.0cm,再滴加Iml由含有0.03125%結(jié)晶紫水溶液配成的初染劑到涂片上，染色50秒，傾去初染劑后不水洗，直接滴加2ml由含有0.005%碘化鉀和0.001%碘的溶液配成的復(fù)染劑A，染色2秒，傾去復(fù)染劑A后不水洗，直接滴加2ml由含有0.0625%堿性品紅的乙醇溶液配成的復(fù)染劑B，染色I秒后，傾去復(fù)染劑B不水洗，干后鏡檢，在涂片中央可見到染成紫色的革蘭陽性菌和染成紅色的革蘭陰性菌，對比鮮明。
[0036]以上所述，僅為本發(fā)明較佳【具體實施方式】，但本發(fā)明的保護范圍并不局限與此，任何熟悉本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.不水洗的革蘭染色方法，包括: 在室溫下，將待檢材料均勻涂在玻片上，干燥，固定，再將初染劑滴加到涂片上，染色，傾去初染劑后直接滴加復(fù)染劑，染色后，傾去復(fù)染劑，干后鏡檢，在涂片中央是染成紫色的革蘭陽性菌和染成紅色的革蘭陰性菌， 其中所述初染劑為含有質(zhì)量百分?jǐn)?shù)0.03125%結(jié)晶紫的水溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的不水洗的革蘭染色方法，其特征在于，所述復(fù)染劑為含有以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)組分的乙醇溶液，其中0.0625%堿性品紅、0.005%碘化鉀、0.001%碘。
3.如權(quán)利要求1所述的不水洗的革蘭染色方法，其特征在于，所述復(fù)染劑分為復(fù)染劑A和復(fù)染劑B，其中復(fù)染劑A為含有質(zhì)量百分?jǐn)?shù)0.005%碘化鉀、0.001%碘的溶液，復(fù)染劑B為含有質(zhì)量百分?jǐn)?shù)0.0625%堿性品紅的乙醇溶液；所述復(fù)染劑A和復(fù)染劑B分兩步滴加。
4.如權(quán)利要求2所述的不水洗的革蘭染色方法，其特征在于，所述初染劑的滴加量為I?4ml，初染劑染色時間為10?50秒；所述復(fù)染劑的滴加量為0.8?2ml，復(fù)染劑染色時間為I?5秒。
5.如權(quán)利要求3所述的不水洗的革蘭染色方法，其特征在于，所述初染劑的滴加量為I?3ml，初染劑染色時間為10?50秒，所述復(fù)染劑A的滴加量為0.8?2ml，復(fù)染劑A染色時間為I?5秒，所述復(fù)染劑B的滴加量為0.8?2ml，復(fù)染劑B染色時間為I?5秒。
6.如權(quán)利要求1所述的不水洗的革蘭染色方法，其特征在于，所述涂在玻片上的待檢材料的直徑為1.0?2.0cm0
7.如權(quán)利要求1所述的不水洗的革蘭染色方法，其特征在于，所述待檢材料包括細菌培養(yǎng)物、送檢分泌物。
【文檔編號】G01N1/30GK103674661SQ201210337417
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月12日
【發(fā)明者】葉元康 申請人:無錫飛伊生物科技有限公司