專(zhuān)利名稱(chēng)：一種甘氨酸含量的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明ー種物質(zhì)含量的測(cè)定方法，尤其涉及一種甘氨酸含量的測(cè)定方法，屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甘氨酸又名氨基こ酸，在分子中同時(shí)具有酸性和堿性官能團(tuán)，通過(guò)水溶液酸堿性的調(diào)節(jié)可以使甘氨酸呈現(xiàn)不同的分子形態(tài)。甘氨酸參與嘌呤類(lèi)、葉啉類(lèi)、肌酸和こ醛酸的合成，可與多種物質(zhì)結(jié)合由膽汁或從 尿中排出。甘氨酸廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥。例如，將甘氨酸與谷氨酸、丙氨酸一起使用，對(duì)防治前列腺肥大并發(fā)癥、排尿障礙、頻尿、殘尿等癥狀頗有效果，其本身還能改善睡眠質(zhì)量。甘氨酸單獨(dú)使用可治療重療肌無(wú)カ等營(yíng)養(yǎng)失調(diào)癥，促進(jìn)脂肪代謝；作為ー種蛋白質(zhì)氨基酸可作為復(fù)方氨基酸輸液和ロ服氨基酸制劑的重要原料；亦可作為原料進(jìn)ー步合成DL-笨丙氨酸和L-蘇氨酸等；作為原料還可以合成治療高血壓藥物地拉普利、抑制胃潰瘍藥用碳酸鈣制劑等。目前甘氨酸的相關(guān)制劑及原料的檢測(cè)方法主要以滴定、衍生化為主。中國(guó)藥典、日本藥典、英國(guó)藥典、歐洲藥典采用滴定法測(cè)定甘氨酸原料含量，該方法專(zhuān)屬性不強(qiáng)，容易受雜質(zhì)干擾影響含量結(jié)果。中國(guó)藥典與美國(guó)藥典中記載甘氨酸沖洗液中甘氨酸的含量采用氫氧化鈉滴定甘氨酸含量，該方法與原料滴定的缺陷一致，也容易受雜質(zhì)干擾影響含量測(cè)定結(jié)果。寧嘯駿等人在《高效液相色譜法測(cè)定含乳飲料中游離甘氨酸的方法研究》一文中公開(kāi)了甘氨酸的含量測(cè)定方法，將樣品中游離的甘氨酸與蛋白質(zhì)大分子分離，鄰苯ニ甲醛(0ΡΑ)衍生，其衍生產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜分離，于熒光檢測(cè)器檢測(cè)，測(cè)得含乳飲料中游離甘氨酸的含量。衍生化反應(yīng)雖然也提高專(zhuān)屬性，但衍生化反應(yīng)容易損壞色譜柱，縮短色譜柱使用壽命，衍生化反應(yīng)容易受衍生化試劑用量、種類(lèi)、衍生化時(shí)間、溫度等條件影響，方法的精密度、準(zhǔn)確度、重現(xiàn)性等容易受到影響?？梢钥闯觯F(xiàn)有甘氨酸的含量檢測(cè)方法均存在一定局限性和弊端。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷提供一種甘氨酸含量的測(cè)定方法，該方法操作簡(jiǎn)單、專(zhuān)屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高。本發(fā)明所述技術(shù)問(wèn)題由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。一種甘氨酸含量的測(cè)定方法，它應(yīng)用氰基柱或氨基柱采用高效液相色譜法直接測(cè)定甘氨酸含量。上述含量測(cè)定方法，所述高效液相色譜法所使用的流動(dòng)相為こ腈和磷酸鹽溶液。上述含量測(cè)定方法，所述磷酸鹽溶液(5-100mmol/L)與こ腈的體積比比例為10 90 60 :40，優(yōu)選 25 75 35 :65。上述含量測(cè)定方法，所述磷酸鹽溶液，其中磷酸鹽選自磷酸氫ニ銨、磷酸ニ氫銨、磷酸氫ニ鈉、磷酸ニ氫鈉、磷酸氫ニ鉀、磷酸ニ氫鉀中的ー種或幾種，優(yōu)選的，上述磷酸鹽溶液中加入O. 1%-5%，體積百分比的三こ胺、氨水、ニこ胺、こニ胺中的ー種或幾種。上述含量測(cè)定方法，所述磷酸鹽溶液中的磷酸鹽為三こ胺、氨水、ニこ胺、こニ胺中的ー種或幾種中加入磷酸后所成的鹽。上述含量測(cè)定方法，所述磷酸鹽溶液的pH為2. O 7. 0，優(yōu)選3. O 4. 5。上述含量測(cè)定方法，所述高效液相色譜法使用的檢測(cè)波長(zhǎng)為199nm，柱溫為25 45°C，流速為 O. 5 2. Oml/min。本專(zhuān)利發(fā)明人在采用氰基柱或氰基柱對(duì)甘氨酸進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)，發(fā)現(xiàn)ー個(gè)奇怪的現(xiàn)象，就是直接以こ臆-水為流動(dòng)相，對(duì)供試品和對(duì)照品進(jìn)行液相檢測(cè)，在最大吸收波長(zhǎng) (199nm)條件下，在2個(gè)小時(shí)內(nèi)無(wú)明顯色譜峰出現(xiàn)，氰基柱基線一直很平，重復(fù)三針均無(wú)色譜峰出現(xiàn)。而采用氨基柱，到一定時(shí)間后發(fā)現(xiàn)色譜圖上基線上揚(yáng)，出現(xiàn)很大的鼓包，峰型極其不好，理論板數(shù)趨于零。分析原因可能為采用氰基柱時(shí)，以こ臆-水為流動(dòng)相系統(tǒng)，色譜柱鍵合氰基的硅膠封尾不完全，硅膠上部分裸露的羥基在流動(dòng)相為こ臆-水的環(huán)境下與氨基酸的氨基發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致甘氨酸直接吸附在色譜柱上而不出峰。采用氨基柱時(shí)，在こ腈-水的流動(dòng)相系統(tǒng)條件下，氨基酸的羧酸直接與氨基柱上的氨基鍵合成鹽而造成峰型極其不好。經(jīng)過(guò)對(duì)氨基柱、氰基柱的分離原理分析、鍵合硅膠的性質(zhì)研究、甘氨酸的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)研究以及大量的科學(xué)試驗(yàn)，本專(zhuān)利發(fā)明人巧妙的解決了氰基柱、氨基柱吸附甘氨酸的現(xiàn)象。當(dāng)采用氰基柱時(shí)，采用流動(dòng)相中的銨離子封閉色譜柱上硅膠上部分裸露的羥基，從而防止氨基酸的氨基與羥基結(jié)合，影響色譜峰峰型。采用新的色譜條件后，采用氰基柱或氨基柱，甘氨酸的色譜峰出峰良好，理論板數(shù)、對(duì)稱(chēng)因子、保留時(shí)間等參數(shù)均能滿足含量測(cè)定要求，因而完成本發(fā)明。


圖I流速和pH值對(duì)保留時(shí)間影響的3D趨勢(shì) 圖2流速和柱溫對(duì)保留時(shí)間影響的3D趨勢(shì) 圖3流速和pH值對(duì)對(duì)稱(chēng)因子影響的3D趨勢(shì) 圖4流速和pH值對(duì)理論板數(shù)影響的3D趨勢(shì) 圖5流速和柱溫對(duì)理論板數(shù)影響的3D趨勢(shì) 圖6流速和柱溫對(duì)壓カ影響的3D趨勢(shì) 圖7進(jìn)樣濃度為O. 3mg/ml的色譜 圖8進(jìn)樣濃度為O. 5mg/ml的色譜 圖9進(jìn)樣濃度為O. 7mg/ml的色譜 圖10進(jìn)樣濃度為O. 9mg/ml的色譜 圖11進(jìn)樣濃度為I. Omg/ml的色譜圖；圖12O. 3-1. Omg/ml濃度范圍內(nèi)濃度與峰面積的線性關(guān)系；
圖13 こ腈比例和流速對(duì)保留時(shí)間影響的3D趨勢(shì) 圖14 pH和流速對(duì)對(duì)稱(chēng)因子影響的3D趨勢(shì) 圖15pH和こ腈比例對(duì)理論板數(shù)影響的3D趨勢(shì)圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明做進(jìn)ー步詳細(xì)說(shuō)明，所列舉實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非對(duì)本發(fā)明的專(zhuān)利保護(hù)范圍做出限制。
對(duì)照溶液與供試溶液的配置如下
對(duì)照溶液精密稱(chēng)取甘氨酸對(duì)照品約12. 5 mg，置25 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。供試溶液精密稱(chēng)取甘氨酸原料藥約12. 5 mg，置25 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。實(shí)施例I
甘氨酸含量檢測(cè)的色譜條件初篩。こ腈與水或磷酸鹽比例見(jiàn)表I，檢測(cè)波長(zhǎng)199nm ;流速lml/min ;柱溫30°C ;進(jìn)樣量5μ1。表I初篩條件及結(jié)果
jf￥ I色譜柱I乙腈I水I磷酸鹽溶液 I主峰保留時(shí)間
1_,氰基柱 70_^30 O_不出峰_^
2氰基柱60 :40 0 不出峰
3氰基柱80 '_20 O 不出峰
4_,氰基柱 70_'0_30_約4分鐘_'
5:氰基柱65 :0 35 不到3分鐘 :
6:氨基柱70 :30 0 基線上漂，出饅頭峰 :
7氨基柱60 40 O 基線上漂，出饅頭峰 :
8_'氨基柱 80_^20 O_基線上漂，出饅頭峰_^
9氨基柱70 :0 30 約6分鐘
10[氨基柱[65 ]0 J35 m 5分鐘實(shí)施例2
采用氰基柱優(yōu)化色譜條件。色譜柱Venusil XBP-CN氰基柱(4. 6mmX 250mm, 5Mm);采用磷酸氫ニ銨為磷酸鹽溶液，pH調(diào)節(jié)、流速、柱溫見(jiàn)表2，檢測(cè)波長(zhǎng)199nm ;進(jìn)樣量5μ1。表2色譜條件3因素2水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案__
序號(hào)乙月青比例(%) 波長(zhǎng)(nm) pH {g 流速(ml/min) 柱溫(°C )
11701993.0 I. 535
12701993.0 I. 525
13701993.0 0.825
14701993.0 0.835
15701994.0 I. 535
16701994.0 0.825
17701994.0 I. 525
181701199 [4.0 ]θ. 8]35分別統(tǒng)計(jì)8組實(shí)驗(yàn)甘氨酸的保留時(shí)間、不對(duì)稱(chēng)因子、理論板數(shù)、柱壓力，結(jié)果見(jiàn)表3。
表3因子設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種甘氨酸含量的測(cè)定方法，其特征在于，該方法應(yīng)用氰基柱或氨基柱采用高效液相色譜法對(duì)甘氨酸進(jìn)行含量測(cè)定。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的含量測(cè)定方法，其特征在于，所述高效液相色譜法所使用的流動(dòng)相為こ腈和磷酸鹽溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的含量測(cè)定方法，其特征在于，所述磷酸鹽溶液5-lOOmmol/L，它與こ腈的(體積比)比例為10 90 60 40o
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的含量測(cè)定方法，其特征在于，所述磷酸鹽溶液20-50mmol/L，它與こ腈的(體積比)比例為20 80 40 60o
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的含量測(cè)定方法，其特征在于，所述磷酸鹽溶液，其中磷酸鹽選自磷酸氫ニ銨、磷酸ニ氫銨、磷酸氫ニ鈉、磷酸ニ氫鈉、磷酸氫ニ鉀、磷酸ニ氫鉀中的ー種或幾種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的含量測(cè)定方法，其特征在于，所述磷酸鹽溶液中加入O. 1%_5%體積百分比的三こ胺、氨水、ニこ胺、こニ胺中的ー種或幾種。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的含量測(cè)定方法，其特征在于，所述磷酸鹽溶液的pH為2.O .7.O。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的含量測(cè)定方法，其特征在于，所述磷酸鹽溶液的pH為2.5 .5.5o
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的含量測(cè)定方法，其特征在干，所述高效液相色譜法所用檢測(cè)波長(zhǎng)為199nm，柱溫為25 45°C，流速為O. 5 2. Oml/min。
全文摘要
一種甘氨酸的含量測(cè)定方法，它應(yīng)用氰基柱或氨基柱采用高效液相色譜法對(duì)甘氨酸進(jìn)行含量測(cè)定，具體步驟為1、取甘氨酸原料和對(duì)照品溶于水中，分別制成對(duì)照溶液和供試品溶液；2、應(yīng)用氰基柱或氨基柱采用高效液相色譜法檢測(cè)甘氨酸含量，以乙腈和磷酸鹽的水溶液為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為199nm，分別取等體積的對(duì)照溶液和供試品溶液注入高效液相色譜儀中，采用外標(biāo)法計(jì)算甘氨酸原料含量。該方法操作簡(jiǎn)單、專(zhuān)屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102841151SQ201210317899
公開(kāi)日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月31日
發(fā)明者田建宣, 劉福利, 李慧英, 高津鳳, 孟建, 田學(xué)文, 岳麗娜, 趙曉雷, 張偉鋒, 李巍, 武永德 申請(qǐng)人:石家莊中碩藥業(yè)集團(tuán)有限公司