專利名稱：花芽內(nèi)源自由態(tài)iaa的提取和定量測定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物內(nèi)源IAA的提取與定量測定，特別涉及花芽自由態(tài)IAA的提取和利用HPLC技術(shù)對自由態(tài)IAA的測定。
背景技術(shù)：
卩引哚乙酸(Indole-3-aceticacid),簡稱IAA,純品為淺黃色結(jié)晶。是一種植物體內(nèi)普遍存在的內(nèi)源生長素，對植物體各個部位的生長均很重要。對光和空氣很敏感，易溶于甲醇、乙酸乙酯；不溶于苯、甲苯、汽油、水及氯仿。它在光和空氣中易分解，不耐貯存。高效液相色譜簡稱HPLC。高效液相色譜的應(yīng)用范圍廣泛，幾乎能夠分析所有的有機、高分子、生物樣品。且有高壓、高效、高靈敏度、分析速度快等優(yōu)點。此外，高效液相色譜還有色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點。目前已知的化合物中，有70%以上的的化合物需要用高效液相色譜法進行分離分析才可以產(chǎn)生好的數(shù)據(jù)結(jié)果。目前，測定植物內(nèi)源IAA的方法有熒光比色法、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法及高效液相色譜法。前兩種方法有的需要衍生，易有干擾而重復(fù)性差，前處理繁瑣，而且儀器昂貴；高效液相色譜法對于植物激素的分離測定具有靈敏、快速和簡便等優(yōu)點。曾有報道黃瓜條、蘋果葉、茶樹梢、獼猴桃、擬南芥、發(fā)酵液等植物樣品中植物激素的HPLC方法，但有關(guān)芽體的自由態(tài)IAA測定方法很少有涉及。而且不同的植物組織生理差異比較大，花芽中的內(nèi)源激素-IAA含量甚微，又富含極多的酚類及色素類等干擾測定的雜質(zhì)。本方法擬用80%甲醇做溶劑提取IAA，甲醇-水(含1%醋酸)為流動相，用高效液相色譜熒光法定量測定
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種花芽內(nèi)源自由態(tài)IAA的提取和定量測定的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案對花芽進行精處理，使花芽內(nèi)部的自由態(tài)IAA可以與其他雜質(zhì)很好的分離開來，同時用HPLC技術(shù)進行精確的定量測定，以更好的測定花芽中自由態(tài)IAA的含量。本發(fā)明的技術(shù)方案內(nèi)容:A.花芽內(nèi)源自由態(tài)IAA的提取技術(shù)；B.利用高效液相色譜法對自由態(tài)IAA的定量測定。A.花芽內(nèi)源自由態(tài)IAA的提取技術(shù)自由態(tài)IAA是很活躍的，在有強光和空氣的環(huán)境中，IAA純品會出現(xiàn)氧化等反應(yīng)，影響測定。為了避免光對試驗數(shù)據(jù)的影響，整個試驗要在不影響試驗進行的弱光條件下進行I).稱取大離心管重量(Ml)，取花芽，重量彡O. 8g，立即用液氮研磨成精細的粉末(M)移入大離心管底部，迅速稱取重量(M2)，待測芽體重量M = M2-M1 ；2).向大離心管中迅速加8ml 80%甲醇，封口，迅速在振蕩儀上振蕩30s，然后置于_20°C浸泡提取24h ；
3).第一次提取結(jié)束,在8500rpm下進行離心25min ;4).取第一次離心后的上清液移入新離心管中，沉淀物再用6ml 80%甲醇溶解，充分震蕩后在_20°C浸泡提取12h ；5).第二次提取結(jié)束,在8500rpm下進行離心25min ;6).取第二次離心后的上清液與第一次的上清液合并，沉淀物再用4ml 80%甲醇溶解，充分震蕩后在_20°C浸泡提取6h ；7).第三次提取結(jié)束,在8500rpm下進行離心25min ;8).取第三次離心后的上清液與第一、二次的上清液合并，棄掉沉淀物；9).分別用 8ml 乙醇(濃度)、16ml 蒸懼水、IOmlSO1^ 甲醇加入 waters C18 (500mg,3ml)固相萃取小柱活化潤洗柱體(柱體內(nèi)液體要保持自然下滴)；10).將第8步中合并的上清液加入waters C18固相萃取小柱過濾處理，收集流出液，處理完再加入6ml甲醇(濃度)淋洗柱體，收集并合并流出液；11).將流出液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45°C低壓蒸餾至干，然后用Iml 80%的甲醇溶解，收集置于2ml離心管；12).用O. 2μπι的微孔濾膜過濾樣液，進樣；B.選擇良好的高效液相色譜條件，利用高效液相色譜法對花芽內(nèi)自由態(tài)IAA的定
量測定。檢測步驟和條件如下高效液相色譜儀Waters2695廠家上海優(yōu)錦電子有限公司型號Waters2695色譜柱Waters sunf ire C18 色譜柱廠家北京金歐亞科技發(fā)展有限公司和型號4.6X 150mm流動相甲醇/ 水(80% 20% V/V ;1% 乙酸；PH :4. O)；流速1.OmL/min ；柱溫20°C；樣品溫度10°C;進樣量20μ I運行時間30min熒光激發(fā)和發(fā)射波長分別為275nm和345nm。此定量測定方法是對自由態(tài)IAA的測定方法之一，不局限在花芽內(nèi)IAA。
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本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明創(chuàng)制的花芽自由態(tài)IAA提取技術(shù)及測定條件可以在短時間內(nèi)就可以針對花芽內(nèi)部的自由態(tài)IAA進行分離和定量測定。同時本發(fā)明發(fā)現(xiàn)并解決了很多自由態(tài)IAA提取的問題⑴很多試驗忽略了光對IAA的影響，其實自由態(tài)IAA是很活躍的，在有強光和空氣的環(huán)境中，IAA純品會出現(xiàn)氧化等反應(yīng)，影響測定。為了避免光對試驗數(shù)據(jù)的影響，本發(fā)明在弱光(不影響操作)下進行。(2)在稱取芽體樣品實際重量的時候，采用差減法。這個方法可以將芽體重量的誤差降到最低。因為花芽中IAA含量極低，任何細微的誤差影響都需要考慮到。(3)采用三次浸提法。以前的試驗很多只是用一次或者兩次浸提法，但是花芽中的雜質(zhì)要遠遠多于其他組織，這需要增加浸提次數(shù)來提高對IAA的提取量。(4)固相萃取小柱的應(yīng)用極大的提高了純化速率，節(jié)省了大量時間，同時操作簡單，IAA分離度好，為大量的純化自由態(tài)IAA提供了保障。以上的細化操作將大大的提高提取的精度。說明書附圖
圖IIAA標(biāo)準(zhǔn)品(200 μ g/ml)的高效液相色譜峰值； 圖2實施例中Od組樣品高效液相色譜峰值；圖3實施例中6d組樣品高效液相色譜峰值；圖4實施例中12d組樣品高效液相色譜峰值；圖5實施例中18d組樣品高效液相色譜峰值；圖6實施例中24d組樣品高效液相色譜峰值；圖7實施例中30d組樣品高效液相色譜峰值。具體實施技術(shù)以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述，但并非對本發(fā)明的限制，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所作的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。實施例I試驗材料為4-5年生牡丹(Paeonia suffruticosa)品種“魯荷紅”的健壯植株?；ㄑ啃螒B(tài)大小要求在(縱徑X橫徑)I. 60cmX0. 6cm以上,每株有6_8枝,每枝條有正常發(fā)育的花芽1-2個，頂芽生長良好。材料處理與取樣2010年11月10號‘魯荷紅’起苗，單株栽植于直徑33厘米、高22厘米盆內(nèi)，澆足水，將盆埋入大田，共54盆。待日最低氣溫達10°C時(II月24號)，此時低溫處理0d，取9盆作為對照組T。，取樣，選取一定數(shù)量植株轉(zhuǎn)移至18_25°C的溫室中，直至12月31號。其余45個植株移入4°C冷庫，開始低溫處理。植株的所有處理安排如下(I)對照(Ttl) :4°C下處理 OcL11月24日Ttl組9盆入溫室。入室前，對其中8盆采取健壯頂芽64個，剝?nèi)[片后，液氮速凍，-80 0C保存，其余搬入溫室。(2)處理一(T1) :4°C條件下處理6d后轉(zhuǎn)至18_25°C溫室條件下生長。11月30日9盆入溫室。入室前，在其中8盆中選取健壯頂芽64個，剝?nèi)[片后，液氮速凍，-80°C保存。(3)處理二(T2) :4°C條件下處理12d后轉(zhuǎn)至18_25°C條件下生長。12月6日9盆移入溫室。入室前，在其中8盆中選取健壯頂芽64個，剝?nèi)[片后，液氮速凍，-80°C保存。(4)處理三(T3) :4°C條件下處理18d后轉(zhuǎn)至18_25°C條件下生長。12月12日9盆移入溫室。入室前，在其中8盆中選取健壯頂芽64個，剝?nèi)[片后，液氮速凍，_80°C保存。
(5)處理四(T4) :4°C條件下處理24d后轉(zhuǎn)至18_25°C條件下生長。12月18日9盆移入溫室。入室前，在其中8盆中選取健壯頂芽64個，剝?nèi)[片后，液氮速凍，_80°C保存。(6)處理五(T5) :4°C條件下處理30d后轉(zhuǎn)至18_25°C條件下生長。12月24日9盆移入溫室。入室前，在其中8盆中選取健壯頂芽64個，剝?nèi)[片后，液氮速凍，_80°C保存?；ㄑ績?nèi)源自由態(tài)IAA的提取I.整個試驗必須確保在弱光下進行，先稱取大離心管重量(M1)，取兩個牡丹頂芽(一共不超過O. Sg)立即用液氮研磨成精細的粉末(M)移入大離心管底部，迅速稱取重量(M2)，待測芽體重量M = M2-M^ 2.向大離心管中迅速加8ml 80%甲醇，封口，迅速在振蕩儀上振蕩30s (不要太劇烈，防止芽體粉末掛壁)，然后置于_20°C浸泡提取24h。3.第一次提取結(jié)束,在8500rpm下進行離心25min。4.取第一次離心后的上清液移入新離心管中(勿吸到下面的沉淀物)，沉淀物再用6ml 80%甲醇溶解，充分震蕩后在_20°C浸泡提取12h。5.第二次提取結(jié)束，在8500rpm下進行離心25min。6.取第二次離心后的上清液與第一次的上清液合并(勿吸到下面的沉淀物)，沉淀物再用4ml 80%甲醇溶解，充分震蕩后在_20°C浸泡提取6h。7.第三次提取結(jié)束,在8500rpm下進行離心25min。8.取第三次離心后的上清液與第一、二次的上清液合并(勿吸到下面的沉淀物)，棄掉沉淀物。9.分別用 8ml 乙醇、16ml 蒸懼水、10111180% 甲醇加入 waters C18 (500mg, 3ml)固相萃取小柱活化潤洗柱體(柱體內(nèi)液體要保持自然下滴)。10.將上清液加入waters C18固相萃取小柱過濾處理，收集流出液，處理完再加入6ml甲醇淋洗柱體，收集并合并流出液。
11.將流出液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45°C低壓蒸餾至干，然后用Iml 80%的甲醇溶解，收集置于2ml離心管。12.用O. 2μπι的微孔濾膜過濾樣液，進樣。實施例2利用高效液相色譜法對牡丹花芽自由態(tài)IAA的定量測定色譜條件如下高效液相色譜儀:Waters2695高效液相色譜儀色譜柱Waterssunf ire C18 色譜柱(4· 6 X 150mm, 5 μ m)流動相甲醇/ 水(80% 20% V/V ;1% 乙酸；PH :4. O)；流速1.OmL/min ；柱溫20°C；樣品溫度10°C;進樣量20μ I運行時間30min熒光激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為275nm和345nm。
檢測結(jié)果出峰時間表I牡丹花芽自由態(tài)IAA在各個低溫培育時期后的色譜出峰時間
權(quán)利要求
1.一種花芽內(nèi)源自由態(tài)IAA的提取方法，具體步驟為 1)稱取大離心管重量(Ml)，取花芽，重量<0.Sg，立即用液氮研磨成精細的粉末(M)移入大離心管底部，迅速稱取重量(M2)，待測芽體重量M = M2-M1 ； 2)向大離心管中迅速加80%甲醇8ml，封口，迅速在振蕩儀上振蕩30s，然后置于-20°C浸泡提取24h ； 3)第一次提取結(jié)束,在8500rpm下進行離心25min； 4)取第一次離心后的上清液移入新離心管中，沉淀物再用80%甲醇6ml溶解，充分震蕩后在-20°C浸泡提取12h ； 5)第二次提取結(jié)束,在8500rpm下進行離心25min； 6)取第二次離心后的上清液與第一次的上清液合并，沉淀物再用80%甲醇4ml溶解，充分震蕩后在_20°C浸泡提取6h ； 7)第三次提取結(jié)束,在8500rpm下進行離心25min； 8)取第三次離心后的上清液與第一、二次的上清液合并，棄掉沉淀物； 9)分別用無水乙醇8ml、蒸懼水16ml、80*%甲酉享IOml加入watersC18(500mg, 3ml)固相萃取小柱活化潤洗柱體； 10)將第8步中合并的上清液加入watersC18固相萃取小柱過濾處理，收集流出液，處理完再加入6ml甲醇(濃度)淋洗柱體，收集并合并流出液； 11)將流出液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45°C低壓蒸餾至干，然后用Iml80%的甲醇溶解，收集置于2ml離心管； 12)用0.2 y m的微孔濾膜過濾樣液，進樣； 整個步驟要在不影響試驗進行的弱光條件下進行。
2.如權(quán)利要求I所述的一種花芽內(nèi)源自由態(tài)IAA的提取方法所提取的花芽內(nèi)源自由態(tài)IAA的檢測方法，其特征在于采用高效液相色譜法檢測，檢測步驟和條件如下 高效液相色譜儀:Waters2695高效液相色譜儀 色譜柱Waters sunfire C18 色譜柱(4. 6 X 150mm, 5 u m) 流動相甲醇 / 水(80% 20% V/V ;1% 乙酸；PH :4.0)； 流速1. OmL/min ； 柱溫20°C ; 樣品溫度10°C ; 進樣量20iil 運行時間30min 熒光激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為275nm和345nm。
全文摘要
花芽內(nèi)源自由態(tài)IAA的提取和定量測定，涉及本發(fā)明涉及植物內(nèi)源IAA的提取與定量測定領(lǐng)域，本發(fā)明的技術(shù)方案對花芽進行精處理，使花芽內(nèi)部的自由態(tài)IAA可以與其他雜質(zhì)很好的分離開來，同時用HPLC技術(shù)進行精確的定量測定，以更好的測定花芽中自由態(tài)IAA的含量。本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明創(chuàng)制的花芽自由態(tài)IAA提取技術(shù)及測定條件可以在短時間內(nèi)就可以針對花芽內(nèi)部的自由態(tài)IAA進行分離和定量測定并大大的提高提取的精度。
文檔編號G01N30/08GK102680614SQ20121014489
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月11日
發(fā)明者勞俊峰, 張金秋, 王春華, 穆平 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)