專利名稱：高靈敏度的銅離子檢測用熒光生物傳感器及其檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種熒光生物傳感器及利用其對水中銅離子進行檢測的方法。
背景技術：
由于工農(nóng)業(yè)廢棄物和城市生活垃圾的劇增以及農(nóng)藥和化肥的大量使用，人類賴以生存的土壤、水體等環(huán)境遭受到了嚴重的重金屬污染，并呈加劇趨勢。在所有重金屬離子中，銅離子是一種重要的痕量元素，在各種生理環(huán)境中發(fā)揮著重要的作用。然而，過量攝入銅離子可能導致人體出現(xiàn)濕疹，危害人的腎臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。所以對環(huán)境和生物樣品中銅離子的分析檢測變得越來越重要。人們采用多種手段來檢測痕量銅離子的濃度，比如原子吸收光譜法，電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)、離子交換色譜等技術、電化學法、化學發(fā)光、吸收光譜和比色法等。這些技術靈敏度高、特異性強，但存在著樣品前處理較為復雜、儀器費用高和需要專業(yè)人員進行操作等缺陷，難以用于重金屬的現(xiàn)場檢測。由于銅離子可以抑制酶的活性，很多學者采用酶生物傳感器來檢測銅離子。酶生物傳感器是一種很有前景的技術，具有檢測時間短，簡便、樣品用量少等優(yōu)點。但是酶傳感器的一個缺點就是檢測限高，難以實現(xiàn)痕量樣品的檢測。雖然很多方法可以用來檢測銅離子，基于有機染料的熒光型傳感器以其較高的靈敏度和操作簡單的特點優(yōu)于其他方法。然而，有機染料的缺點也很明顯，比如信號強度低， 容易光漂白，激發(fā)光譜窄，發(fā)射光譜寬，難以在同一個樣品中同時分析不同的物質。熒光量子點能夠克服有機熒光染料遇到的上述問題，在化學和生物檢測中發(fā)揮了越來越大的作用。這些納米晶材料具有尺寸可調的光學性質、寬吸收、窄發(fā)射、高量子效率、 光穩(wěn)定性等特點。由于量子點的光學性質強烈依靠其表面特性，分析物和量子點表面發(fā)生相互作用會導致其光學性質的巨大變化。所以功能化量子點被廣泛用來檢測離子、分子、生物識別和生物催化等。量子點的一個引人注目的特性是對過氧化氫非常敏感，過氧化氫能腐蝕量子點，使其表面產(chǎn)生缺陷，因而導致量子點的熒光猝滅。過氧化氫是所有氧化酶催化底物后的產(chǎn)物，因此通過過氧化氫來控制量子點的光學特性可以用來測定氧化酶活性、底物或酶抑制劑。到目前為止，還沒有采用量子點的熒光性質結合酶抑制法來檢測重金屬離子的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是利用量子點熒光檢測的高靈敏度結合酶催化反應的高效、專一性，解決目前銅檢測中靈敏度低、選擇性差等問題，提供一種高靈敏度的銅離子檢測用熒光生物傳感器及其檢測方法。本發(fā)明的銅離子檢測用熒光生物傳感器由量子點、酶和酶底物制成，其中量子點濃度為10〃 IO-3 mol/L，酶濃度為O. 01 10U/mL，酶底物濃度為1(Γ4 I mol/L。本發(fā)明按照如下步驟對水中銅離子進行檢測一、將酶加入量子點溶液中，隨后加入酶底物，測得量子點熒光強度的變化；二、將酶和不同濃度的銅離子先混合后再加入量子點溶液中，隨后加入酶底物，測得量子點熒光強度的變化，以相對熒光強度-銅離子濃度作圖，計算得到銅離子的檢測限；上述步驟中量子點濃度為10_7 10_3 mol/L，酶濃度為
0.01 10U/mL,酶底物濃度為10 4 I mol/L
本發(fā)明采用的量子點為CdSe、CdTe, CdS、PbS、CdSeOZnS、CdSeOCdS、CdSeS中的一種或幾種的混合物；酶為甘油磷酸氧化酶、細胞色素C氧化酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、乙醇氧化酶、肌氨酸氧化酶、膽堿氧化酶、抗壞血酸氧化酶、黃嘌呤氧化酶、谷胱甘肽氧化酶、 D-氨基酸氧化酶中的一種；酶底物為甘油磷酸、細胞色素C、葡萄糖、甲醇、肌氨酸、膽堿、抗壞血酸、嘌呤、谷胱甘肽、D-氨基酸中的一種。本發(fā)明具有以下優(yōu)點
一、本發(fā)明得到的檢測銅離子的熒光生物傳感器，由于量子點具有高的熒光量子產(chǎn)率， 結合熒光檢測的高靈敏度，使得檢測靈敏度提高，檢測限降低。二、本發(fā)明得到的檢測銅離子的熒光生物傳感器，采用量子點熒光猝滅結合酶抑制法來檢測銅離子，由于酶的活性被銅離子選擇性猝滅，提高了檢測的選擇性。三、本發(fā)明得到的檢測銅離子的熒光生物傳感器，是基于銅離子對酶活性的抑制作用，從而使量子點猝滅程度降低，熒光強度增強。與以往量子點檢測主要是基于分析物對量子點的熒光猝滅作用相比，這種檢測模式可以避免環(huán)境中其他分析物的干擾，提高檢測的抗干擾能力。四、本發(fā)明工藝簡單，價格低廉，反應條件溫和，易操作，重現(xiàn)性好，是一種很有前景的檢測技術，適用于環(huán)境中甚至生物體系銅離子的痕量檢測。


圖I表示在量子點溶液中加入酶和底物后，熒光光譜隨反應時間的變化圖。(a)為量子點初始熒光光譜；(b)為加入酶后的熒光光譜；(c-j)為在量子點和酶體系中加入底物
1、3、4、5、6、7、8和10分鐘后的熒光光譜。圖2表示在銅離子存在下，量子點、酶、底物體系的相對熒光強度隨時間變化圖。圖3表示熒光相對強度F/h與銅離子濃度線性關系曲線。圖4表示本發(fā)明的生物傳感器的抗干擾能力。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式的銅離子檢測用熒光生物傳感器由量子點、酶和酶底物制成，其中量子點濃度為10_7 10_3 mol/L，酶濃度為0. 01 10U/mL，酶底物濃度為 10 4 I mol/L。本實施方式中，量子點為CdSe、CdTe、CdS、PbS、CdSeOZnS、CdSeOCdS、CdSeS 中的一種或幾種的混合物，其中CdSeOZnS表示是一種核殼結構的量子點，CdSe為內核，外邊包覆一層ZnS的量子點。本實施方式中，酶為甘油磷酸氧化酶、細胞色素C氧化酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、乙醇氧化酶、肌氨酸氧化酶、膽堿氧化酶、抗壞血酸氧化酶、黃嘌呤氧化酶、谷胱甘肽氧化酶、D-氨基酸氧化酶中的一種。本實施方式中，酶底物為甘油磷酸、細胞色素C、葡萄糖、甲醇、肌氨酸、膽堿、抗壞血酸、嘌呤、谷胱甘肽、D-氨基酸中的一種。
具體實施方式
二 本實施方式按照如下步驟對水中銅離子進行檢測一、將酶加入量子點溶液中，隨后加入酶底物，測得量子點熒光強度的變化。二、將酶和不同濃度的銅離子先混合后再加入量子點溶液中，隨后加入酶底物，測得量子點熒光強度的變化。以相對熒光強度-銅離子濃度作圖，計算得到銅離子的檢測限。其中量子點濃度為10_7 10_3 mol/L，酶濃度為O. 01 10U/mL，酶底物濃度為1(Γ4 I mol/L。本實施方式的兩個步驟分別是酶促反應(以及酶活性的抑制)和量子點熒光猝滅， 第一步是酶和底物反應產(chǎn)生產(chǎn)物過氧化氫，第二步是用上一步產(chǎn)生的過氧化氫去猝滅量子點的熒光(熒光降低)，這樣在酶促反應下得到量子點熒光的變化值(I)。當環(huán)境中存在銅離子的時候，銅離子會抑制酶的活性，使第一步中產(chǎn)生的過氧化氫的量減少，進而參與到第二步中的過氧化氫量減少，量子點的熒光猝滅程度減小或不被猝滅，可得含有銅離子條件下的酶促反應使量子點熒光發(fā)生變化的變化值(II)
比較I和II，便可定性定量的檢測出環(huán)境中是否有銅離子，有多少銅離子。本實施方式中量子點為CdSe、CdTe、CdS、PbS、CdSeOZnS、CdSeOCdS、CdSeS 中的一種或幾種的混合物；酶為甘油磷酸氧化酶、細胞色素C氧化酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、乙醇氧化酶、肌氨酸氧化酶、膽堿氧化酶、抗壞血酸氧化酶、黃嘌呤氧化酶、谷胱甘肽氧化酶、D-氨基酸氧化酶中的一種；酶底物為甘油磷酸、細胞色素C、葡萄糖、甲醇、肌氨酸、膽堿、抗壞血酸、嘌呤、谷胱甘肽、D-氨基酸中的一種。
具體實施方式
三本實施方式的銅離子檢測用熒光生物傳感器中量子點濃度為
3.9X 1(T5 mol/L，酶濃度為 lU/mL，酶底物濃度為 4. 92X l(T3mol/L。本實施方式中，當酶和底物加入量子點溶液中后，量子點的熒光明顯降低，如圖I 所示。但酶和底物本身對量子點熒光強度沒有明顯影響，如圖1(b)所示，因此量子點熒光猝滅應該是由于酶催化底物產(chǎn)生的過氧化氫導致的。
具體實施方式
四本實施方式的銅離子檢測用熒光生物傳感器中量子點濃度為
3.9X 10_511101/1，酶濃度為0.川/1^，酶底物濃度為2.46\ 10_3mOl/L，銅離子濃度分別為
0、0· 24 ng/mL、0. 96 ng/mL>I. 44 ng/mL>I. 92 ng/mL、2. 4 ng/mL。本實施方式中，加入銅離子后，酶活性降低，因此量子點熒光猝滅被抑制，即相對熒光強度(FAVF和Ftl分別代表加入甲醇前后量子點的熒光強度)升高。如圖2所示。且隨著銅離子濃度增加，抑制效果越顯著，F(xiàn)/F0值越大。當銅離子濃度為2. 4 ng/mL時，F(xiàn)/F0 接近于1，說明酶活性基本被完全抑制。銅離子濃度在O 2. 4 ng/mL范圍內，相對熒光強度 F/F0與銅離子濃度呈現(xiàn)線性關系，如圖3所示，當信噪比=3時，我們得出此熒光生物傳感器的檢測限為O. 176 ng/mL，遠遠低于美國環(huán)境保護局規(guī)定的飲用水中銅離子的最高含量I. 3 Kg/mL0具體實施方式
五本實施方式的熒光生物傳感器由量子點、酶、底物、銅離子和其他干擾離子制成，其中量子點濃度為3.9 X 10_5 mol/L，酶濃度為0. lU/mL，底物濃度為
2.46 X 10_3 mol/L,銅離子濃度為2. 4ng/mL, Hg2+濃度為24ng/mL，其余離子濃度為240ng/
mLo本實施方式中，當其他干擾離子和銅離子共存時，酶活性被大大抑制。但如果只存在干擾離子時，酶活性變化不大，如圖4所示。表明這種生物傳感器對銅離子具有很好的選擇性，高于其他堿金屬、堿土金屬和重金屬離子。
具體實施方式
六本實施方式按照如下步驟對水中銅離子進行檢測(一)將酶加入量子點溶液中，隨后加入酶底物，測得量子點熒光強度的變化。其中量子點是CdTe量子點，濃度3. 9 X 10_5 mol/L，酶是乙醇氧化酶，濃度O. lU/mL，底物是甲醇，濃度為2. 46mM。 (二)將酶和不同濃度的銅離子先混合后再加入量子點溶液中，隨后加入酶底物，測得量子點熒光強度的變化。以相對熒光強度-銅離子濃度作圖，計算得到銅離子的檢測限。
具體實施方式
七本實施方式按照如下步驟對水中銅離子進行檢測(一)將酶加入量子點溶液中，隨后加入酶底物，測得量子點熒光強度的變化其中量子點是CdTe量子點，濃度3. 9 X 10_5 mol/L，酶是乙醇氧化酶，濃度O. lU/mL，底物是甲醇，濃度為2. 46mM。 (二)將 O. lU/mL 乙醇氧化酶分別與濃度為 240ng/mL 的 Na+，K+，Ca2+，Mg2+，Zn2+，F(xiàn)e3+， Co2+，Ni2+，Cd2+，Pb2+，以及濃度為24ng/mL的Hg2+的背景離子混合。將存在和不存在
2.4ng/mLCu2+的酶-金屬離子混合物，加入到量子點溶液中，隨后加入底物甲醇，測得量子點熒光強度的變化。存在Cu2+的情況下，乙醇氧化酶的活性被有效地抑制了，而僅存在背景離子的情況下，即使這些離子的濃度是Cu2+的100倍，對量子點熒光的影響也是非常小的。 表明這種生物傳感器對銅離子具有很好的選擇性，高于其他堿金屬、堿土金屬和重金屬離子。
具體實施方式
八本實施方式按照如下步驟對水中銅離子進行檢測(一)將葡萄糖氧化酶加入到CdSeOZnS量子點溶液中，隨后加入酶底物葡萄糖，測得量子點熒光強度的變化。其中量子點濃度5. O X 10_4 mol/L,葡萄糖氧化酶濃度O. 5U/mL,葡萄糖濃度為ImM。 (二)將酶和不同濃度的銅離子先混合后再加入量子點溶液中，隨后加入酶底物，測得量子點熒光強度的變化。以相對熒光強度-銅離子濃度作圖，計算得到銅離子的檢測限。
具體實施方式
九本實施方式按照如下步驟對水中銅離子進行檢測(一)將甘油磷酸氧化酶加入到CdS量子點溶液中，隨后加入酶底物甘油磷酸，測得量子點熒光強度的變化。其中量子點濃度7. 5 X 10_6 mol/L，甘油磷酸氧化酶濃度O. I U/mL，甘油磷酸濃度為2 mM。(二)將酶和不同濃度的銅離子先混合后再加入量子點溶液中，隨后加入酶底物，測得量子點熒光強度的變化。以相對熒光強度-銅離子濃度作圖，計算得到銅離子的檢測限。
權利要求
1.高靈敏度的銅離子檢測用熒光生物傳感器，其特征在于所述熒光生物傳感器由量子點、酶和酶底物制成，其中量子點濃度為10_7 10_3 mol/L，酶濃度為O. 01 10U/mL，酶底物濃度為1(Γ4 I mol/L。
2.根據(jù)權利要求I所述的高靈敏度的銅離子檢測用熒光生物傳感器，其特征在于所述量子點為 CdSe、CdTe, CdS、PbS、CdSeOZnS、CdSeOCdS、CdSeS 中的一種或幾種的混合物。
3.根據(jù)權利要求I所述的高靈敏度的銅離子檢測用熒光生物傳感器，其特征在于所述酶為甘油磷酸氧化酶、細胞色素C氧化酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、乙醇氧化酶、肌氨酸氧化酶、膽堿氧化酶、抗壞血酸氧化酶、黃嘌呤氧化酶、谷胱甘肽氧化酶、D-氨基酸氧化酶中的一種。
4.根據(jù)權利要求I所述的高靈敏度的銅離子檢測用熒光生物傳感器，其特征在于所述酶底物為甘油磷酸、細胞色素C、葡萄糖、甲醇、肌氨酸、膽堿、抗壞血酸、嘌呤、谷胱甘肽、 D-氨基酸中的一種。
5.權力要求I所述的高靈敏度的銅離子檢測用熒光生物傳感器檢測方法，其特征在于所述檢測方法包括如下兩個步驟一、將酶加入量子點溶液中，隨后加入酶底物，測得量子點熒光強度的變化；二、將酶和不同濃度的銅離子先混合后再加入量子點溶液中，隨后加入酶底物，測得量子點熒光強度的變化，以相對熒光強度-銅離子濃度作圖，計算得到銅離子的檢測限。
6.根據(jù)權利要求5所述的高靈敏度的銅離子檢測用熒光生物傳感器檢測方法，其特征在于所述量子點為 CdSe、CdTe、CdS、PbS、CdSeOZnS、CdSeOCdS、CdSeS 中的一種。
7.根據(jù)權利要求5所述的高靈敏度的銅離子檢測用熒光生物傳感器檢測方法，其特征在于所述酶為甘油磷酸氧化酶、細胞色素C氧化酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、乙醇氧化酶、肌氨酸氧化酶、膽堿氧化酶、抗壞血酸氧化酶、黃嘌呤氧化酶、谷胱甘肽氧化酶、D-氨基酸氧化酶中的一種。
8.根據(jù)權利要求5所述的高靈敏度的銅離子檢測用熒光生物傳感器檢測方法，其特征在于所述酶底物為甘油磷酸、細胞色素C、葡萄糖、甲醇、肌氨酸、膽堿、抗壞血酸、嘌呤、谷胱甘肽、D-氨基酸中的一種。
全文摘要
高靈敏度的銅離子檢測用熒光生物傳感器及其檢測方法，涉及一種生物傳感器及利用其對水中銅離子進行檢測的方法。為了解決目前銅檢測中靈敏度低、選擇性差等問題，本發(fā)明的銅離子檢測用熒光生物傳感器由量子點、酶和酶底物制成，將酶加入量子點溶液中，隨后加入酶底物，測得量子點熒光強度的變化；將酶和不同濃度的銅離子先混合后再加入量子點溶液中，隨后加入酶底物，測得量子點熒光強度的變化，以相對熒光強度-銅離子濃度作圖，計算得到銅離子的檢測限。本發(fā)明工藝簡單，價格低廉，反應條件溫和，易操作，重現(xiàn)性好，是一種很有前景的檢測技術，適用于環(huán)境中甚至生物體系銅離子的痕量檢測。
文檔編號G01N21/64GK102608092SQ20121008563
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月28日 優(yōu)先權日2012年3月28日
發(fā)明者成晶, 戴志飛, 王金梁, 郭彩欣 申請人:哈爾濱工業(yè)大學