專利名稱：熒光檢測裝置及熒光檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對分析對象物上附著熒光色素的測量對象物受到激光照射后發(fā)出的熒光的熒光信號進行信號處理的熒光檢測裝置及熒光檢測方法。
背景技術(shù)：
流式細胞儀在醫(yī)療、生物領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用。該流式細胞儀用光電倍增管或者雪崩光電二極管等光電轉(zhuǎn)換器接收測量對象物受到激光照射后發(fā)出的熒光，并分析細胞或者基因等測量對象物的種類或頻率或特性。具體來說，流式細胞儀用熒光試劑將細胞、DNA、RNA、酶、蛋白等的活體物質(zhì)等的分析對象物標簽化而制作測量對象物，且施加壓力使測量對象物在以每秒大約IOm以內(nèi)的速度在管道內(nèi)流動的鞘液中流動，由此形成分層鞘流。通過流式細胞儀向該流動中的測量對象物照射激光，由此流式細胞儀接收分析對象物上附著的熒光色素發(fā)出的熒光，并將該熒光作為標簽進行識別，由此特定分析對象物。該流式細胞儀例如能夠測出細胞內(nèi)的DNA、RNA、酶、蛋白質(zhì)等的細胞內(nèi)的相對量， 并能夠在短時間內(nèi)分析這些對象物的作用。另外，流式細胞儀通過熒光判別特定類型的細胞或者染色體，并且用細胞分類器等僅對已判別的細胞或者染色體，以活著的狀態(tài)下在短時間內(nèi)進行分選收集。在該流式細胞儀的使用中，要求在短時間內(nèi)根據(jù)熒光信息對更多的測量對象物進行正確特定。在特開2006-2^698號公報中記載有通過計算出通過激光照射與測量對象物結(jié)合的熒光色素發(fā)出的熒光的熒光壽命(熒光弛豫時間)，能夠在短時間內(nèi)對更多的測量對象物進行正確特定的熒光檢測裝置及方法。該公報記載了以下內(nèi)容熒光檢測裝置對激光進行強度調(diào)制并將其照射在測量對象物上，并求出從測量對象物發(fā)出的熒光的熒光信號相對于用于激光強度調(diào)制的調(diào)制信號的相位滯后，并根據(jù)該相位滯后計算出熒光弛豫時間。但是，測量對象物發(fā)出的熒光，除了包括與細胞等分析對象物結(jié)合的熒光色素發(fā)出的熒光之外，還包括細胞等分析對象物自身發(fā)出的自發(fā)熒光。大部分情況下這樣的自發(fā)熒光的熒光強度相比于熒光色素發(fā)出的熒光的熒光強度小，但也有接收的熒光色素發(fā)出的熒光的熒光強度小的情況。這樣的情況下，無法忽視接收的自發(fā)熒光的影響，會導(dǎo)致無法正確計算出相位滯后，進一步無法正確計算出熒光弛豫時間。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于，為了解決上述課題，提供一種熒光檢測裝置及熒光檢測方法。其中，在對分析對象物上附著熒光色素的測量對象物受到激光照射后發(fā)出的熒光的熒光信號進行信號處理時，能夠計算出高精度的熒光弛豫時間。本發(fā)明的一個實施方式涉及熒光檢測裝置，其中，對分析對象物上至少附著一個熒光色素的測量對象物受到激光照射后發(fā)出的熒光的熒光信號進行信號處理。該裝置包括光源部，利用頻率的調(diào)制信號對第一激光進行強度調(diào)制，并利用與頻率1不同的頻率f2的調(diào)制信號對第二激光進行強度調(diào)制，以發(fā)射出調(diào)制的所述第一激光以及調(diào)制的所述第二激光；受光部，包括將被所述第一激光以及所述第二激光照射所發(fā)出的測量對象物的熒光在第一波段接收并輸出第一熒光信號的第一受光元件，和在與所述第一波段不同的第二波段接收所述測量對象物的所述熒光并輸出第二熒光信號的第二受光元件；第一處理部，通過將所述第一熒光信號與所述頻率的調(diào)制信號混合，生成包括相位信息以及強度信息的第一熒光數(shù)據(jù)P1，通過將所述的第二熒光信號與所述頻率f2的調(diào)制信號混合，生成包括相位信息以及強度信息的第二熒光數(shù)據(jù)P2 ；第二處理部，利用從所述第一熒光數(shù)據(jù)Pl乘以第一常數(shù)的結(jié)果減去第二熒光數(shù)據(jù)P2乘以第二常數(shù)的結(jié)果得到的熒光數(shù)據(jù)，計算出所述熒光色素的熒光弛豫時間。本發(fā)明的其它實施方式涉及熒光檢測方法，其中，對分析對象物上附著熒光色素的測量對象物受到激光照射后發(fā)出的熒光的熒光信號進行信號處理。該方法是對分析對象物上附著熒光色素的測量對象物受到激光照射后發(fā)出的熒光的熒光信號進行信號處理的熒光檢測方法，該檢測方法包括下述步驟利用頻率f\的調(diào)制信號對第一激光進行強度調(diào)制，且利用與頻率fi不同的頻率f2 的調(diào)制信號對第二激光進行強度調(diào)制，以輸出調(diào)制的所述第一激光以及所述第二激光；在第一波段接收測量對象物受到所述第一激光以及所述第二激光照射后發(fā)出的熒光，并輸出第一熒光信號，且在與所述第一波段不同的第二波段接收所述測量對象物的所述熒光，并輸出第二熒光信號；通過將所述第一熒光信號與所述頻率的調(diào)制信號混合，生成包括相位信息以及強度信息的第一熒光數(shù)據(jù)P1，通過將所述第二熒光信號與所述頻率f2的調(diào)制信號混合，生成包括相位信息以及強度信息的第二熒光數(shù)據(jù)P2 ；利用從所述第一熒光數(shù)據(jù)P1乘以第一常數(shù)的結(jié)果減去第二熒光數(shù)據(jù)P2乘以第二常數(shù)的結(jié)果得到的熒光數(shù)據(jù)，計算出所述熒光色素的熒光弛豫時間。在上述實施方式的熒光檢測裝置及熒光檢測方法中，對測量對象物受到激光照射后發(fā)出的熒光的熒光信號進行信號處理時，可以計算出高精度的熒光弛豫時間。


圖1是采用本發(fā)明的強度調(diào)制激光的熒光檢測裝置的流式細胞儀的一個例的概略構(gòu)成圖；圖2是用于圖1所示的流式細胞儀光源部的一個例的概略構(gòu)成圖；圖3是用于圖1所示的流式細胞儀受光部的一個例的概略構(gòu)成圖；圖4是用于圖1所示的流式細胞儀控制和處理部的一個例的概略構(gòu)成圖；圖5是用于圖1所示的流式細胞儀分析裝置的一個例的概略構(gòu)成圖。附圖標記說明10 流式細胞儀
12 樣品20 信號處理裝置22:激光光源部22a,22b 光源23a,26b 分色鏡23bJ6a:透鏡系統(tǒng)24,26 受光部26ci,26c2 帶通濾波器27a、27b 光電轉(zhuǎn)換器28 控制和處理部30 管道32:回收容器3乜、34b:激光驅(qū)動器40 信號生成部42 信號處理部44 信號控制部46a、46b 振蕩器48a、48b 功率分配器50a、50b、52a、52b、54a、54b、64 放大器58a、58b :IQ 混頻器60 系統(tǒng)控制器62 低通濾波器66:A/D 轉(zhuǎn)換器80 分析裝置82 =CPU84 存儲器86:自發(fā)熒光除去部88 熒光信號校正部90 熒光強度計算部92 相位滯后計算部94 熒光弛豫時間計算部
具體實施例方式以下，關(guān)于優(yōu)選使用本發(fā)明的強度調(diào)制激光的熒光檢測裝置的流式細胞儀進行詳細說明。圖1是采用本發(fā)明的強度調(diào)制激光的熒光檢測裝置的流式細胞儀10的概略構(gòu)成圖。流式細胞儀10包括信號處理裝置20和分析裝置(計算機)80。信號處理裝置20朝向作為測量對象的樣品12照射激光，并對樣品12發(fā)出的熒光的熒光信號進行檢測以進行信號處理。分析裝置(計算機)80根據(jù)信號處理裝置20中得到的處理結(jié)果，計算出熒光強度或者熒光弛豫時間。作為樣品12的例子，以下，利用由在細胞(分析對象物) 上附著熒光蛋白(熒光色素U1來構(gòu)成的測量對象物進行說明。在本實施方式中，除了熒光蛋白之外還可以用其它的熒光色素。分析對象物也是，除了細胞之外，還可以用DNA、RNA、酶、蛋白等活體物質(zhì)，除此之外還可以用人工制造的發(fā)出熒光的微球(Micro-beads)。另外，圖1所示的樣品12的構(gòu)成為熒光蛋白&通過絲帶等附著在細胞)(2上，但是這僅僅是模式化的表示。 樣品12的構(gòu)成，例如，也可以是熒光蛋白&進入細胞)(2內(nèi)，形成熒光蛋白&被注入到細胞 X2內(nèi)并分散的構(gòu)成。另外，附著于細胞\的熒光蛋白&不限定于一個，也可以是多個。信號處理裝置20包括激光光源部22、受光部M，沈、控制和處理部觀、管道30?？刂坪吞幚聿?8包括控制部，對從激光光源部22發(fā)射的激光按照特定頻率進行強度調(diào)節(jié)；信號處理部，對樣品12發(fā)出的熒光的熒光信號進行信號處理。在管道30中，使樣品12包括在形成高速流的鞘液中一起流動，由此形成樣品12的流動。在管道30的出口處設(shè)置有回收容器32。在流式細胞儀10的構(gòu)成中也可以配置用來通過激光照射在短時間內(nèi)分離出樣品12中的特定細胞等活體物質(zhì)的細胞分類器，以將其分離于各自的回收容器中。激光光源部22是發(fā)射兩束不同波長激光的部分。透鏡系統(tǒng)按照使激光聚焦在管道30中規(guī)定位置的方式設(shè)置，并在該聚焦位置上形成樣品12的測量點。圖2是表示激光光源部22構(gòu)成的一個例的圖。激光光源部22發(fā)射具有可見光區(qū)域波長且進行強度調(diào)制的激光。激光光源部22包括光源2 和光源22b。光源22a，具有熒光蛋白&的光吸收特性(光吸收系數(shù))相比于細胞(分析對象物) 的光吸收特性(光吸收系數(shù))處于高位置的波段內(nèi)波長的第一激光L1作為CW(連續(xù)波)激光發(fā)射，且用特定頻率的調(diào)制信號對該 CW激光L1強度進行強度調(diào)制。光源22b，具有熒光蛋白&的光吸收特性(光吸收系數(shù))相比于細胞(分析對象物) 的光吸收特性(光吸收系數(shù))處于低位置的波段內(nèi)波長的第二激光L2作為CW(連續(xù)波)激光發(fā)射，且用特定頻率f2的調(diào)制信號對該CW激光L2的強度進行強度調(diào)制。進一步，激光光源部22包括分色鏡23a、透鏡系統(tǒng)23b、激光驅(qū)動器!Ma以及1Mb。 另外，代替分色鏡23a，可以用半透明反射鏡。分色鏡23a使特定波段的激光透射，使其它波段的激光反射。透鏡系統(tǒng)2 使由激光L1和L2構(gòu)成的激光LJL2聚焦在管道30中的測量點上。激光驅(qū)動器3 和34b分別驅(qū)動光源2 和光源22b。作為發(fā)射這樣的激光的光源，例如，可以利用半導(dǎo)體激光器。激光的輸出功率是例如5 lOOmW。另一方面，用于對激光L1和L2進行強度調(diào)制的頻率(調(diào)制頻率)，其周期與熒光弛豫時間相比稍長，例如10 50MHz。對激光L1和L2進行強度調(diào)制的頻率不同。這是因為， 通過使被激光激發(fā)的樣品12發(fā)出的熒光的頻率互為不同，信號處理裝置20得知所接收的熒光來自哪個激光的激發(fā)而產(chǎn)生的熒光，并分離熒光信號。分色鏡23a透射激光L1、反射激光L2。通過該構(gòu)成激光L1和L2被合成而形成為照射測量點樣品12的一束照射光。光源22a、22b在預(yù)先規(guī)定好的波段振蕩，以使激光LpL2通過激發(fā)熒光色素使其發(fā)射出特定波段的熒光。當被激光LpL2激發(fā)的樣品12通過管道30的測量點時，在測量點受到激光Lp L2照射后熒光蛋白&發(fā)射特定波長的熒光，同時細胞\也發(fā)射自發(fā)熒光。受光部M按照夾著管道30與激光光源部22相對而置的方式進行配置。受光部 M包括光電轉(zhuǎn)換器，通過在測量點上通過的樣品12使激光發(fā)生前向散射，由此輸出樣品12 正通過測量點情況的檢測信號。從該受光部M輸出的檢測信號被供給到控制和處理部觀和分析裝置80，用作通知樣品12正通過管道30測量點的時間的觸發(fā)信號、處理開始的ON 和OFF信號。另一方面，受光部沈配置在相對于從激光光源部22發(fā)射的激光發(fā)射方向垂直的方向且相對于管道30中樣品12的移動方向垂直的方向，并包括多個光電轉(zhuǎn)換器，以用來接收樣品12在測量點被激光照射后發(fā)出的熒光。圖3是受光部沈一個例的概略構(gòu)成圖。圖3所示的受光部沈包括對來自樣品12的熒光信號進行聚焦的透鏡系統(tǒng)^a、 分色鏡^b、帶通濾波器^ci、26c2、光電倍增管等光電轉(zhuǎn)換器(受光元件)元件27a、27b。透鏡系統(tǒng)26a按照使入射至受光部沈的熒光在光電轉(zhuǎn)換器27a、27b受光面上聚焦的方式構(gòu)成。分色鏡^b反射規(guī)定范圍波段的熒光，透射其它波段的熒光。按照用帶通濾波器 26ci,26c2過濾后光電轉(zhuǎn)換器27a、27b捕獲規(guī)定波段的熒光的方式設(shè)定分色鏡^b的反射波段以及帶通濾波器^Cl、26c2的透射波段。帶通濾波器^c1、26C2設(shè)置在各光電轉(zhuǎn)換器27a、27b的受光面前面，僅透射具有規(guī)定波段的熒光。透射的熒光波段R1和&分別設(shè)定成對應(yīng)于熒光蛋白&發(fā)出的熒光和細胞 &發(fā)出的自發(fā)熒光的波段。波段是例如為，用來主要接收被從光源2 發(fā)射的波長為408nm 的激光L1照射后發(fā)出的熒光的波長為474nm 514nm波段隊。另外，波段是例如為，用于主要接收被從光源22b發(fā)射的波長為455nm的激光L2照射后發(fā)出的熒光的波長為530nm 570nm 波段 Ii2。此時，優(yōu)選的是，波段R1的熒光蛋白&發(fā)出的熒光的熒光強度和細胞)(2發(fā)出的熒光的熒光強度之比，與波段民的熒光蛋白&發(fā)出的熒光的熒光強度和細胞)(2發(fā)出的熒光的熒光強度之比不同。例如，波段R1優(yōu)選按照在被激光L1照射的樣品12中熒光蛋白&發(fā)出的熒光的熒光強度相對于細胞&發(fā)出的自發(fā)熒光的熒光強度高的方式對應(yīng)于熒光蛋白&設(shè)定。此時， 波段&優(yōu)選按照在被激光L2照射的樣品12中細胞&發(fā)出的自發(fā)熒光的熒光強度相對于熒光蛋白&發(fā)出的熒光的熒光強度高的方式對應(yīng)于自發(fā)熒光設(shè)定。自發(fā)熒光是指，成為熒光測量對象的熒光色素以外的部分發(fā)生熒光，并其成為背景噪音妨礙熒光測量的熒光，并指沒有被染色的細胞等自發(fā)的、在較寬波段上分布的熒光。光電轉(zhuǎn)換器27a、27b是例如包括光電倍增管等傳感器、并將光電面上接收的光轉(zhuǎn)換成電信號的受光元件。在這里，所接收的熒光是基于用特定頻率進行強度調(diào)制的激光激發(fā)的熒光，輸出的熒光信號也是用特定頻率改變強度的信號。該熒光信號被供給到控制和處理部28。如圖4所示，控制和處理部28包括信號生成部40、信號處理部42、信號控制部44。信號生成部40生成用于對激光Lp L2的強度用特定頻率進行調(diào)制的調(diào)制信號。
具體地說，信號生成部40包括振蕩器46a、46b、功率分配器48a、48b以及放大器 50a、50b、52a、52b。信號生成部40將生成的各調(diào)制信號供給到激光光源部22的激光驅(qū)動器34a、34b，同時供給到信號處理部42。如后述，將調(diào)制信號供給到信號處理部42是用作對從光電轉(zhuǎn)換器27a、27b輸出的熒光信號進行檢波的參照信號。另外，調(diào)制信號是在DC成分上載有特定頻率的正弦波信號的信號，其頻率范圍設(shè)定成IOMHz 50MHz。振蕩器46a和振蕩器46b振蕩不同頻率f\、f2的信號，并生成具有不同頻率的調(diào)制信號。信號處理部42利用從光電轉(zhuǎn)換器27a、27b輸出的熒光信號，獲取被激光照射后所發(fā)出的熒光相位滯后信息。信號處理部42包括放大器Ma、Mb、IQ混頻器58a、58b、低通濾波器62。放大器Ma、54b將從光電轉(zhuǎn)換器27a、27b輸出的熒光信號放大。IQ混頻器58a、58b是將從光電轉(zhuǎn)換器27a、27b供給的熒光信號與從信號生成部 40供給的調(diào)制信號作為參照信號混合的裝置。具體地說，IQ混頻器58a，58b各自將參照信號與熒光信號(RF信號)相乘，并各自生成熒光信號的、包括與調(diào)制信號相位相同的成分的 I信號和熒光信號的、包括相對于調(diào)制信號相位90度位移的成分的Q信號。包括相位相同的成分的I信號是通過調(diào)制信號和熒光信號混合生成，包括相位90度位移的成分的Q信號是通過相位90度位移的調(diào)制信號和熒光信號混合生成。由此，被激光L2激發(fā)而在波段R1 中接收的熒光的熒光信號被除去，并被激光L1激發(fā)而在波段&中接收的熒光的熒光信號被除去。低通濾波器62是過濾在IQ混頻器58a、58b中生成的I信號、Q信號的低頻率信號的部分。通過過濾，熒光信號的、與調(diào)制信號相位相同的成分(Re成分)和熒光信號的、 相對于調(diào)制信號相位90度位移的成分am成分)作為熒光數(shù)據(jù)被提取。被提取的各成分送到信號控制部44。Re成分以及Lii成分分別在光電轉(zhuǎn)換器27a、27b上設(shè)定的波段R1以及波段&中得到，因此波段R1的Re成分以及Lii成分的組和波段&的Re成分以及Lii成分的組送到信號控制部44。下面，IQ混頻器58a、58b的混合處理和低通濾波器62的過濾處理統(tǒng)稱為降頻轉(zhuǎn)換處理、通過該處理所得到的數(shù)據(jù)稱為熒光數(shù)據(jù)。信號控制部44放大從信號處理部42送來的熒光信號的Re成分以及Lii成分，并進行AD轉(zhuǎn)換。具體地說，信號控制部44包括系統(tǒng)控制器60，下達用于控制各部分動作的指令， 且管理流式細胞儀10的整個動作；放大器64，放大信號處理部42生成的Re成分以及Lii成分；A/D轉(zhuǎn)換器66，對被放大的Re成分以及Lii成分進行抽樣。分析裝置80根據(jù)在信號控制部44中通過AD轉(zhuǎn)換而得到的Re成分和Lii成分， 求出相對于激光的熒光相位滯后角，進一步地，根據(jù)該相位滯后角求出熒光弛豫時間常數(shù) (熒光弛豫時間)以及熒光強度。圖5為表示分析裝置80的概略構(gòu)成圖。分析裝置80由包括CPU82以及存儲器84的計算機構(gòu)成。分析裝置80進一步包括自發(fā)熒光除去部86、熒光強度計算部90、相位滯后計算部92、熒光弛豫時間計算部94。這些部分是通過啟動計算機上的軟件發(fā)揮其功能的軟件模塊。當然，這些部分可以由專用電路構(gòu)成。自發(fā)熒光除去部86是利用從信號控制部44供給的Re成分和加成分除去細胞\ 發(fā)出的自發(fā)熒光并計算出熒光蛋白&發(fā)出的熒光的熒光數(shù)據(jù)的部分。供給到分析裝置80的Re成分以及Lii成分包括被激光L1激發(fā)的熒光蛋白&發(fā)出的熒光和細胞\發(fā)出的自發(fā)熒光通過在波段Rl中被接收而得到的信息、以及被激光L2 激發(fā)的熒光蛋白&發(fā)出的熒光和細胞&發(fā)出的自發(fā)熒光通過在波段&中接收而得到的信息。因此，分析裝置80為了計算出被激光L1激發(fā)的熒光蛋白\發(fā)出的熒光信息，從被測量的熒光數(shù)據(jù)中除去細胞\發(fā)出的自發(fā)熒光信息。具體地說，分析裝置80將以下四個熒光數(shù)據(jù)預(yù)先求出并存儲，并利用這些熒光數(shù)據(jù)和從信號控制部44供給的Re成分和Lii成分的熒光數(shù)據(jù)，從測量的熒光數(shù)據(jù)中除去細胞 X2發(fā)出的自發(fā)熒光，由此計算出熒光蛋白\發(fā)出的熒光的熒光數(shù)據(jù)。即，在流式細胞儀10中，熒光蛋白\和細胞&各自作為樣品在管道30中流動，信號處理裝置20在波段(第一波段)R1和波段(第二波段) 中接收熒光蛋白&發(fā)出的熒光(第一熒光)和細胞&發(fā)出的熒光(第二熒光)。此時，信號處理裝置20將波段R1的熒光信號和波段&的熒光信號分別用頻率的調(diào)制信號和頻率f2的調(diào)制信號進行混合處理和過濾處理，即進行降頻轉(zhuǎn)換處理。由此，分析裝置80得到包括相位信息以及強度信息的四個熒光數(shù)據(jù)。更加具體地說明的話，在波段R1中接收熒光蛋白&發(fā)出的熒光而得到的熒光信號通過頻率4的調(diào)制信號進行混合處理所生成的熒光數(shù)據(jù)(第三熒光數(shù)據(jù))用A3表示。在波段&中接收熒光蛋白&發(fā)出的熒光而得到的熒光信號通過頻率f2的調(diào)制信號進行混合處理所生成的熒光數(shù)據(jù)(第五熒光數(shù)據(jù))用A5表示。進一步，在波段R1中接收細胞)(2發(fā)出的熒光而得到熒光信號通過頻率的調(diào)制信號進行混合處理所生成的熒光數(shù)據(jù)(第四熒光數(shù)據(jù))用A4表示。在波段&中接收細胞&發(fā)出的熒光而得到的熒光信號通過頻率f2 的調(diào)制信號進行信號處理所生成的熒光數(shù)據(jù)(第六熒光數(shù)據(jù))用A6表示。這些熒光數(shù)據(jù) A3 A6被表示為包括Re成分和Lii成分的值的復(fù)數(shù)。這些復(fù)數(shù)預(yù)先存儲于分析裝置80中。另外，在本實施方式中，熒光數(shù)據(jù)A3 A6的值是分別將熒光蛋白&和細胞作為樣品在管道30中流動而求出的值。但是，還可以是，利用分別適合于熒光蛋白&和細胞& 的濾波器進行熒光數(shù)據(jù)的正確測量，對該測量結(jié)果，利用用于流式細胞儀10的濾波器特性進行校正，預(yù)先求出熒光數(shù)據(jù)A3 A6的值，并存儲于分析裝置80中。另外，還可以利用其它裝置進行測量。該狀態(tài)下，從信號控制部44供給的對應(yīng)于頻率的熒光數(shù)據(jù)，即用頻率的調(diào)制信號進行混合處理而得到的Re成分和Lii成分用復(fù)數(shù)表示的熒光數(shù)據(jù)用P1表示。另一方面，從信號控制部44供給的對應(yīng)于頻率f2的熒光數(shù)據(jù)，即用頻率f2的調(diào)制信號進行混合處理而得到的Re成分和Lii成分用復(fù)數(shù)表示的熒光數(shù)據(jù)用P2表示。此時，熒光蛋白&發(fā)出的熒光和除去細胞)(2發(fā)出的自發(fā)熒光的熒光數(shù)據(jù)P，利用下述式(1)計算出。P = (A3A4) / {(A3A4) - (A5A6)} · P1- (A3A6) / {(A3A4) - (A5A6)} · P2 (1)在這里，式⑴中的(a3/A4)/{(A3/A4)-(A5/A6)}是關(guān)聯(lián)到第一熒光數(shù)據(jù)Pl的第一常數(shù)，(VA6)/{(VA4)-(VA6)}是關(guān)聯(lián)到第二熒光數(shù)據(jù)P2的第二常數(shù)。如此地，通過從上述第一熒光數(shù)據(jù)P1乘以第一常數(shù)的結(jié)果減去第二熒光數(shù)據(jù)I32乘以第二常數(shù)的結(jié)果得到熒光數(shù)據(jù)P。另外，第一常數(shù)以及第二常數(shù)根據(jù)熒光數(shù)據(jù)A3 A6而確定。利用上述式(1)能夠除去自發(fā)熒光的熒光數(shù)據(jù)是基于以下方面的考慮。
通常，按照細胞)(2上附著熒光蛋白&的方式構(gòu)成的樣品12除了熒光蛋白&發(fā)出熒光之外還發(fā)出自發(fā)熒光。因此，利用在波段R1中生成的熒光信號和頻率的調(diào)制信號生成的熒光數(shù)據(jù)P1可以用通過熒光蛋白&發(fā)出的熒光的熒光數(shù)據(jù)P1X1’和通過細胞&發(fā)出的自發(fā)熒光的熒光數(shù)據(jù)Pix2’的加法來表示。同樣，利用在波段&中生成的熒光信號和頻率f2 的調(diào)制信號生成的熒光數(shù)據(jù)P2可以用通過熒光蛋白&發(fā)出的熒光的熒光數(shù)據(jù)P2xi’和通過細胞&發(fā)出的自發(fā)熒光的熒光數(shù)據(jù)P2x2’的加法來表示。進一步，根據(jù)通過激光L1和激光L2收斂的測量點的樣品12的寬度方向的通過位置，所通過的每一個樣品12上熒光強度變動。例如，通過測量點的樣品12通過照射光的端部(激光強度低的部分)，后續(xù)通過的其它樣品12通過照射光的中心部分(激光強度最大的部分)。這樣的熒光強度變動的變動系數(shù)用C(0以上且小于1)表示，將樣品12通過照射光的中心部分時的熒光數(shù)據(jù)用對應(yīng)于各熒光數(shù)據(jù)Pixi’、Pix2’以熒光數(shù)據(jù)P1X1、P1X2表示時，可以用下述式O)、(3)表示。另外，在熒光蛋白&發(fā)出的熒光中，假設(shè)相對于一個細胞)(2有多個(η個)焚光蛋白&發(fā)出熒光，并表示為η · Plxl，η · P2xl。P1 = C · (η · Ρ1Χ1+Ρ1Χ2)(2)P2 = C · (η · Ρ2Χ1+Ρ2Χ2)(3)在這里，式O)中的Pm、P1X2對應(yīng)于上述的熒光數(shù)據(jù)Α3、Α4，式(3)中的Ρ2Χ1、Ρ2Χ2對應(yīng)于上述熒光數(shù)據(jù)Α5、Α6。這些熒光數(shù)據(jù)A3 A6的值預(yù)先存儲在分析裝置80上。因此，利用式( 、(；3)可以定C、n。另一方面，應(yīng)該根據(jù)熒光數(shù)據(jù)Pl計算出的通過激光Ll激發(fā)熒光蛋白Xl發(fā)出的熒光數(shù)據(jù)是On· Pixi，因此如果將該On· Pixi用熒光數(shù)據(jù)A3 A6和P1、 P2表示，就是上述式(1)。如此地，式(1)中，考慮根據(jù)通過測量點的樣品12的通過位置熒光強度變動，且還要考慮相對于一個細胞\多個熒光色素&發(fā)出的熒光，由此可以除去自發(fā)熒光，并能夠計算出僅熒光蛋白&發(fā)出的熒光的熒光數(shù)據(jù)。熒光強度計算部90針對通過自發(fā)熒光除去部86計算出的熒光蛋白&的熒光數(shù)據(jù)P，通過求出復(fù)數(shù)的絕對值，計算出熒光蛋白&的熒光強度。相位滯后計算部92針對通過自發(fā)熒光除去部86計算出的熒光蛋白&的熒光數(shù)據(jù)P，將復(fù)數(shù)的輻角(tan—1 (熒光數(shù)據(jù)的Lii成分/熒光數(shù)據(jù)Re成分))，作為相位滯后角θ 計算出。熒光弛豫時間計算部94利用通過相位滯后計算部92計算出的θ，將熒光蛋白\ 的熒光弛豫時間τ根據(jù)式τ = 1/(2^1^) · tan ( θ )計算出。在這里，是用于對激光L1 進行強度調(diào)制的頻率。能夠通過式τ = 1/(2^1^) - tan(9)算出熒光弛豫時間τ是由于熒光現(xiàn)象表示隨著一次弛豫過程的變化。計算出的熒光蛋白&的熒光強度、相位滯后角θ以及熒光弛豫時間τ是作為結(jié)果信息在未圖示的打印機或者顯示器上輸出。另外，該結(jié)果信息作為樣品12通過管道30 的測量點時測量的結(jié)果，可作為統(tǒng)計處理對象。流式細胞儀10的構(gòu)成如上面所述。接著，關(guān)于用流式細胞儀10進行的熒光檢測方法進行說明。首先，在流式細胞儀10中，針對熒光蛋白&以及細胞)(2，將按照一方的光吸收相對于另一方的光吸收高的方式準備的多個波長的激光Lp L2用不同的多個頻率(f1; f2)進行強度調(diào)制后作為照射光從光源部22射出。接著，具有波段R1以及&的受光部沈接收熒光并輸出熒光信號。此時，優(yōu)選的是，波段R1中的、熒光蛋白&發(fā)出的熒光強度和細胞)(2發(fā)出的熒光的熒光強度之比與波段&中的、熒光蛋白&發(fā)出的熒光的熒光強度和細胞)(2發(fā)出的熒光的熒光強度之比不同。例如，優(yōu)選的是，按照在波段R1中、熒光蛋白&以及細胞)(2中一方的熒光的熒光強度相對于另一方的熒光的熒光強度高，而在波段&中、所述一方的熒光的熒光強度相對于所述另一方的熒光的熒光強度低的方式設(shè)定波段R1以及&?？刂坪吞幚聿坑^通過各輸出的熒光信號與對激光LpL2進行強度調(diào)制的調(diào)制信號的混合，生成包括熒光信號相對于調(diào)制信號的相位滯后角和強度振幅的熒光數(shù)據(jù)Pp P2。分析裝置80將生成的熒光數(shù)據(jù)P1I2代入到上述式(1)來計算出熒光數(shù)據(jù)P。該熒光數(shù)據(jù)P是熒光蛋白\發(fā)出的熒光的熒光數(shù)據(jù)，是已除去細胞&發(fā)出的自發(fā)熒光的熒光數(shù)據(jù)。進一步，分析裝置80利用該熒光數(shù)據(jù)P計算出熒光蛋白\發(fā)出的熒光的熒光強度、 相位滯后角θ以及熒光弛豫時間τ。另外，用于式(1)的熒光數(shù)據(jù)A3 A6的值是存儲于分析裝置80的值。這些值是預(yù)先利用流式細胞儀10將熒光蛋白^c1以及細胞單獨或者一起測量后得到的值。如此地，分析裝置80在計算出熒光弛豫時間τ之前，從熒光數(shù)據(jù)中可以除去細胞 )(2發(fā)出的自發(fā)熒光的熒光數(shù)據(jù)，因此計算出的熒光弛豫時間τ精度高。本實施方式利用兩個具有不同波長的激光，一方的激光相比另一方的激光熒光色素的吸收特性低，因此可以除去分析對象物發(fā)出的自發(fā)熒光。此時，作為優(yōu)選的實施方式， 用于計算熒光數(shù)據(jù)的第一常數(shù)以及第二常數(shù)通過利用通過將熒光色素以及分析對象物分別測量所得到的四個熒光數(shù)據(jù)而確定。此時，由于利用第一常數(shù)以及第二常數(shù)和在相同的激光激發(fā)條件和相同的受光條件下所得到的熒光數(shù)據(jù)P1、Ρ2，因此可以除去根據(jù)測量對象物通過測量點的通過位置熒光數(shù)據(jù)變動的變動原因。以上，關(guān)于本發(fā)明的熒光檢測裝置以及熒光檢測方法進行了說明，但是本發(fā)明不僅限定于上述實施方式，在不脫離本發(fā)明的主要思想的情況下，可以進行各種各樣的改進或者變更。
權(quán)利要求
1.一種熒光檢測裝置，該裝置對分析對象物上至少附著一個熒光色素的測量對象物受到激光照射后發(fā)出的熒光的熒光信號進行信號處理，該檢測裝置包括光源部，利用頻率的調(diào)制信號對第一激光進行強度調(diào)制，且利用與頻率&不同的頻率&的調(diào)制信號對第二激光進行強度調(diào)制，以發(fā)射出調(diào)制的所述第一激光以及調(diào)制的所述第二激光；受光部，包括第一受光元件，在第一波段接收被所述第一激光以及所述第二激光照射所發(fā)出的測量對象物的熒光，并輸出第一熒光信號；第二受光元件，在與所述第一波段不同的第二波段接收所述測量對象物的所述熒光，并輸出第二熒光信號；第一處理部，通過將所述第一熒光信號與所述頻率的調(diào)制信號混合，生成包括相位信息以及強度信息的第一熒光數(shù)據(jù)P1，通過將所述第二熒光信號與所述頻率f2的調(diào)制信號混合，生成包括相位信息以及強度信息的第二熒光數(shù)據(jù)P2 ；第二處理部，利用從所述第一熒光數(shù)據(jù)P1乘以第一常數(shù)的結(jié)果減去第二熒光數(shù)據(jù)P2乘以第二常數(shù)的結(jié)果得到熒光數(shù)據(jù)，計算出所述熒光色素的熒光弛豫時間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光檢測裝置，其特征在于所述第一激光具有所述熒光色素的光吸收特性相對于所述分析對象物的光吸收特性高的波段內(nèi)的波長，所述第二激光具有所述熒光色素的光吸收特性相對于所述分析對象物的光吸收特性低的波段內(nèi)的波長。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的熒光檢測裝置，其特征在于所述第一波段中的、所述熒光色素發(fā)出的熒光的熒光強度與所述分析對象物發(fā)出的熒光的熒光強度之比和所述第二波段中的、所述熒光色素發(fā)出的熒光的熒光強度與所述分析對象物發(fā)出的熒光的熒光強度之比不同。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的熒光檢測裝置，其特征在于所述第二處理部預(yù)先存儲通過在第一波段分別接收所述熒光色素發(fā)出的第一熒光和所述分析對象物發(fā)出的第二熒光而得到的兩個熒光信號與所述頻率f\的調(diào)制信號混合所生成的包括相位信息以及強度信息的兩個熒光數(shù)據(jù)A3、A4 ；且預(yù)先存儲通過在第二波段分別接收所述熒光色素發(fā)出的第一熒光和所述分析對象物發(fā)出的第二熒光而得到的兩個熒光信號與所述頻率f2的調(diào)制信號混合所生成的包括相位信息以及強度信息的兩個熒光數(shù)據(jù) A5、A6，在計算所述熒光弛豫時間時，所述第一常數(shù)以及所述第二常數(shù)根據(jù)已存儲的所述熒光數(shù)據(jù)A3、A4、A5、A6而確定。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的熒光檢測裝置，其特征在于所述第二處理部利用將所述熒光數(shù)據(jù)A3、A4、A5、A6代入到下述式而計算出的熒光數(shù)據(jù)P，計算出熒光弛豫時間。P = (A3A4)/{(A3A4)-(VA6)} · P1 -(A3A6)/{(A3A4)-(A5A6)I · P2
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的熒光檢測裝置，其特征在于所述測量對象物的熒光包括所述熒光色素發(fā)出的熒光和所述分析對象物自身發(fā)出的自發(fā)熒光。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的熒光檢測裝置，其特征在于所述分析對象物是活體物質(zhì)。
8.一種熒光檢測方法，對分析對象物上附著熒光色素的測量對象物受到激光照射后發(fā)出的熒光的熒光信號進行信號處理，該檢測方法包括下述步驟利用頻率的調(diào)制信號對第一激光進行強度調(diào)制，且利用與頻率f\不同的頻率f2的調(diào)制信號對第二激光進行強度調(diào)制，以輸出調(diào)制的所述第一激光以及所述第二激光；在第一波段接收測量對象物受到所述第一激光以及所述第二激光照射后發(fā)出的熒光， 并輸出第一熒光信號，且在與所述第一波段不同的第二波段接收所述測量對象物的所述熒光，并輸出第二熒光信號；通過將所述第一熒光信號與所述頻率的調(diào)制信號混合，生成包括相位信息以及強度信息的第一熒光數(shù)據(jù)P1，通過將所述第二熒光信號與所述頻率f2的調(diào)制信號混合，生成包括相位信息以及強度信息的第二熒光數(shù)據(jù)P2 ；利用從所述第一熒光數(shù)據(jù)P1乘以第一常數(shù)的結(jié)果減去第二熒光數(shù)據(jù)P2乘以第二常數(shù)的結(jié)果得到熒光數(shù)據(jù)，計算出所述熒光色素的熒光弛豫時間。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的熒光檢測方法，其特征在于所述第一激光具有所述熒光色素的光吸收特性相對于所述分析對象物的光吸收特性高的波段內(nèi)的波長，所述第二激光具有所述熒光色素的光吸收特性相對于所述分析對象物的光吸收特性低的波段內(nèi)的波長。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或者9所述的熒光檢測方法，其特征在于所述第一波段中的、所述熒光色素發(fā)出的熒光的熒光強度與所述分析對象物發(fā)出的熒光的熒光強度之比和所述第二波段中的、所述熒光色素發(fā)出的熒光的熒光強度與所述分析對象物發(fā)出的熒光的熒光強度之比不同。
11.根據(jù)權(quán)利要求8至10任一項所述的熒光檢測方法，其特征在于 所述第一常數(shù)以及所述第二常數(shù)根據(jù)預(yù)先得到的四個熒光數(shù)據(jù)而確定， 所述熒光檢測方法包括為得到所述四個熒光數(shù)據(jù)的步驟，該步驟包括通過在第一波段分別接收所述熒光色素發(fā)出的第一熒光和所述分析對象物發(fā)出的第二熒光而得到的兩個熒光信號與所述頻率f\的調(diào)制信號混合，求出包括相位信息以及強度信息的兩個熒光數(shù)據(jù)A3、A4，并將其存儲；通過在第二波段分別接收所述熒光色素發(fā)出的第一熒光和所述分析對象物發(fā)出的第二熒光而得到的兩個熒光信號與所述頻率f2的調(diào)制信號混合，求出包括相位信息以及強度信息的兩個熒光數(shù)據(jù)A5、A6，并將其存儲。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的熒光檢測方法，其特征在于所述第二處理部利用將所述熒光數(shù)據(jù)A3、A4、A5、A6代入到下述式而計算出的熒光數(shù)據(jù)P，計算出熒光弛豫時間。P = (A3A4)/{(A3A4)-(A5A6)I · P1 -(VA6)/{(VA4)-(A5A6)} ·Ρ2。
全文摘要
本發(fā)明提供一種熒光檢測裝置及熒光檢測方法，在利用在分析對象物上附著熒光色素的測量對象物求出熒光色素的熒光弛豫時間時，對第一激光用頻率f1的調(diào)制信號進行強度調(diào)制，且對第二激光用與頻率f1不同的頻率f2的調(diào)制信號進行強度調(diào)制，并發(fā)射出激光；在第一波段接收被激光照射后發(fā)出的測量對象物的熒光而得到第一熒光信號，在第二波段接收熒光而得到第二熒光信號；通過將第一熒光信號與頻率f1的調(diào)制信號混合而生成第一熒光數(shù)據(jù)P1、通過將第二熒光信號與頻率f2的調(diào)制信號混合而生成第二熒光數(shù)據(jù)P2；根據(jù)從第一熒光數(shù)據(jù)P1乘以第一常數(shù)的結(jié)果減去第二熒光數(shù)據(jù)P2乘以第二常數(shù)的結(jié)果所得到的熒光數(shù)據(jù)計算出熒光色素的熒光弛豫時間。
文檔編號G01N21/64GK102272582SQ20108000385
公開日2011年12月7日 申請日期2010年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月9日
發(fā)明者土井恭二 申請人:三井造船株式會社