專利名稱：瘧原蟲抗體膠體金檢測試劑盒及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測用試劑盒，具體涉及一種瘧原蟲抗體膠體金檢測試劑盒及其制備。
背景技術(shù)：
痕疾(Malaria)是由熱帶、亞熱帶的一種蚊盯咬傳播痕原蟲而引起的，不同的痕原蟲分別引起間日瘧、三日瘧、惡性瘧及卵圓瘧。本病主要表現(xiàn)為周期性規(guī)律發(fā)作，全身發(fā)冷、發(fā)熱、多汗，長期多次發(fā)作后，可引起貧血和脾腫大。瘧疾于夏秋季發(fā)病較多，在熱帶及亞熱帶地區(qū)一年四季都可以發(fā)病，并且容易流行。在亞洲和非洲地區(qū)瘧疾仍然是威脅和危害人們健康最為嚴(yán)重的寄生蟲疾病之一。目前，全球仍有I. 2億瘧疾患者，帶蟲者約3億， 非洲每年還有百萬兒童死于瘧疾。富組蛋白(HRP-II)是惡性瘧原蟲消化血紅蛋白后形成的代謝產(chǎn)物，由血液期無性體和早期配子體合成，含有大量組氨酸，具有種特異性，由于是水溶性抗原其可在瘧疾患者的血漿、尿、全血中檢測到，是診斷惡性虐的理想靶位；瘧原蟲乳酸脫氫酶(PLDH)是瘧原蟲體內(nèi)代謝酶，紅內(nèi)期瘧原蟲無性期和配子體期均有表達(dá)，其物理生化、免疫學(xué)特性、酶催化作用等與人體紅細(xì)胞和其他許多微生物的乳酸脫氫酶差異性大，可以作為免疫診斷的靶抗原。目前診斷瘧疾的金標(biāo)準(zhǔn)仍是傳統(tǒng)的血膜染色鏡檢法，且作為瘧疾確診最重要的標(biāo)準(zhǔn)。該法是用普通手動移片和對焦的生物顯微鏡，鏡檢人員常因眼睛疲勞而導(dǎo)致讀片準(zhǔn)確性降低、工作效率低。以納米膠體金為標(biāo)記物的免疫層析技術(shù)發(fā)展很成熟，但現(xiàn)有的瘧疾檢測試劑盒采用的單克隆抗體只能檢測一種抗原，或者是將幾種抗體簡單結(jié)合于檢測區(qū)，增加了生產(chǎn)的復(fù)雜度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種含雙特異性單克隆抗體的瘧原蟲抗體膠體金檢測試劑盒，實現(xiàn)瘧疾(Malaria)的靈敏、特異、快速的檢測。本發(fā)明首先提供了一種瘧原蟲抗體膠體金檢測試劑盒，包括試劑條，試劑條從加樣端開始依次為濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙，免疫膠體金紙片上包被有膠體金標(biāo)記的HRP II-pLDH雙特異性單克隆抗體，硝酸纖維素膜上的檢測區(qū)(T)噴點有抗HRP II特異性單克隆抗體和抗pLDH特異性單克隆抗體、質(zhì)控區(qū)(C)噴點有羊抗鼠免疫球蛋白IgG。較佳的，所述膠體金標(biāo)記的HRPII-pLDH雙特異性單克隆抗體中，膠體金為粒徑 39-42nm的球形顆粒。本發(fā)明的另一方面，提供了這種瘧原蟲抗體膠體金檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟I)用兩步還原法制備平均粒徑為39_42nm的膠體金；
2)采用步驟I制得的膠體金標(biāo)記HRP II-pLDH雙特異性單克隆抗體獲得免疫膠體金;3)采用噴金緩沖液稀釋步驟2)的免疫膠體金獲得免疫膠體金溶液，用免疫膠體金溶液噴涂經(jīng)預(yù)處理的玻璃纖維墊片，制得免疫膠體金紙片；4)在硝酸纖維素膜的檢測線噴點抗HRP II特異性單克隆抗體和抗pLDH特異性單克隆抗體的混合液，在質(zhì)控線上噴點羊抗鼠免疫球蛋白IgG，制得免疫硝酸纖維素膜；5)將濾樣紙、步驟3制備的免疫膠體金紙片、步驟4制備的免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在膠板上，切裁制得檢測試劑條；最后將檢測試劑條裝入塑料盒制得檢測試劑盒。步驟I)所述兩步還原法制備平均粒徑為39_42nm的膠體金具體包括下列步驟a)第一次還原氯金酸溶液制備濃度為O. 0004-0. 0005mol/L的HAuCl4水溶液，加熱煮沸20-30分鐘，之后邊攪拌邊加入檸檬酸三鈉水溶液，HAuCl4與檸檬酸三鈉的摩爾比為I : (8-9)，超聲振蕩2-3 分鐘后冷卻至室溫，既制得14 16nm粒徑的膠體金原溶液。b)第二次還原氯金酸溶液將第一步制得的膠體金原溶液放置于4. 0-4. 5°C恒溫冰浴中穩(wěn)定溫度，隨后按膠體金原溶液與HAuCl4水溶液體積比I : (I. 9-2. O)加入4. 0-4. 5 °C的O. 003-0. 004mol/L HAuCl4水溶液，隨后立即邊攪拌邊滴加4. 0-4. 50C的抗壞血酸與PVP (聚乙烯醇吡咯烷酮) 的混合水溶液，加入的抗壞血酸與本步驟加入的HAuCl4的摩爾比為(25-26) 1，加入的 PVP與本步驟加入的HAuCl4的重量比為I : (2. 0-2. I)，反應(yīng)中保持溫度恒定，攪拌至反應(yīng)完全，溶液呈透明的酒紅色，既制得39-42nm粒徑的膠體金溶液。兩步還原法中，配置各種水溶液均采用雙蒸水。步驟a)中，加入檸檬酸三鈉水溶液的濃度為O. 01-0. 02mol/L。步驟a)中，超聲震蕩的頻率為20-30KHZ。步驟b)中，抗壞血酸與PVP的混合水溶液的滴加速度為1-2滴/S。步驟b)中，所述抗壞血酸與PVP的混合雙蒸水水溶液中，抗壞血酸的濃度為 O. 017-0. 019mol/L, PVP 的濃度為 O. 137-0. 139g/L。步驟b)中，攪拌反應(yīng)約為50-70分鐘。采用上述方法制得的膠體金清亮透明，粒徑尺寸均一，無凝集顆粒，基本未發(fā)現(xiàn)非球形粒子。步驟2)所述HRP II-pLDH雙特異性單克隆抗體是以瘧原蟲富組氨酸蛋白 II(HRP-II)和乳酸脫氫酶(P⑶H)重組蛋白為免疫抗原，利用雜交瘤技術(shù)制得HRP II-pLDH 雙特異性單克隆抗體。進(jìn)一步的，所述HRP II-pLDH雙特異性單克隆抗體是由下列途徑獲得以瘧原蟲富組氨酸蛋白II(HRP-II)和乳酸脫氫酶(P⑶H)重組蛋白為免疫抗原獲得免疫動物脾細(xì)胞后，利用雜交瘤技術(shù)先篩選獲得分泌抗HRP-II單抗的陽性雜交瘤細(xì)胞株，而后將分泌抗 HRP-II單抗的陽性雜交瘤細(xì)胞株再與血清pGDH高滴度的所述免疫動物脾細(xì)胞融合后篩選獲得同時分泌抗HRP-II和P⑶H抗體的雜交-雜交瘤細(xì)胞株，將所述同時分泌抗HRP-II和 PGDH抗體的雜交-雜交瘤細(xì)胞株規(guī)?；囵B(yǎng)后經(jīng)分離純化制得。
較優(yōu)的，所述HRP II-pLDH雙特異性單克隆抗體的制備過程如下以瘧原蟲富組氨酸蛋白II(HRP-II)和乳酸脫氫酶(P⑶H)重組蛋白為免疫原，免疫BALB/c小鼠。取免疫BALB/c小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0，用50%聚乙二醇融合， HAT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)出雜交瘤細(xì)胞。以純化的HRP-II為抗原，間接ELISA法初篩分泌抗 HRP-II抗體的雜交瘤細(xì)胞，有限稀釋法克隆化培養(yǎng)獲得穩(wěn)定分泌抗HRP-II單抗的陽性雜交瘤細(xì)胞株。陽性雜交瘤細(xì)胞株在與血清PGDH高滴度的免疫BALB/c小鼠脾細(xì)胞用50%聚乙二醇(PEG)融合，HAT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)出雜交瘤細(xì)胞，分別用純化的HRP-II，pGDH為抗原， 間接ELISA法篩選同時分泌抗HRP-II和pGDH抗體的雜交-雜交瘤細(xì)胞，有限稀釋法克隆化培養(yǎng)獲得穩(wěn)定分泌抗HRP-II和pGDH雙特異性單克隆抗體陽性的雜交-雜交瘤細(xì)胞株， 規(guī)?；囵B(yǎng)后經(jīng)分離純化制得HRP II-pLDH雙特異性單克隆抗體。步驟2)所述膠體金標(biāo)記HRP II-pLDH雙特異性單克隆抗體可采用常規(guī)方法標(biāo)記。具體的，步驟3)免疫膠體金紙片的制備包括下列步驟I.用噴金緩沖液稀釋步驟2)的免疫膠體金，獲得OD54tl值為I. O 2. O的免疫膠體金溶液；II.用預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙，干燥后，再用免疫膠體金溶液噴涂玻璃纖維紙， 干燥，制得免疫膠體金紙片。較佳的，步驟I所述噴金緩沖液的組分為8 12v% I. OM Tris液、O. 2 O. 4w/ 乂％聚乙二醇20000、0· 15 O. 25界八％牛血清白蛋白，O. I O. 3w/v%脫脂牛奶、O. 25 O. 35w/v%酪蛋白，和O. 02 O. 08w/v%疊氮化鈉，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 5 ±O. 05，余量為水。最優(yōu)的，步驟I中噴金緩沖液配方為10v% I. OM Tris液、O. 3w/v %聚乙二醇 20000、0· 2w/v%牛血清白蛋白，0. 2w/v%脫脂牛奶、O. 3w/v%酪蛋白，和O. 05w/v%疊氮化鈉，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 5±O. 05，余量為水。較佳的，步驟II所述預(yù)處理液的組分包括0. 5 O. 8v% Tween-20,12 18w/ v%鹿糖,溶劑為水。最優(yōu)的，步驟II中預(yù)處理液配方為0.7% Tween-20,16w/v%鹿糖,余量為水。較佳的，步驟II中，用預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙時，每30ml預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙26 Imm X 220mm ;用免疫膠體金溶液噴涂玻璃纖維紙時，每26 Imm X 220mm玻璃纖維紙上噴涂20ml免疫膠體金溶液，干燥，制得免疫膠體金紙片。步驟4)中，抗HRP II特異性單克隆抗體和抗pLDH特異性單克隆抗體的重量比為 O. 8-1. 2:1。最佳為 1:1。本發(fā)明中，Wt %為重量百分比，V %指體積百分比；w/v%指重量體積百分比，Iw/ v%即為IOOml溶液中含lg。所述抗HRP II特異性單克隆抗體和抗pLDH特異性單克隆抗體，可市購或采用常規(guī)方法分別以HRP II和pLDH為免疫原，采用雜交瘤技術(shù)制得。本發(fā)明的試劑盒除試劑條外，還可包括其他例如放置試劑條的盒蓋、盒座，加樣用緩沖液等等。本發(fā)明的瘧原蟲抗體膠體金檢測試劑盒的工作原理，即是利用高度特異的抗體-抗原特異結(jié)合反應(yīng)及免疫膜層析技術(shù)，通過競爭抑制法來定性檢測人尿液中出現(xiàn)的瘧原蟲抗原。
使用時，在加樣區(qū)滴加1-2滴(約50-80 μ I)全血或血清，再滴加2_3滴緩沖液 (可以為生理鹽水、磷酸緩沖液或硼酸緩沖液)，在滴加樣品后20分鐘后判讀結(jié)果。如果血液中含有瘧原蟲HRP II和/或pLDH，其將與固定在玻璃纖維素膜上的HRP II-pLDH雙特異性單克隆抗體膠體金復(fù)合物結(jié)合形成HRP II和/或pLDH抗原-HRP II-pLDH雙特異性單克隆抗體-膠體金復(fù)合物，通過毛細(xì)作用層析至硝酸纖維素膜，與硝酸纖維素膜上檢測線上的HRP II或pLDH單克隆抗體以及質(zhì)控線上的抗抗體結(jié)合，捕獲到膠體金顆粒而呈現(xiàn)兩條紅色色帶，為陽性結(jié)果。如果尿樣中沒有瘧原蟲HRP II和pLDH抗原，則玻璃纖維素膜上的HRP II-pLDH雙特異性單克隆抗體_膠體金復(fù)合物僅與質(zhì)控線上的羊抗鼠IgG結(jié)合，質(zhì)控線捕獲到膠體金顆粒而呈現(xiàn)紅色色帶，為陰性結(jié)果。陰性在結(jié)果觀察窗口內(nèi)出現(xiàn)一條色帶。即質(zhì)控線(C線)位置出現(xiàn)一條紅色線條。表樣品中無痕原蟲抗原存在。陽性在結(jié)果觀察窗口內(nèi)出現(xiàn)兩條色帶。即檢測區(qū)(T線)和質(zhì)控線(C線)位置各出現(xiàn)一條紅色線條，表示樣品中有瘧原蟲抗原存在。無效質(zhì)控線(C線)不出現(xiàn)。任何情況下，C線均應(yīng)形成，表示加樣和操作正確。 C線未出現(xiàn)表明測試結(jié)果是不確定的，應(yīng)重做。本發(fā)明的有益效果(I)本發(fā)明的試劑盒，將HRP II-pLDH雙特異性單克隆抗體包被于免疫膠體金紙片上，特異性強，即能同時檢測兩種抗原，又沒有增加生產(chǎn)操作的復(fù)雜度。(2)本發(fā)明在制備膠體金檢測試劑盒時，采用了兩步還原法制備膠體金分子，使得到的膠體金分子呈大小均一的約40nm球形顆粒，比之已公開的技術(shù)，雖然增加了一個操作步驟，但由于膠體金顆粒大小適中、整體均一，使其與單克隆抗體的結(jié)合效率更高、效果更穩(wěn)定，這保證了標(biāo)記步驟的可控性、降低了試劑盒的批間差異。(3)免疫膠體金紙片制備步驟中，通過采用合理配方的預(yù)處理液對玻璃纖維膜進(jìn)行預(yù)處理并選配合適的噴金緩沖液，可保證免疫膠體金釋放完全的基礎(chǔ)上，有效減慢檢測時免疫膠體金的釋放層析，有利于抗原抗體充分反應(yīng)結(jié)合，有效的提高了反應(yīng)的靈敏度，同樣的閾值下，還可降低免疫膠體金的用量，節(jié)約成本。(4)本發(fā)明制備的檢測試劑盒具有靈敏度高；特異性強；操作簡單便省時，十分適合現(xiàn)場使用。


圖I :膠體金透射電鏡2 :瘧原蟲抗體膠體金檢測試劑盒試劑條示意圖I :濾樣紙2 :免疫膠體金紙3 :免疫硝酸纖維素膜4 :吸水紙5 :檢測線(T線)6 :質(zhì)控線(C線)
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實施例I試劑盒的制備
I.材料I. IBalb/c小鼠30只,6-8周齡,公司自己飼養(yǎng)；I. 2試劑來源羊抗鼠IgG多克隆抗體、HRP-11-pLDH重組蛋白購自美國美迪生物技術(shù)有限公司(MAXMED LABORATORIES INC.)，抗HRP-II單克隆抗體和抗pLDH單克隆抗體(可參考現(xiàn)有文獻(xiàn)報道制備，如郝文波，李明等?？箰盒辕懺x重組HRP-II單克隆抗體的制備與鑒定[J]。中國寄生蟲病防治雜志，2000，13(3) :165-168 ;汪俊云，包意芳，楊玥濤， 湯林華，惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶特異性單克隆抗體的制備。中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志， 2005，4 等)硝酸纖維素薄膜、玻璃纖維紙購自德國賽多利斯公司(SART0RIUS)2 方法2. I膠體金的制備用檸檬酸鈉-抗壞血酸兩步還原法制備粒徑40nm的膠體金a)第一次還原氯金酸溶液將6ml O. 0164mol/L的HAuCl4水溶液加入200ml雙蒸水中，加熱煮沸30分鐘，之后緩慢攪動并準(zhǔn)確加入50ml O. 016mol/L檸檬酸三鈉水溶液。 25KHZ超聲振蕩2分鐘后冷卻至室溫，既制得約15nm粒徑的膠體金原溶液。b)第二次還原氯金酸溶液取第一步制得的膠體金原核溶液26ml，并放置于4°C 水浴鍋中穩(wěn)定溫度，隨后加入50ml預(yù)冷為4. (TC的O. 0035mol/L HAuCl4水溶液并立即緩慢滴加250ml預(yù)冷為4. (TC的含O. 018mol/L的抗壞血酸與O. 138g/L PVP的混合水溶液，滴加速度為1-2滴/s，攪拌反應(yīng)I小時，溶液呈透明的酒紅色，既制得40nm粒徑的膠體金溶液。制得的膠體金采用紫外分光光度計掃描有單一吸收峰，峰形窄，Xmax約為 525nm，采用透射電鏡觀察，如圖I所示，粒徑范圍約為40nm，粒徑尺寸均一，無凝集顆粒，基本未發(fā)現(xiàn)非球形粒子。2. 2雙特異性單克隆抗體的制備2. 2. ISDS-PAGE凝膠電泳法鑒定HRP-II-HpaA重組蛋白2. 2. 2動物免疫與小鼠血清效價測定(I)動物免疫 免疫6-8周齡雌性SPF級Balb/c小鼠10只，將HRP_II-p⑶H抗原用生理鹽水配成 200ug/ml，與福氏完全佐劑等比例充分乳化混勻后，取Iml混懸液于腹部皮下注射免疫，每只小鼠注射Iml/次(分別含抗原IOOug和200ug)，各免疫5只，作為基礎(chǔ)免疫(取免疫前的 Balb/c小鼠尾血作陰性對照)；共進(jìn)行3次基礎(chǔ)免疫，時間隔為兩周；后兩次基礎(chǔ)免疫以同于劑量加福氏不完全佐劑進(jìn)行注射；加強免疫在融合前三天進(jìn)行，用純化抗原100-150ug/ 只腹腔注射。(2)間接ELISA法測定小鼠血清效價2. 2. 3融合前準(zhǔn)備融合前兩周復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)于完全培養(yǎng)液，37°C、5% C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長穩(wěn)定后，以終濃度為20ug/ml 8-氮雜鳥嘌呤完全培養(yǎng)兩周，篩選次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷型細(xì)胞，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。取Balb/c小鼠,麻醉后拔除眼球放血處死,用75%酒精浸泡5min,消毒小鼠體表。 用注射器抽取5ml無血清培養(yǎng)液注入腹腔2-3min，用吸管吸取巨噬細(xì)胞懸液，將腹腔巨噬細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔O. Iml含2*105細(xì)胞。
2. 2. 4制備脾細(xì)胞懸液I，于加強免疫后的3-4天，用間接ELISA法測定小鼠血清產(chǎn)生抗體的效價，選擇高效價者免疫小鼠，麻醉后摘除眼球放血，分離血清用于陽性對照；拉頸處死小鼠，用75%酒精浸泡3-5min，摘取脾臟，去除脂肪和結(jié)締組織，脾臟移入盛有5ml無血清培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。2. 2. 5細(xì)胞融合a.取小鼠脾細(xì)胞懸液,進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1*108;骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0) 懸液進(jìn)行計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1*107。b.將調(diào)整細(xì)胞數(shù)后的小鼠脾細(xì)胞懸液和骨髓瘤細(xì)胞在離心管中混勻成糊狀，離心去上清，緩慢加入50% PEG溶液，完成細(xì)胞融合。c.接種于含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板，每孔lOOul。放入37°C、5% C02孵箱培養(yǎng)。2. 2. 6間接ELISA法篩選陽性克隆以HRP II為抗原間接ELISA法初篩克隆化培養(yǎng)后第14天，細(xì)胞集落長至1/4孔大，用ELISA法檢測有無HRP II抗體分泌。重復(fù)檢測I次，將陽性且為單克隆的孔進(jìn)行第二次克隆化培養(yǎng)，方法同第一次克隆化培養(yǎng)。在聯(lián)系進(jìn)行多次克隆化培養(yǎng)，直至100%的克隆化分泌特異性抗體為止。擴(kuò)大培養(yǎng)特異性抗體。2. 2. 7. HRP II雜交瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞的融合取抗pGDH血清滴度最高的小鼠，分離小鼠脾細(xì)胞，并進(jìn)行計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為 1*108 ;收集對數(shù)生長期的上述雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)1*107。用Iml 50% PEG 溶液，進(jìn)行細(xì)胞融合，離心棄上清重懸浮于40ml HAT培養(yǎng)液中。接種于含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96 孔培養(yǎng)板上，每孔lOOul。放入37°C、5% C02孵箱培養(yǎng)。分別用純化的HRP-II，p⑶H為抗原，間接ELISA法篩選同時分泌抗HRP-II和pGDH抗體的雜交-雜交瘤細(xì)胞，有限稀釋法克隆化培養(yǎng)獲得穩(wěn)定分泌抗HRP-II和pGDH雙特異性單克隆抗體陽性的雜交-雜交瘤細(xì)胞株。2. 2. 8抗HRP II和p⑶H雙特異性單克隆抗體的大量制備和特性鑒定(I)制備小鼠腹水和雙特異性單克隆抗體的純化①腹水制備a.擴(kuò)大培養(yǎng)陽性雜交-雜交瘤細(xì)胞按IO5個細(xì)胞/ml從96孔培養(yǎng)板、24孔培養(yǎng)板、6孔培養(yǎng)板、IOml培養(yǎng)瓶，逐步擴(kuò)大培養(yǎng)。b.收集雜交-雜交瘤細(xì)胞IOOOg離心lOmin，收集雜交-雜交瘤，并用無血清培養(yǎng)液洗滌1-2次，盡量洗去雜蛋白，計數(shù)然后配成濃度為106/ml的細(xì)胞懸液。c.用IO6個細(xì)胞/只小鼠，無菌條件下腹腔內(nèi)大量繁殖。10-15天后小鼠腹部脹大，腹腔內(nèi)出現(xiàn)腹水,此時即可收集腹水,離心取上清。②飽和硫酸銨鹽析法初步純化抗體用50 %飽和硫酸銨和33 %飽和硫酸銨分級提取。③免疫吸附層析法純化獲得雙特異性單克隆抗體。2. 3制備抗HRP II和p⑶H雙特異性單克隆抗體_膠體金復(fù)合物2. 3. I將抗HRP II和P⑶H雙特異性單克隆抗體用0. IM PH7. 2的磷酸鹽緩沖液稀釋成I. 2mg/ml的雙特異性單克隆抗體溶液。2. 3. 2免疫膠體金溶液的配制向配置好的IOOOml的膠體金溶液中加入1/10倍膠體金體積的O. IM PH7. 2的磷酸鹽緩沖液混勻。在攪拌下，再緩緩將I. 2mg/ml的雙特異性克隆抗體溶液20ml加入其中(24 μ g單克隆抗體包被Iml膠體金)。室溫反應(yīng)10分鐘并不時緩緩攪拌。2. 3. 3反應(yīng)結(jié)束后，在上述反應(yīng)液中加入1/50倍反應(yīng)液總體積的5% BSA，使反應(yīng)液中BSA的終濃度為O. I %。室溫反應(yīng)10分鐘并不時緩緩攪拌。2. 3. 4用PH7. 2,0. OlM磷酸鹽-O. 01 % BSA緩沖液在位清洗膠體金洗滌濃縮系統(tǒng)，
將系統(tǒng)清洗干凈。2. 3. 5將反應(yīng)結(jié)束后的免疫膠體金泵入膠體金洗滌濃縮系統(tǒng)中，洗滌純化。純化結(jié)束后，繼續(xù)濃縮免疫膠體金復(fù)合物溶液至體積小于80ml，補充PH7. 2,0. OlM磷酸鹽-O. 01% BSA緩沖液至最終體積80ml。2. 4免疫膠體金紙制備分別采用方法1、2、3制備。方法I 2. 4. I預(yù)處理液的制備準(zhǔn)確稱取7ml Tween-20,160g鹿糖，加純化水定容至 IOOOml02. 4. 2噴金緩沖液的制備取800ml純化水，往里加入100ml I. OM Tris液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 5。準(zhǔn)確稱取3. Og聚乙二醇20000、2. Og牛血清白蛋白，2. Og脫脂牛奶，3. Og 酪蛋白溶液和O. 5g疊氮化鈉加入溶液中，充分溶解，混合均勻，加純化水至總體積1000ml。2. 4. 3用噴金緩沖液稀釋步驟3制備的免疫膠體金，至溶液OD540值為I. 2，獲得免疫膠體金溶液。2. 4. 4用預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙，每30ml預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙 26 Imm X 220mm,浸泡30min后，37 °C下干燥；再用免疫膠體金溶液噴涂玻璃纖維紙，每 261mmX 220mm玻璃纖維紙上噴涂20ml免疫膠體金溶液，干燥，制得免疫膠體金紙片。方法2:2. 4. I預(yù)處理液的制備準(zhǔn)確稱取5ml Tween-20,180g鹿糖，加純化水定容至 IOOOml02.4. 2噴金緩沖液的制備取800ml純化水，往里加入120ml 1.0M Tris液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 5。準(zhǔn)確稱取2. Og聚乙二醇20000、I. 5g牛血清白蛋白，3. Og脫脂牛奶，2. 5g 酪蛋白溶液和O. 8g疊氮化鈉加入溶液中，充分溶解，混合均勻，加純化水至總體積1000ml。2. 4. 3用噴金緩沖液稀釋步驟3)的免疫膠體金，至溶液OD54tl值為I. 2，獲得免疫膠體金溶液。2. 4. 4用預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙，每30ml預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙 26 Imm X 220mm,浸泡25min后，37 °C下干燥；再用免疫膠體金溶液噴涂玻璃纖維紙，每 261mmX 220mm玻璃纖維紙上噴涂20ml免疫膠體金溶液，干燥，制得免疫膠體金紙片。方法3:2. 4. I預(yù)處理液的制備準(zhǔn)確稱取8ml Tween-20,120g鹿糖，加純化水定容至 IOOOml0
2. 4. 2噴金緩沖液的制備取800ml純化水，往里加入80ml I. OM Tris液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 5。準(zhǔn)確稱取4. Og聚乙二醇20000、2. 5g牛血清白蛋白，I. Og脫脂牛奶，3. 5g 酪蛋白溶液和O. 2g疊氮化鈉加入溶液中，充分溶解，混合均勻，加純化水至總體積1000ml。2. 4. 3用噴金緩沖液稀釋步驟3)的免疫膠體金，至溶液OD54tl值為I. 2，獲得免疫膠體金溶液。2. 4. 4用預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙，每30ml預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙 26ImmX 220mm，浸泡30min后，37 °C下干燥；再用免疫膠體金溶液噴涂玻璃纖維紙，每 261mmX 220mm玻璃纖維紙上噴涂20ml免疫膠體金溶液，干燥，制得免疫膠體金紙片。2.5制備免疫硝酸纖維素膜2. 5. IC線溶液的配制:2.5. I. I根據(jù)需配制的C線溶液的量量取羊抗鼠IgG原液，將其用0.01M，PH7.2磷酸緩沖液稀釋成2. 5mg/ml的羊抗鼠IgG抗體溶液。2. 5. I. 2在配制好的羊抗鼠IgG溶液中，加入1/150倍于其體積的上述O. 05M EDTA 溶液，使EDTA的終濃度為O. 33mM。2. 5. 2T線溶液的配制2. 5. 2. I配制批量為5ml，抗HRP-II單克隆抗體和抗pLDH單克隆抗體蛋白的終濃度均分別為2. Omg/ml。抗HRP-II單克隆抗體和抗pLDH單克隆抗體的重量比為I : I。2. 5. 2. 2在配制好的T線溶液中加入1/150倍于其體積的上述O. 05M EDTA溶液， 使EDTA的終濃度為O. 33mM。2. 5. 3.在硝酸纖維素膜的相應(yīng)位置噴點C、T線。2. 5. 4將濾樣紙、免疫膠體金紙、免疫硝酸纖維素膜、吸水紙按圖2所示依次粘貼在膠板上，切裁成寬度為3 5mm的試劑條制得檢測試劑條；2. 5. 5將檢測試劑條進(jìn)一步裝入設(shè)有加樣孔和觀察窗的盒體，并裝入塑料盒制得檢測試劑盒。實施例2瘧原蟲抗體膠體金膠體金檢測試劑盒的靈敏度實驗檢測方法I、取實施例I制得的瘧原蟲抗體膠體金檢測試劑盒，將試劑盒放置在水平臺面上。2、用加樣吸管吸取樣品，然后滴2滴(約50-80 μ I)樣品到試劑盒的加樣孔中，再滴加2滴生理鹽水。每檢測一份不同的樣品使用不同的吸管。3、觀察結(jié)果在滴加樣品后20分鐘判讀結(jié)果。檢測樣品配置HRP-II濃度為10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml的質(zhì)控參考品作為樣品。配置pLDH濃度為5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml的質(zhì)控參考品作為樣品。檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種瘧原蟲抗體膠體金檢測試劑盒，包括試劑條，試劑條從加樣端開始依次為濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙，免疫膠體金紙片上包被有膠體金標(biāo)記的 HRP II-pLDH雙特異性單克隆抗體，硝酸纖維素膜上的檢測區(qū)(T)噴點有抗HRP II特異性單克隆抗體和抗PLDH特異性單克隆抗體、質(zhì)控區(qū)(C)噴點有羊抗鼠免疫球蛋白IgG。
2.如權(quán)利要求I所述瘧原蟲抗體膠體金檢測試劑盒，其特征在于，所述膠體金標(biāo)記的 HRPII-pLDH雙特異性單克隆抗體中，膠體金為粒徑39_42nm的球形顆粒。
3.如權(quán)利要求I或2所述瘧原蟲抗體膠體金檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟1)用兩步還原法制備平均粒徑為39-42nm的膠體金；2)采用步驟I制得的膠體金標(biāo)記HRPII-pLDH雙特異性單克隆抗體獲得免疫膠體金；3)采用噴金緩沖液稀釋步驟2)的免疫膠體金獲得免疫膠體金溶液，用免疫膠體金溶液噴涂經(jīng)預(yù)處理的玻璃纖維墊片，制得免疫膠體金紙片；4)在硝酸纖維素膜的檢測線噴點抗HRPII特異性單克隆抗體和抗pLDH特異性單克隆抗體的混合液，在質(zhì)控線上噴點羊抗鼠免疫球蛋白IgG，制得免疫硝酸纖維素膜；5)將濾樣紙、步驟3制備的免疫膠體金紙片、步驟4制備的免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在膠板上，切裁制得檢測試劑條；最后將檢測試劑條裝入塑料盒制得檢測試劑盒。
4.如權(quán)利要求3所述瘧原蟲抗體膠體金檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟I) 所述兩步還原法制備平均粒徑為39-42nm的膠體金具體包括下列步驟a)第一次還原氯金酸溶液制備濃度為O. 0004-0. 0005mol/L的HAuCl4水溶液，加熱煮沸20-30分鐘，之后邊攪拌邊加入檸檬酸三鈉水溶液，HAuCl4與檸檬酸三鈉的摩爾比為I : (8-9)，超聲振蕩2-3分鐘后冷卻至室溫，既制得14 16nm粒徑的膠體金原溶液；b)第二次還原氯金酸溶液將第一步制得的膠體金原溶液放置于4. 0-4. 5°C恒溫冰浴中穩(wěn)定溫度，隨后按膠體金原溶液與 HAuCIjK溶液體積比 I (I. 9-2. O)加入 4. 0-4. 5°C 的 O. 003-0. 004mol/L HAuCl4 水溶液，隨后立即邊攪拌邊滴加4. 0-4. 5°C的抗壞血酸與PVP (聚乙烯醇吡咯烷酮)的混合水溶液，加入的抗壞血酸與本步驟加入的HAuCl4的摩爾比為(25-26) 1，加入的PVP與本步驟加入的HAuCl4的重量比為I : (2.0-2. I)，反應(yīng)中保持溫度恒定，攪拌至反應(yīng)完全，溶液呈透明的酒紅色，既制得39-42nm粒徑的膠體金溶液；兩步還原法中，配置各種水溶液均采用雙蒸水。
5.如權(quán)利要求3所述瘧原蟲抗體膠體金檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟2) 所述HRP II-pLDH雙特異性單克隆抗體是以瘧原蟲富組氨酸蛋白II(HRP-II)和乳酸脫氫酶(P⑶H)重組蛋白為免疫抗原，利用雜交瘤技術(shù)制得的HRP II-pLDH雙特異性單克隆抗體。
6.如權(quán)利要求3所述瘧原蟲抗體膠體金檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟3) 免疫膠體金紙片的制備包括下列步驟I.用噴金緩沖液稀釋步驟2)的免疫膠體金，獲得OD54tl值為I.O 2. O的免疫膠體金溶液；II.用預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙，干燥后，再用免疫膠體金溶液噴涂玻璃纖維紙，干燥， 制得免疫膠體金紙片。
7.如權(quán)利要求6所述瘧原蟲抗體膠體金檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟I所述噴金緩沖液的組分為8 12v% I. OM Tris液、02 O. 4￥八％聚乙二醇20000、0· 15 O.25界八％牛血清白蛋白，O. I O. 3w/v%脫脂牛奶、O. 25 O. 35w/v%酪蛋白，和O. 02 O.08w/v%疊氮化鈉，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 45-8. 55,余量為水。
8.如權(quán)利要求6或7所述瘧原蟲抗體膠體金檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟 II所述預(yù)處理液的組分包括0. 5 O. 8v% Tween-20,12 18w/v%鹿糖,溶劑為水。
9.如權(quán)利要求3所述瘧原蟲抗體膠體金檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟4) 中，抗HRP II特異性單克隆抗體和抗pLDH特異性單克隆抗體的重量比為O. 8-1. 2 I。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種瘧原蟲抗體膠體金檢測試劑盒及其制備。本發(fā)明的瘧原蟲抗體膠體金檢測試劑包括試劑條，試劑條從加樣端開始依次為濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙，免疫膠體金紙片上包被有膠體金標(biāo)記的HRPⅡ-pLDH雙特異性單克隆抗體，硝酸纖維素膜上的檢測區(qū)(T)噴點有抗HRPⅡ特異性單克隆抗體和抗pLDH特異性單克隆抗體、質(zhì)控區(qū)(C)噴點有羊抗鼠免疫球蛋白IgG。本發(fā)明的瘧原蟲抗體膠體金檢測試劑盒可實現(xiàn)瘧疾(Malaria)的靈敏、特異、快速檢測。
文檔編號G01N33/558GK102590522SQ20121005842
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月7日
發(fā)明者張國華 申請人:上海凱創(chuàng)生物技術(shù)有限公司