尿液分子的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種個體或被測試者是否患有癌癥，或者有發(fā)生癌癥可能性的檢測腫瘤癌變的尿液分子的應(yīng)用。本發(fā)明通過對被檢腫瘤尿液進(jìn)行差異分子篩選，檢測驗證分析其在腫瘤尿樣中人富含亮氨酸α-糖蛋白和氨肽酶N的水平含量，所述的人富含亮氨酸α-糖蛋白差異分子表達(dá)與腫瘤癌變正相關(guān)，所述的氨肽酶N差異分子的表達(dá)與腫瘤癌變惡性度正相關(guān)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的兩個腫瘤相關(guān)分子標(biāo)志物為篩查和診斷個體有可能發(fā)生癌癥或已經(jīng)存在癌癥提供了新的、方便的實驗室檢測指標(biāo)。同以往的腫瘤相關(guān)檢測需要抽血或進(jìn)行組織穿刺相比，這種腫瘤相關(guān)分子的檢測將是無創(chuàng)的，而且取樣方便，特別適用于對腫瘤高危人群的大范圍篩查和在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測。
【專利說明】尿液分子的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，特別涉及一種早期檢測腫瘤癌變的尿液分子的應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]癌癥(cancer)是一種由于細(xì)胞生長增殖機(jī)制失常而引起的疾病，惡變的細(xì)胞除了生長失控以外，并不同程度地失去原來細(xì)胞固有的形態(tài)和功能，還可侵犯周圍組織，甚至經(jīng)由體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到身體的其他部分，從而導(dǎo)致患者的惡性結(jié)局甚至死亡。目前關(guān)于癌癥發(fā)生的原因并未完全闡明，故而缺乏有效的預(yù)防手段。如能在癌癥發(fā)生的早期進(jìn)行診斷，其治療的成功率則會大大提高。
[0003]一般來講，癌癥的診斷主要依賴于患者的臨床表現(xiàn)、實驗室檢查和各種影像學(xué)檢測技術(shù)。但是，臨床上很多癌癥患者在早期并無明顯的癥狀，發(fā)現(xiàn)時往往已到了晚期，比如卵巢癌，腫瘤早期基本上無任何癥狀。
[0004]實驗室檢查，包括對血液腫瘤標(biāo)志物的檢測、尿液和其他體液的化驗和病理學(xué)檢查，還存在各種各樣的缺陷和操作上的困難，因而在實際應(yīng)用中還達(dá)不到早期篩查、早期檢測以及早期治療腫瘤的目的。對大多數(shù)腫瘤而言，目前還缺乏特異性好、敏感度高的血液腫瘤診斷標(biāo)志物。腫瘤組織的病理學(xué)檢查，是確診腫瘤的可靠方法，但需要進(jìn)行組織穿刺、或者進(jìn)行組織活檢，屬于“侵入式”檢查且臨床操作較為復(fù)雜，顯然不適用于大范圍的腫瘤早期篩查。其他一些檢測技術(shù)，比如乳房X線和B超檢查，腸鏡以及CT、磁共振等影像學(xué)檢查，作為臨床上重要的腫瘤診斷的輔助手段，通常不能發(fā)現(xiàn)較小的早期腫瘤，而且需要特殊昂貴的儀器，因而在應(yīng)用上存在一定的局限性，尤其是不能應(yīng)用于大范圍的腫瘤早期篩查。
[0005]流行病學(xué)調(diào)查顯示，原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC，肝癌)的全球發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，死亡率接近60萬/年，位居腫瘤相關(guān)死亡的第3位。肝癌在我國高發(fā)，發(fā)病人數(shù)約占全球的55%，死亡率為30萬/年，在腫瘤相關(guān)死亡中僅次于肺癌。在亞洲和非洲的一些國家和地區(qū)，肝癌主要與肝炎病毒感染有關(guān)，如HBV、HCV的慢性感染及其基礎(chǔ)上的肝硬化。肝炎-肝硬化-肝癌為肝炎病程發(fā)展的“三部曲”。在肝炎發(fā)病率低的國家，肝癌主要源于其它器官腫瘤的轉(zhuǎn)移，如直腸癌的肝轉(zhuǎn)移。肝癌的治療及預(yù)后取決于很多因素，但主要取決于腫瘤的大小和進(jìn)展階段。分級高的腫瘤預(yù)后較差，而分級低的腫瘤通常多年不被發(fā)現(xiàn)。目前血清AFP(Alpha Fetal Protein,甲胎蛋白)的檢測仍是實驗室篩查和診斷肝癌的主要標(biāo)志物，其對肝癌診斷的陽性率雖可達(dá)到70-90%，但是還存在很多缺陷:1.診斷不夠早期。血清AFP升高> 400ng/ml，才可進(jìn)行定性診斷。2.檢測不夠特異，檢測結(jié)果存在一定的假陽性，影響因素較多。一些良性肝病如急性肝炎、慢性活動性肝炎、肝硬化等肝臟疾病時AFP均升高，有時會呈高濃度陽性；妊娠期、患惡性生殖系統(tǒng)的胚胎腫瘤時AFP也會升高。有報道表明其他一些疾病，如先天性膽道閉鎖、酪氨酸代謝異常、部分繼發(fā)性肝癌、肝臟的一些良性腫瘤等疾病也有不同程度的AFP升高。3.檢測方法較為復(fù)雜，且常用的放射免疫法，存在放射性污染。研究發(fā)現(xiàn)更好的肝癌早期診斷標(biāo)志物，也是世界范圍內(nèi)研究的熱點和難點。
[0006]國內(nèi)外學(xué)者為尋找肝癌診斷、預(yù)后判斷的標(biāo)志物，利用高通量、整合性的“組學(xué)”技術(shù)進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)了一些潛在的標(biāo)志物，如磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican，GPC)、高爾基蛋白-73(golgiprotein，GP-73)、miR-151、miR-26等；或者利用標(biāo)志物組合，如⑶151和c-Met、細(xì)胞角蛋白10和19、包含十幾到幾十個分子標(biāo)簽的組合或者miRNA指紋。但這些標(biāo)志物多來源于科研機(jī)構(gòu)的獨立報道，其臨床應(yīng)用價值尚需進(jìn)一步多中心、規(guī)模化驗證，且這些檢測需要的技術(shù)和成本較高，通常使用組織或者血液樣品，需要侵入性取材，因此用于臨床尚且有待時日或有一定的局限性。
[0007]如果能對高危人群進(jìn)行及早篩查和早期確診，可及時實施相應(yīng)的治療手段，如放化療、手術(shù)或者肝臟移植，則有可能對小的、分化度較好或者生長速度較慢的腫瘤達(dá)到較好的治療效果。但事實是幾乎沒有早期確診的患者，發(fā)現(xiàn)時往往已到了肝癌晚期，對此各種治療手段都可能無濟(jì)于事。不能夠早期診斷是肝癌死亡率居高不下的一個重要原因。
[0008]早期篩查、診斷是及時進(jìn)行腫瘤治療的關(guān)鍵。因此研究發(fā)現(xiàn)肝癌及其他腫瘤診斷相關(guān)的分子標(biāo)志物，發(fā)展成為簡便易行的檢測方法，用以早期篩查或者判斷個體有無發(fā)展為腫瘤的傾向或者已經(jīng)發(fā)生腫瘤，對于腫瘤的早發(fā)現(xiàn)、早治療以及預(yù)后具有重要的臨床應(yīng)用價值。
[0009]理想的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)當(dāng)具有特異性高、敏感性高，能在腫瘤發(fā)生早期被檢測出來；檢測方法應(yīng)當(dāng)具有簡便易行、取樣取材方便等特點，適宜于在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)操作和用于大范圍的腫瘤篩查。
[0010]近些年來，利用體液樣品對患者脫落的癌細(xì)胞及其相關(guān)的代謝產(chǎn)物、分泌的蛋白分子進(jìn)行檢測，已成為潛在的較為簡便和可靠的腫瘤診斷方式。比如，通過對唾液樣品進(jìn)行細(xì)胞病理學(xué)分析，對分泌的生長因子和其他分子進(jìn)行檢測，用于肺癌、唾液腺癌的診斷；對糞便里的脫落細(xì)胞的遺傳和表觀遺傳學(xué)基因改變的檢測，用于直腸、結(jié)腸癌的診斷；尿液里的分泌的代謝產(chǎn)物和大分子的檢測，同樣有可能作為前列腺癌、腎癌和膀胱癌診斷的標(biāo)志物。
[0011]肝臟作為人體主要的代謝器官，參與糖、蛋白質(zhì)、脂類、維生素等的代謝以及激素的滅活；同時肝臟還參與膽汁生成和排泄，具有解毒、凝血、免疫防御、調(diào)節(jié)血容量等功能。肝臟病變可直接或間接影響到機(jī)體各種生物分子的代謝水平，癌變細(xì)胞的生長增殖、黏附侵襲、血管生成等相關(guān)分子的表達(dá)和代謝異常。其代謝產(chǎn)物異常有可能表現(xiàn)于在體液中，通過相關(guān)的檢測方法檢測出來，從而成為肝癌診斷的標(biāo)志物。
[0012]因此，我們嘗試從患者尿液中尋找和發(fā)現(xiàn)可用于肝癌和其他腫瘤診斷的分子標(biāo)志物，以期達(dá)到從尿液中方便地進(jìn)行腫瘤篩查和早期診斷檢測的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的目的旨在解決對腫瘤患者的篩查、早期診斷以及療效評估、預(yù)后判斷的問題，提供一種個體或被測試者是否患有癌癥，或者有發(fā)生癌癥可能性的診斷檢測的尿液分子應(yīng)用。
[0014]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0015]一種尿液分子的應(yīng)用，其特征在于，包括:對被檢腫瘤尿液進(jìn)行差異分子篩選并檢測驗證分析其在腫瘤尿樣中的水平含量，
[0016]所述差異分子是指人富含亮氨酸α -糖蛋白和氨肽酶N，[0017]所述差異分子篩選是指采用質(zhì)譜分析技術(shù)，
[0018]所述檢測驗證分析是指western-blot分析和免疫斑點雜交分析。
[0019]所述的人富含亮氨酸α -糖蛋白差異分子，英文描述為:leucine_rich-2-glycoprotein-l,簡稱:LRG1,注冊號:GeneBank accession number:NP_443204,該分子與腫瘤癌變正相關(guān)。
[0020]所述的氨肽酶N差異分子,英文描述為:Aminopeptidase N,簡稱:APN或⑶13,注冊號:GeneBank accession number:NP_001141,該分子與腫瘤癌變惡性度正相關(guān)。
[0021]肝癌患者可檢測到人富含亮氨酸α-糖蛋白和氨肽酶N兩個差異分子。
[0022]肺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、食道癌、腎癌、前列腺癌、尿道癌、胰腺癌、膀胱癌、直腸癌、骨髓瘤以及轉(zhuǎn)移性肝癌患者可檢測到人富含亮氨酸α-糖蛋白差異分子。
[0023]本發(fā)明篩選肝癌患者尿液中可能存在的腫瘤相關(guān)分子，并進(jìn)一步對篩選出的分子用肝癌或其他腫瘤患者尿樣進(jìn)行鑒定，探索其用于肝癌或其他腫瘤的篩查或診斷的可能性。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的兩個腫瘤分子標(biāo)志物為篩查和診斷個體有可能發(fā)生癌癥或已經(jīng)存在癌癥提供了新的、方便的實驗室檢測指標(biāo)。同以往的腫瘤相關(guān)檢測需要抽血或進(jìn)行組織穿刺相t匕，這種腫瘤相關(guān)分子的檢測將是無創(chuàng)的，取樣方便，特別適用于對腫瘤高危人群的大范圍篩查和在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測。這種分子的檢測將不需要昂貴的儀器，檢測價格低廉，且具有早期發(fā)現(xiàn)、篩查出腫瘤的優(yōu)勢，并且本發(fā)明對于腫瘤治療過程中療效的評價以及預(yù)后判斷可能具有重要價值。
[0024]說明書附圖
[0025]圖1:實驗步驟流程圖。
[0026]圖2:患者尿樣蛋白分離結(jié)果圖。
[0027]圖3:LRG1 二次質(zhì)譜結(jié)果圖。
[0028]圖4:二次質(zhì)譜鑒定出的LRGl肽段的搜索結(jié)果圖。
[0029]圖5:基于Mowse分?jǐn)?shù)的LRGl可能性結(jié)果圖。
[0030]圖6:患者樣品經(jīng)二次MS檢測出的肽段序列結(jié)果圖。
[0031]圖7 =LRGl的氨基酸序列，與測試吻合的多肽片段圖，顯示為著重處。
[0032]圖8:CD13 二次質(zhì)譜結(jié)果圖。
[0033]圖9:二次質(zhì)譜鑒定出的⑶13肽段的搜索結(jié)果圖。
[0034]圖10:基于Mowse分?jǐn)?shù)的⑶13可能性結(jié)果圖。
[0035]圖11:患者樣品經(jīng)二次MS檢測出的肽段序列結(jié)果圖。
[0036]圖12:⑶13的氨基酸序列，與測試吻合的多肽片段圖，顯示為著重處。
[0037]圖13:western-blot方法驗證肝癌尿樣中LRGl的水平的結(jié)果圖。
[0038]圖14:western-blot方法驗證健康對照尿樣中⑶13的水平的結(jié)果圖。
[0039]圖15:western-blot方法驗證健康對照者尿樣中⑶13和LRGl的水平的結(jié)果圖。
[0040]圖16:western-blot方法驗證肝癌患者尿樣中的CD13和LRGl水平的結(jié)果圖。
[0041]圖17:免疫斑點雜交方法檢測其他惡性腫瘤患者尿樣中LRGl的部分結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0042]以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的過程做進(jìn)一步描述:[0043]本發(fā)明所描述的尿液分子的應(yīng)用，要解決的技術(shù)問題是篩選肝癌患者尿液中可能存在的腫瘤相關(guān)分子，并進(jìn)一步對篩選出的分子用肝癌或其他腫瘤患者尿樣進(jìn)行鑒定，探索其用于肝癌或其他腫瘤的篩查或診斷的可能性。
[0044]具體實施方案步驟如下:
[0045]I)測試對象的選擇
[0046]選擇健康對照者和臨床確診的肝癌患者。其中健康對照者來源于體檢正常人群，排除其它病毒感染性疾病(如HAV、HCV、HDV、HEV、HIV等)、酒精性肝硬化、膽道疾病以及其它惡性腫瘤。
[0047]肝癌患者及其他惡性腫瘤患者來源于陜西省腫瘤醫(yī)院和西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院的住院患者，臨床診斷明確，排除其他惡性腫瘤和腎臟疾病。檢測方案經(jīng)各醫(yī)院倫理委員會審核，患者被告知并簽署知情同意書。
[0048]2)體液樣品的收集
[0049]用干凈的一次性容器收集測試者的晨起、中段尿約10mL。尿樣收集后，低溫儲存運(yùn)輸，進(jìn)行編號登記，分裝后保存于_80°C低溫冰箱直到檢測分析。如尿樣渾濁，先進(jìn)行離心(1500rpm, 5min)去除沉淀物。
[0050]3)樣品中蛋白的分離
[0051]尿樣濃縮后行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，分離尿液中的蛋白質(zhì)。
[0052]4)質(zhì)譜分析
[0053]A.樣品還原和烷基化:將上述電泳蛋白條帶切下，置于50% 0.1M碳酸銨，48.75%乙腈，I %碘乙醇和0.25%三乙膦溶液(pH 10)中I小時；
[0054]B.樣品消化:用胰蛋白酶消化過夜(緩沖液為50mM碳酸氫銨，pH 8.0);用5%甲酸，50%乙腈溶劑提取酶解的肽段；真空干燥機(jī)濃縮至10 μ L ;
[0055]C.質(zhì)譜分析:用加樣緩沖液(0.1 %甲酸，2%乙腈)重建溶液之后，樣品手動加樣，流速為 10μ L/min，進(jìn)行 LC/ESI/MS/MS 液相質(zhì)譜分析。(R-P column, 100x0.300mm,5μΜ/300Α, Polymeric C18 ；MS Model Bruker 1n-Trap)。
[0056]D.質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索:使用mascot數(shù)據(jù)庫(Matrix Science)進(jìn)行搜索,得出檢測結(jié)
果O
[0057]5)檢測結(jié)果的western-blot方法驗證
[0058]對篩選出的LRGl和CD13兩種分子，用健康對照者和肝癌患者尿樣進(jìn)行進(jìn)一步驗證，具體步驟如下:取測試者尿樣30 μ L，行10% SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上；
[0059]Α、用 10%脫脂奶粉封閉 PVDF 膜后，分別加入 LRGl (LRG-lpolyclonal antibody,Sigma, Cat#:HPA001888)和 CD13 (CD13antibody rabMab，Epitomics，Inc Cat#:2933-1) —抗，4°C孵育過夜；
[0060]B、洗滌后，分別加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的兔或鼠的IgG 二抗(Cell Signaling)，37°C孵育2h ;加入ECL溶液反應(yīng)，沖洗膠片，得到檢測結(jié)果。
[0061]6)其他腫瘤患者尿液中LRGl分子的檢測
[0062]采用Dot-blot方法檢測LRGl在其他各種腫瘤患者尿樣中的存在情況，方法如下:[0063]A、取測試者尿樣5 μ L，加至PVDF膜上；
[0064]B、用10%脫脂奶粉封閉PVDF膜lh，然后加入LRGl兔抗人多抗(LRG-lpolyclonalantibody, Sigma, Cat#:HPAOO1888)，37°C孵育 2hr ；
[0065]C、洗滌后，加入HRP標(biāo)記的兔IgG 二抗(Cell Signaling)，37°C孵育Ih ;加入ECL溶液反應(yīng)，沖洗膠片，得到檢測結(jié)果。
[0066]本方案的實施流程圖如圖1所示，包括樣品采集，蛋白分離，蛋白消化，質(zhì)譜檢測，數(shù)據(jù)分析，以及進(jìn)一步的免疫雜交(western-blot)驗證。圖2展示了患者尿樣蛋白分離結(jié)果(31-42)，其中，M:蛋白marker，N:正常健康對照樣品。圖3展示了一個典型的LRGl 二次質(zhì)譜結(jié)果。圖4展示了二次質(zhì)譜鑒定出的LRGl肽段的搜索結(jié)果。圖5展示了基于Mowse分?jǐn)?shù)的LRGl可能性結(jié)果，LRGl的可能性分?jǐn)?shù)約為380。圖6展示了患者樣品經(jīng)二次MS檢測出的肽段序列結(jié)果和人富含亮氨酸的α-糖蛋白(LRGl)序列相一致。圖7展示了人富含亮氨酸的α-糖蛋白的氨基酸序列，與測試吻合的多肽片段為著重顯示。圖8展示了一個典型的CD13 二次質(zhì)譜結(jié)果。圖9展示了二次質(zhì)譜鑒定出的CD13肽段的搜索結(jié)果。圖10展示了基于Mowse分?jǐn)?shù)的⑶13可能性結(jié)果，⑶13的可能性分?jǐn)?shù)約為825。圖11展示了患者樣品經(jīng)二次MS檢測出的肽段序列結(jié)果與CD13相一致。圖12展示了 CD13的氨基酸序列，和測試吻合的多肽片段為著重顯示。圖13展示了 western-blot方法驗證肝癌尿樣中LRGl的水平的結(jié)果，其中，M:蛋白Marker ；N005-N040:健康對照者尿樣；A108:肝癌患者尿樣。結(jié)果顯示:與肝癌對照相比較，健康對照者尿樣中LRGl水平很低或者略微升高。圖14展示了 western-blot方法驗證健康對照尿樣中⑶13的水平的結(jié)果,其中,M:蛋白Marker ；N005-N040:健康對照者尿樣；A108:肝癌患者尿樣。結(jié)果顯示:與肝癌對照相比較,健康對照者尿樣中⑶13水平極低,個別樣品略微升高。圖15展示了 western-blot方法驗證健康對照者尿樣中⑶13和LRGl的水平的結(jié)果。N041-N048健康對照者尿樣；A108:肝癌患者尿樣。結(jié)果顯示:與肝癌對照相比較，健康對照者尿樣中CD13和LRGl水平極低。圖16展示了western-blot方法驗證肝癌患者尿樣中的⑶13和LRGl水平的結(jié)果,其中,M:蛋白Marker ；N:健康對照尿樣；其余數(shù)字為肝癌患者尿樣。結(jié)果顯示:與健康對照者相比較，肝癌患者尿樣中LRGl和CD13水平基本上都有大幅度的升高。圖17展示了用免疫斑點雜交方法檢測其他惡性腫瘤患者尿樣中LRGl的部分結(jié)果。結(jié)果顯示:肝癌、轉(zhuǎn)移性肝癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、食道癌、腎癌、前列腺癌、膀胱癌以及骨髓瘤轉(zhuǎn)移性肝癌患者尿樣中可檢測到不同程度LRGl水平。
[0067]本發(fā)明可能實施的方案或形式的進(jìn)一步的說明:
[0068]本發(fā)明為檢測個體是否可能具有患有腫瘤的危險或已經(jīng)罹患腫瘤提供兩個新的檢測指標(biāo)或方法。在鑒定出LRGl和CD13兩個候選分子后，我們實施了四種檢測方案:即分別檢測LRG1、⑶13在肝癌患者尿液中的水平；聯(lián)合檢測LRGl和⑶13在在肝癌患者尿樣中的水平；另外對其他惡性腫瘤患者尿樣中LRGl進(jìn)行檢測，目的是驗證其能否用于其他腫瘤的篩查或診斷，如肺癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、食道癌、胰腺癌、乳腺癌、轉(zhuǎn)移性肝癌等。
[0069]我們實驗結(jié)果的意義在于:檢測待測對象尿液樣品中的LRG1、CD13或者二者共同的水平，經(jīng)與對照值比較后可以用于:1.判斷待測對象可能發(fā)展為癌癥或已經(jīng)可能已經(jīng)存在癌癥的危險性；2.確定待測對象可能發(fā)展或已經(jīng)有以下惡性腫瘤的可能危險性肝癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、食道癌、腎癌、前列腺癌、膀胱癌、直腸癌、骨髓瘤以及轉(zhuǎn)移性肝癌；3.確定待測對象可能發(fā)展或已經(jīng)有肝癌的危險性。
[0070]正常人血液中產(chǎn)生的LRGl和⑶13水平都極低，現(xiàn)有的檢測手段通常無法在體液中檢測得到(如圖13-16)。于此形成明顯對比的是在肝癌患者樣品里L(fēng)RGl和⑶13水平都大為升高(如圖13-16)。我們的液相質(zhì)譜和蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果都表明LRGl (6/6)和CD13(5/6)在肝癌患者尿樣里升高，而在健康對照者樣品中都是陰性的，表明LRGl (0/6)和⑶13 (1/6)在肝細(xì)胞癌陰性個體尿樣里基本無上升。這種LRGl (45/48)和⑶13 (48/48)在肝癌患者樣品升高的結(jié)果，經(jīng)質(zhì)譜分析和蛋白免疫印跡進(jìn)一步證實。進(jìn)一步的54個健康對照實驗，結(jié)果為:LRGl(3/54)和CD13(2/54)略微上升。我們所有的結(jié)果都強(qiáng)烈顯示LRGl和CD13水平上升和肝癌密切相關(guān)。因此，我們的發(fā)現(xiàn)可以成為肝癌診斷的新指標(biāo)或標(biāo)志物。
[0071]另外，其他各種腫瘤患者尿樣中也可以檢測到LRG1，這與檢測方法的特異度、以及腫瘤的分級分期有關(guān)，能檢測到的樣本均來源于惡性腫瘤，且臨床分期較晚、腫瘤惡性度較高，尚需用更為特異的方法進(jìn)行進(jìn)一步驗證。但是結(jié)果依然提示其用于其他惡性腫瘤的篩查或輔助診斷的可能性。
[0072]因而，我們的發(fā)現(xiàn)可以進(jìn)一步發(fā)展成為LRGl和或⑶13定性、定量檢測診斷試劑盒，同現(xiàn)有的檢測相比較，其將具有較高檢測靈敏度，而且簡單易行，樣本容易取得。
[0073]預(yù)定值或進(jìn)一步的實施方案:
[0074]LRGl和⑶13的水平可以用很多定性和定量的方法來檢測，如金標(biāo)法、吸光度法，蛋白濃度測定法(如DC蛋白測定法，BCA蛋白測定法和Lowry蛋白測定法)，電泳分離法(如SDS-PAGE膠純化法)，蛋白免疫印跡(如western blot),色譜分析(如分子大小色譜分析，離子交換色譜分析和親和柱色譜)，沉淀法，超速離心法，酶聯(lián)免疫法(ELISA法)和其它常用技術(shù)。另外，也可以用檢測試劑盒進(jìn)行LRGl和CD13的定量分析。
[0075]因此，在進(jìn)一步的實施方案中，我們可對健康群體尿液樣品中的LRGl和/或⑶13水平進(jìn)行檢測，設(shè)定尿液參考值(預(yù)定值)。其他人群尿液的測定水平與其進(jìn)行比較，檢測受試者體液中LRGl和/CD13水平是否異常，從而篩選、判斷受試者是否可能患有癌癥或者有發(fā)展成為癌癥的風(fēng)險。
[0076]預(yù)定值可能有各種形式,其可能是一個單個的臨界值(cut-off value),比如中位數(shù)或者是均值；也可以是從某個特定定義組里得出的數(shù)值，比如不同的腫瘤組或腫瘤的不同分期組；預(yù)定值可能是一個范圍，受試人群依據(jù)檢測結(jié)果分成不同等級，如低危、中等危險和聞危人群。
[0077]LRGl和/或CD13水平的預(yù)定值，如臨界值、中位數(shù)和均值等，由測量整體人群或者選定人群的大量樣品之后應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)模型而建立，比如說預(yù)示值方法是選定一個陽性判定標(biāo)準(zhǔn)或者可接受的容許曲線，用以定義最適特異性(最高真陰性率)和敏感度(最高真陽性率)?！癱ut-off’值可以用以判定LRG1、⑶13或兩者的共同水平。
[0078]受試者中體液樣品LRGl和⑶13水平與預(yù)定值比較:
[0079]受試者體液樣品中危險預(yù)測對象(LRG1和/或CD13)的水平都將和LRGl和/或CD13預(yù)定值或者預(yù)定值的范圍進(jìn)行比較。如果受試者體液樣品中LRGl和/或CD13水平高于預(yù)定值或預(yù)定值范圍，受試者則可能比其他低于預(yù)定值或預(yù)定范圍的個體有更高的患有肝癌可能性或已經(jīng)患有肝癌。受試者的LRGl和/或CD13水平和預(yù)定值之間差別的大小對于判斷這種危險性大小也有意義，按照低、中、高危的水平，為判斷受試者是否要采取進(jìn)一步的診斷和治療措施提供參考。
[0080]另外，本發(fā)現(xiàn)LRGl和⑶13水平升高除了可作為肝癌腫瘤標(biāo)志物，還可以作為檢測其他高風(fēng)險癌癥的指示物，比如肺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、食道癌、腎癌、前列腺癌、膀胱癌、骨髓瘤以及轉(zhuǎn)移性肝癌。因此，這個發(fā)現(xiàn)對于篩查、檢測現(xiàn)有的實驗室方法無法檢測的高風(fēng)險惡性腫瘤有特別重要的價值。而且，更重要的是，這兩種腫瘤相關(guān)分子如果能同時與現(xiàn)有的腫瘤標(biāo)志物一起使用，比如甲胎蛋白，將提高癌癥風(fēng)險預(yù)測和診斷的準(zhǔn)確性。
[0081]以上是對本方案的具體描述，很顯然，在本方案的發(fā)明構(gòu)思下所做出的任何改變都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種尿液分子的應(yīng)用，其特征在于，包括:對被檢腫瘤尿液進(jìn)行差異分子篩選并檢測驗證分析其在腫瘤尿樣中的水平含量， 所述差異分子是指人富含亮氨酸α-糖蛋白和氨肽酶N， 所述差異分子篩選是指采用質(zhì)譜分析技術(shù)， 所述檢測驗證分析是指western-blot分析和免疫斑點雜交分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿液分子的應(yīng)用，其特征在于:所述的人富含亮氨酸α-糖蛋白差異分子，英文描述為:leucine-rich-2-glycoprotein-l,簡稱:LRG1,注冊號:GeneBank accession number:NP_443204,該分子與腫瘤癌變正相關(guān)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿液分子的應(yīng)用，其特征在于:所述的氨肽酶N差異分子，英文描述為:Aminopeptidase N,簡稱:APN 或 CD13,注冊號:GeneBank accession number:NP_001141，該分子與腫瘤癌變惡性度正相關(guān)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿液分子的應(yīng)用，其特征在于:肝癌患者可檢測到人富含亮氨酸α-糖蛋白和氨肽酶N兩個差異分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿液分子的應(yīng)用，其特征在于:肺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、食道癌、腎癌、前列腺癌、尿道癌、胰腺癌、膀胱癌、直腸癌、骨髓瘤以及轉(zhuǎn)移性肝癌患者可檢測到人富含亮氨酸α-糖蛋白差異分子。
【文檔編號】G01N27/62GK103487493SQ201210015044
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年6月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月14日
【發(fā)明者】劉紅莉, 周愛民, 曾春 申請人:劉紅莉