專利名稱：熒光測(cè)定法的制作方法
熒光測(cè)定法本發(fā)明涉及熒光測(cè)定法，且具體地涉及用于樣本中熒光的時(shí)延檢測(cè)的方法和設(shè)備，例如用于一種臨床環(huán)境。使用熒光的技術(shù)可用于生物分子的檢測(cè)。各種涉及以這種方式檢測(cè)熒光的技術(shù)已為人所知，例如，如Connally等人在“用于時(shí)間選通發(fā)光顯微鏡檢法的高強(qiáng)度固態(tài)紫外源(High Intensity Solid-State UV Source for Time-Gated Luminescence Microscopy)，，細(xì)胞計(jì)量術(shù)A69A部分:1020-1027,2006中所披露的，其中，描述了一種基于紫外(UV) LED的系統(tǒng)，該系統(tǒng)用于檢測(cè)包括鑭系元素螯合物的探針中的熒光。此類熒光探針具有長熒光壽命，這使它們的檢測(cè)能夠與具有非常短壽命的背景熒光區(qū)分開來。通常，為了區(qū)分探針熒光和背景熒光，在一段采集時(shí)期內(nèi)，可以從一個(gè)樣本上檢測(cè)到一個(gè)光信號(hào)，該采集時(shí)期在該背景熒光有效地消失時(shí)開始。在Connally等人中，使用了一種利用電觸發(fā)UV LED和攝像機(jī)的光學(xué)裝置，在沿提供至該LED的激勵(lì)信號(hào)的下降沿的一段拖延時(shí)期后觸發(fā)該攝像機(jī)。也提到了早期時(shí)間選通儀器，其中，斬波器盤被用作廉價(jià)的脈沖激勵(lì)源。由于脈沖輪廓具有緩慢的上升和下降沿并在分辨率和敏感度上有限制，Connally等人提到這種早期儀器是不利的。斬波器盤的其他明顯限制因素包括該脈沖方式的不靈活性質(zhì)、光能的低使用率以及由于驅(qū)動(dòng)電機(jī)振動(dòng)引起的圖像模糊風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)該熒光探針的濃度低時(shí)，例如，當(dāng)其在臨床樣本中下被用于檢測(cè)低豐度生物分子時(shí)，噪聲和敏感度不足是特別的問題。Greinert等人在生物化學(xué)和生物物理方法期刊，I (1979) 77-83，“E式延遲熒光去極化，一種在微秒范圍內(nèi)用探針探查旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)的技術(shù)(E-Type Delayed FluorescenceDepolarization, A Technique to Probe Rotational Motion in the MicrosecondRange)”中披露了使用一個(gè)斬波器盤的機(jī)械選通熒光計(jì)的示例，其中，一種脈沖氮激光器用于照亮樣本，并且斬波器盤用于阻擋早期熒光發(fā)射并使得一延遲部分能夠穿過一個(gè)光電倍增管。Marriott 等人在“時(shí)間分辨成像顯微法(Time resolved imaging microscopy)”，生物物理學(xué)，期刊，60卷，1991年12月，1374-1387頁中披露了另一個(gè)示例，其中，兩個(gè)鎖相斬波器和一個(gè)慢掃描CCD攝像機(jī)附裝在一個(gè)突光顯微鏡上,樣本被一個(gè)光脈沖周期序列照亮，且各激勵(lì)期結(jié)束后，在定義的時(shí)間間隔內(nèi)記錄一張圖像。US4, 954, 714中披露了 一種機(jī)械選通突光計(jì)的另一個(gè)不例,其中，一個(gè)斬波器裝置與一個(gè)攝像機(jī)結(jié)合使用，該斬波器防止攝影膠片暴露在背景熒光下并與光源的閃光頻率相協(xié)調(diào)以保證該膠片只暴露在延遲熒光輻射下。如Connally等人所述的，現(xiàn)有機(jī)械選通熒光計(jì)系統(tǒng)的一個(gè)問題在于脈沖沿上升和下降緩慢，此問題可使具有短壽命的熒光探針的檢測(cè)更加困難。另一個(gè)問題涉及需要將這些機(jī)械組件和透鏡系統(tǒng)結(jié)合進(jìn)一個(gè)熒光計(jì)系統(tǒng)的設(shè)備的尺寸和復(fù)雜性，該問題可防止此類系統(tǒng)被用于受控實(shí)驗(yàn)室以外的環(huán)境中，例如用于空間更受限制的醫(yī)院床邊環(huán)境等臨床環(huán)境內(nèi)。這種機(jī)器的操作也可能是復(fù)雜的，并且需要專家或高度熟練的操作員。需要進(jìn)行各種試驗(yàn)以保證可靠性并滿足質(zhì)量控制要求。這些問題的結(jié)果是，臨床樣本通常被移至一個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析，且獲得分析結(jié)果太晚而不能通知臨床決策，特別是在急救護(hù)理上。
另一個(gè)問題涉及復(fù)雜系統(tǒng)的使用，無論是機(jī)械的還是電氣的/電子的，這些復(fù)雜系統(tǒng)用于使光源發(fā)出的光與由一個(gè)檢測(cè)器檢測(cè)的光同步(或，在US4，954，714，案例中，一個(gè)感光膠片)，這樣只有該延遲熒光被檢測(cè)到。US’ 714中，通過將一個(gè)用于光發(fā)射的斬波器和一個(gè)用于光檢測(cè)的斬波器結(jié)合進(jìn)一個(gè)共用斬波器盤內(nèi)一定程度上解決了此問題，雖然這只部分地解決了所用設(shè)備的尺寸問題，且未解決(和可能突出)與引起圖像模糊的電機(jī)振動(dòng)相關(guān)的問題，或者使用電子光傳感器情況下的問題，可能來自該電機(jī)的影響該光檢測(cè)器的噪聲。本發(fā)明的目的是解決以上所提到的問題中的一個(gè)或多個(gè)問題。本說明書中的明顯先前發(fā)布的文件的列表和討論不必視為對(duì)該文件是本領(lǐng)域狀態(tài)的一部分或者是公共常識(shí)的承認(rèn)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)第一方面提供了一種突光計(jì)，該突光計(jì)包括:一個(gè)光源；一個(gè)光檢測(cè)器；—個(gè)安置在該光源和該光檢測(cè)器之間的樣本容器；一個(gè)電機(jī)；以及一個(gè)安置在該樣本容器周圍并包括一對(duì)附裝在該電機(jī)上用于繞一個(gè)共軸旋轉(zhuǎn)盤的光透射調(diào)制器，這對(duì)盤被安排成允許從該光源至一個(gè)第一旋轉(zhuǎn)位置上的樣本的光透射，被安排成允許從該樣本至一個(gè)第二旋轉(zhuǎn)位置上的光檢測(cè)器的光透射并阻擋第一和第二旋轉(zhuǎn)位置二者上的光源和檢測(cè)器之間的直射光透射。一個(gè)安置在該光源和檢測(cè)器之間的樣本容器周圍并包括一對(duì)被附裝的繞一個(gè)共軸旋轉(zhuǎn)盤的光透射調(diào)制器的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)為與現(xiàn)有系統(tǒng)相比，可減小該設(shè)備的外形尺寸和復(fù)雜性。光透射和檢測(cè)之間的相位關(guān)系由這對(duì)盤的相對(duì)旋轉(zhuǎn)位置確定，而不由單獨(dú)斬波器盤之間或上述先前技術(shù)中披露的光源和單個(gè)斬波器盤之間的更為復(fù)雜的同步確定。因此，該設(shè)備更適用于除受控實(shí)驗(yàn)室環(huán)境外的多種情況，且非專家操作員可以更容易環(huán)境該設(shè)備以便使用。不論該調(diào)制器的旋轉(zhuǎn)位置或速度如何，使用單個(gè)電機(jī)驅(qū)動(dòng)該調(diào)制器的兩個(gè)盤可以使該調(diào)制器保持同步。該電機(jī)也可以放在遠(yuǎn)離該光檢測(cè)器的位置上，這樣一來減少了任何噪聲對(duì)該檢測(cè)器的影響，不論是電氣的還是機(jī)械的。該光源和光檢測(cè)器優(yōu)選地為電子裝置，例如，該光源為發(fā)光二極管或激光器，以及該檢測(cè)器為光傳感器，如電荷耦合裝置或其他類型基于半導(dǎo)體的光傳感器。為啟動(dòng)保持在該樣本容器內(nèi)的樣本中的熒光，該光源優(yōu)選地能夠發(fā)射紫外線(UV)輻射，而該光檢測(cè)器通常能夠檢測(cè)該可視帶內(nèi)的熒光。該光透射調(diào)制器的這對(duì)盤可以被配置為從共用旋轉(zhuǎn)軸起與該樣本容器的任意一邊正交延伸的盤。每個(gè)盤可以包括一個(gè)在第一對(duì)角上方的光透射部分和一個(gè)在該盤的第二對(duì)角上方的擋光部分。這些盤的擋光部分優(yōu)選地互相重疊以阻擋光從該光源直接透射到任一旋轉(zhuǎn)位置上的檢測(cè)器。這些盤可具有固定的相對(duì)旋轉(zhuǎn)位置，盡管此位置通過改變這些盤中的一個(gè)或兩個(gè)盤相對(duì)于另一個(gè)盤的旋轉(zhuǎn)位置是可調(diào)的，例如，當(dāng)以選定的速度旋轉(zhuǎn)時(shí)，調(diào)節(jié)各盤的擋光部分和光透射部分的相對(duì)定時(shí)。在某些實(shí)施例中，這些盤可包括基本上呈半圓或半月形狀，這樣該光透射部分和擋光部分大致相等。在某些實(shí)施例中，這些擋光部分可能具有一個(gè)比該光透射部分更大的對(duì)角，這允許一個(gè)重疊，該重疊確定從該樣本切斷來自該光源的光透射的時(shí)間與能夠進(jìn)行該樣本至該檢測(cè)器的光的檢測(cè)的時(shí)間之間的時(shí)延。這也減少了從該光源到該檢測(cè)器的光的
泄露量。該光源可被配置為受控，這樣其操作與該光透射調(diào)制器的旋轉(zhuǎn)位置相同步，或者在測(cè)量序列過程中可以繼續(xù)被操作，在各熒光測(cè)量期期間只依賴該調(diào)制器來阻擋透射。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)第二方面，提供了 一種用于檢測(cè)樣本的時(shí)間分辨熒光的方法，該方法包括以下步驟:根據(jù)該第一方面的設(shè)備提供一個(gè)突光計(jì)；將該樣本安置在該樣本容器內(nèi)；操作該電機(jī)使該光透射調(diào)制器旋轉(zhuǎn)；當(dāng)該光透射調(diào)制器處于該第一旋轉(zhuǎn)位置上時(shí)，操作該光源以照亮該樣本；以及捕捉來自該光檢測(cè)器的指示該樣本的熒光的光信號(hào)數(shù)據(jù)。與本方面的第一方面一樣，第二方面的優(yōu)點(diǎn)為使用一種具有減小的尺寸和復(fù)雜性(相對(duì)于以上已知的設(shè)備)的設(shè)備進(jìn)行測(cè)量。該方法可包括停止該電機(jī)的運(yùn)行的步驟，其中，停止該電機(jī)的運(yùn)行后且當(dāng)該光透射調(diào)制器正在旋轉(zhuǎn)時(shí)進(jìn)行捕捉光信號(hào)數(shù)據(jù)的步驟。在捕捉來自該光檢測(cè)器的光信號(hào)數(shù)據(jù)前停止該電機(jī)的運(yùn)行的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是減小或消除該電機(jī)發(fā)出的電器噪聲和機(jī)械振動(dòng)。通常，關(guān)閉或斷開該電機(jī)后，該光調(diào)制器的旋轉(zhuǎn)速度降低至不再捕捉延遲熒光的程度前，可以非常充分地進(jìn)行一段時(shí)期測(cè)量。該方法可以包括從一個(gè)旋轉(zhuǎn)檢測(cè)器提供的信號(hào)檢測(cè)該光透射調(diào)制器的旋轉(zhuǎn)位置以及捕捉來自該旋轉(zhuǎn)檢測(cè)器的觸發(fā)信號(hào)，以便使該被捕捉的光信號(hào)數(shù)據(jù)與該光透射調(diào)制器的旋轉(zhuǎn)位置同步。檢測(cè)該調(diào)制器的旋轉(zhuǎn)位置的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以使該延遲熒光的測(cè)量與該調(diào)制器的一個(gè)已知的位置同步，使得來自該旋轉(zhuǎn)檢測(cè)器的觸發(fā)信號(hào)可用于確定來自該光源的透射被切斷的點(diǎn)。適當(dāng)?shù)氖?，通過從該被捕捉的光信號(hào)數(shù)據(jù)上提取多條衰變曲線并從該多條衰變曲線上導(dǎo)出一個(gè)平均輸出信號(hào)來確定該樣本中熒光的測(cè)量，根據(jù)一個(gè)相對(duì)應(yīng)的觸發(fā)信號(hào)的位置確定每條衰變曲線的起點(diǎn)。每次測(cè)量用的信噪比可能低。從一些在同一個(gè)樣本上進(jìn)行的連續(xù)測(cè)量導(dǎo)出一個(gè)平均輸出信號(hào)可以增加該測(cè)量的總體信噪比。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)第三方面，提供了一種時(shí)間分辨熒光系統(tǒng)，該時(shí)間分辨熒光系統(tǒng)包括:根據(jù)第一方面的設(shè)備提供一個(gè)熒光計(jì)；以及一個(gè)連接至該控制器、該光源和該光檢測(cè)器的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其中，該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)被配置成當(dāng)該光透射調(diào)制器在該第一旋轉(zhuǎn)位置上時(shí)操作該電機(jī)使該光透射調(diào)制器旋轉(zhuǎn)、操作該光源照亮該樣本、并捕捉來自該光檢測(cè)器的指示該樣本的熒光的光信號(hào)數(shù)據(jù)。根據(jù)第三方面的系統(tǒng)地總體優(yōu)點(diǎn)與第一和第二方面的優(yōu)點(diǎn)相同，這是因?yàn)榭梢允褂靡环N更小且不那么復(fù)雜的系統(tǒng)。該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)可以被配置成一旦該光透射調(diào)制器旋轉(zhuǎn)則停止該電機(jī)的運(yùn)行以及停止該電機(jī)的運(yùn)行后和當(dāng)該光透射調(diào)制器正在旋轉(zhuǎn)時(shí)捕捉來自該光檢測(cè)器的光信號(hào)數(shù)據(jù)。如以上提到的與本發(fā)明的第二方面相關(guān)的內(nèi)容，信號(hào)采集前停止該電機(jī)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是減小了會(huì)以其他方式對(duì)光信號(hào)測(cè)量造成不利影響的電噪聲和振動(dòng)。該系統(tǒng)包括一個(gè)旋轉(zhuǎn)檢測(cè)器，該旋轉(zhuǎn)檢測(cè)器連接至該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)并被配置成檢測(cè)該光透射調(diào)制器的旋轉(zhuǎn)位置，其中，該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)被配置成捕捉來自該旋轉(zhuǎn)檢測(cè)器的信號(hào)并使該被捕捉的光信號(hào)數(shù)據(jù)與來自該旋轉(zhuǎn)檢測(cè)器的信號(hào)同步。如以上提到的與本發(fā)明的第二方面相關(guān)的內(nèi)容，檢測(cè)該調(diào)制器的旋轉(zhuǎn)位置可以使該調(diào)制器的旋轉(zhuǎn)位置與從該光檢測(cè)器上捕捉的信號(hào)同步。因?yàn)樾盘?hào)采集和分析過程中可以解釋該調(diào)制器的旋轉(zhuǎn)速度的變化，所以當(dāng)停止該電機(jī)的運(yùn)行后該系統(tǒng)被配置成捕捉光信號(hào)數(shù)據(jù)時(shí)，這特別有利。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)第四方面，提供了一種用于向根據(jù)第三方面的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)發(fā)指令的計(jì)算機(jī)程序來執(zhí)行檢測(cè)安置在該設(shè)備的樣本容器中的樣本內(nèi)的時(shí)間分辨熒光的方法，該方法包括以下步驟:操作該電機(jī)使該光透射調(diào)制器旋轉(zhuǎn)；當(dāng)該光透射調(diào)制器處于該第一旋轉(zhuǎn)位置上時(shí)，操作該光源以照亮該樣本；捕捉來自該光檢測(cè)器的指示該樣本的熒光的光信號(hào)數(shù)據(jù)；以及采集來自一個(gè)光傳感器的觸發(fā)信號(hào)，該光傳感器被配置成檢測(cè)從該光源到該樣本的光透射，其中，停止該電機(jī)的運(yùn)行后且當(dāng)該光透射調(diào)制器正在旋轉(zhuǎn)時(shí)進(jìn)行操作該光源和捕捉光信號(hào)數(shù)據(jù)的步驟。該計(jì)算機(jī)程序優(yōu)選地被提供在一個(gè)計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)上，如適用于安裝在根據(jù)本發(fā)明的第三方面的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)上的存儲(chǔ)器或盤。適當(dāng)?shù)氖?，根?jù)本發(fā)明的第二方面的方法，該樣本包括大量指示一個(gè)試樣中存在的選定的生物分子的數(shù)量的熒光分子或部分。用于生物分子的定量檢測(cè)的競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定方法，例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)等免疫測(cè)定或其他捕捉測(cè)定在本領(lǐng)域(如Green和Thompson (1997)期刊，免疫方法205:35-41)是熟知的。該樣本可以按如下制備:(i)將一個(gè)試樣與一個(gè)捕捉分子相接觸,如一種抗體,其能夠?qū)ｉT粘合在所選定的生物分子上，在該捕捉分子和該選定的生物分子之間形成一種絡(luò)合物；(ii)在一次非競(jìng)爭(zhēng)性或競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定中，通過直接或間接將該絡(luò)合物、該捕捉分子或該選定的生物分子與一個(gè)探針相接觸來檢測(cè)該絡(luò)合物，該探針包括能夠參與熒光的一部分，如鑭系元素螯合物，其中，該探針的數(shù)量指示該試樣中存在的選定的生物分子的數(shù)量；以及(iii)將一個(gè)包括該探針的試驗(yàn)樣本暴露在熒光在其中發(fā)射的條件下。如免疫測(cè)定的測(cè)定可以是競(jìng)爭(zhēng)性的或非競(jìng)爭(zhēng)性的。在一個(gè)典型的競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定中，一個(gè)標(biāo)記生物分子就一個(gè)捕捉分子與該樣本中的生物分子競(jìng)爭(zhēng)，如專門粘合在該生物分子上的抗體。然后測(cè)量粘合在該捕捉分子上的標(biāo)記生物分子的數(shù)量。該樣本中的生物分子的濃度與檢測(cè)到的標(biāo)記生物分子的數(shù)量呈反比關(guān)系。在非競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定中，包括免疫測(cè)定，該樣本中的生物分子被粘合至一個(gè)捕捉分子，如抗體，然后一種標(biāo)記檢測(cè)試劑(通常是一種抗體)被粘合至該生物分子上。然后測(cè)量粘合在該捕捉分子上的標(biāo)記檢測(cè)試劑的數(shù)量。不像該競(jìng)爭(zhēng)性方法，該非競(jìng)爭(zhēng)方法的結(jié)果會(huì)與該生物分子的濃度成正比。典型地，該標(biāo)記檢測(cè)試劑粘合至一種不同的抗原確定區(qū)而不是該捕捉分子。在競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定中，該標(biāo)記生物分子被直接粘合至該捕捉分子上。在非競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定中，該標(biāo)記檢測(cè)試劑被直接粘合至該生物分子上。標(biāo)記生物分子或標(biāo)記檢測(cè)試劑可以是包括能夠參與熒光的一部分的探針。可替代地，在添加該探針前，這種標(biāo)記分子也可以被另一種試劑粘合。這種情況下，該生物分子或捕捉分子被該探針間接粘合。典型地，在任 --種類型測(cè)定中，該捕捉分子被吸附在或共軛在一種固體基質(zhì)上，
如磁珠。添加該試樣且該生物分子粘合至該捕捉抗體后，通常通過清洗而移除非粘合材料。因此，要進(jìn)行熒光檢測(cè)的試驗(yàn)樣本通常包括該探針和未通過清洗移除的粘合材料。合適的熒光分子或部分包括鑭系元素螯合物。合適的鑭系離子為鋱、銪、釤以及鏑。典型的螯合物包括一個(gè)共價(jià)連接至一種敏化劑的鑭系元素螯合劑，其捕捉光。US5, 639，615 (Selvin和Hearst ;加利福尼亞大學(xué)的試劑)描述了合適的螯合劑、敏化劑以及鑭系元素螯合物。也披露了將該螯合物耦合至各種化合物以產(chǎn)生探針的合適的方法。US4, 808, 541 (ffallac Oy)描述了熒光鑭系元素螯合物，其中該螯合基為二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或它的一種派生物。US2010/0036102 (ffallac Oy)描述了鑭系元素螯合物，其中一種發(fā)色部分(敏化劑)包括一個(gè)或多個(gè)三烷氧基苯基吡啶基基團(tuán)并且一種螯合部分可以包括羧酸基團(tuán)。一種優(yōu)選的鑭系元素螯合物可以按照Bailey等人(1984)分析家109方法的修改制作:1449-1450。Bailey描述了一種鑭系元素螯合物的合成，其中，DTPA為該螯合劑且4-氨基水楊酸(pAS)為該敏化劑。基本上，將干燥并且溶解在DMSO中的pAS逐滴滴入DTPAA (DTPA的二環(huán)酸酐)以及溶解在DMSO中的三乙胺，形成DTPA-pAS派生物。通過將該DTPA-pAS派生物與蛋白溶液(這種情況下人血清白蛋白)混合入一種溶液(這種情況下0.1M磷酸鹽緩沖液)來制備該螯合物的共軛物。Bailey通過透析從過量標(biāo)簽上描述了該共軛物的純化。然而，優(yōu)選的是避免該透析步驟而是過濾該產(chǎn)品，例如使用一個(gè)0.2微米過濾器。該后者程序提供了一種具有比Bailey所描述的探針更高的熒光穩(wěn)定性的探針。對(duì)該方法進(jìn)一步的變化時(shí)可能的。例如，該共軛物可以包含聚賴氨酸而不是一種蛋白質(zhì)。若使用蛋白質(zhì)，其可以是明膠。該溶液可以包含一種除磷酸鹽緩沖液以外的緩沖液。該共軛物可以被生物素化和例如通過一種抗生物素蛋白分子結(jié)合至一種生物素化的抗體而在一種間接檢測(cè)方法中使用。合適的熒光分子或部分如以上提到的鑭系元素螯合物在典型的緩沖液和測(cè)定條件中是典型地有熒光的。其他試劑需要經(jīng)受加強(qiáng)液以產(chǎn)生熒光，如在出自Perkin Elmer生命科學(xué)公司(Perkin Elmer Life Sciences)的時(shí)間分辨免疫熒光免疫測(cè)定法(DELFIA)系統(tǒng)中。在這種情況下，包括能夠參與熒光的一部分的探針通常為弱螯合銪離子。在適當(dāng)?shù)臈l件下，該銪離子離解并形成一種新的高熒光螯合物。適當(dāng)?shù)氖牵鶕?jù)本發(fā)明的第二方面的方法，從其中制備要進(jìn)行試驗(yàn)的樣本的試樣是一個(gè)病人樣本，如尿液、血液、血清、血漿、或腦脊液(CSF)樣本。病人樣本的類型可以取決于該病人的狀況和該臨床醫(yī)生需要通知臨床決策的信息?？梢栽谝粋€(gè)病人樣本中檢測(cè)到的合適的生物分子包括蛋白質(zhì)類或糖蛋白，特別是組織特異性蛋白質(zhì)類或糖蛋白。合適的示例為S-100蛋白質(zhì)類,如S-1OOb (上述Green和Thompson),由星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)；神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP),由星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)；神經(jīng)元特異性烯醇酶(Schaarschmidt等人(1994)中風(fēng)25 =558-565),由神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)；神經(jīng)纖維細(xì)絲NF重和NF輕，由神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)；以及泛素羧基末端酯酶Ll(UCHLl)，由神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)。合適的心臟蛋白質(zhì)類包括由心肌表達(dá)的TnI和TnT肌鈣蛋白、N端前腦鈉素(NTproBdNP)以及肌酸激酶同工酶蛋白(CKMB)。合適的腎蛋白質(zhì)類包括β 2微球蛋白。合適的肝或腸蛋白質(zhì)類包括癌胚抗原(CEA)。一種合適的肺(感染)蛋白為C反應(yīng)蛋白(CRP)，其指示急性炎癥。對(duì)于形成深靜脈血栓的病人，測(cè)定纖維蛋白D- 二聚體可能有用。生物流體(特別是血液和其派生物)中腦蛋白的存在是臨床關(guān)注的，因?yàn)槠渲甘玖四X蛋白釋放進(jìn)該CSF、血液和尿中。這可能是中風(fēng)、急性傷害或其他情況引起的腦外傷的結(jié)果。S-1OOb是在該中央神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的一種主要蛋白質(zhì)，并且它在CSF中的存在與急性神經(jīng)損傷(上述Green和Thompson)相關(guān)聯(lián)。上述Schaarschmidt等人回顧性地測(cè)定身患腦血管疾病的病人中的神經(jīng)元特異性烯醇酶。來自任一給定的病人上的數(shù)據(jù)點(diǎn)的軌跡可以顯示增加、減少或無變化以及“速度”或坡度的任何變化。這給出了關(guān)于個(gè)別病人的診斷和/或治療的有用信息，并可以與其他信息，如該病人的年齡、性別、體重等，結(jié)合使用。Timofeev和Hutchinson (2006 )損傷，國際護(hù)理受傷雜志37: 1125-1132 )指示了若該大腦由于腦水腫而腫脹起來時(shí)多么有必要進(jìn)行去骨瓣減壓術(shù)。Subramaniam和Hill (2009)神經(jīng)學(xué)專家15:178-184強(qiáng)調(diào)了需要更多與磁共振成像(MRI)和電腦斷層(CT)掃描相結(jié)合的信息以確定是否或何時(shí)應(yīng)用去骨瓣減壓術(shù)。當(dāng)該被麻醉的病人明顯不能報(bào)告四肢疼痛或麻痹時(shí)，外科手術(shù)過程中，生化分析可能也是重要的。本發(fā)明的一個(gè)第五方面提供了一種用于至少一個(gè)病人樣本的臨床評(píng)估的方法，該方法包括:(i)收集至少一個(gè)病人樣本，如尿液、血液、血清、血漿或腦脊液的一個(gè)樣本；(ii)將該至少一個(gè)病人樣本與一個(gè)捕捉分子相接觸,如一種抗體,其能夠明確地粘合在一個(gè)所選定的生物分子上，在該捕捉分子和該選定的生物分子之間形成一種絡(luò)合物；(iii)在一個(gè)非競(jìng)爭(zhēng)性或競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定中，通過直接或間接將該絡(luò)合物、該捕捉分子或該鎖定的生物分子與一個(gè)探針相接觸來檢測(cè)該絡(luò)合物，該探針包括能夠參與熒光的一部分，其中，該探針的數(shù)量指示該至少一個(gè)病人樣本中存在的選定的生物分子的數(shù)量；(iv)將包括至少一個(gè)包括該探針的試驗(yàn)樣本暴露在熒光在其中發(fā)射的條件下；(V)根據(jù)本發(fā)明的第二方面的方法檢測(cè)該至少一個(gè)試驗(yàn)樣本的時(shí)間分辨熒光；以及(vi)從該至少一個(gè)試驗(yàn)樣本中檢測(cè)到的時(shí)間分辨熒光上估計(jì)該至少一個(gè)病人樣本中存在的選定的生物分子的數(shù)量。形成并檢測(cè)一個(gè)生物分子和一個(gè)捕捉分子間的絡(luò)合物的方法如上所述。如以上所指出的，在典型地非競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定中，假定了該所測(cè)得的熒光與生物分子濃度之間的一種線性關(guān)系。例如，該測(cè)定(已從兩者上去掉了背景)中，若樣本A是樣本B的光密度的兩倍，則與B相比，A中的生物分子濃度是兩倍的。然而，優(yōu)選地是建立一條已知生物分子濃度的連續(xù)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過這樣做，在估計(jì)該樣本中的生物分子的數(shù)量中可以考慮該線性關(guān)系的任何變化。
適當(dāng)?shù)氖?，該方法包括每隔一定時(shí)間從一個(gè)病人上獲得多個(gè)病人樣本以及實(shí)時(shí)估計(jì)這些病人樣本中存在的一種或多種選定的生物分子的數(shù)量。合適的時(shí)間間隔可以為每24小時(shí)、每12小時(shí)、每6小時(shí)、每4小時(shí)、每2小時(shí)、每小時(shí)或每小時(shí)2、3、4或6次。該樣本收集和試驗(yàn)的頻率將取決于臨床需要。試驗(yàn)可進(jìn)行數(shù)小時(shí)、數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月。該方法也可以進(jìn)一步包括診斷或預(yù)測(cè)該病人或根據(jù)該病人樣本或多個(gè)樣本中的一種或多種選定的生物分子的存在、數(shù)量和/或該存在或數(shù)量隨時(shí)間的變化來修改該病人的治療。以下本發(fā)明的實(shí)施例的詳細(xì)描述中可發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的各種方面的其他可選和優(yōu)勢(shì)特征。通過舉例和參考附圖，以下進(jìn)一步詳細(xì)描述了本發(fā)明的多個(gè)方面和實(shí)施例，其中:

圖1a為根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的熒光計(jì)的示意透視圖；圖1b為根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的熒光計(jì)的一個(gè)替代性示意透視圖；圖2a為用于圖1a或圖1b中的熒光計(jì)的一個(gè)光透射調(diào)制器的一個(gè)示意平面圖；圖2b為用作用于圖1a或圖1b中的熒光計(jì)的一個(gè)光調(diào)制器用的盤的替代性形式的一個(gè)示意平面圖；圖3為根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的時(shí)間分辨突光系統(tǒng)的一個(gè)不意框圖；圖4為一個(gè)用于配置一種示波器功能的顯示器的一部分的一個(gè)屏幕快照；圖5為一系列帶有相對(duì)應(yīng)的觸發(fā)信號(hào)的輸出延遲突光信號(hào)軌跡；圖6為一個(gè)監(jiān)視一個(gè)觸發(fā)信號(hào)的計(jì)算機(jī)化示波器的一個(gè)示例性屏幕快照；圖7至圖11為一系列裳變曲線和相對(duì)應(yīng)的觸發(fā)點(diǎn)的不意圖；圖12至圖14為各種輸出信號(hào)軌跡的屏幕快照；圖15為一個(gè)原始和調(diào)節(jié)后的形式下的輸出信號(hào)的一個(gè)屏幕快照；圖16a和圖16b分別為根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的突光計(jì)的不意正視圖和不意側(cè)視圖；以及圖17為1gltl熒光對(duì)使用本發(fā)明的熒光計(jì)和該現(xiàn)有技術(shù)的熒光計(jì)獲得的探針濃度的一個(gè)繪圖。圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的熒光計(jì)100的主要組件的一個(gè)示意性圖示。該熒光計(jì)100包括一個(gè)光源101和一個(gè)放置在一個(gè)光透射調(diào)制器105的任意一側(cè)的光檢測(cè)器102。該光透射調(diào)制器105包括一對(duì)盤106、107，這對(duì)盤在安置在該光源101和檢測(cè)器102之間的樣本容器103的一側(cè)。這些盤106、107被安裝用于繞一個(gè)共軸108旋轉(zhuǎn)并被一個(gè)附裝在一個(gè)驅(qū)動(dòng)桿109的一端的電機(jī)104驅(qū)動(dòng)。該驅(qū)動(dòng)桿109的一個(gè)對(duì)端可旋轉(zhuǎn)地安裝在一個(gè)軸承110內(nèi)。該調(diào)制器105的旋轉(zhuǎn)引起從該光源101至該樣本容器103的光被交替地按從該樣本容器103至該檢測(cè)器102的光透射路徑順序透射和阻擋。圖1所展示的實(shí)施例中的盤106、107以半圓形盤的形式相對(duì)地安裝在該驅(qū)動(dòng)桿109上，以便當(dāng)該光源101發(fā)出的光透射到一個(gè)保持在該樣本容器103內(nèi)的樣本111上時(shí)，從該樣本111至該檢測(cè)器102的光透射路徑被該第二盤107阻擋住，并且當(dāng)從該樣本111至該檢測(cè)器102的光透射路徑敞開的時(shí)候，從該光源101至該樣本111的光透射路徑被該第一盤阻擋住。優(yōu)選地，該第一和第二盤105、106部分地重疊,這樣該光源101和該光檢測(cè)器102之間的直接透射路徑一直被一個(gè)或兩個(gè)盤106、107阻擋著。這些盤之間的重疊度確定了該光源101和樣本111之間的光透射路徑112被阻擋的時(shí)間與該樣本111和該檢測(cè)器102之間的光透射路徑113被打開的時(shí)間之間的時(shí)延。該調(diào)制器105的旋轉(zhuǎn)速度進(jìn)一步確定了此時(shí)延。當(dāng)旋轉(zhuǎn)速度增加時(shí)，此時(shí)延被縮短。若這些盤106、107的前面的和后面的徑向邊位于一條從該軸延伸出來的徑向線上，這些透射路徑112、113相對(duì)于該軸108的徑向位置對(duì)該時(shí)延沒有影響。圖1b示出了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的熒光劑100的一個(gè)替代性的表示，其中，相對(duì)應(yīng)的參考號(hào)指示以上所述用于圖1a的相同組件。如同圖la，該表示是不按比例的。在示例性實(shí)施例中，每個(gè)盤106、107的外徑可以通常為130mm左右，而各盤的內(nèi)半圓部分116、117可以只小幾毫米，例如直徑為122mm左右。這種小差距足夠容許該光源101和檢測(cè)器102之間的光透射的所要求的順序。當(dāng)這些盤106、107高速旋轉(zhuǎn)時(shí)，維持這些盤106、107的內(nèi)部和外部的直徑之間的小差距減小了沿該桿109的任何不平衡。通過有區(qū)別地加重這些盤106、107的內(nèi)部部分和外部部分可以進(jìn)一步平衡這些盤106、107，以便保證這些盤在最小不平衡下旋轉(zhuǎn)。例如，各盤的內(nèi)部部分可以包括一個(gè)加重的部分，導(dǎo)致該內(nèi)部部分具有與該外部部分相同的旋轉(zhuǎn)慣性。這些盤106、107也優(yōu)選地沿該驅(qū)動(dòng)桿109挨著以進(jìn)一步將振動(dòng)減到最小。在一個(gè)示例性實(shí)施例中，這些盤106、107沿該驅(qū)動(dòng)桿被隔開大約15mm。圖2a示出了圖1中的光透射調(diào)制器105的一個(gè)平面圖，其中，該第一和第二盤106、107之間提供了一個(gè)重疊201以便在阻擋從該光源101至該樣本111的透射路徑112與打開從該樣本111至該檢測(cè)器102之間的透射路徑113之間提供時(shí)延。這可以通過使該第一或第二盤以一種弧對(duì)角大于180度而非半圓的實(shí)弧的形式實(shí)現(xiàn)。圖2b示出了一種示例性盤206，該盤用于圖1a和圖1b中所示的熒光計(jì)100的盤106、107中的一個(gè)或兩個(gè)的地方。用來阻擋至該樣本111或來自該樣本的光的外徑部分201比該內(nèi)徑部分202只大幾個(gè)百分比，由此減小了由不平衡引起的任何振動(dòng)。作為一種替代方案，可在該盤206 (被配置成使光傳到該樣本或從樣本傳出)內(nèi)提供一條弧形縫203，由此可以平衡該盤206而不使用砝碼。該盤206可以被設(shè)計(jì)為使得被移除以形成該縫203的材料可以緊密地或準(zhǔn)確地被形成該盤206的外部部分201的補(bǔ)充材料平衡。一個(gè)示例性測(cè)量周期總共可以取20ms，這段時(shí)間這些盤106、107將旋轉(zhuǎn)360度，或一個(gè)全周期。在第一半周期IOms期間，該光源101發(fā)出的紫外光被透射至該樣本容器103內(nèi)的樣本111上，并且從該樣本111至該檢測(cè)器的透射被第二盤106阻擋住。該紫外光激勵(lì)該樣本以及該樣本111內(nèi)的任何熒光探針。在第二半周期IOms內(nèi)，該第一盤106阻擋該光源發(fā)出的光并且第二盤107使得該樣本111射出的熒光被該檢測(cè)器102檢測(cè)。為完成一次20ms的測(cè)量周期，該電機(jī)104使這些盤106、107每秒旋轉(zhuǎn)3000rpm或50次周期。該電機(jī)104優(yōu)選地被配置成每秒最大至少10，OOOrpm或167次周期的速度運(yùn)行，在該速度下，會(huì)完成一次6ms的測(cè)量周期。為了進(jìn)一步縮短測(cè)量周期，更高的速度是可能的?？商娲鼗蛄硗獾?，這些調(diào)制器盤106、107可以各自包括兩個(gè)或更多被光透射部分分開的實(shí)弧部分，這些實(shí)弧部分會(huì)允許每次旋轉(zhuǎn)不止一個(gè)測(cè)量周期。使用兩個(gè)或更多弧部分具有另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，即允許這些盤被內(nèi)在地機(jī)械地平衡，由此減小了一個(gè)測(cè)量周期過程中的振動(dòng)。在一個(gè)示例性實(shí)施例中，可以以一個(gè)具有310nm波長、其透鏡被配置成提供準(zhǔn)直光束的紫外發(fā)光二極管(UV LED)的形式提供該光源,如從維也納Roithner-Lasertechnik(www.Roithner-Laser.com)上可以買得到的一種UVT0P310-BL-T039LED。檢測(cè)器可以是對(duì)300nm-700nm范圍內(nèi)的波長敏感的光電倍增光檢測(cè)器的形式，如從Hamamatsu Photonics(www.hamamatsu.com)上可以買得到的H6780-1。二次光傳感器或觸發(fā)器可以是帶有如該S9269的前置放大器的娃光電二極管，也可以從Hamamatsu Photonics買得到。Dremel鉆，型號(hào)300 (www.dremel.com)可以提供一臺(tái)能夠在2000rpm-3000rpm范圍內(nèi)的所要求的速度下運(yùn)行的合適的電機(jī)。該熒光計(jì)100也可以結(jié)合另外一個(gè)放置在靠近該樣本容器103處的光傳感器114，以作為旋轉(zhuǎn)檢測(cè)器發(fā)揮作用。該光傳感器114優(yōu)選地被放置以同時(shí)接收該光源101和該樣本111發(fā)出的光，例如，被放置在一條在該軸108和該樣本111之間延伸的徑向線。因此，來自該光傳感器114的輸出信號(hào)可以被用于提供一個(gè)用于來自該檢測(cè)器102的捕捉數(shù)據(jù)的觸發(fā)信號(hào)。檢測(cè)該調(diào)制器105的旋轉(zhuǎn)的替代性方式也可以是可能的，例如，使用，例如，一種附裝在該軸109或并入該電機(jī)104的光編碼器檢測(cè)該電機(jī)104或驅(qū)動(dòng)桿109的旋轉(zhuǎn)位置。圖3示出了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的時(shí)間分辨熒光系統(tǒng)300的一個(gè)示意框圖。該系統(tǒng)300包括一個(gè)上述的熒光計(jì)100和一個(gè)連接至該熒光計(jì)100上的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)301。該系統(tǒng)300還可以包括一個(gè)監(jiān)視器302，該監(jiān)視器連接至該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)301上用于顯示結(jié)果并控制該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)301的運(yùn)行。該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)301通過連接件303連接至該熒光計(jì)上以允許該電機(jī)、光源以及該熒光計(jì)100內(nèi)的光檢測(cè)器和旋轉(zhuǎn)檢測(cè)器的控制和運(yùn)行，和/或從其接收信號(hào)數(shù)據(jù)。該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)301被配置成捕捉來自該旋轉(zhuǎn)檢測(cè)器的信號(hào)，例如，以上述光傳感器114的形式，以及使從該旋轉(zhuǎn)檢測(cè)器上接收到的信號(hào)與來自該旋轉(zhuǎn)檢測(cè)器102的被捕捉到的光信號(hào)數(shù)據(jù)同步。該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)301可以以一種示波器的形式被配置，其中，從該光檢測(cè)器102和該光傳感器114上接收到的信號(hào)被用作該示波器的信道輸入。雖然其他基于軟件或硬件的示波器將能夠執(zhí)行所要求的功能，但示例性示波器為帶有從WWW.USB-1nstruments.com上可以買得到的EasyScope軟件的DSC2200C。圖4展示了用于配置本示波器功能的顯示器的一部分。使用兩個(gè)光檢測(cè)器，一個(gè)信號(hào)用作觸發(fā)器以及另一個(gè)用于檢測(cè)與該樣本111中的探針的熒光相對(duì)應(yīng)的延遲衰變光子。該觸發(fā)信號(hào)測(cè)量來自該光傳感器114的輸出以測(cè)量激活該樣本111的光子，下一示例中的觸發(fā)信號(hào)被假定是信道A。因此，該觸發(fā)器下拉框401被設(shè)為信道A。該測(cè)量該延遲熒光的光電倍增器(光檢測(cè)器)發(fā)出的輸出信號(hào)被設(shè)為信道B。該時(shí)基402確定該掃描的長度。該掃描長度應(yīng)足夠長以捕捉該調(diào)制器的若干次旋轉(zhuǎn)。實(shí)際上，已發(fā)現(xiàn)100msec的掃描對(duì)于典型使用是足夠的。樣本403的選定的數(shù)量為一個(gè)給定的運(yùn)行將被采樣的次數(shù)。由于該調(diào)制器在一次掃描(該電機(jī)被關(guān)閉或與該調(diào)制器斷開后)過程中會(huì)減速，當(dāng)該調(diào)制器仍在以一種可接受的速度轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，這是對(duì)挑選最好數(shù)據(jù)范圍的一種妥協(xié)。一些樣本被設(shè)為4或時(shí)基為100情況下，這導(dǎo)致大約4*100=400msec的總掃描時(shí)間。若使用該保存原始數(shù)據(jù)選擇框404，信道A和B發(fā)出的信號(hào)數(shù)據(jù)將會(huì)和該時(shí)基402和樣本403的數(shù)量一起被保存。這考慮了該最初數(shù)據(jù)被保存后的該數(shù)據(jù)的離線分析。無需保存該觸發(fā)信號(hào)和觸發(fā)電平，因?yàn)樵诓杉^程中會(huì)使用這些并會(huì)確定該數(shù)據(jù)被如何捕捉到的。一旦該被保存的數(shù)據(jù)通過了該采集階段，可在該同一最初采集的數(shù)據(jù)上進(jìn)行一種不同的分析。選中該測(cè)量LED角框405引起該系統(tǒng)計(jì)算該樣本(即該樣本被該光源照亮的時(shí)間)的激活結(jié)束與延遲熒光的檢測(cè)開始之間的角，這與照明的結(jié)束與檢測(cè)的開始之間的時(shí)延相對(duì)應(yīng)。圖5中示出了該光檢測(cè)器102與來自該光傳感器114 (圖1)的信號(hào)輸出的一個(gè)示例性結(jié)果繪圖。該繪圖示出了該觸發(fā)信號(hào)501和該延遲熒光信號(hào)502。從圖5中箭頭503指示的觸發(fā)信號(hào)501開始的下降沿指示了該樣本的照亮的結(jié)束。用于該掃描的總時(shí)間為IOOms(按圖4所示的時(shí)基402環(huán)境)，這期間，該調(diào)制器已進(jìn)行了 6次全旋轉(zhuǎn)，并且已檢測(cè)到7個(gè)觸發(fā)信號(hào)。為提取各觸發(fā)點(diǎn)，貫穿整個(gè)觸發(fā)信號(hào)501的最大負(fù)坡度的點(diǎn)被確定。此最大坡度的具有在預(yù)定分?jǐn)?shù)例如60%以內(nèi)的坡度的任何一點(diǎn)被作為一個(gè)觸發(fā)點(diǎn)而接受，以便將由噪聲和該調(diào)制器的減速引起的振動(dòng)考慮在內(nèi)。通過從該被捕捉的光信號(hào)數(shù)據(jù)502上提取多條衰減曲線并從這些衰變曲線上導(dǎo)出一個(gè)平均輸出信號(hào)來確定該樣本中熒光的測(cè)量，根據(jù)一個(gè)相對(duì)應(yīng)的觸發(fā)信號(hào)的位置確定每條衰變曲線的起點(diǎn)。如下詳細(xì)所述，也可以在該被采集的信號(hào)數(shù)據(jù)上進(jìn)行其他可選步驟。這些信號(hào)501、502的噪聲等級(jí)將確定一個(gè)可接受的掃描的極限，這樣這些會(huì)影響離線計(jì)算的結(jié)果。類似地，從該光源泄露至該檢測(cè)器的任何光將會(huì)影響這些結(jié)果。若有漏光，這將會(huì)強(qiáng)烈影響該噪聲并確定掃描是否被接受或拒絕?？梢蕴砑友舆t406 (圖4)來移動(dòng)與該計(jì)算的觸發(fā)點(diǎn)相比的起點(diǎn)，該延遲可以用于消除來自該光檢測(cè)器的信號(hào)的任何快速衰變的部分，其也可以強(qiáng)烈影響該噪聲。例如，當(dāng)分析從一個(gè)單獨(dú)的機(jī)器上發(fā)出的數(shù)據(jù)時(shí)，可以使用上述延遲，其中，可以調(diào)節(jié)這些參數(shù)以在給定可用數(shù)據(jù)的情況下獲得最好的結(jié)果。通常，然而，任何延遲將會(huì)是正在被使用的系統(tǒng)的機(jī)械參數(shù)給出的一個(gè)固定值，并被優(yōu)化用于該特殊環(huán)境。因此，在一般方面中，各觸發(fā)信號(hào)可以加上一個(gè)預(yù)定的延遲以確定每條衰變曲線的起點(diǎn)。圖6示出了該軟件示波器上的一個(gè)示例性屏幕快照，其中，指示了觸發(fā)信號(hào)601?？梢酝ㄟ^在該觸發(fā)信號(hào)的高電平和低電平之間選定一個(gè)值來選定一個(gè)觸發(fā)點(diǎn)，在該點(diǎn)處將會(huì)檢測(cè)到最大坡度。例如，該值可以是該高電平和低電平的平均值。示例性熒光計(jì)100 (圖1)將具有兩個(gè)光檢測(cè)器:一個(gè)用于檢測(cè)該樣本發(fā)出的延遲光子的一個(gè)第一檢測(cè)器102和一個(gè)用于檢測(cè)用于計(jì)時(shí)目的觸發(fā)器的第二檢測(cè)器114。不假定使該調(diào)制器轉(zhuǎn)動(dòng)的電機(jī)104的速度是不變的，但假定該調(diào)制器的兩個(gè)盤106、107之間的幾何關(guān)系是不變的。當(dāng)該調(diào)制器105旋轉(zhuǎn)從而阻擋和允許至該樣本111和從該樣本111出來的光子通道時(shí)，這可以表達(dá)為這兩個(gè)盤之間的一個(gè)角。此角被稱為光角，可以通過使用來自這兩個(gè)檢測(cè)器的輸出信號(hào)來測(cè)量。由于該檢測(cè)器與該光源在一條直視線上，所以來自該觸發(fā)檢測(cè)器的信號(hào)可以一直被假定具有一個(gè)強(qiáng)信號(hào)。因此，該觸發(fā)信號(hào)可以作為用于計(jì)時(shí)該光角的基礎(chǔ)使用。然后可以為一個(gè)具有強(qiáng)烈二次發(fā)射的樣本測(cè)量該光角。圖7中的繪圖示出了從該第二檢測(cè)器114的輸出上提取的觸發(fā)信號(hào)701、704，和來自該第一檢測(cè)器102的輸出信號(hào)702。為了確定光角,各觸發(fā)信號(hào)和該輸出信號(hào)之間的角度偏移可以通過測(cè)量各觸發(fā)信號(hào)和下一輸出信號(hào)702之間的距離703并比較此距離與到下一觸發(fā)信號(hào)704的距離來確定。由于該旋轉(zhuǎn)速度沒有必要是不變的，所以當(dāng)對(duì)多個(gè)信號(hào)求平均時(shí)，這使得該信號(hào)702可以被相應(yīng)地調(diào)節(jié)。這保持了一種確定該光角的有效方法，其條件是，這些檢測(cè)器和該調(diào)制器的相對(duì)位置在整個(gè)測(cè)量周期內(nèi)不改變。
雖然該觸發(fā)信號(hào)通常為一種與該熒光信號(hào)相比強(qiáng)烈得多的信號(hào)，它也能受到噪聲影響。圖8中展示的，首先考慮噪聲不是問題的一般情況，可以容易地為各對(duì)觸發(fā)信號(hào)801a-801e和后續(xù)熒光信號(hào)802a_802e測(cè)量該光角。然而，最后一個(gè)熒光信號(hào)802e不完整且因此可能不適合使用。在該周期長度將逐周期地大致保持不變的事實(shí)基礎(chǔ)上，可以決定是否可以通過比較剩余的數(shù)據(jù)的長度與前一個(gè)周期長度(即觸發(fā)信號(hào)801d和SOle之間的長度)來使用該信號(hào)802e。若數(shù)據(jù)的數(shù)量在預(yù)定的分?jǐn)?shù)內(nèi)，例如80%，則可以使用該信號(hào)802e。在這種情況下，該最終信號(hào)802e可能被拒絕?？赡苈┦б粋€(gè)或多個(gè)觸發(fā)信號(hào)。圖9展示了漏失一個(gè)觸發(fā)信號(hào)901c的情況。這導(dǎo)致需要消除兩個(gè)信號(hào)902b、902c，因?yàn)椴荒転樗鼈儨y(cè)量一個(gè)周期長度。為確定這是不是該情況，后續(xù)觸發(fā)信號(hào)901b、901d之間的明顯的周期長度將會(huì)是信號(hào)901a、901b之間的前一個(gè)周期長度的兩倍。因此，可以環(huán)境一個(gè)規(guī)則:從這些計(jì)算上消除任何比之前的一個(gè)周期大一個(gè)環(huán)境余量的周期。合適的余量為50%，即若一個(gè)周期大于前一個(gè)周期的150%，則它被拒絕。在與以上所展示的相反的情況下，可以檢測(cè)到一個(gè)虛假觸發(fā)信號(hào)而不是漏失一個(gè)觸發(fā)信號(hào)。圖10中展示了這種情況，其中，在觸發(fā)信號(hào)1001b、1001c之間檢測(cè)到一個(gè)虛假信號(hào)1001’ C。本虛假信號(hào)1001’ C會(huì)導(dǎo)致一個(gè)被縮短的周期和一個(gè)錯(cuò)誤的偏移，引起錯(cuò)誤的求和和求平均值。這也可以作為異常周期長度被檢測(cè)到。例如，若該周期長度小于前一周期的周期長度一個(gè)環(huán)境余量，例如小于之前的周期的67%，則該變化太大而無效。如上個(gè)示例中，沒有可靠的方式了解哪個(gè)是該虛假觸發(fā)信號(hào)，所以兩個(gè)都會(huì)被消除掉。然后該過程可以根據(jù)一個(gè)漏失的觸發(fā)器的前一示例繼續(xù)進(jìn)行并以同一種方式處理，拒絕該虛假觸發(fā)信號(hào)任意一側(cè)的信號(hào)。在某些情況下，可以檢測(cè)到并消除虛假觸發(fā)信號(hào)而無需消除任何有效觸發(fā)信號(hào)。圖11中示出了這種情況的一個(gè)示例，其中，在真實(shí)觸發(fā)信號(hào)IlOlbUlOlc之間檢測(cè)到虛假觸發(fā)信號(hào)1101’ C。在這種情況下，該前述的觸發(fā)信號(hào)IlOlb的后續(xù)的觸發(fā)信號(hào)IlOlc之間的兩個(gè)距離都太小而無效。因此，已清楚哪個(gè)信號(hào)是虛假的，并且可以消除該虛假觸發(fā)信號(hào)1101’ C而不影響剩余的信號(hào)。為了提高該測(cè)量的信噪比，一旦確定了這些觸發(fā)信號(hào)和周期長度，一起對(duì)不同樣本的掃描求平均。如圖4中噪聲等級(jí)輸入407指示的，噪聲參數(shù)可用于確定一個(gè)給定的樣本是否被接受或拒絕。每個(gè)信號(hào)被標(biāo)準(zhǔn)化以便它的絕對(duì)值沒有意義且該偏差被比作為該環(huán)境噪聲等級(jí)。每個(gè)樣本的噪聲等級(jí)被比作該預(yù)定義的噪聲等級(jí)。任何不滿足該噪聲等級(jí)的樣本都被拒絕，并且剩余的樣本被求平均以獲得一個(gè)最終平均后的樣本。一旦計(jì)算了一個(gè)初始平均值，可以檢查所有的附加樣本，以查看它們是否被接受或拒絕。除了該平均值以外，還可以存儲(chǔ)和展示兩條其他曲線:該預(yù)定義的可接受的極限內(nèi)的噪聲最大的曲線，以及該可接受的極限外的最大噪聲曲線。圖12中展示了一個(gè)示出這種結(jié)果的繪圖的一個(gè)示例。該繪圖的標(biāo)題1201指示了 15個(gè)樣本中有7個(gè)滿足該噪聲標(biāo)準(zhǔn)。這7個(gè)信號(hào)的平均值1202與該最大噪聲可接受信號(hào)1203和該最大噪聲不可接受信號(hào)1204一起被繪制出來。圖13中示出了圖12的繪圖的一個(gè)經(jīng)放大后的部分，其中，更詳細(xì)地示出了該峰值區(qū)。該峰值區(qū)內(nèi)的噪聲通常比各曲線的尾區(qū)內(nèi)的噪聲更顯著。為補(bǔ)償這一點(diǎn)，每條曲線的第一 20%內(nèi)的噪聲具有雙權(quán)重。30%以上的噪聲具有單權(quán)重。20%和30%之間，該噪聲因數(shù)在2.0和1.0之間進(jìn)行調(diào)整。因此，在一般方面中，在每個(gè)測(cè)量周期期間，噪聲等級(jí)根據(jù)來自光檢測(cè)器的信號(hào)的部分加權(quán)?？梢酝ㄟ^改變?cè)撛肼暤燃?jí)輸入環(huán)境407 (圖4)來調(diào)節(jié)該噪聲等級(jí)。該噪聲等級(jí)優(yōu)選地以與一條平均曲線的RMS偏差為基礎(chǔ)，這樣，若它們超過預(yù)設(shè)噪聲等級(jí)，可以排除任何異常值軌跡。通過測(cè)量一個(gè)為一條曲線(在沒有樣本的情況下測(cè)量該曲線)以上的預(yù)定量的等級(jí)可以從濃度曲線上實(shí)驗(yàn)地確定一個(gè)合適的噪聲等級(jí)。如圖13中所示，鑒于該數(shù)據(jù)每100微妙被取樣，用于該拒絕的信號(hào)1204的觸發(fā)值被該X方向(時(shí)間)上的一個(gè)取樣單元抵消。與其他信號(hào)相比，此移動(dòng)引起該峰位巨大偏差，這很可能是該樣本曲線1024被拒絕的原因。其他樣本數(shù)據(jù)曲線1202、1203也示出了一些顯著的偏差，但該峰值在正確位置上。為保證來自該系統(tǒng)的數(shù)據(jù)輸出是正確的和有意義的，可以實(shí)施進(jìn)一步的質(zhì)量控制操作。這可以以測(cè)量被使用的熒光探針的半衰期為基礎(chǔ)。這應(yīng)該是一個(gè)固定數(shù)，并且因此可以被校準(zhǔn)。給定用于一個(gè)已知的樣本濃度的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線，這也可以使信號(hào)輸出曲線被轉(zhuǎn)換成實(shí)際濃度。為了獲得可接受的統(tǒng)計(jì)精度，該衰變曲線下面的面積優(yōu)選地用于獲得一個(gè)濃度。然而，這假定了一條具有指數(shù)形狀的衰變曲線。一個(gè)第一必須因此要進(jìn)行的校正為去除該輸出信號(hào)內(nèi)的任何DC偏移。這在圖14中展示了，其中，DC偏移1401在該原始數(shù)據(jù)信號(hào)中是清楚的。為得到該偏移的估算，按從一些半衰期(通常為4個(gè))到該曲線端，計(jì)算該曲線的平均值。在4個(gè)半衰期，信號(hào)將被減小至其初始值的1/16 (或6.25%)。由此，可以從該整個(gè)樣本數(shù)據(jù)上去除計(jì)算的DC偏移。有至少兩種方式，可以通過這兩種方式計(jì)算該指數(shù)的值。一種第一方法假定了它符合該指定的半衰期給出的指數(shù)衰變。該曲線被分為兩段:0到I個(gè)半衰期，和I個(gè)半衰期至4個(gè)半衰期。按定義，通過I個(gè)半衰期，該曲線下面的面積應(yīng)該為該總面積的一半，另一半在該剩余的尾部分中。實(shí)際上，該半衰期可以不落在該曲線上的樣本點(diǎn)中其中一個(gè)點(diǎn)上，并且只對(duì)4個(gè)半衰期而不對(duì)該曲線的端進(jìn)行整合。這導(dǎo)致一個(gè)被計(jì)算用于校正這些影響的比值。在理想的情況下，該曲線兩半的比值會(huì)等于1，但實(shí)際上，多少不同于I。若我們?nèi)∵@兩個(gè)面積的比值并將其與該計(jì)算的比值比較，任何差值應(yīng)反映一個(gè)附加偏移?？杉由洗似疲@樣我們得到該指定的半衰期的真實(shí)指數(shù)衰變。該結(jié)果的半對(duì)數(shù)繪圖應(yīng)揭示一條直線。圖15中以舉例說明的方式示出了這種情況，其中，該原始信號(hào)數(shù)據(jù)1501已被處理以導(dǎo)致一個(gè)顯示一條比較直的線的輸出數(shù)據(jù)1502環(huán)境。該被處理的曲線1502可以等于與使用一個(gè)校準(zhǔn)比值的濃度?！N第二方法減少使用一個(gè)假定的指數(shù)衰變，而是假定從該尾獲得的偏移的初始值是正確的。然后在沒有進(jìn)一步校正的情況下計(jì)算該曲線1501下面的面積。如圖17中的一樣，用于探針的給定的濃度的圖15中所示的曲線下面的面積(這種情況下，該值為8.2)可以呈現(xiàn)為一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。優(yōu)選的是使用該曲線下面的面積而不使用一個(gè)點(diǎn)值(如峰熒光)，因?yàn)榍罢呖赡芨煽??？梢詮脑摌?biāo)準(zhǔn)曲線上通過插值法導(dǎo)出該樣本中的探針的濃度。若有任何生化如由該樣本的降解引起的“位阻”，該所測(cè)得的該探針的半衰期可能與所預(yù)期的半衰期不同，因此所測(cè)得的半衰期和所預(yù)期的半衰期的比較可能是有用的?？赡馨l(fā)給該操作員一條消息以提供一個(gè)“新鮮”樣本。其他可能性在于該病人被發(fā)了一些會(huì)部分地“粘合”至該熒光絡(luò)合物上并因而改變?cè)摪胨テ诘乃幬?。如一個(gè)“篩子”看是否有任何“粘和物”一樣比較這兩個(gè)值(原始對(duì)指數(shù))。這兩個(gè)值應(yīng)在其他值的20%以內(nèi)。若不是，則可能有幾個(gè)該半衰期的迭代以發(fā)現(xiàn)該“改變了的”半衰期并且然后報(bào)告這個(gè)新值(帶有警告)。若沒有“發(fā)現(xiàn)”(根據(jù)該20%協(xié)議規(guī)則)該半衰期，則發(fā)給該操作員一條消息，報(bào)告此特殊值被信任。再次需要一個(gè)“新鮮”樣本?？梢越Y(jié)合或作為用于執(zhí)行圖16中所示的免疫測(cè)定的機(jī)器的一部分提供一個(gè)熒光計(jì)。磁探針1601可以向上或向下移動(dòng)并且可以在一個(gè)水平構(gòu)件1602上橫向前進(jìn)穿過在含有該熒光探針1603的井中結(jié)束的各種試劑井構(gòu)成的一個(gè)線性陣列。最后，它被定位在用于熒光檢測(cè)的熒光計(jì)1604處。為節(jié)省空間，這些試劑井可以作為一個(gè)圓形陣列被提供。由于人眼能夠看到延遲熒光，此處所述的熒光計(jì)(帶有或不帶有光檢測(cè)器)也可以用作一個(gè)熒光顯微鏡的一部分。同樣地，該熒光計(jì)可以結(jié)合入一個(gè)凝膠掃描儀中，其中，凝膠在該光源和光檢測(cè)器或顯微鏡之間的透射路徑上平移，或使用一個(gè)圖像增強(qiáng)器分析更大的面積或使用一個(gè)攝像機(jī)分析整個(gè)凝膠。示例1:一種穩(wěn)定的熒光螯合物的制備I)在100 μ L DMSO (其已用分子篩干燥)中溶解2mg pAS。2)在100 μ L經(jīng)干燥后的DMSO中溶解4mg DTPAA。3)向步驟2中的產(chǎn)品中加入IOOuL經(jīng)干燥后的Et3N。4)向步驟3的DTPAA制劑中逐滴地添加步驟I中制備的pAS并在20° C下混合30mino5)在IOOyL pH7.0的二甲胂酸鹽緩沖液中溶解4mg多聚賴氨酸6)向步驟4的產(chǎn)品中添加步驟5的產(chǎn)品并在4° C下混合2hr。7)在100 μ L20mM pH8.5的硼酸鹽緩沖液中溶解4mg TbCl。8)向步驟6的產(chǎn)品中添加步驟7的產(chǎn)品并在4° C下混合lhr。9) NHS生物素在100 μ L DMSO中添加至步驟8的產(chǎn)品并在4° C下混合lhr。10)使步驟9的產(chǎn)品經(jīng)過一個(gè)0.2 μ m過濾器。該穩(wěn)定的突光螯合物的激勵(lì)峰值為約310nm(UV)。雖然有在550nm和600nm兩個(gè)更大的峰值，但該發(fā)射在綠色中主要在500nm。適當(dāng)?shù)氖?，PMT可以收集從300nm至700nm的所有波長。由于該熒光長時(shí)期是穩(wěn)定的，所以可能需要更少的質(zhì)量控制試驗(yàn)，并且?guī)в斜绕渌结樃偷念l率。這便于在醫(yī)院環(huán)境中使用。示例2:執(zhí)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)按如下方式使用圖16中所示的機(jī)器執(zhí)行用于任何具體的腦特異性蛋白的典型的ELISA。有一瓶帶有共價(jià)地附著的“捕捉”抗體的磁珠(間歇性搖動(dòng))，并且吸入IyL并且然后轉(zhuǎn)移(用兩個(gè)伺服電機(jī))至該第一反應(yīng)瓶中。該操作員(使用一個(gè)一次性吸管)添加5 μ L血清樣本。該磁針移動(dòng)至該第一小瓶的上方并上/下移動(dòng)超過5min以混合該血清加珠子。然后通過蠕動(dòng)泵添加100 μ L磷酸鹽緩沖液，且上/下混合后，通過另一個(gè)蠕動(dòng)“排水”泵將洗液從該底部消除。兩次重復(fù)緩沖液洗滌后，該磁探針移動(dòng)至該第二小瓶。這添加了 IuL第二 “檢測(cè)子”抗體并被上/下混合5min，就像與先前的“捕捉”抗體孵育。然后這像前一個(gè)小瓶一樣也具有三次緩沖液洗滌。然后該磁探針移動(dòng)至該第三具有I μ L第三生物素化的抗體(或者后者可以后續(xù)地被添加至同一個(gè)小瓶內(nèi))的小瓶。這具有與該第一兩個(gè)抗體相同的孵育和洗滌。然后該磁探針移動(dòng)至該第四小瓶，其中，10 μ L戊二醛被添加以交聯(lián)所有3個(gè)抗體。這被上/下混合Imin并且然后用IOyL三羥甲基氨基甲烷(TRIS)緩沖液洗滌3次以中和任何殘留的戊二醛，接著用緩沖液再洗滌3次。然后該磁探針移動(dòng)至該第五小瓶，在該小瓶中已添加了 IuL抗生物素蛋白，接著像前3個(gè)抗體一樣混合/洗滌。然后該磁探針移動(dòng)至該第六小瓶，在該小瓶中，I μ L螯合聯(lián)至生物素化多聚賴氨酸的熒光按之前的抗體步驟再一次被混合/洗滌。最后，該探針移動(dòng)至該斬波器中的光析槽內(nèi)，在該斬波器中，該轉(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)20秒且該膝上計(jì)算機(jī)控制的顯微鏡在20秒內(nèi)讀取讀數(shù)并以圖形形式在該膝上計(jì)算機(jī)的屏幕上指示該結(jié)果。該第二和后續(xù)的測(cè)定后，在同一個(gè)圖形上顯示所有進(jìn)一步的點(diǎn)以示出該給定的蛋白質(zhì)的水平的任何順序變化。示例3:熒光計(jì)的敏感性示例I中制備的穩(wěn)定的熒光螯合物被連續(xù)稀釋。通過根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的熒光計(jì)和現(xiàn)有技術(shù)(來自(英國巴克斯)BMG萊伯泰有限公司的FLUOstar Optima)熒光計(jì)來進(jìn)行本探針的熒光測(cè)量。圖17中的結(jié)果顯示了熒光和探針濃度之間在用于兩臺(tái)機(jī)器的探針濃度的幅度的三個(gè)至四個(gè)次序上存在一種近似線性的關(guān)系。然而，如該熒光曲線的更陡的坡度所示，本發(fā)明的熒光計(jì)具有一個(gè)大得多的敏感性。這使得它特別適用于低豐度分子的測(cè)量。按所附權(quán)利要求所定義的，其他實(shí)施例有意地在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種熒光計(jì)，包括: 一個(gè)光源； 一個(gè)光檢測(cè)器； 一個(gè)安置在該光源和該光檢測(cè)器之間的樣本容器； 一個(gè)電機(jī)；以及 一個(gè)光透射調(diào)制器，該光透射調(diào)制器安置在該樣本容器周圍并包括一對(duì)附裝在該電機(jī)上用于繞一個(gè)共軸旋轉(zhuǎn)的盤，這對(duì)盤被安排成允許從該光源至一個(gè)第一旋轉(zhuǎn)位置上的樣本的透射，被安排成允許從該樣本至一個(gè)第二旋轉(zhuǎn)位置上的檢測(cè)器的透射并阻擋第一和第二旋轉(zhuǎn)位置二者上的光源和檢測(cè)器之間的直射光透射。
2.一種用于檢測(cè)樣本的時(shí)間分辨熒光的方法，包括以下步驟: 提供一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光計(jì)； 將該樣本安置在該樣本容器內(nèi)； 操作該電機(jī)使該光透射調(diào)制器旋轉(zhuǎn)； 當(dāng)該光透射調(diào)制器處于該第一旋轉(zhuǎn)位置上時(shí)，操作該光源以照亮該樣本；以及 捕捉來自該光檢測(cè)器的指示該樣本的熒光的光信號(hào)數(shù)據(jù)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，包括以下步驟: 停止該電機(jī)的運(yùn)行， 其中，停止該電機(jī)的運(yùn)行后且當(dāng)該光透射調(diào)制器正在旋轉(zhuǎn)時(shí)進(jìn)行捕捉光信號(hào)數(shù)據(jù)的步驟。
4.如權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所述的方法，包括以下步驟: 從一個(gè)旋轉(zhuǎn)檢測(cè)器提供的信號(hào)檢測(cè)該光透射調(diào)制器的旋轉(zhuǎn)位置以及捕捉來自該旋轉(zhuǎn)檢測(cè)器的觸發(fā)信號(hào)，以便使該被捕捉的光信號(hào)數(shù)據(jù)與該光透射調(diào)制器的旋轉(zhuǎn)位置同步。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，通過從該被捕捉的光信號(hào)數(shù)據(jù)上提取多條衰變曲線并從該多條衰變曲線上導(dǎo)出一個(gè)平均輸出信號(hào)來確定該樣本中熒光的測(cè)量，根據(jù)一個(gè)相對(duì)應(yīng)的觸發(fā)信號(hào)的位置確定每條衰變曲線的起點(diǎn)。
6.—種時(shí)間分辨突光系統(tǒng),包括: 一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光計(jì)；以及 一個(gè)連接至該控制器、該光源和該光檢測(cè)器的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)， 其中，該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)被配置成當(dāng)該光透射調(diào)制器在該第一旋轉(zhuǎn)位置上時(shí)操作該電機(jī)使該光透射調(diào)制器旋轉(zhuǎn)、操作該光源以便照亮該樣本、并捕捉來自該光檢測(cè)器的指示該樣本的熒光的光信號(hào)數(shù)據(jù)。
7.如權(quán)利要求6所述的時(shí)間分辨熒光系統(tǒng)，包括一個(gè)旋轉(zhuǎn)檢測(cè)器，該旋轉(zhuǎn)檢測(cè)器連接至該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)并被配置成檢測(cè)該光透射調(diào)制器的旋轉(zhuǎn)位置，其中，該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)被配置成捕捉來自該旋轉(zhuǎn)檢測(cè)器的信號(hào)并使該被捕捉的光信號(hào)數(shù)據(jù)與來自該旋轉(zhuǎn)檢測(cè)器的信號(hào)同步。
8.如權(quán)利要求6或權(quán)利要求7所述的時(shí)間分辨熒光，其中，該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)被配置成一旦該光透射調(diào)制器旋轉(zhuǎn)則停止該電機(jī)的運(yùn)行以及停止該電機(jī)的運(yùn)行后和當(dāng)該光透射調(diào)制器正在旋轉(zhuǎn)時(shí)捕捉來自該光檢測(cè)器的光信號(hào)數(shù)據(jù)。
9.一種計(jì)算機(jī)程序，該計(jì)算機(jī)程序用于向連接至根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光計(jì)的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)發(fā)指令以執(zhí)行一種檢測(cè)安置在樣本容器中的樣本內(nèi)的時(shí)間分辨熒光的方法，該方法包括以下步驟: 操作該電機(jī)使該光透射調(diào)制器旋轉(zhuǎn)； 當(dāng)該光透射調(diào)制器處于該第一旋轉(zhuǎn)位置上時(shí)，操作該光源以照亮該樣本； 捕捉來自該光檢測(cè)器的指示該樣本的熒光的光信號(hào)數(shù)據(jù)；以及 采集來自一個(gè)光傳感器的觸發(fā)信號(hào)，該光傳感器被配置成檢測(cè)從該光源到該樣本的光透射， 其中，停止該電機(jī)的運(yùn)行后且當(dāng)該光透射調(diào)制器正在旋轉(zhuǎn)時(shí)進(jìn)行操作該光源和捕捉光信號(hào)數(shù)據(jù)的步驟。
10.如權(quán)利要求2至5中任意一項(xiàng)所述的方法,其中，該樣本包括大量突光分子或部分，如一種鑭系元素螯合物，其指示一個(gè)試樣中存在的一種選定的生物分子的數(shù)量。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，該試樣為一個(gè)病人樣本，如尿液、血液、血清、血漿或腦脊液的樣本。
12.如權(quán)利要求10或11所述的方法，其中，所選定的生物分子為一種蛋白質(zhì)或糖蛋白，如一種SlOO蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇酶、一種NF重或NF輕神經(jīng)細(xì)絲、泛素羧基末端酯酶L1、TnI或TnT肌鈣蛋白、N端前腦鈉素、肌酸激酶MB蛋白、β 2微球蛋白、癌胚抗原、C反應(yīng)蛋白或纖維蛋白原D- 二聚體。
13.一種用于至少一個(gè)病人樣本的臨床評(píng)估的方法，包括: (i)收集至少一個(gè)病人樣本，如尿液、血液、血清、血漿或腦脊液的一個(gè)樣本； (ii)將該至少一個(gè)病人樣本與一種捕捉分子相接觸，如一種抗體，其能夠?qū)ｉT粘合在一種所選定的生物分子上，以便在該捕捉分子和該選定的生物分子之間形成一種絡(luò)合物； (iii)在一次非競(jìng)爭(zhēng)性或競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定中，通過直接或間接將該絡(luò)合物、該捕捉分子或該選定的生物分子與一個(gè)探針相接觸來檢測(cè)該絡(luò)合物，該探針包括能夠參與熒光的一部分，如鑭系元素螯合物，其中，該探針的數(shù)量指示該至少一個(gè)病人樣本中存在的選定的生物分子的數(shù)量； (iv)將至少一個(gè)包括該探針的試驗(yàn)樣本暴露在熒光在其中發(fā)射的條件下； (v)根據(jù)權(quán)利要求2至5、權(quán)利要求11或12中任意一項(xiàng)所述的方法檢測(cè)該至少一個(gè)試驗(yàn)樣本中的時(shí)間分辨熒光； (vi)從該至少一個(gè)試驗(yàn)樣本中檢測(cè)到的時(shí)間分辨熒光上估計(jì)該至少一個(gè)病人樣本中存在的選定的生物分子的數(shù)量。
14.如權(quán)利要求13所述的方法,包括每隔一定時(shí)間從一個(gè)病人上獲得多個(gè)病人樣本以及實(shí)時(shí)估計(jì)這些病人樣本中存在的一種或多種選定的生物分子的數(shù)量。
15.如權(quán)利要求13或14所述的方法，進(jìn)一步包括診斷或預(yù)測(cè)該病人或根據(jù)該至少一個(gè)病人樣本中的一種或多種選定的生物分子的存在、數(shù)量和/或該存在或數(shù)量隨時(shí)間的變化來修改該病人的治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及熒光測(cè)定法，且具體地涉及用于樣本中熒光的時(shí)延檢測(cè)的方法和設(shè)備，例如用于一種臨床環(huán)境。所披露的示例性實(shí)施例涉及一種熒光計(jì)(100)，這種熒光計(jì)包括一個(gè)光源(101)、一個(gè)光檢測(cè)器(102)、一個(gè)安置在該光源和該光檢測(cè)器之間的樣本容器(103)、一個(gè)電機(jī)(104)；以及一個(gè)安置在該樣本容器周圍的光透射調(diào)制器(105)并包括一對(duì)附裝在該電機(jī)上用于繞一個(gè)共軸(108)旋轉(zhuǎn)的盤(106、107)，這對(duì)盤被安排成允許從該光源至一個(gè)第一旋轉(zhuǎn)位置上的樣本的透射，被安排成允許從該樣本至一個(gè)第二旋轉(zhuǎn)位置上的檢測(cè)器的透射并阻擋第一和第二旋轉(zhuǎn)位置二者上的光源和檢測(cè)器之間的直射光透射?？梢栽谕Ｖ闺姍C(jī)的運(yùn)行之后并且在光透射調(diào)制器旋轉(zhuǎn)的同時(shí)捕捉光信號(hào)數(shù)據(jù)，以便降低或消除來自電機(jī)的電噪聲和機(jī)械振動(dòng)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK103180721SQ201180051249
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月1日
發(fā)明者愛德華·約翰·湯普森, 伊蘭·塔爾 申請(qǐng)人:愛德華·約翰·湯普森