專利名稱：顯微鏡裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及顯微鏡裝置。本申請基于2010年6月3日提出的日本專利申請2010-127906號要求優(yōu)先權(quán)，并將其內(nèi)容援引至此。
背景技術(shù)：
目前，作為超分辨率顯微鏡，已知有STORM (Stochastic Optical ReconstructionMicroscopy ;隨機光學(xué)重建顯微鏡)(例如參照專利文獻1、2)。在該顯微鏡中，作為觀察試樣，使用熒光物質(zhì)或者附著有熒光物質(zhì)的物質(zhì)。該熒光物質(zhì)具有這樣的特性若被照射規(guī)定波長的活性光則成為活性化狀態(tài)，若此后被照射與活性光的波長不同的激發(fā)光則發(fā)出熒光并成為非活性化狀態(tài)。通過對觀察試樣照射微弱的活性光，熒光物質(zhì)在低密度下成為活性 化狀態(tài)。然后，通過照射激發(fā)光而僅使活性化狀態(tài)的熒光物質(zhì)發(fā)光，從而取得熒光圖像。在這樣取得的熒光圖像中，由于在低密度下發(fā)光的熒光物質(zhì)的像是各自分離的，所以能夠求出各個像的重心位置。使這種獲取熒光物質(zhì)的位置的步驟重復(fù)多次、例如數(shù)百次 數(shù)萬次以上，從而制作出將熒光物質(zhì)的所有像配置在各個位置上而成的一張圖像，由此，能夠得到高分辨率的觀察圖像。另外，作為超分辨率顯微鏡裝置，已知有三維方式的ST0RM，其不僅能夠提高在試樣面(XY平面)內(nèi)的分辨率，還能夠提高試樣的厚度方向(Z方向)上的分辨率(例如參照非專利文獻)。在這種三維方式的STORM中，通過在成像光學(xué)系統(tǒng)中插入柱面透鏡而對試樣的像付與規(guī)定的像散差，由此能夠使熒光物質(zhì)的像成為橢圓形狀，并根據(jù)其橢圓率求出Z方向的坐標(biāo)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻I :美國專利申請公開第2008/0032414號專利文獻2 :美國專利申請公開第2008/0182336號非專利文獻I Bo Huang, et. al. Science 319，810-813 (2008)但是，在上述三維方式的STORM中，若根據(jù)試樣的圖像獲取條件來改變物鏡的倍率和開口數(shù)，則有可能無法良好地測定出Z位置的坐標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠得到高分辨率的觀察圖像的顯微鏡裝置。根據(jù)本發(fā)明的方式，提供一種顯微鏡裝置，其具有倍率彼此不同的多個物鏡；成像系統(tǒng)，經(jīng)由所述物鏡接收從包含有熒光物質(zhì)的試樣發(fā)出的光，并提供被付與了像散差的所述試樣的像；和攝像裝置，拍攝來自所述成像系統(tǒng)的所述試樣的像，所述成像系統(tǒng)包含根據(jù)所述物鏡的焦點深度來改變所述像散差的像散差改變裝置。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明的形式，能夠根據(jù)樣本的圖像獲取條件來使像散差最恰當(dāng)。


圖I是表示第一實施方式的顯微鏡裝置的概略構(gòu)成的圖。圖2是表示本實施方式的柱面透鏡單元的構(gòu)成的圖。圖3是表示顯微鏡裝置的成像光學(xué)系統(tǒng)的概略構(gòu)成的圖。圖4是表示一個熒光物質(zhì)在攝像裝置上所形成的像的形狀的圖。圖5是表示熒光物質(zhì)的Z坐標(biāo)與像在X、Y方向上各自的寬度的關(guān)系的圖表。圖6A是表示物鏡的倍率以及柱面透鏡的焦距與像散差的關(guān)系的圖。圖6B是表示物鏡的倍率以及柱面透鏡的焦距與像散差的關(guān)系的圖。圖7是表示第二實施方式的顯微鏡裝置的概略構(gòu)成的圖。圖8是表示第二實施方式的柱面透鏡單元的構(gòu)成的圖。圖9是表示第三實施方式的顯微鏡裝置的概略構(gòu)成的圖。圖10是表示本實施方式的柱面透鏡單元的構(gòu)成的圖。圖11是表示從旋轉(zhuǎn)軸方向觀察柱面透鏡單元所看到的構(gòu)成的圖。圖12A是表示各柱面透鏡的位置關(guān)系的圖。圖12B是表示各柱面透鏡的位置關(guān)系的圖。圖13是表示第四實施方式的柱面透鏡單元的概略構(gòu)成的圖。
具體實施例方式以下，參照

本發(fā)明的顯微鏡裝置的一個實施方式的構(gòu)成。此外，本實施方式是為了更好地理解發(fā)明的要旨來具體地進行說明的，在沒有特別指定的情況下，并不對本發(fā)明進行限定。另外，以下說明中所用的附圖，有時為了使特征易于理解，出于方便，會將重要部分放大表示，各申請要素的尺寸比例等不一定與實際相同。(第一實施方式)圖I是表示本實施方式的顯微鏡裝置的概略構(gòu)成的圖。如圖I所示，顯微鏡裝置100具有照明系統(tǒng)10 ;載置試樣8的載物臺123 ;與載物臺123上的試樣8相對配置的物鏡單元12A ;成像光學(xué)系統(tǒng)(成像系統(tǒng))7 ;對通過成像光學(xué)系統(tǒng)7所成像的試樣8的像進行拍攝的攝像裝置14 ;中繼光學(xué)系統(tǒng)15 ;和綜合性地控制顯微鏡裝置100的控制部25。本實施方式的顯微鏡裝置100是與二維方式或者三維方式對應(yīng)的STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)。在顯微鏡裝置 100 中，米用被付與了熒光物質(zhì)來作為標(biāo)識的試樣。該熒光物質(zhì)若被照射規(guī)定波長的活性光則成為活性化狀態(tài)。而且，該熒光物質(zhì)若在活性化狀態(tài)下被照射與活性光的波長不同的激發(fā)光，則發(fā)出熒光并成為非活性化狀態(tài)。而且，反復(fù)進行這樣的動作通過使用激發(fā)光和活性光僅使作為試樣中一部分的熒光物質(zhì)發(fā)光，由此來觀察離散分布的熒光。利用這樣獲取的大量的熒光圖像能夠形成試樣圖像。此外，熒光物質(zhì)可以包括Cy5或Alexa647等有機化合物。而且，熒光物質(zhì)可以包括PA-GFP等熒光蛋白質(zhì)。照明系統(tǒng)10包括激光臺40、光纖9、透鏡2、3、激發(fā)濾色鏡(exciter filter) 4。激光臺40具有第一激光光源41a和第二激光光源41b。第一激光光源41a是照射用于使付與至試樣中的熒光物質(zhì)活性化的活性光LI的光源。第一激光光源41a射出波長適合于包含在試樣中的熒光物質(zhì)的活性光LI。作為第一激光光源41a，例如能夠根據(jù)熒光物質(zhì)的種類而使用綠色激光(波長532nm)、紅色激光(波長633nm、657nm)、紫色激光(波長405nm)、藍色激光(波長457nm)等。
第二激光光源41b是照射用于使付與至試樣中的熒光物質(zhì)發(fā)光的激發(fā)光L2的光源。第二激光光源41b射出波長適合于包含在試樣中的突光物質(zhì)的激發(fā)光L2。作為第二激光光源41b，例如能夠根據(jù)熒光物質(zhì)的種類而使用綠色激光(波長532nm)、紅色激光(波長633nm、657nm)、紫色激光(波長405nm)、藍色激光(波長457nm)等。激光臺40具有配置在各個激光光源41a、41b前的快門42a、42b ;使來自激光光源41b的光L2反射的反射鏡43 ;使來自激光光源41a的光LI透過，且使來自激光光源41b的光L2反射的分色鏡44 ;對入射的激光的強度進行調(diào)整的聲光器件45 ;和用于使激光會聚至光纖9的入射端的耦合器46。此外，在激光臺40上連接有控制部25?？刂撇?5控制快門42a以及快門42b的開閉，從而能夠切換活性光LI、激發(fā)光L2的照射。而且，同時，控制部25還控制聲光器件45以調(diào)整向光纖入射的激光的強度。在照明系統(tǒng)10與物鏡單元12A的光路之間配置有分色鏡5。物鏡單元12A包含焦點深度淺的低倍率物鏡12a和焦點深度深的高倍率物鏡12b。以下，為了便于說明，將低倍率物鏡12a和高倍率物鏡12b統(tǒng)稱為物鏡12。來自照明系統(tǒng)10的照明光通過被分色鏡5反射而會聚于物鏡12的光瞳面。由此，從物鏡12射出的照明光將試樣8照亮。上述那樣，控制部25使活性光LI以及激發(fā)光L2從激光光源41a、41b向試樣8照射。從試樣8發(fā)出的光入射至物鏡12，并成為平行光而射出。該光在透過了分色鏡5、屏障濾光片(barrier filter) 6后,入射至成像光學(xué)系統(tǒng)7中。成像光學(xué)系統(tǒng)7包含成像透鏡20 ;棱鏡21 :構(gòu)成遠焦光學(xué)系統(tǒng)的透鏡22、23 ;和設(shè)置在這些透鏡22、23之間的柱面透鏡單元(像散差改變裝置)50。在棱鏡21上連接有控制部25。另外，在棱鏡21上設(shè)置有未圖示的進退機構(gòu)，從而棱鏡21能夠相對于光路移出或插入。即，在棱鏡21插入至光路中的情況下，能夠使來自物鏡12的光反射而將其導(dǎo)向攝像裝置14。中繼光學(xué)系統(tǒng)15通過在成像透鏡20的后方配置反射鏡11、透鏡13、反射鏡16、透鏡17、18、反射鏡19而構(gòu)成。通過使上述棱鏡21從光路中退避，來自試樣8的光由中繼光學(xué)系統(tǒng)15中繼，并作為試樣8的像經(jīng)由目鏡37而被觀察者(觀察眼)38觀察到。具體地，來自成像透鏡20的光在被反射鏡11反射之后，形成一次像24a。而且，來自一次像24a的光在透過透鏡13之后被反射鏡16反射而通過透鏡17、18，并由反射鏡19反射而形成二次像24b。觀察者38能夠通過目鏡37目視觀察到二次像24b。此外，中繼光學(xué)系統(tǒng)15是例如在觀察者38對試樣8中的圖像獲取區(qū)域進行設(shè)定的初始設(shè)定時使用的。本實施方式的顯微鏡裝置100向通過成像光學(xué)系統(tǒng)7而得到的試樣8的像付與后述的像散差，并通過攝影裝置14拍攝該像，由此能夠取得試樣8的三維信息。攝影裝置14例如由CXD照相機等攝像元件構(gòu)成。在攝像裝置14上連接有控制部25。在本實施方式中，為了向通過成像光學(xué)系統(tǒng)7而得的試樣8的像付與像散差，成像光學(xué)系統(tǒng)7在透鏡22、23之間具有圖2所示的柱面透鏡單元50。在柱面透鏡單元50上連接有控制部25。如圖2所示，柱面透鏡單元50具有柱面透鏡101、102、和使這些柱面透鏡101、102在透鏡22、23之間進退的滑動部(進退部)105?；瑒硬?05包含以能夠使柱面透鏡101、102在透鏡22、23之間滑動的方式保持柱面透鏡101、102的滑動板105a ;和使該滑動板105a滑動的驅(qū)動部105b。在驅(qū)動部105b上連接有控制部25。在滑動板105b上設(shè)置有柱面透鏡101、102的保持部101a、102a、和開口部106。這些保持部101a、102a以及開口部106沿著滑動板105a的滑動方向(水平方向)而配置。開口部106被設(shè)定為，具有使透過透鏡22的光無遮攔地通過的大小。柱面透鏡101、102通過嵌合在保持部101a、102a上而被保持在滑動板105a上。此外，柱面透鏡101、102具有彼此不同的焦距。具體地，柱面透鏡102的焦距被設(shè)定得比柱面透鏡101的焦距短。柱面透鏡101、102的各箭頭A、B表示各透鏡的母線方向，在本實施例中，例如均被設(shè)定為與滑動板105a的滑動方向正交的鉛垂方向。由此，在使用柱面透鏡101、102的任意一個的情況下，都能夠防止形成在攝像裝置14上的試樣8的像的橢圓方向發(fā)生變化。也可以取而代之，配置成柱面透鏡101、102的母線方向均為水平方向(滑動板105的滑動方向)。在柱面透鏡單元50的這種結(jié)構(gòu)中，控制部25對驅(qū)動部105b進行驅(qū)動而使滑動板105a滑動。伴隨與此，柱面透鏡單元50能夠?qū)Σ迦氲匠上窆鈱W(xué)系統(tǒng)7的光路中的柱面透鏡101、102進行切換。由此，顯微鏡裝置100能夠如后所述通過以三維方式取得試樣8的圖像。另外，顯微鏡裝置100能夠通過驅(qū)動滑動板105a而將開口部106插入到成像光學(xué)系統(tǒng)7內(nèi)的光路中，從而也能夠以二維方式取得試樣8的圖像。圖3是顯微鏡裝置100的成像光學(xué)系統(tǒng)的概略構(gòu)成圖，具體地，示出了通過滑動板105a使柱面透鏡101插入到光路中的狀態(tài)。此外，為了使說明容易理解，省略了照明裝置9、成像透鏡20、棱鏡21以及透鏡22、23等的圖示。另外，為了便于說明，在圖3中設(shè)定XYZ坐標(biāo)系，并適當(dāng)?shù)厥褂迷揦YZ坐標(biāo)系來進行說明。關(guān)于XYZ坐標(biāo)系，例如沿著水平面設(shè)定X軸以及Y軸，沿著垂直方向朝上設(shè)定Z軸。此外，該XYZ坐標(biāo)系僅在圖3內(nèi)有效?！?br> 來自試樣8的光入射至物鏡12而成為平行光束，并入射至成像透鏡20。在圖3所示的狀態(tài)下，對在成像透鏡20與攝像裝置14之間配置有柱面透鏡101的情況進行說明。柱面透鏡101以使母線方向成為Y方向的方式配置。柱面透鏡101的狀態(tài)為在X方向上具有折射力，但在Y方向(母線方向)上不具有折射力。圖4是表示存在于試樣8的表面上的一個熒光物質(zhì)在攝像裝置14上所形成的像的形狀的圖。通常，比成像光學(xué)系統(tǒng)的分辨率小的熒光物質(zhì)在攝像裝置14上形成圓形的像。在本實施方式中，由于使用包含柱面透鏡101的成像光學(xué)系統(tǒng)7，所以像根據(jù)該Z坐標(biāo)的不同而X方向的寬度(Wx)、Y方向的寬度(Wy)分別變化。若將像為圓形(Wx = Wy)的熒光物質(zhì)的Z坐標(biāo)設(shè)為Z = 0，則在Z > O時，像成為在X方向上具有長軸的橢圓(Wx > Wy)，另外，在Z < O時，像成為在Y方向上具有長軸的橢圓(Wx<Wy)。即，向試樣8付與的一個熒光物質(zhì)在攝像裝置14上所形成的像根據(jù)后述的Z坐標(biāo)的不同而X方向的寬度與Y方向的寬度分別變化。圖5是表示熒光物質(zhì)的Z坐標(biāo)(橫軸)與像在X、Y方向上各自的寬度的關(guān)系的圖表。Χ、Υ方向上的寬度Wx、Wy分別在Z < 0、Ζ > O時具有極小值。換言之，Wx在未達到O的某個Z位置處成為極小。Wy在超過O的某個Z位置處成為極小。在Z = O時，Wx = Wy。Wx、Wy分別成為極小時的Z坐標(biāo)的差Δ即為像散差。換言之,像散差是Wx成為極小時的Z位置與Wy成為極小時的Z位置之差。
顯微鏡裝置100中的試樣8的圖像觀察方法包括從激光臺40內(nèi)的第一激光光源41a對試樣8照射能量弱的活性光LI的步驟；對激光臺40內(nèi)的快門42a、42b以及聲光器件45進行切換而從第二激光光源9b向試樣8照射能量強的激發(fā)光L2以取得熒光圖像的步驟；和將這樣測定的熒光圖像保存的步驟，將這些步驟反復(fù)進行幾百次到幾萬次。顯微鏡裝置100將如下數(shù)據(jù)存儲在控制部25，該數(shù)據(jù)是使將柱面透鏡101配置在成像透鏡3與攝像裝置14之間的情況下的像的變化率(X方向的寬度與Y方向的寬度的比例；Wy/Wx)與Z坐標(biāo)相關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)并且是預(yù)先通過實驗等求出的數(shù)據(jù)。在顯微鏡裝置100中，將對存在于試樣8的表面上的各個熒光物質(zhì)在攝像裝置14上所形成的像的形狀進行拍攝而得到的數(shù)據(jù)、和存儲在控制部25內(nèi)的數(shù)據(jù)進行比較，由此能夠檢測出像(熒光物質(zhì))的Z坐標(biāo)。這樣，顯微鏡裝置100通過攝像裝置14拍攝被付與了像散差的像，并根據(jù)各圖像求出熒光物質(zhì)的位置(也包含Z坐標(biāo))，且將這些配置在一張圖像中。由此，能夠使用顯微鏡裝置100取得包含三維信息(Z坐標(biāo))的高分辨率的試樣8的圖像。但是，上述的像散差需要與物鏡的焦點深度相配合地調(diào)整為規(guī)定的量。圖6A是表示在像散差相對于物鏡的焦點深度比較大的情況下的、Z與Wx、Wy的關(guān)系的圖表。如圖6A所示，在像散差相對于物鏡的焦點深度比較大的情況下，Z僅從Z = O的位置稍微偏移，Wx或者Wy就變得非常大。若像變得過大，則攝像裝置14上的強度下降，S/N降低。該結(jié)果為，從所取得的圖像求出的Wx、Wy的誤差有變大的傾向，有可能無法正確地求出像的Z坐標(biāo)。另一方面，圖6B是表示在像散差相對于物鏡的焦點深度比較小的情況下的、Z與Wx、Wy的關(guān)系的圖表。如圖6B所示，在像散差相對于物鏡的焦點深度比較小的情況下，在Z=O附近的橢圓率(Wy/Wx)的變化率較小。該結(jié)果為，存在從像求出的Wx、Wy中所包含的微小誤差在Z坐標(biāo)的計算結(jié)果中變成較大誤差的傾向，有可能無法正確地求出像的Z坐標(biāo)。因此，在進行三維方式的圖像觀察的情況下，通過與物鏡12的焦點深度相配合地使用具有恰當(dāng)焦距的柱面透鏡，能夠?qū)⑾裆⒉钫{(diào)整在最合適的范圍內(nèi)。具體地，優(yōu)選為，將像散差調(diào)整為物鏡的焦點深度的兩倍左右。若將物鏡的開口數(shù)設(shè)為NA，將與物鏡的樣本側(cè)的面接觸的介質(zhì)的折射率設(shè)為n，將色素的熒光波長設(shè)為λ，則焦點深度FD通過下述的算式表示。FD = (ηλ )/(2ΝΑ"2) ... (I)另一方面，若將柱面透鏡的焦距設(shè)為f，將從柱面透鏡到像面的距離設(shè)為d，則在通過柱面透鏡產(chǎn)生的、像側(cè)的像散差Λ ’通過下述的算式表示。Λ ’ = (d~2)/(f+d) ... (2)另外，若將物鏡的倍率設(shè)為β，則將像散差換算為物體側(cè)的值Λ通過下述的算式表不。Λ = (ηΛ，)/(β ~2) …(3)為了使像散差成為焦點深度的兩倍，滿足下述的條件式可。Δ = 2FD ... (4)若在算式(I) (4)中求解f，則得到如下的算式。f = (d'2 · NA'2) / ( β '2 · λ) ...(5)因此，只要與所利用的物鏡相配合地切換以使柱面透鏡的焦距滿足算式(5)，就能夠得到恰當(dāng)?shù)南裆⒉?。例如，在通過倍率為100倍、NA為I. 4的物鏡對熒光波長為550nm的熒光色素進行觀察的情況下，只要將焦距為841mm的柱面透鏡配置在離鏡面50mm的位置上即可。另夕卜，在使用倍率為60倍、NA為I. 4的物鏡的情況下，只要將柱面透鏡的焦距切換為2425mm即可。另外，在利用倍率20倍、NA為O. 75的物鏡的情況下，只要將柱面透鏡的焦距切換為6342mm 即可。本實施方式的顯微鏡裝置100的柱面透鏡單元50包含與焦點深度較淺的物鏡12a對應(yīng)的柱面透鏡101、和與焦點深度較深的物鏡12a對應(yīng)的柱面透鏡102。柱面透鏡101的焦距與柱面透鏡102的焦距不同。即，顯微鏡裝置100構(gòu)成為，包括焦距彼此不同的多個柱面透鏡101、102，并與所使用的物鏡12的焦點深度相配合地選擇具有恰當(dāng)焦距的柱面透 鏡。在顯微鏡裝置100中，在使用低倍率物鏡12a來進行基于三維方式的圖像獲取的情況下，控制部25驅(qū)動柱面透鏡單元50的驅(qū)動部105b，使滑動板105a滑動，由此，將柱面透鏡101插入到成像光學(xué)系統(tǒng)7內(nèi)的光路中。另一方面，在顯微鏡裝置100中，若由觀察者38選擇了高倍率物鏡12b，則通過控制部25驅(qū)動柱面透鏡單元50的驅(qū)動部105b，使滑動板105a滑動,從而將柱面透鏡102插入到來自成像光學(xué)系統(tǒng)7的光的光路中。以上那樣，在顯微鏡裝置100中，根據(jù)圖像獲取條件使物鏡12的倍率、開口數(shù)改變。另外，在顯微鏡裝置100中，即使在焦點深度發(fā)生了變化的情況下，也可以與物鏡12對應(yīng)地選擇具有最恰當(dāng)?shù)慕咕嗟闹嫱哥R101、102的任意一方。由此，能夠設(shè)定規(guī)定范圍的像散差，從而能夠高精度地進行基于三維方式的試樣8的圖像觀察。另外，在顯微鏡裝置100中，在觀察者38希望進行基于二維方式的圖像獲取的情況下，通過控制部25驅(qū)動柱面透鏡單元50的驅(qū)動部105b，使滑動板105a滑動，從而將開口部106插入到來自成像光學(xué)系統(tǒng)7的光的光路中。此時，由于來自試樣8的光從開口部106通過，所以像不會如從柱面透鏡通過的情況那樣變形為橢圓形，從而在攝像裝置14上形成圓形的像。由此，在顯微鏡裝置100中，基于攝像裝置14所拍攝的圓形的像，能夠取得試樣8的二維圖像。另外，在上述的實施方式中，說明了柱面透鏡101、102與物鏡12的對應(yīng)關(guān)系為兩種的情況，但是本發(fā)明也能夠適用于組合三種以上的柱面透鏡以及物鏡的情況。例如，柱面透鏡的種類數(shù)能夠為2、3、4、5、6、7、8、9、10或者更多。在該情況下，各柱面透鏡具有在與所對應(yīng)的物鏡12組合時能夠設(shè)定最恰當(dāng)?shù)南裆⒉畹慕咕唷?第二實施方式)接下來，說明本發(fā)明的顯微鏡裝置的第二實施方式。本實施方式的構(gòu)成與第一實施方式的構(gòu)成僅在物鏡單元以及柱面透鏡單元的構(gòu)成上不同。因此，在以下的說明中主要說明柱面透鏡單元的構(gòu)成，在與第一實施方式相同的構(gòu)成以及部件上標(biāo)注相同的附圖標(biāo)記，且省略其詳細的說明，或者將其說明簡略化。圖7是表示本實施方式的顯微鏡裝置的概略構(gòu)成的圖，圖8是表示本實施方式中的柱面透鏡單元的構(gòu)成的圖。在本實施方式中，如圖7所示，物鏡單元112A包括第一物鏡112a、第二物鏡112b、第三物鏡112c、第四物鏡112d以及第五物鏡112e。這些第一 第五物鏡112a 112e被設(shè)定成焦點深度以該順序變深。即，第一物鏡112a的焦點深度最淺，物鏡112e的焦點深度被設(shè)定成最深。以下，為了便于說明，將第一 第五物鏡112a 112e統(tǒng)稱為物鏡112。如圖7所示，在本實施方式的顯微鏡裝置200中，在成像光學(xué)系統(tǒng)7中的透鏡22、23之間設(shè)置有柱面透鏡單元150。如圖7、8所示，本實施方式的柱面透鏡單元150具有多個柱面透鏡201 205、和使這些柱面透鏡201 205在透鏡22、23之間進退的轉(zhuǎn)盤部(進退部)215。轉(zhuǎn)盤部215包括保持柱面透鏡201 205的圓板部件215a、和通過使圓板部件215a繞著從該圓板部件215a的中心通過的旋轉(zhuǎn)軸J旋轉(zhuǎn)，而使各個柱面透鏡201 205能夠在透鏡22、23之間進退的旋轉(zhuǎn)驅(qū)動部215b。在圓板部件215a上設(shè)置有柱面透鏡201 205的保持部201a 205a和開口部206。這些保持部201a 205a以及開口部206沿著圓板部件215a的圓周方向(旋轉(zhuǎn)方向)配置。開口部206被設(shè)定為，具有使透過透鏡22的光無遮攔地通過的大小。柱面透鏡201 205例如通過嵌合在保持部201a 205a上而被保持在圓板部件215a上。柱面透鏡201 205內(nèi)的箭頭表示各透鏡的母線方向，在本實施例中，例如以分別 沿著圓板部件215a的徑向的方式安裝。即，各透鏡的母線方向相對于旋轉(zhuǎn)軸J所通過的圓板部件215a的中心在放射方向上設(shè)定，在各柱面透鏡201 205被插入到透鏡22、23之間的情況下，各個透鏡的母線以成為鉛垂方向的方式配置。由此，在使用柱面透鏡201 205的任意一個的情況下，都能夠防止形成在攝像裝置14上的試樣8的橢圓方向的朝向發(fā)生變化。此外，即使柱面透鏡201 205以使其母線方向都成為圓周方向(與徑向垂直的方向)的方式配置也沒有問題。柱面透鏡201 205具有彼此不同的焦距，具體地，以按照從柱面透鏡205至柱面透鏡201的順序焦距變短的方式設(shè)定。即，柱面透鏡205的焦距被設(shè)定為最長，柱面透鏡201的焦距被設(shè)定為最短。在本實施方式中，使物鏡112中的焦點深度最淺的第一物鏡112a、與柱面透鏡單元150中焦距最長的柱面透鏡205相對應(yīng)。另一方面，使焦點深度最深的第五物鏡112e與柱面透鏡單元150中焦距最短的柱面透鏡201相對應(yīng)。另外，第二物鏡112b與柱面透鏡204相對應(yīng)，第三物鏡112c與柱面透鏡203相對應(yīng)，第四物鏡112d與柱面透鏡202相對應(yīng)。基于這種構(gòu)成，顯微鏡裝置200根據(jù)由觀察者38選擇的物鏡112的種類，由控制部25驅(qū)動柱面透鏡單元150的旋轉(zhuǎn)驅(qū)動部215b，使圓板部件215a旋轉(zhuǎn)而將所對應(yīng)的柱面透鏡201 205插入到成像光學(xué)系統(tǒng)7的光路中。由此，在顯微鏡裝置200中，即使在根據(jù)觀察者38所希望的圖像獲取條件而將物鏡112的倍率、開口數(shù)改變的情況下，也能夠設(shè)定與物鏡112對應(yīng)的最恰當(dāng)?shù)闹嫱哥R201 205，從而能夠高精度地進行基于三維方式的試樣8的圖像觀察。另外，在顯微鏡裝置200中，在觀察者38希望進行基于二維方式的圖像獲取的情況下，通過控制部25驅(qū)動柱面透鏡單元150的旋轉(zhuǎn)驅(qū)動部215b，使圓板部件215a旋轉(zhuǎn)而將開口部206插入到成像光學(xué)系統(tǒng)7的光路中。此時，由于來自試樣8的光從開口部206通過，所以像不會如從柱面透鏡201 205通過的情況那樣變形為橢圓形，而是在攝像裝置14上形成圓形的像。由此，在顯微鏡裝置200中，基于攝像裝置14所拍攝的圓形的像，能夠以二維方式取得試樣8的二維圖像。另外，在上述的實施方式中，說明了柱面透鏡201 205與物鏡112的對應(yīng)關(guān)系為五種的情況，但是本發(fā)明也可以適用于少于五種或是六種以上的情況。例如，柱面透鏡201 205與物鏡112的對應(yīng)關(guān)系的數(shù)量可以為2、3、4、5、6、7、8、9、10或者更多。(第三實施方式)接下來，說明本發(fā)明的顯微鏡裝置的第三實施方式。此外，本實施方式的構(gòu)成與第
一、第二實施方式的構(gòu)成僅在柱面透鏡單元的構(gòu)成上不同。由此，在以下的說明中主要說明柱面透鏡單元的構(gòu)成，在與上述實施方式相同的構(gòu)成以及部件上標(biāo)注相同的附圖標(biāo)記，且省略其詳細的說明，或者將其說明簡略化。圖9是表示本實施方式的顯微鏡裝置300的概略構(gòu)成的圖，圖10是表示本實施方式的柱面透鏡單元的構(gòu)成的圖。如圖9所示，在本實施方式的顯微鏡裝置300中，在成像光學(xué)系統(tǒng)7中的透鏡22、23之間設(shè)置有柱面透鏡單元250。本實施方式的柱面透鏡單元250包括一對柱面透鏡301、302、和保持這些柱面透鏡301、302的旋轉(zhuǎn)動作缸部315。旋轉(zhuǎn)動作缸部315將一對柱面透鏡301、302分別以能夠繞著規(guī)定的旋轉(zhuǎn)軸K旋轉(zhuǎn)的狀態(tài)保持。在此處，柱面透鏡301、302中的規(guī)定的旋轉(zhuǎn)軸K由與成像光學(xué)系統(tǒng)7內(nèi)的像的光線束的中心軸平行的軸來規(guī)定。通過使這些柱面透鏡301、302相互旋轉(zhuǎn)，能夠使像散差連續(xù)地變化。柱面透鏡301、302成為彼此的焦距的正負不同，但絕對值相等的關(guān)系。具體地，在本實施方式中，如圖10所示，作為柱面透鏡301，使用凹型柱面透鏡，作為柱面透鏡302，使用凸型柱面透鏡。圖11是從旋轉(zhuǎn)軸K的軸方向觀察柱面透鏡單元250所看到的圖。圖11中的箭頭A表示柱面透鏡301的母線方向，圖11中的箭頭B表示柱面透鏡302的曲率方向(與母線方向垂直的方向)，將箭頭A、B所成的角度作為Θ。此外，在圖11中，為了易于說明，將柱面透鏡301、302的形狀用圓形簡化地表示。圖12A是表示箭頭A、B所成角度Θ為O度的情況下的柱面透鏡301、302的狀態(tài)的俯視圖，圖12B是表示箭頭A、B所成角度Θ為90度的情況下的柱面透鏡301、302的狀態(tài)的俯視圖。柱面透鏡301、302能夠在將兩根箭頭A、B的中線C(合成母線)始終保持在鉛垂方向上的同時，以使Θ變化的方式相互旋轉(zhuǎn)。即，柱面透鏡301、302每次各自向相反方向各旋轉(zhuǎn)相同的角度，使箭頭A以及B與中線C所成的角度分別為Θ/2。這樣，柱面透鏡單元250通過將箭頭A、B的中線C始終保持在鉛垂方向，能夠防止在攝像裝置14上形成的試樣8的像的橢圓方向發(fā)生旋轉(zhuǎn)。由于柱面透鏡單元250在如圖12A所示Θ為O度時，透鏡的折射力在鉛垂方向與水平方向上的差為最大，所以像散差成為最大。另一方面，由于如圖12B所示，在Θ為90度時，透鏡的折射力在鉛垂方向與水平方向上的差消失，所以像散差成為O。這樣，柱面透鏡單元250通過將Θ在O度到90度之間調(diào)整，能夠使像散差連續(xù)地變化。此外，顯微鏡裝置300將如下數(shù)據(jù)存儲在控制部25內(nèi)，該數(shù)據(jù)為將預(yù)先通過實驗等而求出的、使物鏡112的焦點深度與產(chǎn)生對應(yīng)于該焦點深度的像散差的透鏡301、302的旋轉(zhuǎn)角度Θ相關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)。在顯微鏡裝置300中，根據(jù)由觀察者38選擇的物鏡112的種類，由控制部25驅(qū)動柱面透鏡單元250的旋轉(zhuǎn)動作缸部315，使一對柱面透鏡301、302僅旋轉(zhuǎn)規(guī)定角度。由此，在顯微鏡裝置300中，即使在根據(jù)觀察者38希望的圖像獲取條件而改變了物鏡112的倍率、開口數(shù)的情況下，也能夠設(shè)定與物鏡112的焦點深度對應(yīng)的最恰當(dāng)?shù)南裆⒉睿瑥亩軌蛱峁└呔鹊幕谌S方式的試樣8的圖像觀察。
另外，在顯微鏡裝置300中，在觀察者38希望進行基于二維方式的圖像獲取的情況下，通過控制部25驅(qū)動柱面透鏡單元250的旋轉(zhuǎn)動作缸部315，使一對柱面透鏡301、302的角度Θ為90度。此時，由于來自試樣8的光在通過柱面透鏡301、302時不產(chǎn)生像散差，所以像不會發(fā)生變形，從而在攝像裝置14上形成圓形的像。由此，在顯微鏡裝置300中，基于攝像裝置14所拍攝到的圓形的像，能夠以二維方式取得試樣8的圖像。(第四實施方式)接下來，說明本發(fā)明的顯微鏡裝置的第四實施方式。此外，本實施方式的構(gòu)成與第
二、第三實施方式的構(gòu)成僅在柱面透鏡單元的構(gòu)成上不同。由此，在以下的說明中主要說明柱面透鏡單元的構(gòu)成，在與第一實施方式相同的構(gòu)成以及部件上標(biāo)注相同的附圖標(biāo)記，且省略其詳細的說明，或者將其說明簡略化。 圖13是表示本實施方式的柱面透鏡單元的構(gòu)成的圖。本實施方式的柱面透鏡單元是使第一實施方式的柱面透鏡單元的一部分構(gòu)成與第三實施方式的柱面透鏡單元的一部分構(gòu)成組合而成的。具體地,如圖13所示,本實施方式的柱面透鏡單元350具有保持一對柱面透鏡401,402的旋轉(zhuǎn)動作缸部415、和滑動部(進退部)405?；瑒硬?05包括將旋轉(zhuǎn)動作缸部415能夠滑動地保持的滑動板405a、和使該滑動板405a滑動的驅(qū)動部405b。在滑動板405a上設(shè)置有旋轉(zhuǎn)動作缸部415的保持部415a和開口部306。這些保持部315a以及開口部306沿著滑動板405a的滑動方向(水平方向)配置。開口部306被設(shè)定為，具有使從透鏡22通過的光無遮攔地通過的大小。旋轉(zhuǎn)動作缸部415通過嵌合在保持部415a上而被保持在滑動板405a上。在本實施方式中，柱面透鏡401、402均使用凸型柱面透鏡。由此，雖然無法如將凸型凹型柱面透鏡組合的第三實施方式那樣使像散差為0，但在本實施方式中，能夠通過組合上述開口部306而使像散差處于O的狀態(tài)下(基于二維方式的圖像觀察)。在本實施方式的顯微鏡裝置中，在進行基于三維方式的圖像獲取的情況下，通過控制部25驅(qū)動柱面透鏡單元350的驅(qū)動部405b，使滑動板405a滑動，從而將旋轉(zhuǎn)動作缸部415插入到成像光學(xué)系統(tǒng)7內(nèi)的光路中。此時，控制部25根據(jù)由觀察者38選擇的物鏡112的種類來驅(qū)動旋轉(zhuǎn)動作缸部415，使一對柱面透鏡401、402僅旋轉(zhuǎn)規(guī)定角度。由此，在顯微鏡裝置中，即使在根據(jù)觀察者38希望的圖像獲取條件而改變了物鏡的倍率、開口數(shù)的情況下，也能夠設(shè)定與物鏡的焦點深度對應(yīng)的最恰當(dāng)?shù)南裆⒉?，從而能夠高精度地進行基于三維方式的試樣8的圖像觀察。另外，在本實施方式的顯微鏡裝置中，在觀察者希望進行基于二維方式的圖像獲取的情況下，通過控制部25驅(qū)動柱面透鏡單元350的驅(qū)動部405b，使滑動板405a滑動，從而將開口部306插入到來自成像光學(xué)系統(tǒng)7的光的光路中。此時，由于來自試樣8的光從開口部306通過，所以像不會如從柱面透鏡通過的情況那樣變形為橢圓形，而是在攝像裝置14上形成圓形的像。由此，在顯微鏡裝置中，基于攝像裝置14所拍攝的圓形的像，能夠以二維方式取得試樣8的圖像。此外，也可以采用這樣的構(gòu)成，S卩使用第二實施方式的轉(zhuǎn)盤部來進行旋轉(zhuǎn)動作缸部與開口部的切換。另外，在上述第四實施方式中，作為一對柱面透鏡401、402，使用了凸型柱面透鏡與凸型柱面透鏡的組合，但是，也可以使用凹型柱面透鏡與凹型柱面透鏡的組合。
在以上實施例中，說明了在活性化用與激發(fā)用中使用波長不同的兩種激光的顯微鏡裝置。另一方面，作為僅使用激發(fā)用的激光的顯微鏡，已知有dSTORM(direct StochasticOptical Reconstruction Microscopy ;直接隨機光學(xué)重建顯微鏡)。在dSTORM中，不會如以往的STORM那樣照射活性化用的激光，而是以熒光物質(zhì)的自發(fā)的閃爍為基礎(chǔ)，取得僅有少量熒光色素的圖像。本發(fā)明的像散差改變裝置也能夠適用在dSTORM中。在一個實施方式中，顯微鏡裝置具有各自的倍率不同的多個物鏡；成像系統(tǒng)，接收通過對含有熒 光物質(zhì)的試樣照射激發(fā)光而從上述試樣發(fā)出且從上述物鏡射出的光，并以對上述試樣的像付與了像散差的狀態(tài)成像，其中，上述熒光物質(zhì)若被照射規(guī)定波長的上述激發(fā)光則發(fā)出熒光；和攝像裝置，拍攝經(jīng)上述成像系統(tǒng)形成的上述試樣的像，上述成像系統(tǒng)包括根據(jù)上述物鏡的焦點深度來改變上述像散差的像散差改變裝置。在一個實施方式中，顯微鏡裝置具有各自的倍率不同的多個物鏡成像系統(tǒng)，接收通過對含有熒光物質(zhì)的試樣照射激發(fā)光而從上述試樣發(fā)出且從上述物鏡射出的光，并以對上述試樣的像付與了像散差的狀態(tài)成像，其中，上述熒光物質(zhì)若被照射規(guī)定波長的活性光則活性化，若在活性化狀態(tài)下照射與上述活性光的波長不同的上述激發(fā)光則發(fā)出熒光且成為非活性化狀態(tài)；和攝像裝置，拍攝經(jīng)上述成像系統(tǒng)形成的上述試樣的像，上述成像系統(tǒng)包括根據(jù)上述物鏡的焦點深度來改變上述像散差的像散差改變裝置。附圖標(biāo)記說明7成像光學(xué)系統(tǒng)(成像系統(tǒng))12、112 物鏡14攝像裝置50、150、250、350柱面透鏡單元(像散差改變裝置)100、200、300 顯微鏡裝置101、102、201 205 柱面透鏡105、405滑動部(進退部)215轉(zhuǎn)盤部(進退部)
權(quán)利要求
1.一種顯微鏡裝置，其特征在于，具有 各自的倍率不同的多個物鏡； 成像系統(tǒng)，經(jīng)由所述物鏡接收從含有熒光物質(zhì)的試樣發(fā)出的光，并且提供被付與了像散差的所述試樣的像；和 攝像裝置，拍攝來自所述成像系統(tǒng)的所述試樣的像， 所述成像系統(tǒng)包括根據(jù)所述物鏡的焦點深度來改變所述像散差的像散差改變裝置。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的顯微鏡裝置，其特征在于， 還包括照射裝置，所述照射裝置能夠使活性化用的光朝向所述試樣，或者能夠使活性化用的光及激發(fā)用的光中的至少一種朝向所述試樣。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的顯微鏡裝置，其特征在于， 所述像散差改變裝置具有多個柱面透鏡，能夠?qū)λ鲈嚇拥南穹謩e付與不同的像散差；和進退部，使所述多個柱面透鏡相對于從所述物鏡射出的光的光路進退。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的顯微鏡裝置，其特征在于， 所述進退部包括能夠在圓周方向上旋轉(zhuǎn)的圓板部件，所述多個柱面透鏡沿著所述圓板部件的圓周方向而配置。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的顯微鏡裝置，其特征在于， 所述多個柱面透鏡以使各自的母線方向朝著所述圓板部件的徑向的方式配置。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的顯微鏡裝置，其特征在于， 所述進退部包括相對于從所述物鏡射出的光的光路滑動移動的滑動板，所述多個柱面透鏡沿著所述滑動板的滑動方向而配置。
7.根據(jù)權(quán)利要求3至6中任一項所述的顯微鏡裝置，其特征在于， 所述進退部具有開口部。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至7中任一項所述的顯微鏡裝置，其特征在于， 所述像散差改變裝置包括一對柱面透鏡，各個柱面透鏡能夠繞著規(guī)定的旋轉(zhuǎn)軸相互旋轉(zhuǎn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的顯微鏡裝置，其特征在于， 所述一對柱面透鏡每次分別向相反方向各旋轉(zhuǎn)相同的角度。
全文摘要
一種顯微鏡裝置，具有倍率彼此不同的多個物鏡(12)；成像系統(tǒng)(7)，接收通過對含有熒光物質(zhì)的試樣照射激發(fā)光(L2)而從試樣(8)發(fā)出且從物鏡(12)射出的光，并以對試樣(8)的像付與了像散差的狀態(tài)成像，所述熒光物質(zhì)若被照射規(guī)定波長的活性光(L1)則活性化，若在活性化狀態(tài)下被照射與活性光(L1)的波長不同的激發(fā)光(L2)則發(fā)出熒光且成為非活性化狀態(tài)；和攝像裝置(100)，拍攝經(jīng)成像系統(tǒng)(7)形成的試樣(8)的像。成像系統(tǒng)(7)包括根據(jù)物鏡(12)的焦點深度來改變像散差的像散差改變裝置(50)。
文檔編號G01N21/64GK102934005SQ20118002689
公開日2013年2月13日 申請日期2011年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月3日
發(fā)明者中山浩明, 大內(nèi)由美子 申請人:株式會社尼康