專利名稱：前胃泌素和肝病理的制作方法
前胃泌素和肝病理I.對相關(guān)申請的交叉參考本申請要求在2010年I月8日提交的美國臨時申請?zhí)?1/293，557的優(yōu)先權(quán)，將所述臨時申請的內(nèi)容完整并入本文作為參考。2.對序列表的參考序列表隨同本文同時提交。3.背景本公開提供用于診斷和篩選肝病理，包括肝增生或者退化疾病的方法和材料；并·且更特別地，提供用于定量或測定前胃泌素水平的方法和材料來診斷肝病理。3. I.胃泌素和前胃泌素的背景胃泌素是腸肽激素，其作為胃酸分泌的刺激劑行使功能。在成體哺乳動物中，它主要由胃竇的G細(xì)胞產(chǎn)生，并且在小腸上部和胰臟內(nèi)產(chǎn)生的程度不同，在結(jié)腸內(nèi)幾乎沒有可檢測的量。最近，對在結(jié)腸直腸致癌作用中肽的胃泌素家族作用有越來越多的興趣。特別地，有證據(jù)表明以前被認(rèn)為是無活性的胃泌素的前體形式(前胃泌素和甘氨酸延伸的胃泌素)，在結(jié)直腸癌的發(fā)展中起作用。胃泌素基因被翻譯成101個氨基酸的多肽，稱作前胃泌素原，其包含信號序列(下劃線)，信號序列被切割，產(chǎn)生一個80個氨基酸的多肽前胃泌素。依次地，前胃泌素被加工以便提供裂解產(chǎn)物G34，其是相應(yīng)于前胃泌素殘基38至71的一個34個氨基酸的肽。然后G34在它的羧基末端用甘氨酸殘基延伸，產(chǎn)生甘氨酸延伸的胃泌素(G34-Gly)15前胃泌素切割的副產(chǎn)物是6個氨基酸的肽，稱作C末端側(cè)翼肽或者CTFP，其在序列中對應(yīng)于前胃泌素的殘基55到72并且稱作G17-Gly。G34-Gly和G17-Gly的C-末端甘氨酸的去除，接著C 一末端酰胺化，分別產(chǎn)生G34和G17,其都被C-末端酰胺化。大部分前胃泌素的測定法不能區(qū)分前胃泌素和其他的胃泌素基因產(chǎn)物，導(dǎo)致全長的前胃泌素水平的不準(zhǔn)確測量。因為前胃泌素水平在一種或者多種疾病中起作用，希望有用于測量前胃泌素的準(zhǔn)確方法。3.2.肝病理背景許多肝病理是很難診斷的。例如，通過常規(guī)的血液測試不能診斷肝癌。通常需要醫(yī)生用腫瘤標(biāo)記甲胎蛋白(AFP)篩查。然而，升高的AFP不是對肝癌特異的。在成人中，在三種情況下肝癌、生殖細(xì)胞腫瘤(睪丸和卵巢的癌癥)、肝的轉(zhuǎn)移癌(起源于其他器官的癌癥)可見高血液水平(超過500ng/mL)的AFP。此外，AFP對于肝癌的敏感性是約60%。換句話說，只有在約60%的肝癌患者中可見升高的AFP血液水平；40%的肝癌患者中具有正常的AFP水平。另一種難于診斷的肝病理是肝硬化，其是特征為肝斑痕形成和肝功能不全的慢性肝疾病的結(jié)果。診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是通過肝的活組織檢查，其是侵入性的技術(shù)。丙型肝炎是一種由丙型肝炎病毒(HCV)引起的影響肝的傳染病。這種感染通常是無癥狀的，但是一旦建立感染，慢性感染可以進(jìn)展到肝的斑痕形成(纖維化)并且晚期斑痕形成(硬化)。通常通過血清學(xué)的篩選診斷丙型肝炎。將期望檢測和/或證實丙型肝炎的其他手段。
因為肝癌、肝硬化和丙型肝炎的早期和準(zhǔn)確檢測具有增加患者存活率的可能，現(xiàn)在并且長期需要診斷或者檢測這些病理的方法，所述病理包括患者患有超過一種或者全部上述疾病的的情況。4.概述已經(jīng)發(fā)現(xiàn)盡管具有一種或者兩種肝病理的患者可以顯示出升高的人前胃泌素(hPG)水平，但是具有肝癌、丙型肝炎和肝硬化的患者顯示極其升高的hPG水平，其超過具有這些病癥的一種或者兩種的患者顯示出的hPG水平的僅僅相加的結(jié)果?；诒竟_，患者的hPG血漿或血清水平可以用于為肝病理分配危險度系數(shù)。此外，hPG的過量的血清或者血漿水平可用于診斷患有肝癌、丙型肝炎和肝硬化的患者。通過本公開的方法可以診斷的肝癌包括原發(fā)性肝癌(例如肝細(xì)胞癌，起源于肝的癌)和繼發(fā)性肝癌。本申請也提供了診斷方法，其中，如果檢測到了高于閾值(例如，至少約 400，450，500，550，600，650，700或者750pM)的人前胃泌素(hPG)水平，那么鑒定患者患有肝疾病。在具有比肝疾病平均發(fā)生率更高的群體中，例如，在吸毒者或者嗜酒者群體中或者居住在比肝疾病平均發(fā)生率更高的地理區(qū)域的人中，這種方法也可用作標(biāo)準(zhǔn)診斷。因此，也提供了在這些群體中檢測升高的hPG水平的方法?；诨颊叩膆PG水平，本公開也提供將患者分配至一種或者多種肝病理如肝癌(肝細(xì)胞癌)、丙型肝炎和肝硬化的風(fēng)險群體中的方法。例如，hPG的第一個閾值水平可以表明患者對于肝病理處于“低風(fēng)險”;hPG的第二個閾值水平可以表明患者對于肝病理處于“升高的風(fēng)險” ;hPG的第三個閾值水平可以表明患者對于肝病理處于“高風(fēng)險”，hPG的第四個閾值水平可以表明患者對于肝病理處于“嚴(yán)重風(fēng)險”。定量的hPG水平也可以與額外的生物標(biāo)記如甲胎蛋白(“AFP”)一起使用來幫助鑒定、診斷、區(qū)分肝病理或者對其進(jìn)行風(fēng)險分配。本文公開的方法可以用于確定合適的療程。在某些情況下，篩選已經(jīng)診斷為具有肝病理的患者以確定是否要保證進(jìn)一步的治療選項是有用的。因此，在某些方面，在患者生物學(xué)樣品的hPG水平的基礎(chǔ)上，將以前診斷為具有肝病理的患者診斷為患有另外的肝疾病。以前的肝病理可以是丙型肝炎、肝硬化或者肝癌如肝細(xì)胞癌。有利地，非常高的hPG水平(例如，在高于400、450、500、550、600、650、700pM的hPG濃度)表明患者具有全部這些疾病?？梢詫颊哌M(jìn)行進(jìn)一步的測試來鑒定具體的肝疾病，所述患者的hPG水平表明該患者患有肝病理，或者所述患者以前被診斷具有肝病理并且其hPG水平比一種肝疾病指示的更高?？梢詫λ龌颊邷y試肝癌、丙型肝炎或者肝硬化。使用本公開的方法已經(jīng)鑒定具有一種或者多種肝病理的患者，可以按照它們的病癥被治療。經(jīng)歷肝病理治療的患者也可以對他們的hPG水平進(jìn)行監(jiān)測來評估疾病的進(jìn)展和/或治療效果。hPG水平保持在閾值之上的患者可以繼續(xù)接受治療。在實施本文公開的方法中，如果測量的hPG水平是準(zhǔn)確的，那么測量hPG水平的具體測定法不是關(guān)鍵的。在一些實施方案中，將抗_hPG抗體方便地用于測量hPG水平。如提到的，hPG被機(jī)體切割成更小的肽。優(yōu)選地，在本公開的方法中，使用不檢測出前胃泌素加工的副產(chǎn)物的測定法來檢測和測量hPG以避免不準(zhǔn)確的hPG測量。通過使用與全長hPG結(jié)合但不與更小的hPG肽結(jié)合的抗體可以實現(xiàn)此目的。通過使用兩種不同的抗體也可以實現(xiàn)此目的，所述抗體都與全長hPG結(jié)合，但是在所述兩種抗體與較小的hPG肽結(jié)合的程度上，不與相同的較小的hPG肽結(jié)合。在這種測定法中，兩種抗體都結(jié)合的唯一產(chǎn)物是全長hPG。例如，與hPG的C末端和N末端表位結(jié)合的抗體允許檢測和測量全長hPG，而不檢測和測量較小的hPG肽。因此，在某些方面，本公開提供診斷患者的方法，其中生物學(xué)樣品與第一抗體接觸，所述第一抗體結(jié)合hPG的第一表位，優(yōu)選地C末端或者N末端表位，并且與第二抗體接觸，所述第二抗體結(jié)合hPG的不同的表位，優(yōu)選地在另一末端的表位。在使用抗hPG的抗體來檢測和測量hPG的示例性方法中，通過將來自患者的樣品接觸至少一種抗hPG抗體，并且基于與抗體結(jié)合的hPG的量，確定樣品是否具有高于閾值的hPG濃度，例如，至少約400、450、500、550、或者600pM，通常400、450或者500pM，鑒定患者患有肝疾病。本公開的方法通常包括測定生物學(xué)樣品的hPG水平。所述生物學(xué)樣品可以是血漿或者血清。也可以使用組織水平；然而，當(dāng)患者患有肝病理時，預(yù)期組織中的測量的hPG水平與血清或者血漿中發(fā)現(xiàn)的hPG水平不同，而是其相對于患者正常的hPG水平將升高。從·而，hPG的組織水平也可以用于監(jiān)測患者的肝病理的風(fēng)險或者狀態(tài)。當(dāng)使用組織樣品時，使用在細(xì)胞或者組織提取物上進(jìn)行的免疫測定，或者可以利用免疫組織化學(xué)技術(shù)，使用標(biāo)記有可檢測標(biāo)記的多克隆或者單克隆抗體可以檢測前胃泌素。免疫組織化學(xué)技術(shù)提供前胃泌素水平的定性測量。合適的可檢測標(biāo)記包括放射性標(biāo)記(如放射性的碘)、熒光標(biāo)記或者化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。本文也提供診斷試劑盒。診斷試劑盒可以包含，例如任選地標(biāo)記有可檢測標(biāo)記的針對前胃泌素的一種或者多種抗體，所述抗體可以用于篩選、診斷或者區(qū)分肝病理。診斷試劑盒可以包含具有對hPG的N末端肽區(qū)域親和力的第一抗體，以及具有對不同的表位如hPG的C末端肽區(qū)域的親和力的第二抗體。本公開也提供用于進(jìn)行診斷肝病理的方法的試劑盒，其包含N末端抗hPG單克隆抗體和單克隆或者多克隆的C末端抗hPG抗體，以及合適的試劑，所述每種抗體在單獨(dú)的容器中。在一些實施方案中，提供的抗體中的一種或者兩種都被標(biāo)記。也提供診斷患者是否患有多種肝疾病的方法，其中，例如通過使用生化測定法測試來自患者的血清或者血漿的hPG水平，將具有至少約400pM的血液hPG濃度的患者鑒定為具有下面疾病中的兩種或者以上丙型肝炎、肝癌或者肝硬化。在鑒定了這種患者后，使用用于丙型肝炎、肝癌或者肝硬化的測定法可以進(jìn)一步診斷患者的肝病理。使用基于核酸的測定法可以診斷丙型肝炎。使用射線照相術(shù)或者成像技術(shù)(用或者不用對照)可以診斷肝癌。通過測試來自所述患者的樣品的纖維化的一種或者多種血清標(biāo)記可以診斷肝硬化，所述標(biāo)記包括α-2巨球蛋白、觸珠蛋白、脫脂載脂蛋白Al、Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、總膽紅素和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)。患者可以具有其他的診斷上的重要標(biāo)記，如升高的甲胎蛋白和/或脫Y羧基凝血酶原，并且診斷或者治療的方法可以進(jìn)一步地包括測量這些水平的步驟。在診斷后，可以使用常規(guī)試劑對患者的肝疾病治療，例如可以用聚乙二醇化的干擾素a _2a、聚乙二醇化的干擾素a _2b和/或病毒藥物利巴韋林治療具有丙型肝炎的患者；可以使用肝移植手術(shù)和用于肝硬化的并發(fā)癥的癥狀治療來治療肝硬化患者；可以用放射療法和/或化學(xué)療法治療診斷為肝癌的患者。
使用本公開的技術(shù)也可以監(jiān)測患者。在一種方法中，通過對患有肝疾病并且具有在閾值量之上的血液hPG濃度的患者，進(jìn)行用于所述肝疾病的治療方案監(jiān)測患有肝疾病的患者的疾病狀態(tài)。在治療后，確定所述患者是否仍然具有閾值量之上的血液hPG濃度，并且如果是，那么繼續(xù)進(jìn)行治療方案。如果患者不再具有閾值量之上的血液hPG濃度，那么可以定期監(jiān)測患者的hPG水平以確定其是否上升到所述閾值量之上，允許重新開始治療。也提供了診斷患者的肝健康狀況的系統(tǒng)。本公開的系統(tǒng)包含一種或者多種以下的組分接收患者血液hPG濃度值的輸入裝置，處理器，其配置成比較患者血液hPG濃度與參照血液hPG濃度，處理器，其配置成完全或者部分基于患者血液hPG濃度輸出患者的肝病理的風(fēng)險水平和顯示器，其配置成顯示肝病理的風(fēng)險水平。可以修改系統(tǒng)以便處理器輸出對肝病理的低的、升高的、高的或者嚴(yán)重的風(fēng)險水平測定。系統(tǒng)也可以包含接收患者甲胎蛋白(AFP)水平的輸入裝置，其中處理器被配置成比較AFP水平與參照AFP水平并且基于hPG和AFP水平輸出肝病理的風(fēng)險水平。本文公開了不同的風(fēng)險組的閾值(i)hPG以及(ii)hPG和AFP水平。 也提供計算機(jī)可讀存貯介質(zhì)，其中儲存了代表通過經(jīng)編程的處理器可執(zhí)行的指令的數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)用于診斷患者的肝健康狀況，存儲介質(zhì)包含用于比較患者的血液hPG濃度與參照血液hPG濃度的指令；以及完全或者部分基于患者血液hPG濃度輸出患者肝病理的風(fēng)險水平。介質(zhì)可以輸出肝病理的風(fēng)險水平，例如，低、升高的、高或者嚴(yán)重的風(fēng)險水平測定。介質(zhì)也可以包含用于比較患者的血液AFP水平與參照水平的數(shù)據(jù)用于輸出風(fēng)險水平測定。本文公開了不同風(fēng)險組的閾值(i)hPG以及(ii)hPG和AFP水平。附圖
簡述圖I提供前胃泌素原(其中在信號肽處有下劃線)、前胃泌素和前胃泌素加工的產(chǎn)物的氨基酸序列，所述前胃泌素加工的產(chǎn)物包括G34、G34-Gly, G17, G17-Gly和C-末端側(cè)翼肽CTFP。圖2提供指示某些肝病理的hPG值的條形圖。附圖3A-3L提供示例性的小鼠抗_hPG單克隆抗體的VH和VL鏈的多肽和相應(yīng)的多核苷酸序列。圖3A顯示抗-hPG MAb3的多核苷酸(SEQ ID NO: 16)和多肽(SEQ ID NO: 12)小鼠VH鏈，并且圖3B顯示抗-hPG的MAb3的多核苷酸(SEQ ID NO: 17)和多肽(SEQ ID NO: 13)小鼠VL鏈。圖3C 顯示抗-hPG 的 MAb4 的多核苷酸(SEQ ID NO: 18)和多肽(SEQ ID NO: 14)小鼠VH鏈，并且圖3D顯示抗-hPG的MAb4的多核苷酸(SEQ ID NO: 19)和多肽(SEQ IDNO: 15)小鼠VL鏈。圖3E顯示抗-hPG的MAb8的多核苷酸(SEQ ID NO:67)和多肽(SEQ ID NO: 59)小鼠VH鏈，并且圖3F顯示抗-hPG的MAb8多核苷酸(SEQ ID NO: 71)和多肽(SEQ ID NO: 63)的小鼠VL鏈。圖3G 顯示抗-hPG 的 MAbl3 的多核苷酸(SEQ ID NO:68)和多肽(SEQ ID NO:60)小鼠VH鏈，并且圖3H顯示抗-hPG的MAbl3的多核苷酸(SEQ ID NO: 72)和多肽(SEQ IDNO: 74)小鼠VL鏈。圖31 顯示抗-hPG 的 MAbl6 的多核苷酸(SEQ ID NO:69)和多肽(SEQ ID N0:61)小鼠VH鏈，并且圖3J顯示抗-hPG的MAbl6的多核苷酸(SEQ ID NO: 73)和多肽(SEQ IDNO:65)小鼠VL鏈。圖3K 顯示抗-hPG 的 MAbl9 的多核苷酸(SEQ ID NO: 70)和多肽(SEQ ID NO:62)小鼠VH鏈，并且圖3L顯示抗-hPG的MAbl9的多核苷酸(SEQ ID NO: 74)和多肽(SEQ IDNO:66)小鼠VL鏈。圖4A-4Z提供示例性的人抗-hPG的單克隆抗體的VH和VL鏈的多肽序列。圖4A顯示抗hPG的MAb3的多肽(SEQ ID NO: 21)人VH鏈并且圖4B顯示抗hPG的 MAb3 的多肽(SEQ ID NO: 22)人 VL 鏈。圖4C顯示抗hPG的MAb4的多肽(SEQ ID NO: 23)人VH鏈并且圖4D顯示抗hPG的 MAb4 的多肽(SEQ ID NO: 24)人 VL 鏈。
圖4E顯示抗hPG的MAb8(a)的多肽(SEQ ID NO: 75)人VH鏈并且圖4F顯示抗hPG 的 MAb8(a)的多肽(SEQ ID NO: 76)人 VL 鏈。圖4G顯示抗hPG的MAb8(b)的多肽(SEQ ID NO: 77)人VH鏈并且圖4H顯示抗hPG 的 MAb8(b)的多肽(SEQ ID NO: 78)人 VL 鏈。圖41顯示抗hPG的MAb8(c)的多肽(SEQ ID NO: 79)人VH鏈并且圖4J顯示抗hPG 的 MAb8(c)的多肽(SEQ ID NO: 76)人 VL 鏈。圖4K顯示抗hPG的MAb13 (a)的多肽(SEQ ID NO: 80)人VH鏈并且圖4L顯示抗hPG 的 MAbl3(a)的多肽(SEQ ID NO:81)人 VL 鏈。圖4M顯示抗hPG的MAb13 (b)的多肽(SEQ ID NO: 82)人VH鏈并且圖4N顯示抗hPG 的 MAbl3(b)的多肽(SEQ ID NO:83)人 VL 鏈。圖40顯示抗hPG的MAb 16 (a)的多肽(SEQ ID NO: 84)人VH鏈并且圖4P顯示抗hPG 的 MAbl6(a)的多肽(SEQ ID NO:85)人 VL 鏈。圖4Q顯示抗hPG的MAbl6 (b)的多肽(SEQ ID NO: 86)人VH鏈并且圖4R顯示抗hPG 的 MAbl6(b)的多肽(SEQ ID NO:87)人 VL 鏈。圖4S顯示抗hPG的MAbl6(c)的多肽(SEQ ID NO: 88)人VH鏈并且圖4T顯示抗hPG 的 MAbl6(c)的多肽(SEQ ID NO:89)人 VL 鏈。圖4U顯示抗hPG的MAbl9 (a)的多肽(SEQ ID NO:90)人VH鏈并且圖4V顯示抗hPG 的 MAbl9(a)的多肽(SEQ ID NO:91)人 VL 鏈。圖4W顯示抗hPG的MAbl9 (b)的多肽(SEQ ID NO: 92)人VH鏈并且圖4X顯示抗hPG 的 MAbl9(b)的多肽(SEQ ID NO:93)人 VL 鏈。圖4Y顯示抗hPG的MAbl9(c)的多肽(SEQ ID NO: 94)人VH鏈并且圖4Z顯示抗hPG 的 MAbl9(c)的多肽(SEQ ID NO:95)人 VL 鏈。5.發(fā)明詳述5. I.定義除非另外指出，以下的術(shù)語意在具有它們的普通含義，在本公開的上下文中在下面討論所述含義“人前胃泌素”或者“hPG”是鑒定為SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的多肽。如本文使用的，hPG被定義為包含胃泌素基因的主要蛋白質(zhì)產(chǎn)物；即，沒有信號肽或者前肽的前胃泌素原。見 Rehfeld 等人·(2004) Regulatory Peptides 120 (1-3) : 177-183。hPG 由兩個d-精氨酸切割位點(diǎn)分開的三種界限清楚的區(qū)域組成。因此，除非另外指出，hPG由前胃泌素原加工的產(chǎn)物組成，所述hPG保留兩個d-精氨酸位點(diǎn)。hPG不包括“胃泌素類”，即G34和G17，但是可以包含，例如保留位于氨基酸36/37和73/74上或者附近的兩個d_精氨酸位點(diǎn)的hPG的短的截短物(多達(dá)1，2，3，4或者5個氨基酸)或者變體。見圖I。“生物學(xué)標(biāo)記”或者“生物標(biāo)記”指的是一種特征，其被客觀地測量和評估，作為正常生物過程，致病過程或者對治療干預(yù)的藥理學(xué)反應(yīng)的指標(biāo)?！皧A層測定法”指的是特定類型的免疫測定法，其可被用于對與樣品相互作用的化合物的量定量。夾層測定法被如此稱謂是因為在捕獲抗體和檢測或者參考抗體之間結(jié)合樣品的抗原。在本公開的夾層測定法中，在抗_hPG抗體之間結(jié)合人前胃泌素。該測定提供了hPG而不是它的前體或者產(chǎn)物的定量，因此提供了 hPG濃度的更準(zhǔn)確的測量。有利地，本公開的針對前胃泌素的N-末端或者C-末端區(qū)域的抗體也分別對前胃泌素特異。因此，胃泌素原的較小的加工片段不太可能作為一種或者其他抗體的競爭者從而可能使測定的結(jié)果有偏差。
“受試者”或者“患者”在本文可互換使用，其指的是脊椎動物，優(yōu)選的是哺乳動物，更優(yōu)選的是人?！翱贵w”或“Ab”是指特異地結(jié)合特定抗原，或與特定抗原起免疫學(xué)反應(yīng)的免疫球蛋白分子，其包括多克隆抗體、單克隆抗體、基因工程抗體和其他修飾形式的抗體，所述修飾形式的抗體包括但不限于嵌合抗體、人源化抗體和抗體的抗原結(jié)合片段，包括例如，F(xiàn)ab’、F(ab，)2、Fab、Fv、rlgG和scFv片段。在多種實施方案中，抗_hPG單克隆抗體包含抗體恒定區(qū)的全部或者部分。在一些實施方案中，恒定區(qū)是選自IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD,IgE, IgG(例如，IgGp IgG2, IgG3或IgG4)和IgM的同種型?？梢詮囊恍┪锓N的任一種產(chǎn)生抗體(包括單克隆抗體)，所述物種包括但不限于小鼠、兔、大鼠、豬、豚鼠、雞、驢、馬、駱駝和駱馬。如本文使用，如果抗體與全長的前胃泌素結(jié)合，但是它根本不結(jié)合CTFP、酰胺化胃泌素或者甘氨酸延伸的胃泌素，那么所述抗體對hPG是“高度特異的”，并且如果抗體顯示與hPG結(jié)合比與CTFP以及胃泌素基因其他的產(chǎn)物結(jié)合至少強(qiáng)約5-倍(如在標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測定法中測量)，那么其是“對hPG特異”或者“特異地與hPG結(jié)合”。在實施例4中提供了可以用于評估特定的抗_hPG抗體的特異性的ELISA測定法。這種特異的抗-hPG抗體(本文指的是“抗hPG的抗體”)可以是多克隆的(“抗-hPGPAbs”)或者單克隆的(“抗-hPGMAbs”)，盡管對于治療應(yīng)用和某些情況下，診斷或者其他的體外應(yīng)用，單克隆抗體是優(yōu)選的。本文使用的術(shù)語“單克隆抗體”不限于通過雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的抗體。單克隆抗體是通過本領(lǐng)域可獲得的或者已知的任何手段，來源于包括任一真核克隆，原核克隆，或噬菌體克隆的單一克隆的抗體。使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)，包括使用雜交瘤、重組技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)，或它們的組合可以制備本公開中有用的單克隆抗體。在本公開的許多應(yīng)用中，包括抗_hPG的單克隆抗體在人中的體內(nèi)應(yīng)用和體外檢測測定，可以適當(dāng)使用嵌合的、靈源化的(primatized)、人源化的或人抗體。術(shù)語“ scFv"指的是單鏈Fv抗體，其中已經(jīng)將重鏈的可變區(qū)和來自常規(guī)抗體的輕鏈連接以形成一條鏈。
對“VH”的參考指的是抗體的免疫球蛋白重鏈的可變區(qū)，所述重鏈包括Fv、scFv或者Fab的重鏈。對“VL”的參考指的是免疫球蛋白輕鏈的可變區(qū)，所述輕鏈包括Fv、scFv、dsFv或者Fab的輕鏈。抗體(Abs)和免疫球蛋白(Igs)是具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白。然而抗體顯示對特定的靶標(biāo)的結(jié)合特異性，免疫球蛋白包括抗體和缺少靶特異性的其他抗體-樣的分子。天然抗體和免疫球蛋白通常是約150，000道爾頓的異源四聚體糖蛋白，其由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(L)鏈組成。每條重鏈在一端具有可變結(jié)構(gòu)域(VH)，緊接著是幾個恒定結(jié)構(gòu)域。每條輕鏈在一端具有可變結(jié)構(gòu)域(VL)，在它的另一端是恒定結(jié)構(gòu)域。本公開的抗-hPG單克隆抗體包含“互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rs) ”。也已知⑶Rs是輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的高變區(qū)。將可變結(jié)構(gòu)域的更高度保守的部分稱作構(gòu)架(FR)。本領(lǐng)域已知，取決于背景和本領(lǐng)域已知的多種定義，劃定抗體高變區(qū)的氨基酸位置/邊界可以不同。可以將在可變結(jié)構(gòu)域中的一些位置看作雜合高變位置，原因在于，在一套標(biāo)準(zhǔn)下，可以認(rèn)為這些位置在高變區(qū)內(nèi)，然而在一套不同的標(biāo)準(zhǔn)下，認(rèn)為這些位置在高變區(qū)之外。在延伸的高變區(qū)中也可以發(fā)現(xiàn)這些位置中的一種或者多種。本公開提供了包含在這些雜合高變位·置中修飾的抗體。每種天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包含四種主要采用β_折疊構(gòu)型的通過三個⑶R連接的FR區(qū)，所述⑶R形成環(huán)連接，并且在一些情況下形成β -折疊結(jié)構(gòu)的部分。每條鏈中的⑶Rs通過FR區(qū)很接近地結(jié)合在一起，并且其與來自其他鏈的⑶Rs —起有助于形成抗體的祀結(jié)合位點(diǎn)(見Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987)。術(shù)語“表位”指的是蛋白質(zhì)的任一部分(決定簇)，其能引起免疫反應(yīng)并且被抗體特異地結(jié)合。表位決定簇通常由分子的活性表面定組如氨基酸或者GAG側(cè)鏈組成，并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電荷特征。如果蛋白質(zhì)中的氨基酸突變降低或者消除了其與一種抗體的結(jié)合，也降低或者消除了其與另一種抗體的結(jié)合，和/或者如果抗體競爭結(jié)合蛋白質(zhì)，即一種抗體與蛋白質(zhì)的結(jié)合降低或者消除了另一種抗體與該蛋白質(zhì)的結(jié)合，那么所述的兩種抗體結(jié)合基本相同的蛋白質(zhì)表位(或者蛋白質(zhì)的重疊表位)。通過本領(lǐng)域已知的方法，如競爭測定法實現(xiàn)確定兩種抗體是否基本上與相同的表位結(jié)合。在對照抗體(例如，本文描述的一種抗-前胃泌素抗體)和任一測試抗體之間進(jìn)行抗體競爭研究，可以首先用可檢測的標(biāo)記如生物素、酶、放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記來標(biāo)記對照抗體以便能進(jìn)行隨后的鑒定。與對照(標(biāo)記的)抗體結(jié)合基本相同的表位的測試(未標(biāo)記的)抗體應(yīng)該能封閉對照抗體的結(jié)合并且因此應(yīng)該降低對照抗體的結(jié)合。“特異針對hPG的測定”或者“特異針對人前胃泌素的測定”指的是區(qū)分全長的hPG和胃泌素基因的其他產(chǎn)物的測定。在基于抗體的診斷測定的背景下，特異針對hPG的測定可以利用特異結(jié)合hPG的抗體。備選地，特異針對hPG的測定可以利用都與全長的hPG結(jié)合但是都不與相同的胃泌素基因產(chǎn)物結(jié)合的兩種抗體，以致hPG是由胃泌素基因產(chǎn)生且被兩種抗體識別的唯一分子。例如，可將結(jié)合hPGC-末端和N-末端表位的幾種抗體用在區(qū)分hPG和其他的胃泌素基因肽的測定中。在使用術(shù)語癌方面，需注意的是在患者中，來自原發(fā)性(原始)腫瘤的細(xì)胞已經(jīng)逃脫，并且通常通過淋巴或者血液，經(jīng)由稱作“轉(zhuǎn)移”的過程轉(zhuǎn)移到機(jī)體內(nèi)的另一個位置，以形成另一個轉(zhuǎn)移(或者繼發(fā)性)腫瘤，不考慮它的新的位置，繼發(fā)性或者轉(zhuǎn)移腫瘤通常是和原始腫瘤相同的類型，從而該疾病被稱作轉(zhuǎn)移癌，而不是新的居住組織的癌。例如，已經(jīng)擴(kuò)散到肝的胰腺癌是轉(zhuǎn)移的胰腺癌，不是肝癌。因此，轉(zhuǎn)移的肝細(xì)胞癌指的是起源于肝中并且轉(zhuǎn)移到別處的癌?；趆PG的過量水平也可以診斷繼發(fā)性肝癌(即已經(jīng)轉(zhuǎn)移至肝中的非肝來源的轉(zhuǎn)移癌)。例如，已經(jīng)轉(zhuǎn)移到肝中的結(jié)直腸癌(即轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌)是繼發(fā)性肝癌的形式。換句話說，在原發(fā)性和繼發(fā)性肝癌中，使用血清、血漿或者組織中的hPG水平，可以檢測肝中的癌。
5. 2.前胃泌素水平和肝病理一般認(rèn)為正常的前胃泌素水平低于20至50pM，通常在O和5pM之間。本公開證明具有一種或者兩種肝病理的患者可以顯示升高的人前胃泌素(hPG)水平，并且具有肝癌、丙型肝炎和肝硬化的患者顯示出極度升高的hPG水平。圖2圖示性地說明具有一種或者以上肝病理的患者中的hPG水平，其通過ELISA-夾層測定法使用抗-hPG抗體測定。方框區(qū)域的外部邊界指示第25至第75百分位。須指示第5至第95百分位。單條線代表中位數(shù)。點(diǎn)指示異常值。下表總結(jié)第5至第95百分位的數(shù)據(jù)表I
具有肝病理的患者中的前y泌素水平(p!V1)(5—艿百分位)
___肝硬化_
_O 至 l_C20>f__10 至 7_(_)_
肝癌和丙型肝炎肝癌，丙型肝炎和肝硬化10 至 500(50) 150 至 20_(1300-14_)_f括號中的值指示平均hPG水平_基于前述，50pM或者IOOpM之上的hPG水平可以指示一種或者多種肝病理。至少約400pM、500pM或者600pM的hPG水平有特別的診斷重要性，因為它們強(qiáng)烈地指示多種肝病理，特別是肝癌和肝硬化、肝癌和丙型肝炎，以及肝癌、肝硬化和丙型肝炎的存在。在測量總前胃泌素水平(即全長的前胃泌素和裂解產(chǎn)物的水平)的研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)只具有丙型肝炎的患者的血衆(zhòng)水平與健康人相似。Konturek等人，2003，Scand JGastroenterol 6:643-647。預(yù)期只患有丙型肝炎的患者的全長前胃泌素水平非常低。前胃泌素水平可以用于分配風(fēng)險點(diǎn)得分和相應(yīng)的疾病風(fēng)險概率。對于用于分配患有終末期肝疾病的患者的死亡風(fēng)險的模型的實例，參見Kamath等人.(2001)Hepatology33(2):464-70。使用將測定的前胃泌素水平與肝疾病狀態(tài)相關(guān)的經(jīng)驗數(shù)據(jù)，從生物標(biāo)記，如前胃泌素，以及任選的其他的生物學(xué)標(biāo)記水平可以取得點(diǎn)得分和相關(guān)的疾病風(fēng)險概率。使用四個風(fēng)險組低風(fēng)險、升高的風(fēng)險、高風(fēng)險和嚴(yán)重風(fēng)險可以定性地描述疾病風(fēng)險概率。在本公開中提到的風(fēng)險水平具有下面的含義
O “低風(fēng)險”意味著患者的生物學(xué)標(biāo)記水平指示不存在給定的肝病理?！吧叩娘L(fēng)險”意味著患者的生物學(xué)標(biāo)記水平指示給定的肝病理的風(fēng)險增加。該風(fēng)險是有必要進(jìn)一步測試的量值。O “高風(fēng)險”意味著患者的生物標(biāo)記水平指示給定的肝病理的風(fēng)險大大增加。該風(fēng)險是需要進(jìn)一步測試的量值?；谏飳W(xué)標(biāo)記特異性的試驗性診斷可能是有理由的。〇“嚴(yán)重風(fēng)險”意味著患者的生物學(xué)標(biāo)記水平明顯地不正常并且指示潛在的病理?？梢赃M(jìn)行生物標(biāo)記特異性的診斷。具有低于OpM至IOOpM的血清或者血衆(zhòng)前胃泌素水平的患者具有被診斷為肝癌如肝細(xì)胞癌和肝硬化的低風(fēng)險，并且具有被診斷為肝癌、肝硬化和丙型肝炎的全部三種的極低風(fēng)險。具有正常血清或者血漿前胃泌素水平(例如，O至5pM)或者輕微升高的水平(多達(dá)IOOpM)的患者仍然可能具有肝癌。因此，建議進(jìn)一步測試具有IOOpM或者更低的血清或者血漿hPG水平的患者以評估其是否具有肝癌?！ぞ哂蠭OOpM至400pM之間的血清或者血漿前胃泌素水平的患者不太可能只患有肝癌而沒有其他的肝病理。這種患者具有患有肝硬化(有或者沒有肝癌)的高風(fēng)險，并且另外具有丙型肝炎的升高的風(fēng)險。具有400pM之上的血清或者血漿前胃泌素水平的患者處于具有肝癌、丙型肝炎和肝硬化的嚴(yán)重風(fēng)險。在多種診斷方法中可以使用患者的hPG水平和肝病理狀態(tài)之間的關(guān)系。診斷方法一般需要將患者樣品中的hPG水平與正常的hPG值，例如與來自健康個體或者健康個體池的hPG水平比較。如果hPG水平升高了，例如在上文提供的風(fēng)險分配的基礎(chǔ)上，升高的水平與可能的肝病理相關(guān)聯(lián)。這種方法任選地包括這樣的步驟，其中患者提供體液樣品。然后，優(yōu)選地通過生物化學(xué)測定可以分析體液的hPG水平。在某些應(yīng)用中，測試患者的癌標(biāo)記水平連同患者的hPG水平可以用于增加患者中的肝癌標(biāo)記的特異性，或者用于分配風(fēng)險點(diǎn)得分和相應(yīng)的疾病風(fēng)險概率。優(yōu)選的第二標(biāo)記是甲胎蛋白(AFP)。血清AFP，一種胎兒特異的糖蛋白抗原，是用于測定患者具有肝癌例如肝細(xì)胞癌的最廣泛使用的腫瘤標(biāo)記。AFP用于檢測肝細(xì)胞癌的已報告的靈敏度在乙型肝炎病毒(HBV)陽性和HBV陰性群體中有很大不同，這歸因于在篩選和診斷研究設(shè)計之間的重疊。當(dāng)使用AFP篩選高風(fēng)險群體時，已經(jīng)報告了 39%至97%的靈敏度，76%至95%的特異性和9%至32%的陽性預(yù)測值(PPV)。AFP不是對肝癌特異的。在急性或者慢性肝炎中，妊娠中和生殖組織腫瘤的存在下，AFP的滴度也升高了?；趆PG水平連同AFP水平，下表指示了對給定肝病理的相對風(fēng)險。在hPG和AFP水平的基礎(chǔ)上比僅在AFP的基礎(chǔ)上相對風(fēng)險的分配提供了對肝病理的更靈敏和更準(zhǔn)確的測試。表權(quán)利要求
1.診斷患者是否患有肝疾病的方法，其包括通過生物化學(xué)測定法測定在來自患者的樣品中至少約400pM的人前胃泌素(hPG)濃度的步驟。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述患者具有選自由肝癌、丙型肝炎和肝硬化組成的組的一種或者兩種疾病。
3.權(quán)利要求I或者權(quán)利要求2的方法，其中所述肝癌是肝細(xì)胞癌。
4.權(quán)利要求I至3中任一項的方法，其中所述濃度是至少約500pM。
5.權(quán)利要求I至4中任一項的方法，其中所述測定包括來自所述患者樣品中的hPG與至少一種抗體的結(jié)合。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述測定包括來自所述患者的樣品中的hPG與多種抗體的彡口口
7.權(quán)利要求I至6中任一項的方法，其中所述患者屬于具有比丙型肝炎的平均發(fā)生率更高發(fā)生率的群體。
8.權(quán)利要求I至7中任一項的方法，其中所述患者居住在具有比丙型肝炎的平均發(fā)生率更高發(fā)生率的地理區(qū)域。
9.權(quán)利要求I至8中任一項的方法，其中所述患者具有藥物或者酒精依賴性狀況。
10.診斷患者是否患有肝疾病的方法，其包括步驟 Ca)將來自患者的樣品接觸至少一種抗-hPG抗體；和 (b)基于與所述至少一種抗體結(jié)合的hPG的量測定樣品是否具有至少約400pM的hPG濃度。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述樣品與特異針對hPG的第一表位的第一抗體以及特異針對hPG的不同表位的第二抗體接觸。
12.權(quán)利要求10或權(quán)利要求11的方法，其中所述抗體的一種帶有可檢測的標(biāo)記并且通過對所述可檢測標(biāo)記的水平定量測定結(jié)合的hPG的水平。
13.權(quán)利要求10至12任一項的方法，其中所述患者屬于具有比丙型肝炎的平均發(fā)生率更高發(fā)生率的群體。
14.權(quán)利要求10至13任一項的方法，其中所述患者居住在具有比丙型肝炎的平均發(fā)生率更高發(fā)生率的地理區(qū)域。
15.權(quán)利要求10至14任一項的方法，其中所述患者具有藥物或者酒精依賴性狀況。
16.診斷患者是否患有肝疾病的方法，其中患者已經(jīng)被診斷具有除了丙型肝炎以外的肝病理，所述方法包括測定來自所述患者的樣品中的人前胃泌素(hPG)水平的步驟，其中如果前胃泌素水平高于閾值，那么表明患者患有丙型肝炎。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述閾值是至少400pM。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述患者屬于具有比丙型肝炎的平均發(fā)生率更高發(fā)生率的群體。
19.權(quán)利要求16的方法，其中所述患者居住在具有比丙型肝炎的平均發(fā)生率更高發(fā)生率的地理區(qū)域。
20.權(quán)利要求16的方法，其中所述患者具有藥物或者酒精依賴性狀況。
21.診斷患者是否患有肝疾病的方法，其中所述患者已經(jīng)被診斷具有第一肝病理，所述方法包括測定來自所述患者樣品中的人前胃泌素(hPG)水平的步驟，其中如果前胃泌素水平高于閾值，那么表明所述患者患有至少一種額外的肝病理。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述閾值是至少400pM。
23.權(quán)利要求21或權(quán)利要求22的方法，其中所述患者屬于具有比丙型肝炎的平均發(fā)生率更高發(fā)生率的群體。
24.權(quán)利要求21至23中任一項的方法，其中所述患者居住在具有比丙型肝炎的平均發(fā)生率更高發(fā)生率的地理區(qū)域。
25.權(quán)利要求21至24中任一項的方法，其中所述患者具有藥物或者酒精依賴性狀況。
26.診斷患者是否患有肝疾病的方法，其包括使用生物化學(xué)測定檢測來自被診斷具有第一種肝病理的患者的樣品中人前胃泌素(hPG)水平的步驟，所述人前胃泌素水平指示多種肝病理。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述第一種肝病理選自由肝硬化、丙型肝炎和肝細(xì)胞癌組成的組。
28.權(quán)利要求26或27中的任一項的方法，其中所述水平是至少400pM。
29.權(quán)利要求26至28中任一項的方法，其中所述患者屬于具有比丙型肝炎的平均發(fā)生率更高發(fā)生率的群體。
30.權(quán)利要求26至29中任一項的方法，其中所述患者居住在具有比丙型肝炎的平均發(fā)生率更高發(fā)生率的地理區(qū)域。
31.權(quán)利要求26至30中任一項的方法，其中所述患者具有藥物或者酒精依賴性狀況。
32.檢測至少具有一種非肝病理的患者的肝病理的發(fā)展的方法，其包括使用生物化學(xué)測定檢測來自患者的樣品中的指示所述肝病理的發(fā)展的人前胃泌素(hPG)水平的步驟。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述患者以前已經(jīng)被診斷具有一種或者多種肝病理。
34.權(quán)利要求32或權(quán)利要求33的方法，其中所述hPG的指示水平是至少約400pM。
35.檢測被診斷患有癌的患者的肝病理發(fā)展的方法，其包括使用生物化學(xué)測定檢測來自所述患者的樣品中人前胃泌素(hPG)水平的步驟，所述人前胃泌素水平指示所述肝病理。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述患者以前已經(jīng)被診斷具有一種或者多種肝病理。
37.權(quán)利要求35或權(quán)利要求36的方法，其中所述hPG的指示水平是至少約400pM。
38.診斷患者是否患有多種肝疾病的方法，其包括以下步驟 Ca)鑒定具有至少約400pM的血液hPG濃度的患者； (b)測試所述患者以下疾病的至少兩種 i)肝癌，使用射線照相術(shù)或者成像技術(shù)； ii)丙型肝炎病毒，使用基于核酸的測定；和 iii)肝硬化，通過測試來自所述患者的血液樣品中纖維化的一種或者多種血清標(biāo)記， 從而診斷患者是否患有多種肝疾病。
39.確定患者的多種肝疾病風(fēng)險的方法，其包括 (a)通過生物化學(xué)測定確定患者的血清或者血漿hPG水平；和， (b)在(a)的基礎(chǔ)上，向患者分配一種或者多種肝病理的相對風(fēng)險，其中 i)低于IOOpM的hPG水平表明患者對一種或者多種肝病理是處于“低風(fēng)險”的； ii)IOOpM和400pM之間的hPG水平表明患者對有或者沒有肝癌的肝硬化是處于“高風(fēng)險”，并且患者對具有丙型肝炎處于“升高的風(fēng)險”，和iii)高于400pM的hPG水平表明患者對具有肝癌、肝硬化和丙型肝炎是處于“嚴(yán)重的風(fēng)險”; (c)其中如果所述患者具有低于IOOpM的hPG水平，那么使用其他的診斷手段任選地進(jìn)一步測試所述患者以證實所述患者不具有肝癌；并且 (d)其中如果所述患者具有IOOpM到400pM之間的hPG水平，那么任選地使用用于肝癌和/或丙型肝炎的其他診斷方法進(jìn)一步測試所述患者。
40.確定患者對肝病理的風(fēng)險的方法，其包括 (a)通過生物化學(xué)測定確定患者的血液hPG水平； (b)通過生物化學(xué)測定確定患者的血液甲胎蛋白(“AFP”)水平；和 (c)在(a)和(b)的基礎(chǔ)上，向患者分配肝病理的相對風(fēng)險，其中 i)hPG和AFP的第一個閾值水平表明患者對肝病理是處于“低風(fēng)險”的； ii)hPG和AFP的第二個閾值水平表明患者對肝病理是處于“升高的風(fēng)險”的； iii)hPG和AFP的第三個閾值水平表明患者對肝病理是處于“高風(fēng)險”的； iv)hPG和AFP的第四個閾值水平表明患者對肝病理是處于“嚴(yán)重風(fēng)險”的； 其中所述第一、第二、第三和/或第四個閾值水平任選地是在表2中顯示的用于相應(yīng)風(fēng)險水平的那些，例如其中所述第一閾值水平是O至IOOpM的hPG水平和251至500pM的AFP水平，或者是100至400pM的hPG水平和51至250pM的AFP水平。
41.監(jiān)測具有肝疾病的患者的疾病狀態(tài)的方法，所述方法包括 (a)對患有肝疾病或者具有高于閾值量的血液hPG濃度的患者進(jìn)行用于所述肝疾病的治療方案； (b)在步驟(a)之后，確定所述患者是否繼續(xù)具有高于閾值量的血液hPG濃度；并且 (c)如果所述患者繼續(xù)具有高于閾值量的hPG濃度，那么繼續(xù)治療方案并且如果所述患者不再具有高于所述閾值量的血液hPG濃度，那么定期監(jiān)測所述患者的血液hPG水平以確定所述hPG水平是否上升到所述閾值量之上。
42.診斷患者的肝健康狀況的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括 (a)接收患者的血液hPG濃度值的輸入裝置； (b)處理器，其配置成比較患者血液hPG濃度與參照血液hPG濃度，所述處理器被配置成完全或者部分基于患者血液hPG濃度輸出患者的肝病理的風(fēng)險水平；和 (c)顯示器，其配置成顯示肝病理的風(fēng)險水平。
43.計算機(jī)可讀存儲介質(zhì)，其已經(jīng)儲存了代表通過經(jīng)編程的處理器可執(zhí)行的指令的數(shù)據(jù)，用于診斷患者的肝健康狀態(tài)，所述存儲介質(zhì)包括用于以下的指令 (a)比較患者的血液hPG濃度與參照血液hPG濃度；和 (b)完全或者部分基于患者的血液hPG濃度輸出患者肝病理的風(fēng)險水平。
全文摘要
測定了前胃泌素水平以診斷一種或多種肝病理。
文檔編號G01N33/74GK102947707SQ201180010319
公開日2013年2月27日 申請日期2011年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月8日
發(fā)明者J-F·弗洛克, L·胡胡 申請人:拜若提