專利名稱:一種快速提取抗胃泌素釋放肽腫瘤疫苗的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域：
，具體說，涉及從原核細(xì)胞，特別是大腸桿菌中快速提取抗胃泌素釋放肽腫瘤疫苗的制備工藝。
背景技術(shù)：
胃泌素釋放肽(gastrin-releasing peptide，GRP)及其樣肽，作為自分泌或旁分泌生長因子，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。胃泌素釋放肽C端的7至8個(gè)氨基酸已被證實(shí)為其抗原表位，因此針對(duì)胃泌素釋放肽及其樣肽表位開發(fā)多肽疫苗就成為一條腫瘤治療的新途徑，這樣不但可以完全阻斷胃泌素釋放肽及其樣肽刺激腫瘤細(xì)胞增殖的作用，還避免了反復(fù)多次給藥的麻煩。基于以上研究，本單位已經(jīng)開發(fā)出了一種以GRP的C端7肽為靶抗原表位的腫瘤多肽疫苗并申請了專利(名稱“基于胃泌素釋放肽的腫瘤多肽疫苗”專利公開號(hào)CN1830489)。
我們通過分子生物學(xué)技術(shù)將熱休克蛋白65(HSP65)的基因與六段GRP的表位基因連接在一起得到重組質(zhì)粒pET28a-HSP65-GRP6，并將該重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌E.coli BL21(DE3)得到重組工程菌。該重組蛋白以可溶的形式在菌體內(nèi)表達(dá)。由于蛋白HSP65自身就具有蛋白酶的催化活性，當(dāng)細(xì)菌裂解后，HSP65很容易被自身蛋白酶活性所分解，從而在聚丙烯酰胺凝膠上表現(xiàn)為一系列梯狀蛋白條帶，雖然HSP65-GRP6融合蛋白的降解強(qiáng)度比HSP65要小，但是仍然有自身降解的特性，并且該融合蛋白一旦降解，就會(huì)給后續(xù)的分離純化工作帶來很大的麻煩。現(xiàn)有的純化工藝包括硫酸銨分步沉淀、陰離子樹脂分離等多步純化過程，但是在純化的過程中融合蛋白也在不斷的降解，從而導(dǎo)致難以制備得到高純度的蛋白樣品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種既能夠防止該蛋白提取過程中的降解、又能獲得高純度的產(chǎn)物并且還能極大簡化純化過程的制備工藝。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是將誘導(dǎo)表達(dá)了目的蛋白的重組工程菌以1g/ml的比例懸浮在菌體裂解液(pH8.0，50mM Tris-HC1，0.02％溶菌酶)中，室溫?cái)嚢?0分鐘后，加入DNaseI將DNA消化至溶液不粘稠；用冷凍離心機(jī)在4℃以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心25分鐘；收集離心后的上清液，在攪拌的條件下緩慢加入磨細(xì)的硫酸銨粉末，直到硫酸銨達(dá)到10％的飽和度，然后將該溶液在冰水混合物中靜置30分鐘；然后用冷凍離心機(jī)在4℃以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心25分鐘；將沉淀溶解于蒸餾水中，裝入14000KDa截流量的透析袋中，置于大量蒸餾水中透析24小時(shí)，每8小時(shí)換一次蒸餾水；透析去鹽后的蛋白溶液冷凍干燥，保存。
本發(fā)明在菌體裂解以后選擇適當(dāng)?shù)臈l件，用一步沉淀法從裂解上清液中獲得了較高純度的目的蛋白，避免了蛋白在多步純化過程中的降解，又極大的簡化了制備過程，節(jié)約了生產(chǎn)成本。



圖1 SDS-PAGE電泳顯示重組工程菌在誘導(dǎo)后目的蛋白的表達(dá)。1.標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；2.乳糖誘導(dǎo)前的菌體全蛋白；3.乳糖誘導(dǎo)1小時(shí)后的菌體全蛋白；4.乳糖誘導(dǎo)2小時(shí)后的菌體全蛋白； 5.乳糖誘導(dǎo)3小時(shí)后的菌體全蛋白；6.乳糖誘導(dǎo)4小時(shí)后的菌體全蛋白；7.乳糖誘導(dǎo)5小時(shí)后的菌體全蛋白；8.乳糖誘導(dǎo)6小時(shí)后的菌體全蛋白；9.乳糖誘導(dǎo)7小時(shí)后的菌體全蛋白圖2 SDS-PAGE電泳顯示硫酸銨一步沉淀后獲得的純化目的蛋白。1.標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；2.乳糖誘導(dǎo)前的菌體全蛋白；3.乳糖誘導(dǎo)6小時(shí)后的菌體全蛋白；4.一步沉淀法得到的純化蛋白具體實(shí)施方式
實(shí)施例1，從平板上挑取重組工程菌單菌落接種含有50μg/ml卡那霉素的36ml LB液體培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化鈉10g/L)中，于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)過夜，按2％比例轉(zhuǎn)接種入新鮮的1.8L含有50μg/ml卡那霉素的玉米漿液體培養(yǎng)基(玉米漿25g/L，牛肉浸膏15g/L，味精10g/L)中，37℃培養(yǎng)4小時(shí)后，加入終濃度為0.5mmol/L的α-乳糖誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)T7RNA聚合酶，繼續(xù)培養(yǎng)從而表達(dá)融合蛋白HSP65-GRP6，加入誘導(dǎo)劑乳糖以后，每小時(shí)取樣。SDS-PAGE電泳再經(jīng)薄層掃描顯示已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了HSP65-GRP6的融合表達(dá)，誘導(dǎo)后6小時(shí)融合蛋白占細(xì)菌總蛋白的30％左右，結(jié)果見附圖1。
實(shí)施例2，誘導(dǎo)表達(dá)后的工程菌經(jīng)離心回收菌體約10g，將菌體懸浮在100ml菌體裂解液(pH8.0，50mM Tris-HCl，0.02％溶菌酶)中，室溫?cái)嚢?0分鐘，加入30μl DNaseI(1mg/ml)將DNA消化至溶液不粘稠為止，離心回收上清；收集離心后的上清液，在攪拌的條件下緩慢加入磨細(xì)的硫酸銨粉末，直到硫酸銨5.3g，達(dá)到10％的飽和度，然后將該溶液在冰水混合物中靜置30分鐘；然后用冷凍離心機(jī)在4℃以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心25分鐘；將沉淀溶解于蒸餾水中，裝入14000KDa截流量的透析袋中，置于大量蒸餾水中透析24小時(shí)，每8小時(shí)換一次蒸餾水；透析去鹽后的蛋白溶液冷凍干燥后稱重0.11g；用SDS-PAGE電泳檢查制備樣品的純度，結(jié)果見附圖2。
權(quán)利要求
1.一種快速提取抗胃泌素釋放肽腫瘤疫苗的制備工藝，其特征在于1)將表達(dá)目的蛋白的重組工程菌懸浮于菌體裂解液(pH8.0，50mM Tris-HCl，0.02％溶菌酶)中，室溫?cái)嚢柚辆w完全裂解后加入核糖核酸酶I，繼續(xù)攪拌至溶液不再粘稠；2)將溶液冷凍離心，轉(zhuǎn)速12000rpm，25分鐘；3)收集離心后的上清液，在攪拌的條件下緩慢加入一定的硫酸銨粉末，然后將該溶液在冰水混合物中靜置30分鐘；4)將溶液冷凍離心，轉(zhuǎn)速12000rpm，25分鐘；5)將離心所得沉淀溶解于蒸餾水，裝入透析袋中，置于大量蒸餾水中透析24小時(shí)，每8小時(shí)換一次蒸餾水；6)透析去鹽后的蛋白溶液冷凍干燥，即得純化的蛋白樣品。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的制備工藝，其特征是緩慢加入硫酸銨粉末，直到溶液中硫酸銨的飽和度達(dá)到5％-15％。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的制備工藝，其特征是加入的硫酸銨的量是指在0℃條件下達(dá)到5％-15％飽和度所需要的量。
專利摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域：
，公開了一種快速高效地從大腸桿菌中提取抗胃泌素釋放肽腫瘤疫苗的制備工藝。將表達(dá)目的蛋白的重組工程菌裂解以后，用一步硫酸銨沉淀法從裂解上清液中獲得了高純度的目的蛋白，既避免了蛋白在多步純化過程中的降解，又極大的簡化了制備過程，節(jié)約了生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12P21/02GKCN101015687SQ200610098313
公開日2007年8月15日 申請日期2006年12月11日
發(fā)明者劉景晶, 吳國君, 歐陽可棟, 謝燕飛, 過為, 李建平, 陳慶梅, 吳潔, 曹榮月 申請人:中國藥科大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan