專利名稱：檢測(cè)肌紅蛋白含量的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種檢測(cè)肌紅蛋白含量的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒，具體而言，本發(fā)明涉及ー種應(yīng)用膠乳粒子增強(qiáng)技術(shù)提高肌紅蛋白濃度檢測(cè)的靈敏度的試劑盒。
背景技術(shù)：
肌紅蛋白是肌肉中運(yùn)載氧的蛋白質(zhì)，由153個(gè)氨基酸殘基組成，可幫助肌細(xì)胞將氧轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體。肌紅蛋白在正常人血清中含量甚微，當(dāng)心肌或骨骼肌受損時(shí)，會(huì)從受損肌細(xì)胞中釋放入血。在急性心肌梗塞時(shí)發(fā)生心肌缺血壞死，細(xì)胞通透性増加，由于肌紅蛋白的分子量僅為17，500，遠(yuǎn)小于CKMB和AST等酶分子，因此更易釋放進(jìn)入血循環(huán)，12h內(nèi)幾乎所有心肌梗塞患者肌紅蛋白都有升高，幅度大于各種心肌酶，從而成為急性心肌梗塞最早的診斷學(xué)指標(biāo)。另ー方面，由于肌紅蛋白半衰期短(15min)，胸痛發(fā)作后6_12h不升高，有助于排除心肌梗塞的診斷，是篩查心肌梗塞重要而有效的指標(biāo)。肌紅蛋白還是溶栓治療中判斷有無再灌注的敏感而準(zhǔn)確的指標(biāo)。若溶栓術(shù)后1-2小時(shí)內(nèi)肌紅蛋白的濃度超出溶栓術(shù)前的4倍，則提示成功再灌注。由于在心肌梗塞后患者血中肌紅蛋白很快從腎臟清除，發(fā)病18-30h內(nèi)可完全恢復(fù)到正常水平，故肌紅蛋白的測(cè)定有助于在心肌梗塞病程中觀察有無再梗死或梗死再擴(kuò)展。肌紅蛋白頻繁增高，提示原有心肌梗死仍在延續(xù)。因此，高靈敏度的肌紅蛋白的檢測(cè)在診斷心肌損傷疾病方面的及時(shí)性、進(jìn)程、預(yù)后及治療效果方面具有廣泛的臨床意義。目前臨床常用檢測(cè)肌紅蛋白的方法有ELISA法、膠體金法和化學(xué)發(fā)光法等。其中ELISA法適合大批量檢測(cè)，但重復(fù)性差，操作復(fù)雜；膠體金法特異性相對(duì)較好，但敏感度偏低；化學(xué)發(fā)光法靈敏度高，特異性好，但成本要求過高。另外免疫化學(xué)法也比較靈敏，但抗血清必須是對(duì)肌紅蛋白特異的。對(duì)流免疫電泳是ー種定性方法，靈敏度只有2mg/ml (血清中肌紅蛋白參考范圍0-70ng/ml)，不適宜檢測(cè)心肌梗死。放射免疫試驗(yàn)靈敏度高，特異性強(qiáng)，但使用放射性同位素，造成對(duì)環(huán)境的污染，現(xiàn)已少用。現(xiàn)有的乳膠免疫比濁試劑盒靈敏度低，線性差、抗體利用率也較低，導(dǎo)致價(jià)格昂貴。因此有必要采取新的技術(shù)方案來克服現(xiàn)有產(chǎn)品抗體利用率低、線性差和靈敏度低的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的技術(shù)目的在于研制ー種抗體利用率高、線性好、靈敏度高的肌紅蛋白膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒。因此，本發(fā)明的第一方面涉及ー種檢測(cè)人血清或尿液中肌紅蛋白含量的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒，該試劑盒包括試劑R1、試劑R2和肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，其中試劑Rl為反應(yīng)緩沖液，試劑R2為苯こ烯膠乳顆粒、肌紅蛋白抗體和反應(yīng)緩沖液形成的白色膠乳懸濁液，肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為含有不同濃度肌紅蛋白的反應(yīng)緩沖液，其特征在于所述的肌紅蛋白抗體先利用高碘酸鹽氧化然后利用碳化ニ亞胺和雙官能団交聯(lián)劑定向固定在苯こ烯膠乳顆粒上。優(yōu)選地，所述的反應(yīng)緩沖液為PBS緩沖液、Hepes緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液或氯化銨緩沖液中的ー種或幾種，緩沖液濃度在20-500mM之間，優(yōu)選地，反應(yīng)緩沖液為PBS緩沖液、Hepes緩沖液、甘氨酸緩沖液中的ー種或兩種組合，濃度為20—200mMo優(yōu)選地，所述的苯こ烯膠乳顆粒粒徑范圍為O. 05-0. 5 μ m,優(yōu)選地，苯こ烯膠乳顆粒粒徑為O. 08-03 μ Μ,羧基含量為100-300 μ mol/g,優(yōu)選地，含量為120-200 μ mol/g。 優(yōu)選地，所述的肌紅蛋白抗體為非親和的IgG抗體、親和的IgG抗體或IgY抗體中的ー種或兩種，抗體來源為兔抗人、山羊抗人、綿羊抗人、鼠抗人、雞抗人、鴨抗人抗體中的ー種或兩種，抗體種類包括單克隆抗體和多克隆抗體。優(yōu)選地，所述的肌紅蛋白抗體利用碳化ニ亞胺和雙官能団交聯(lián)劑定向固定在苯こ烯膠乳顆粒的途徑為稱取2-20mg (優(yōu)選地,5-15mg,更優(yōu)選地,7-10mg)碳化ニ亞胺加入20-200ml (優(yōu)選地，50-100ml)適當(dāng)緩沖液中溶解均勻，加入I-IOml (優(yōu)選地，3_8ml，更優(yōu)選地，5ml)苯こ烯膠乳顆粒，混勻，37°C搖床反應(yīng)O. 5_3h (優(yōu)選地，l_2h)，然后加入15-150mg (優(yōu)選地，30-100mg，更優(yōu)選地，60mg)雙官能団交聯(lián)劑，37°C搖床反應(yīng)O. 5_6h (優(yōu)選地，l-3h)，形成活化的苯こ烯膠乳顆粒；量取O. 35-35ml (優(yōu)選地，l_20ml)肌紅蛋白抗體與300-3000ml (優(yōu)選地，500-2000ml，更優(yōu)選地，1000ml)適當(dāng)緩沖液混勻，放入三角瓶中，加入 O. 002-0. 05mmol/l (優(yōu)選地，O. 005-0. 02mmol/l，更優(yōu)選地，O. 01mmol/l)的高碘酸鈉O. 4-4ml (優(yōu)選地，l-3ml,更優(yōu)選地,2ml)混勻10_60min(優(yōu)選地,20_40min,更優(yōu)選地，30min),加入已活化的苯こ烯膠乳顆粒50ml,顛倒混勻，37°C搖床反應(yīng)2_8h(優(yōu)選地,4_6h,更優(yōu)選地，5h)后離心，去上清液，超聲分散后置于緩沖液中形成試劑R2。優(yōu)選地，雙官能團(tuán)交聯(lián)劑選自こニ胺、丁 ニ胺、こニ胺ニ酰肼的ー種或幾種。優(yōu)選地，試劑R2中結(jié)合有人肌紅蛋白抗體的苯こ烯膠乳含量為O. 5_3mg/ml，優(yōu)選地，苯こ烯膠乳含量為l_2mg/ml。優(yōu)選地，所述的肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為含有穩(wěn)定劑的不同濃度的肌紅蛋白的反應(yīng)緩沖液，其中肌紅蛋白含量分別為100、200、400、800ng/ml或類似比例的濃度。優(yōu)選地，所述肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品中含有的穩(wěn)定劑選自牛血清白蛋白、雞蛋清蛋白、多聚賴氨酸、脫脂奶粉、抗生素、疊氮鈉或硫柳汞中的ー種或幾種，濃度在O. 05-5g/L，優(yōu)選地，穩(wěn)定劑選用牛血清白蛋白、多聚賴氨酸和疊氮鈉兩種或兩種以上組合使用，濃度為O. 5-5g/
し最優(yōu)選地，所述的檢測(cè)人血清或尿液中肌紅蛋白含量的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒選自具有如下組成的試劑盒試劑盒I:試劑Rl 0. 5% NaCUO. 5% BSA,O. 05% NaN3、20mM 甘氨酸緩沖液 pH8，試劑R2 0. 5% BSA,O. 05% NaN3、20mM甘氨酸緩沖液pH8. 5、40mg抗人肌紅蛋白抗體，O. 05 μ m膠乳顆粒；肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品人肌紅蛋白、O. 5% BSA,O. 05% NaN3>20mMHepes緩沖液；試劑盒2:試劑Rl 8% NaCl,5% BSA,O. 5% NaN3、500mM 甘氨酸緩沖液 pH8，
試劑R2 5% BSA、0. 5% NaN3、500mM甘氨酸緩沖液pH8. 5、150mg抗人肌紅蛋白抗體、O. 5 μ m膠乳顆粒
肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品人肌紅蛋白、5% BSA,O. 5% NaN3、500mM Hepes緩沖液。換言之,本發(fā)明從抗體固定化分子朝向入手,建立了抗體定向固定化工藝，提高了抗體固定化效率，大大節(jié)約了試劑成本。該試劑能夠用于檢測(cè)人血清或尿液中的肌紅蛋白，具有較高的靈敏度和線性范圍。本發(fā)明研究選擇了合適的膠乳顆粒以及肌紅蛋白抗體和苯こ烯膠乳顆粒共價(jià)結(jié)合的合適途徑，建立了低濃度肌紅蛋白水平與已結(jié)合苯こ烯膠乳顆粒的肌紅蛋白抗體發(fā)生作用形成在340nm-700nm可以檢測(cè)的濁度反應(yīng)體系，這個(gè)體系包括反應(yīng)必需的合適緩沖液，pH值和離子強(qiáng)度等。具體而言，為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為ー種膠乳增強(qiáng)免疫比濁方法檢測(cè)人血清或尿液中肌紅蛋白含量的試劑盒，該試劑盒包含試劑R1、試劑R2、標(biāo)準(zhǔn)品，所述的試劑Rl為適當(dāng)?shù)木彌_液。所述的試劑R2為用高碘酸鈉氧化過的抗人肌紅蛋白抗體致敏由碳化ニ亞胺活化過的苯こ烯膠乳顆粒，然后將致敏后的苯こ烯膠乳顆粒置于適當(dāng)?shù)木彌_液中形成試劑R2，試劑R2中結(jié)合有人肌紅蛋白抗體的苯こ烯膠乳含量為O. 5-3mg/ml。上述的抗人肌紅蛋白抗體包括但不限于兔、羊、鼠、雞、鴨來源的單克隆抗體或多克隆的非親和的IgG抗體、親和的IgG抗體或IgY抗體中的ー種或兩種。上述所述的適當(dāng)緩沖液包括但不限于PBS緩沖液、Hepes緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液或氯化銨緩沖液以及其他具有相似性質(zhì)的緩沖液中的ー種或幾種；緩沖液濃度在20-500mM之間。在本發(fā)明所述的肌紅蛋白檢測(cè)試劑盒中，還包含肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，所述的肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為含有穩(wěn)定劑的不同濃度肌紅蛋白的適當(dāng)緩沖液，其中肌紅蛋白含量分別為100、200、400、800ng/ml或類似比例的含量。上述所述的穩(wěn)定劑包括但不限于牛血清白蛋白、雞蛋清蛋白、多聚賴氨酸、脫脂奶粉、抗生素、疊氮鈉或硫柳萊中的ー種或幾種；穩(wěn)定劑濃度在O. 5-5g/L。本發(fā)明上面所述的用高碘酸鈉氧化過的抗人肌紅蛋白抗體，其原理是高碘酸鈉可以將肌紅蛋白抗體Fe片段上的羥基氧化成醛基，而醛基可以快速的和活化過的苯こ烯膠乳顆粒表面氨基結(jié)合，使抗人肌紅蛋白抗體定向連接于苯こ烯膠乳顆粒上。本發(fā)明所述的由碳化ニ亞胺活化過的苯こ烯膠乳顆粒，其是由碳化ニ亞胺與苯こ烯膠乳顆粒上的羧基發(fā)生反應(yīng)后再與ニ胺或ニ酰肼類分子反應(yīng)，膠乳表面生成氨基，氨基可與醛基快速反應(yīng)進(jìn)行交聯(lián)。本發(fā)明采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁方法檢測(cè)人血清或尿液中肌紅蛋白含量，其原理是以多克隆抗體為基礎(chǔ)的改良免疫比濁分析。利用基因工程或化學(xué)方法將抗體與膠乳顆粒結(jié)合，當(dāng)抗原抗體相結(jié)合時(shí)便形成了抗原-抗體-膠乳顆粒復(fù)合物，增強(qiáng)了反應(yīng)吸光度，反應(yīng)液住一定波長處比濁，與同樣處理的標(biāo)準(zhǔn)液比較，即可計(jì)算樣本中抗原的含量。在本發(fā)明中，血清或尿液中的肌紅蛋白與結(jié)合在膠乳顆粒表面的抗人肌紅蛋白抗體結(jié)合，發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，使膠乳顆粒凝集產(chǎn)生濁度，在340nm-700nm波長處測(cè)定吸光度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線可得出樣本中肌紅蛋白的含量。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果
此試劑盒可用于檢測(cè)人血清或尿液中濃度范圍為10-1000ng/ml的肌紅蛋白水平，靈敏度達(dá)3ng/ml，CV < 10%，因此能夠用于早期診斷心肌梗塞等心肌損傷疾病，滿足臨
床需要。本發(fā)明是一種基于抗原抗體反應(yīng)的試驗(yàn)方法，其特別之處在于，本發(fā)明采用的是不同于常規(guī)的抗體與苯こ烯膠乳顆粒致敏方法，提供了新的肌紅蛋白抗體和苯こ烯膠乳顆粒共價(jià)結(jié)合的合適途徑。以往的交聯(lián)方法抗體是隨機(jī)結(jié)合在苯こ烯膠乳顆粒上，抗體利用率低；為了提高靈敏度，需要加入更多量的抗體，提升了成本。而本發(fā)明所用的交聯(lián)方法，即用高碘酸鈉氧化過的抗人肌紅蛋白抗體致敏由碳化ニ亞胺活化過的苯こ烯膠乳顆粒的方法，與已知的抗體致敏膠乳方法相比，本法能夠使抗體定向的結(jié)合到苯こ烯膠乳顆粒上，提高抗體定向固定化效率，降低了試劑盒的制作成本。


圖1 :肌紅蛋白試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于了解，下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例I肌紅蛋白檢測(cè)試劑盒的制備試劑盒I的制備試劑Rl :含有O. 5% NaCUO. 5% BSA,O. 05% NaN3的甘氨酸緩沖液，pH8，該試劑為無色透明溶液。試劑R2 制備方法(I)取14ml抗人肌紅蛋白抗體(3. lmg/ml)與20ml O. 005mmol/l的高碘酸鈉溶液室溫混合10分鐘后備用；(2)用80ml Hepes pH7. 5溶液溶解2. 5mg碳化ニ亞胺，使反應(yīng)濃度達(dá)到O. 03mg/ml，加入I. 8ml粒徑50nm膠乳顆粒，使膠乳顆粒活化濃度為O. 2%，37°C搖床混勻O. 5小時(shí)；(3)加入ISmgこニ胺ニ酰肼，37°C搖床混勻O. 5小時(shí)后形成致敏膠乳；(4)將氧化后的抗人肌紅蛋白抗體加入到致敏膠乳顆粒緩沖液中，37°C搖床混勻2小時(shí)；(5)加入2ml封閉液(含有2mg/ml吐溫-20的甘氨酸緩沖液，ρΗ7· 4)室溫?fù)u床過夜；(6) 4で離心，I5OOOrpm, 40 分鐘；(7)用IOml去離子水溶解膠乳顆粒，離心清洗；(8)棄上清，加入150ml工作液(含有0.5% BSA、0· 05% NaN3的甘氨酸緩沖液，PH8. 5)，超聲重懸后得到的乳白色溶液即為試劑R2。肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為在含有O. 5% BSA、0. 05% NaN3的20mM Hepes緩沖液中分別加入100、200、400、800ng/ml的肌紅蛋白，除菌過濾。
試劑盒2的制備試劑Rl :含有8% NaCl,5% BSA、0. 5% NaN3的甘氨酸緩沖液，pH8，該試劑為無色透明溶液。試劑R2 制備方法(I)取40ml抗人肌紅蛋白抗體(3. lmg/ml)與20ml O. 05mmol/l的高碘酸鈉溶液室溫混合60分鐘后備用；(2)用80ml Hepes pH7. 5溶液溶解25mg碳化ニ亞胺，使反應(yīng)濃度達(dá)到O. 3mg/ml,加入20ml粒徑500nm膠乳顆粒，使膠乳顆?；罨瘽舛葹?°ん37°C搖床混勻4小時(shí)；(3)加入200mgこニ胺ニ酰肼，37°C搖床混勻4小時(shí)后形成致敏膠乳；(4)將氧化后的抗人肌紅蛋白抗體加入到致敏膠乳顆粒緩沖液中，37°C搖床混勻8小時(shí)；(5)加入25ml封閉液(含有20mg/ml吐溫-20的甘氨酸緩沖液，ρΗ7· 4)室溫?fù)u床過夜；(6) 4°C離心，15000rpm, 60 分鐘；(7)用IOOml去離子水溶解膠乳顆粒，離心清洗；(8)棄上清，加入1500ml工作液(含有5 % BSA，O. 5 % NaN3的，甘氨酸緩沖液，PH8. 5)，超聲重懸后得到的乳白色溶液即為試劑R2。肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為在含有5% BSA、0. 5% NaN3的500mM Hepes緩沖液中分別加入100、200、400、800ng/ml的肌紅蛋白，除菌過濾。對(duì)照試劑盒的制備方法試劑Rl :與本發(fā)明試劑盒I的試劑Rl相同；試劑R2 (I)用80ml Hepes pH7. 5溶液溶解8. 75mg碳化ニ亞胺，使反應(yīng)濃度達(dá)到O. 07mg/ml，加入6. 25ml粒徑200nm膠乳顆粒，使膠乳顆粒活化濃度為O. 5%，37°C搖床混勻I小時(shí)，形成致敏膠乳顆粒；(2)雞抗人肌紅蛋白抗體加入到致敏膠乳顆粒緩沖液中，37°C搖床混勻4小時(shí)；(3)加入7. 5ml封閉液(含有10mg/ml吐溫-20的甘氨酸緩沖液，pH7. 4)室溫?fù)u床過夜；(4)4°C離心，15000rpm，40 分鐘；(5)用IOml去離子水溶解膠乳顆粒，離心清洗；(6)棄上清，加入500ml工作液(含有I %BSA，0. I ^NaN3的，甘氨酸緩沖液，PH8. 5)，超聲重懸后得到的乳白色溶液即為試劑R2。肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為在含有1% BSA、0. 1% NaN3的Ifepes緩沖液中分別加入100、200、400、800ng/ml的肌紅蛋白，除菌過濾。肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品均為無色透明液體。實(shí)施例2肌紅蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定步驟，定標(biāo)曲線的繪制，與通用制備方法進(jìn)行 對(duì)比情況檢測(cè)工具01ympus全自動(dòng)生化分析儀分析方法2點(diǎn)終點(diǎn)法；
主波長570nm，副波長800nm；樣品量6.Oul ；R1 180ul ；R2 60ul ；校準(zhǔn)方式樣條函數(shù)Spline ;反應(yīng)方向上升；測(cè)定穩(wěn)定37°C ；樣品與Rl混勻后，于第10秒讀取吸光度A1，于3-5分鐘加入R2，于5分鐘時(shí)讀取 吸光度A2。反應(yīng)吸光度的計(jì)算為A2與A1的校準(zhǔn)差值。計(jì)算方法多點(diǎn)定標(biāo)，以樣條函數(shù)作為計(jì)算方法，根據(jù)吸光度與標(biāo)準(zhǔn)品的值做劑量/反應(yīng)曲線，樣品含量可根據(jù)其吸光度值在劑量/反應(yīng)曲線上求出。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫軸，相應(yīng)的AOD57tl為縱軸，運(yùn)用不同的交聯(lián)方法及不同的抗體濃度，采用非線性擬合，如spline繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖I。實(shí)施例3肌紅蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定肌紅蛋白檢測(cè)工具01ympus全自動(dòng)生化分析儀分析方法2點(diǎn)終點(diǎn)法；主波長700nm，副波長800nm；樣品量6.Oul ；R1 180ul ；R2 60ul ；校準(zhǔn)方式樣條函數(shù)Spline ;反應(yīng)方向上升；測(cè)定穩(wěn)定37°C ；樣品與Rl混勻后，于第10秒讀取吸光度A1，于3-5分鐘加入R2，于5分鐘時(shí)讀取吸光度A2。反應(yīng)吸光度的計(jì)算為A2與A1的校準(zhǔn)差值。計(jì)算方法多點(diǎn)定標(biāo)，以樣條函數(shù)作為計(jì)算方法，根據(jù)吸光度與標(biāo)準(zhǔn)品的值做劑量/反應(yīng)曲線，樣品含量可根據(jù)其吸光度值在劑量/反應(yīng)曲線上求出。參考范圍血清/血漿肌紅蛋白く 70ng/ml。實(shí)施例4肌紅蛋白檢測(cè)試劑盒I各項(xiàng)性能指標(biāo)測(cè)試I)最小檢測(cè)限用本申請(qǐng)的試劑盒I測(cè)定4種不同肌紅蛋白含量的質(zhì)控樣品，每個(gè)樣品測(cè)10次，通過計(jì)算均值和SD值，得到試劑檢測(cè)的最小檢測(cè)限。結(jié)果表明，本發(fā)明檢測(cè)試劑盒I的靈敏度為3ng/ml,對(duì)照試劑盒為10ng/ml (見表I和2)。表I :本發(fā)明試劑盒I的最小檢測(cè)限
「0D值
樣本 ng/mL 0.0I23
測(cè)定次數(shù) 101010' 10
均值 0.10- 19.6023.7028.50
3 SD21.0915.63 12.41 8.03^均值+3SD 21.19 35.23 36.11 36.53 均值-3 SD-20.99 — 3.97 11.29表2 :對(duì)照試劑盒的最小檢測(cè)限
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)人血清或尿液中肌紅蛋白含量的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒，該試劑盒包括試劑R1、試劑R2和肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，其中試劑Rl為反應(yīng)緩沖液，試劑R2為苯こ烯膠乳顆粒、肌紅蛋白抗體和反應(yīng)緩沖液形成的白色膠乳懸濁液，肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為含有不同濃度肌紅蛋白的反應(yīng)緩沖液，其特征在于所述的肌紅蛋白抗體先利用高碘酸鹽氧化然后利用碳化ニ亞胺和雙官能団交聯(lián)劑定向固定在苯こ烯膠乳顆粒上。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)人血清或尿液中肌紅蛋白含量的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒，其特征在于，所述的反應(yīng)緩沖液為PBS緩沖液、Hepes緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液或氯化銨緩沖液中的ー種 或幾種，緩沖液濃度在20-500mM之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的檢測(cè)人血清或尿液中肌紅蛋白含量的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒，其特征在干，所述的苯こ烯膠乳顆粒粒徑范圍為O. 05-0. 5 μ m,羧基含量為100-300 μmol/go
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3任一項(xiàng)所述的檢測(cè)人血清或尿液中肌紅蛋白含量的膠乳增強(qiáng)免疫比池試劑盒，其特征在于，所述的肌紅蛋白抗體為非親和的IgG抗體、親和的IgG抗體或IgY抗體中的ー種或兩種，抗體來源為兔抗人、山羊抗人、綿羊抗人、鼠抗人、雞抗人、鴨抗人抗體中的ー種或兩種，抗體種類包括單克隆抗體和多克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4任一項(xiàng)所述的檢測(cè)人血清或尿液中肌紅蛋白含量的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒，其特征在于，所述的肌紅蛋白抗體利用碳化ニ亞胺和雙官能団交聯(lián)劑定向固定在苯こ烯膠乳顆粒的途徑為稱取2-20mg碳化ニ亞胺加入20-200ml適當(dāng)緩沖液中溶解均勻，加入I-IOml苯こ烯膠乳顆粒，混勻，37°C搖床反應(yīng)O. 5_3h，然后加入15_150mg雙官能団交聯(lián)劑，37°C搖床反應(yīng)O. 5-6h，形成活化的苯こ烯膠乳顆粒；量取O. 35-35ml肌紅蛋白抗體與300-3000ml適當(dāng)緩沖液混勻，放入三角瓶中，加入O. 002-0. 05mmol/l的高碘酸鈉O. 4-4ml混勻10-60min,加入已活化的苯こ烯膠乳顆粒50ml,顛倒混勻，37°C搖床反應(yīng)2-8h后離心，去上清液，超聲分散后置于緩沖液中形成試劑R2。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5任一項(xiàng)所述的檢測(cè)人血清或尿液中肌紅蛋白含量的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒，其特征在于雙官能團(tuán)交聯(lián)劑選自こニ胺、丁ニ胺、こニ胺ニ酰肼的ー種或幾種。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至6任一項(xiàng)所述的檢測(cè)人血清或尿液中肌紅蛋白含量的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒，其特征在于試劑R2中結(jié)合有人肌紅蛋白抗體的苯こ烯膠乳含量為O. 5_3mg/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至7任一項(xiàng)所述的檢測(cè)人血清或尿液中肌紅蛋白含量的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒，其特征在于所述的肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為含有穩(wěn)定劑的不同濃度的肌紅蛋白的反應(yīng)緩沖液，其中肌紅蛋白含量分別為100、200、400、800ng/ml或類似比例的濃度。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測(cè)人血清或尿液中肌紅蛋白含量的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒，其特征在于所述肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品中含有的穩(wěn)定劑選自牛血清白蛋白、雞蛋清蛋白、多聚賴氨酸、脫脂奶粉、抗生素、疊氮鈉或硫柳汞中的ー種或幾種，濃度在O. 05-5g/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求I至9任一項(xiàng)所述的檢測(cè)人血清或尿液中肌紅蛋白含量的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒，其特征在于其選自具有如下組成的試劑盒 試劑盒I : 試劑 Rl 0. 5% NaCUO. 5% BSA,O. 05% NaN3、20mM 甘氨酸緩沖液 pH8，試劑R2 0. 5% BSA、0. 05% NaN3、20mM甘氨酸緩沖液pH8. 5、40mg抗人肌紅蛋白抗體，O.05 μ m膠乳顆粒； 肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品人肌紅蛋白、O. 5% BSA,O. 05% NaN3>20mMHepes緩沖液； 試劑盒2 試劑 Rl 8% NaCl,5% BSA,O. 5% NaN3、500mM 甘氨酸緩沖液 pH8， 試劑R2 5% BSA,O. 5% NaN3、500mM甘氨酸緩沖液pH8. 5、150mg抗人肌紅蛋白抗體、O.5 μ m膠乳顆粒， 肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品人肌紅蛋白、5% BSA,O. 5% NaN3、500mM Hepes緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)肌紅蛋白含量的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒，具體而言，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)人血清或尿液中肌紅蛋白含量的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒，該試劑盒包括試劑R1、試劑R2和肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，R1為適當(dāng)緩沖液，試劑R2為苯乙烯膠乳顆粒、肌紅蛋白抗體和適當(dāng)?shù)木彌_液形成的白色膠乳懸濁液，標(biāo)準(zhǔn)品為含有不同濃度肌紅蛋白的適當(dāng)緩沖液。本發(fā)明試劑盒可快速有效穩(wěn)定的檢測(cè)血清或尿液中10-1000ng/mL線性內(nèi)的肌紅蛋白水平，最低檢測(cè)限為3ng/ml，CV＜10％，能夠及時(shí)驗(yàn)證心肌損傷狀況，滿足臨床需要。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102628865SQ20111045457
公開日2012年8月8日 申請(qǐng)日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者劉希, 劉鶴, 張小銳, 蔡華雅 申請(qǐng)人:北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司