專利名稱：一種用于檢測(cè)免疫不育相關(guān)自身抗體的新型抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
生殖免疫學(xué)包括生殖道粘膜免疫調(diào)節(jié)、生育免疫調(diào)節(jié)、母一胎免疫調(diào)節(jié)以及生殖內(nèi)分泌一免疫調(diào)節(jié)4個(gè)方面。生殖免疫學(xué)認(rèn)為人類的生殖腺與生殖細(xì)胞及其產(chǎn)生的激素都具有抗原性，可導(dǎo)致免疫反應(yīng)，產(chǎn)生自身抗體，影響生殖過程的各個(gè)環(huán)節(jié)。正常人血清中有多種自身抗體，但其效價(jià)很低，不足以引起破壞作用，故稱之為“生理性抗體”;但當(dāng)其效價(jià)明顯升高后，即引起自身免疫性疾病。1900年，Meichnikoff發(fā)現(xiàn)精子具有抗原性并能誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。1954年Wilson和Rumke首先在男性不育患者血清中發(fā)現(xiàn)了抗精子抗體(antisperm antibody, AsAb) 1994年Marshburn等通過眾多研究提出:血清和生殖道內(nèi)的AsAb可影響人類的生育能力。有研究指出:由AsAb引起的不育占總體不育者的10%-30%。然而精子抗原是一種復(fù)合性抗原，并非所有的抗精子抗體都與不育有關(guān)，只有那些針對(duì)在受精過程中起關(guān)鍵作用的精子靶抗原的抗精子抗體才有可能影響生育。精子上的與生育無關(guān)的無效抗原，可能會(huì)降低檢測(cè)敏感性及特異性，給病人的治療帶來不必要的麻煩。因此，分離純化精子特異性靶抗原作為包被抗原，是建立準(zhǔn)確的檢測(cè)影響生育的抗精子抗體的方法。
背景技術(shù)：
免疫性不育，在臨床上通常是指排除器質(zhì)性病變之外的“不明原因不育”的病因之一，對(duì)于免疫性不育的實(shí)驗(yàn)室診斷，目前主要是針對(duì)抗精子抗體進(jìn)行測(cè)定。采用的技術(shù)包括傳統(tǒng)抗原抗體反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、免疫熒光、免疫珠、酶聯(lián)免疫吸附法、混合抗球蛋白反應(yīng)等，檢測(cè)的臨床標(biāo)本包括血清、宮頸粘液、精漿等。然而，人類精子抗原相當(dāng)復(fù)雜，約有100多種，按其特異性分為精子特異性抗原和精子非特異性抗原。它們所誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗精子抗體對(duì)生育的影響力不盡相同。精子特異性乳酸脫氫酶(sperm-specific lactatedehydrogenase, LDH-C4)特異地存在于鳥類和哺乳動(dòng)物的睪丸和精子中，可催化丙酮酸和乳酸的轉(zhuǎn)化，為精子的運(yùn)動(dòng)和存活提供能量，雌性動(dòng)物和雄性動(dòng)物的免疫系統(tǒng)均可將其識(shí)別為異已成份，作為自身抗原、異型抗原或同種異型抗原，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。將純化的LDHC4 蛋白、經(jīng)化學(xué)修飾的LDHC4多肽或構(gòu)建的LDHC4-DNA疫苗免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在動(dòng)物的血清或生殖道分泌液中均可檢測(cè)到特異性抗體的存在，且動(dòng)物的生育率明顯降低，說明LDHC4抗體可能是抗精子抗體中與生殖密切有關(guān)的一種抗體。

發(fā)明內(nèi)容
(一)目的
原核表達(dá)并純化制備重組人精子特異性乳酸脫氫酶(rhLDH-C4)抗原，并以此抗原為包被抗原，建立人血清抗LDH-C4抗體(IgG型)檢測(cè)的間接ELISA方法，為更準(zhǔn)確的檢測(cè)免疫性不育患者體內(nèi)的自身抗體建立一種可靠的方法。并探討人血清抗LDH-C4抗體與不育癥的具體關(guān)系。(二)技術(shù)路線I pET-28 (a+) -hLDHC重組載體的構(gòu)建及鑒定
目的片段的擴(kuò)增及回收:依據(jù)GenBank登錄的人LDH-C mRNA (G1: 187065)全長序列，采用OMIGA軟件，自行設(shè)計(jì)針對(duì)人LDH-C全長編碼序列兩端的引物，并委托上海博亞公司合成。Pl (上游引物):5' -CCGAAGCTTGCACCAT
GTCAACTGTCAAGGAGCAGC-3;，帶一個(gè)Hind III酶切位點(diǎn)(劃線處)。P2 (下游引物)序列為 5' -CCGCTCGAGTTAAAATATTAGATCCTTT-
TGAATATTCC-3;帶一個(gè)Xhol I酶切位點(diǎn)(劃線處)。以人睪丸λ TripEx cDNA文庫為模板，進(jìn)行編碼序列的PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為50μ1。體系如下:10 X PCR緩沖液5μ1，dNTP混合液4Pl，cDNA模板Iμ ，上下游引物各141，了&9聚合酶(5~卜1)0.5卜1，ddH20 37.5μ1?；靹蚝?，94°C預(yù)變性4分30秒，按下列參數(shù):94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 2min，擴(kuò)增。共30個(gè)循環(huán)。最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束后繼續(xù)在72°C延伸6min。產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠中電泳，切割含預(yù)期區(qū)帶的凝膠塊，上海華舜公司DNA凝膠回收試劑盒回收DNA。具體方法如下:將切下的凝膠塊，放入eppendorf管中，每IOOmg凝膠塊加入300μ1 SI緩沖液,置50°C水浴IOmin使膠溶解；將溶液移入吸附柱，13000r/min離心30s ;棄離心液，加入500μ1洗滌緩沖液Wl, 13000r/min離心15sec。重復(fù)此步驟一次；13000r/min離心Imin后,將吸附柱放入一新的1.5ml eppendorf管中，加入30μ1超純水，室溫靜置Imin后，13000r/min離心2min,收集管中離心液。重組載體的構(gòu)建:將回收的PCR產(chǎn)物按如下體系進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切:10X酶切緩沖液 5Pl，PCR 回收產(chǎn)物(7lPg /πι1)25μ1,Η η(1 IIK 10υ/μ1) μ1，Χ1ιο1 I (10υ/μ1) μ1,ddH20 18μ1。將原核表達(dá)載體(pET_28a質(zhì)粒)按如下體系進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切:10Χ酶切緩沖液5μl，pET-28a質(zhì)粒(265μg/ml)10μl，Hind IIK 10υ/μ1)2μ1, Xhol I (10υ/μ1)2μ1,ddH20 3 μ1。將上述反應(yīng) 體系分別混勻后，37°C水浴箱中反應(yīng)3h。酶切后產(chǎn)物與酶切前產(chǎn)物同時(shí)做DNA凝膠電泳，判斷酶切是否完全。在紫外燈下用刀片切下含預(yù)期區(qū)帶的凝膠塊，用上海華舜公司DNA凝膠回收試劑盒從中回收DNA。具體方法同前。將回收后的雙酶切的PCR產(chǎn)物和pET-28a質(zhì)粒按如下體系進(jìn)行連接:10X連接緩沖液Wl，pET_28a質(zhì)粒(38μ8 /ml)2μ1，PCR 產(chǎn)物(36Pg /ml) 3μ1, T4 DNA 連接酶 0.5μ1，ddH20 3.5μ1。反應(yīng)總體積為 10μ1,16°C過夜。表達(dá)菌及克隆菌的制備和鑒定:用CaC12處理法，制備E.coliBL21(DE3) plysS感受態(tài)細(xì)胞作為表達(dá)菌，具體步驟如下:(1)無菌條件下從37°C培養(yǎng)的新鮮E.coliBL21(DE3)plysS平板中挑取單個(gè)菌落接種于3ml不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床搖菌過夜。(2)將0.1mol/L CaC12和1.5ml印pendorf管放在冰浴盒內(nèi)冰浴。(3)取上述過夜菌液30μ1接種于3ml不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床上劇烈振搖2h。(4)將菌液移至冰預(yù)冷的1.5ml eppendorf管中，置冰浴盒內(nèi)冰浴5 min。(5)在4°C條件下，13000r/min離心30s。(6)棄上清，加入冰預(yù)冷的500μ1 0.lmol/L CaCl2輕輕重懸菌液，使其成均勻混懸狀，置冰浴盒內(nèi)冰浴5 min。(7)在4°C條件下，13000r/min離心30s。(8)棄上清，加入冰預(yù)冷的200μ1 0.lmol/L CaC12輕輕重懸菌液，4°C放置24 h。(9)取出上述感受態(tài)細(xì)胞，加入10μ1連接產(chǎn)物，輕輕混懸菌液，置冰浴盒內(nèi)冰浴30 min。( 10) 42°C水浴熱休克90 s (其間不要搖動(dòng)EP管，休克時(shí)間一定要準(zhǔn)確)，快速將EP管放入冰浴盒內(nèi)冰浴5min，使細(xì)胞冷卻。(11)加入37°C預(yù)溫的LB液體培養(yǎng)基900μ1，37°C搖床溫和搖菌45 min,使細(xì)胞復(fù)蘇。(12) 13000r/min離心30s,棄去700μ1上清液。(13)用移液器將轉(zhuǎn)化菌輕輕混懸，全部滴加到預(yù)溫的含100mg/L卡那霉素(Kan+)的LB培養(yǎng)板上，用無菌的彎頭玻璃棒均勻涂布。37°C孵箱放置待轉(zhuǎn)化產(chǎn)物完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置過夜。(14)次日觀察菌落生長情況。按上述制備表達(dá)菌的方法制備E.coli JM109克隆菌。無菌條件下從37°C培養(yǎng)的新鮮平板中挑取單個(gè)菌落接種于3ml不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床搖菌過夜。使用上海華舜公司質(zhì)粒提取純化試劑盒抽提重組質(zhì)粒，具體方法如下:(1)將過夜培養(yǎng)的3ml菌液13000r/min離心Imin,棄上清；(2)加入250μ1 Pl液，振蕩至徹底懸浮；(3)加入250μ1 Ρ2液，立即溫和顛倒eppendorf管5 8次以混勻，室溫靜置4 min; (4)加入350μ1 Ρ3液,立即溫和顛倒eppendorf管5 8次以混勻，13000r/min離心IOmin,小心移上清至吸附柱，13000r/min離心15sec,棄離心液；
(5)加入 500μ1 BI 液，13000r/min 離心 15sec，棄離心液；(6)加入 500μ1 Wl 液，13000r/min離心15sec,棄離心液；(7)重復(fù)步驟(6) —次,13000r/min離心Imin,將吸附柱放在新的eppendorf管上；(8)力口入50μ1 Tl液,室溫靜置I min, 13000r/min離心Imin,收集離心管中液體；(9)取適量分別進(jìn)行DNA定量與Hind III /Xhol I雙酶切鑒定(反應(yīng)體系如前)，以觀察是否含有目的片斷。重組質(zhì)粒委托上海博亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序。2 rhLDH_C4蛋白抗原的原核表達(dá)及純化
重組蛋白抗原的表達(dá):無菌條件下從37°C培養(yǎng)的新鮮平板中挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化的表達(dá)菌菌落接種于3ml不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床搖菌過夜。取30μ1過夜菌接種于3ml含Kan的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至A600為0.4-0.6，加入IPTG至終濃度0.1mM,另一支不加IPTG作為誘導(dǎo)前對(duì)照,30°C誘導(dǎo)5h。然后各取0.5ml菌液，13000 rpm離心3min,棄上清，加入80μ1 IXPBS重懸沉淀，再加入5 X SDS凝膠上樣緩沖液20μ1混勻，100°C煮沸5min。5000rpm離心lOmin，取上清在12%SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳(12%SDS_PAGE)。200V電壓下電泳55min后，小心取出凝膠在考馬斯亮藍(lán)染色液中染色2_3h，脫色至背景清楚，在Flour-S成像系統(tǒng)中成相并保存。重組蛋白抗原的純化:按上述誘導(dǎo)表達(dá)條件,取誘導(dǎo)后的重組菌液IOOOml離心，收集菌體，重懸于IOml結(jié)合緩沖液中。加入Triton X-100 100 μ I (終濃度為1%)和溶菌酶(10mg/ml)100y 1，并加入適量DNA酶-1，在液氮中與37°C (恒溫水浴箱中)條件下反復(fù)凍融4次裂解菌體。4°C條件下，14000rpmX IOmin離心收集上清。按照His-融合蛋白純化試劑盒(Qiagen公司產(chǎn)品)說明書所述方法進(jìn)行條件優(yōu)化后，用Ni+_NTA親和層析法對(duì)上清中可溶性的rhLDH-C4蛋白進(jìn)行分離純化。、具體過程如下:(I)取菌體裂解后所得上清IOml與Iml 50% Ni+-NTA混勻。4°C條件下，反復(fù)溫和振蕩使其充分結(jié)合后，裝Ni+柱；(2)打開Ni+柱蓋子，使柱內(nèi)液體自然流出，收集穿柱液。(3)用25ml洗滌緩沖液洗滌Ni+柱3次，收集過柱洗滌液。(4)用洗脫緩沖液過柱洗脫蛋白，每次1ml，收集每次洗脫液，監(jiān)測(cè)洗脫液乳酸脫氫酶活性，適時(shí)終止洗脫。在純化過程中，用OLYMPUS AU2700自動(dòng)生化分析儀監(jiān)測(cè)純化前菌體上清及穿柱液、洗滌液、洗脫液中的乳酸脫氫酶活性。將未誘導(dǎo)菌體、誘導(dǎo)后菌體及穿柱液、洗滌液、洗脫液等進(jìn)行12%SDS-PAGE鑒定其內(nèi)蛋白質(zhì)成分。純化蛋白的濃縮及定量:將上述純化所得的重組蛋白液，裝入一透析帶中，兩端用線扎緊，經(jīng)PBS透析平衡后，埋入裝有蔗糖的平皿中。待液體濃縮至理想體積時(shí)，用蛋白定量試劑盒(PIERCE公司產(chǎn)品)進(jìn)行蛋白定量，具體方法如下:(I)用試劑盒提供標(biāo)準(zhǔn)品制備蛋白濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，輸入微量核酸-蛋白定量?jī)x備用。(2)將試劑盒提供的A液與B液按照50:1比例混合，即為工作液。(3)將25μ1待測(cè)樣品加入200μ1工作液中，37°C水浴30min。(4)冷卻至室溫，在波長562nm處測(cè)吸光度，微量核酸-蛋白定量?jī)x自動(dòng)換算蛋白濃度。25μ1 PBS加入200μ1工作液中作為空白對(duì)照調(diào)零。取一定量濃縮定量后的純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后觀察電泳區(qū)帶，以此鑒定純化蛋白的純度。IOOOml菌液共可獲得目的蛋白約1.5mg。3人血清抗LDH-C4抗體(IgG型)間接ELISA方法的建立
酶標(biāo)抗體最適工作濃度的確定:(I)用100ng/ml人IgG包被酶標(biāo)板(4°C 18_24h)，PBS洗滌3次，每次5min。(2)將HRP標(biāo)記鼠抗人IgG用1% BSA-PBS稀釋液作一系列稀釋(I:2500-1 =80000),分別加入IgG包被孔內(nèi)，每孔ΙΟΟμΙ，室溫下反應(yīng)2h后，PBS洗滌3次，每次5min。(3)加入底物H202/TMB，37°C孵浴20min，加入2M H2S04終止反應(yīng)后測(cè)OD值。(4)依據(jù)文獻(xiàn)，以0D495值為1.0時(shí)的酶標(biāo)鼠抗人IgG抗體稀釋度(1:20000)為最適工作濃度。抗原最適包被濃度的確定:(I)將rhLDH_C4抗原以pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋為 0.000,0.125,0.250,0.500,1.000,2.000 和 4.000 μ g/ml 等一系列濃度，然后加到酶標(biāo)板的微量孔中，每個(gè)濃度的抗原各包被6孔，每孔ΙΟΟμΙ。(2)將酶標(biāo)板置4°C包被過夜(18-24h)。(3)取出板，以PBS洗滌3次，每次3min，扣干。(4)每孔加200μ1的封閉液，將酶標(biāo)板置濕盒內(nèi)，于37°C封閉2h。(5)取出板，以PBS洗滌3次，每次3min，扣干。(6)每一包被濃度分別加1:100稀釋的陽性對(duì)照血清(PC)、陰性對(duì)照血清(NC)及稀釋液(空白對(duì)照)，各2孔，每孔ΙΟΟμΙ。(7)將酶標(biāo)板置濕盒內(nèi)，于37°C反應(yīng)Ih0以0.05%Tween-20_PBS洗滌5次,每次3min，扣干。(8)每孔加1:20000稀釋的酶標(biāo)抗體，每孔ΙΟΟμΙ。置濕盒內(nèi)，于37°C反應(yīng)lh。(9) PBS洗滌5次，每次3min，扣干。每孔加ΙΟΟμΙ的底物液，37°C作用20min。(10)以2M H2S04終止反應(yīng)，每孔50μ1。( 11)在495nm的波長下讀取各孔OD值，以O(shè)D陽性對(duì)照/OD陰性對(duì)照比值最大者為最適抗原包被濃度(1.000 μ g/ml)。臨界值(cut-off)的確定:以確定的最適抗原包被濃度及酶標(biāo)抗體工作濃度，測(cè)定25份處女(小于10歲)血清標(biāo)本OD值，計(jì)算其均數(shù)()及標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。以處女血清標(biāo)本OD值的平均值加3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差作為陽性血清標(biāo)本的判定臨界值(cut-off)，即cut-off=+3SD ；0D值> cut-off判定為陽性，OD值< cut-off判定為陰性。重復(fù)性檢測(cè):取建立的ELISA法檢測(cè)陽性和陰性的血清標(biāo)本各一份，分別同時(shí)測(cè)定4孔，計(jì)算其批內(nèi)變異系數(shù)；不同時(shí)間點(diǎn)先后4次測(cè)定同一份陰性血清標(biāo)本和同一份陽性血清標(biāo)本，計(jì)算其批間差異；當(dāng)批間及批內(nèi)差異均小于10%時(shí)，說明所建立的ELISA方法穩(wěn)定性良好。(三)效果
以100ng/ml人IgG包被酶標(biāo)板,與一系列稀釋的鼠抗人IgG(HRP)酶標(biāo)抗體反應(yīng)后確定1:20000為酶標(biāo)抗體最適工作濃度，lug/ml為rhLDH—C4抗原最適包被濃度,判定臨界值(⑶T一OFF)確定為0.110，重復(fù)性檢測(cè)顯示批內(nèi)，批間差異均小于10%，說明所建立的間接ELISA方法重復(fù)性良好。應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)建立的方法與ASA免疫膠體金檢測(cè)試劑盒同時(shí)檢測(cè)47份血清標(biāo)本，ASA免疫膠體金檢測(cè)試劑盒陽性率為21.28%ο而抗LDH-C4抗體檢測(cè)的間接ELISA方法檢測(cè)陽性率為40.43%，SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算，卡方值(x 2)為4.27，P〈0.05，說明兩種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果存在明顯差異。究其原因可能是:免疫膠體金檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的是復(fù)合ASA，其所用的包被抗原是一種復(fù)合抗原(即可溶性精子膜抗原)，其抗原成分復(fù)雜，其中大部分抗原與不育無關(guān)，甚至一部分與不育密切相關(guān)的抗原成分由于制作工藝的缺陷而丟失或含量降低，故其檢測(cè)結(jié)果經(jīng)常不可靠，缺乏臨床參考價(jià)值。而本實(shí)驗(yàn)建立的ELISA方法是以單一精子特異性rhLDH-C4作為包被抗原，僅針對(duì)血清LDH-C4抗體進(jìn)行檢測(cè)，它避免了包被抗原中可能混有其它非特異蛋白成分對(duì)結(jié)果造成的干擾，大大地提高了檢測(cè)的敏感性及特異性。四
具體實(shí)施例方式
用本研究建立的間接ELISA方法檢測(cè)74份已育者血清標(biāo)本和177份不明原因不育者血清標(biāo)本。結(jié)果顯示:不育者血清標(biāo)本陽性率為30.51%,已育者血清標(biāo)本陽性率僅為
9.46%。應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算，卡方值(x 2)為12.57，Ρ〈0.005，說明兩者陽性率差別具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，已育者血清標(biāo)本出現(xiàn)陽性可能是由于:生育后由于各種原因，已育夫婦體內(nèi)發(fā)生了免疫性不育，而取樣時(shí)仍將其當(dāng)成可育。
權(quán)利要求
1.本研究將從人睪丸XTripExCDNA文庫中克隆的人精子特異性乳酸脫氫酶(sperm-specific lactate dehydrogenases, LDH-C4)與高效原核表達(dá)載體pET_28a(+)連接，構(gòu)建了 pET-28 (a+) -hLDHC重組質(zhì)粒，將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Ecol.BL21 (DE3)plysS溶原菌中表達(dá)，在0.1mM IPTG誘導(dǎo)下可高效表達(dá)可溶性的rhLDH-C4蛋白，經(jīng)Ni+-NTA親和層析法純化并用透析帶濃縮后，濃度可達(dá)1.0mg/ml，IOOOml菌液共可獲得目的蛋白約1.5mg ;以此純化蛋白作為包被抗原建立人血清抗LDH-C4抗體(IgG型)檢測(cè)的間接ELISA方法，為準(zhǔn)確的檢測(cè)不育患者體內(nèi)的自身抗體(LDH-C4抗體)提供一種可靠的臨床參考指標(biāo)；故要求如下: (I)pET-28 (a+) -hLDHC原核重組載體的保存及使用。
2.(2) rhLDH-C4重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化技術(shù)。
3.(3) rhLDH-C4純化蛋白在臨床上的應(yīng)用以及以此為原料開發(fā)新的試劑盒。
全文摘要
一種用于檢測(cè)免疫不育相關(guān)自身抗體的新型抗原，該發(fā)明屬生殖免疫學(xué)免疫不孕領(lǐng)域。目前，免疫不育者的實(shí)驗(yàn)室診斷主要是針對(duì)抗精子抗體。然而，精子抗原是一種復(fù)合性抗原，其中的大部分與不育無關(guān)。精子特異性乳酸脫氫酶是與不育有密切關(guān)系的精子抗原的一種。本研究利用分子克隆的方法構(gòu)建了人精子特異性乳酸脫氫酶重組載體，將此載體轉(zhuǎn)化E.coliBL21后在異丙基硫代-β-D-半乳糖苷誘導(dǎo)下，此轉(zhuǎn)化菌可高效表達(dá)rhLDHC4蛋白，純化后以此蛋白建立了人血清抗LDH-C4抗體(IgG型)檢測(cè)的間接ELISA方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用此方法檢測(cè)已育者血清和不明原因不育者血清。兩者陽性率差別具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
文檔編號(hào)G01N33/531GK103175952SQ20111043531
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月22日
發(fā)明者蘭風(fēng)華 申請(qǐng)人:蘭風(fēng)華