專利名稱：有機磷農藥生物標志物的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種有機磷農藥生物標志物的電化學檢測方法。利用肟類復活劑對抑制后乙酰膽堿酯酶(AChE)的復活作用，通過酶活性的變化測定有機磷農藥生物標志物的含量，用于評估生物體內有機磷農藥暴露的情況。
背景技術：
大多數有機磷農藥(organophosphorous pesticides, OPs)顯示出低的環(huán)境持久性，但長時間、大面積使用或接觸這類農藥已經給生態(tài)環(huán)境和人類健康帶來了巨大威脅，對其所產生的生物效應和環(huán)境風險進行評價已成為分析化學和農藥化學領域最重要的研究內容之一。OPs的毒作用機制是它能與機體內的膽堿酯酶(cholinesterase，ChE)的活性位點的絲氨酸羥基共價結合，形成磷酰化膽堿酯酶復合物(OP-ChE)，導致酶的活性降低而不能催化水解作為神經遞質的乙酰膽堿，使神經傳導受阻。目前的檢測方法都是通過測定酶活性的降低并于標準值進行比較，來判斷有機磷農藥的中毒狀況。但是，由于個體間膽堿酯酶的含量差異，導致標準值的波動很大，從而對于低劑量有機磷農藥暴露無法準確定量。 OP-ChE作為有機磷農藥生物標志物，為早期監(jiān)測有機磷農藥的接觸水平和預測可能的毒性作用提供了新途徑。因此，發(fā)展快速、靈敏、高效、安全的OP-ChE的檢測方法對監(jiān)測機磷農藥暴露十分必要。肟類化合物，如解磷定(Pralidoxime，PAM-C1/I)、雙復磷(Obidoxime,DM04)、雙解磷(Trimedoxime，TMB4)，HI-6等，是一類膽堿酯酶復活劑，它們能使乙磷?；憠A酯酶加合物(OP-AChE)中被抑制的酶脫離出來，完全恢復酶的活性，即復活過程。因此，復活后的乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)含量可作為個體的標準值，避免了個體之間正常AChE的水平差異。基于此思想，申請人提出了一種新的有機磷農藥生物標志物的檢測方法，分別測量復活前、后AChE的活性，根據兩者之間的活性差異，得到對應乙磷?；憠A酯酶加合物(OP-AChE)含量，從而判斷農藥的接觸水平。該方法無需標準AChE含量作為基線，克服了個體差異的影響，為監(jiān)測低劑量有機磷農藥暴露提供了新途徑。

發(fā)明內容
本發(fā)明提出了一種新的有機磷農藥生物標志物的檢測方法。該方法分別測量復活前、后乙酰膽堿酯酶(AChE)的活性，根據兩者之間的活性差異，得到對應乙磷?；憠A酯酶加合物(OP-AChE)含量，從而判斷農藥的接觸水平。該方法以復活后AChE含量作為個體自身的基準，消除了個體間正常水平AChE的變異性。本發(fā)明的技術方案有機磷農藥的電化學檢測方法第一步四氧化三鐵與金納米(Fe304/AuNPs)磁性納米粒子制備1)將0. Olwt %的四氯化金IOOmL溶液在攪拌的條件下加熱煮沸，隨后一次性加入 1. 0襯％檸檬酸三鈉溶液2. 5mL，待溶液顏色變成酒紅色金膠溶液后，使金膠溶液繼續(xù)攪拌lOmin，再停止加熱使其冷卻至室溫，保存于4°C冰箱中備用；2)取IOmg羧基化磁性納米粒子(Fe3O4-COOH)加入到IOmL含O. 20wt%聚二甲基二烯丙基氯化銨(Poly(diallyldimethylammonium chloride, PDDA)的 2OmM Tris/NaCl 溶液中，超聲振蕩30min，用磁鐵進行磁分離、蒸餾水洗滌，棄去多余的PDDA，得到潔凈的 PDDA-Fe3O4磁性納米粒子；再把PDDA-Fe3O4和50mL步驟1)制備的金膠溶液進行混合攪拌 30min，帶負電的金納米粒子自組裝到帶正電的PDDA-Fe3O4納米粒子表面，磁鐵磁分離，蒸餾水洗滌，配成lmg/mL核殼式Fe304/AuNPs磁性納米粒子。第二步磷?；阴Ｄ憠A酯酶加合物OP-AChE的制備對氧磷(paraoxon，OP)作為有機磷農藥的模型分子，制備乙酰膽堿酯酶加合物 (OP-AChE)。將對氧磷溶解在乙醇溶液中，用pH 7.0磷酸緩沖溶液(PBS)稀釋成不同濃度的溶液；取1. OmL含有3nM AChE的PBS溶液與一系列不同濃度的對氧磷(對氧磷的最終濃度分別為0. Ing/mL, 0. 2ng/mL, 0. 5ng/mL, Ing/mL, 2ng/mL, 5ng/mL, lOng/mL, 15ng/mL)混合， 在37°C下溫浴反應30min，得到不同抑制程度的乙酰膽堿酯酶(AChE)，即生成了不同濃度的 OP-AChE。第三步=OP-AChE的復活及吸附取制備好的不同濃度的1. OmLOP-AChE與等體積的5mM碘解磷定(Pralidoxime iodide, 2-PAM)混合反應15min，讓抑制的AChE完全恢復活性，然后加入50 μ L氯化乙酰硫代膽堿(Acetylthiocholine chloride, ATC1)，ATCl 最終濃度為 3mM，溫浴反應 5min，使其充分反應，產生硫代膽堿(thiochline)，再加入制備好的250 μ L濃度為lmg/mLFe304/AuNPS 磁性納米粒子，震蕩搖勻30min，磁鐵磁分離，蒸餾水洗滌，形成待檢測的Fe304/AuNPS-硫代膽堿納米復合物；作為對照，未受對氧磷抑制的3nM乙酰膽堿酯酶(AChE)與同樣濃度的氯化乙酰硫代膽堿混合后加入同樣的Fe3O4AuNPs磁性納米粒子；第四步線性掃描法測定取20 μ L上述自組裝好的Fe304/AuNPs-硫代膽堿懸液滴于工作電極表面，印刷電極下放置一塊磁鐵，在外加磁場的作用下，Fe304/AuNPS-硫代膽堿緊附于工作電極表面，再滴加50 μ L磷酸緩沖溶液(PBS)，用線性掃描法進行電化學檢測，在掃速為50mV/s，電位掃描范圍0. 2 1. 2V條件下電化學檢測；作為對照，未受對氧磷抑制的3nM乙酰膽堿酯酶與同樣濃度的氯代乙酰硫代膽堿混合后反應，用上述同樣的方式進行檢測，抑制率和復活率按如下公式計算1%= (io-it)/ioX100%I1V0= (ir-it)/irX100%R%= (ir-it)/(i0-it) X100%其中i。和it分別來自未經過農藥抑制和經過農藥抑制后的乙酰膽堿酯酶和氯代乙酰硫代膽堿溶液反應的峰電流，i,為乙酰膽堿酯酶復活后測得的峰電流。本發(fā)明有益效果1、核殼式Fe3O4AuNPs磁性納米粒子。一方面，由于其磁性核的存在，可以通過磁分離進行分離、純化。另一方面，AuNPs附著于Fe3O4表面有較大的比表面積，對硫代膽堿有更強的富集能力，并加速了電子的傳遞。2、被抑制的AChE被肟類完全復活，樣品復活后的ChE含量減去復活前活性ChE含量，即可得到OP-AChE的含量。3、以樣品自身復活后的AChE為基準，無需基線對照，避免了個體間正常AChE水平的差異，使得檢測更加可靠和精準。


圖1核殼式Fe304/AuNPs磁性納米粒子組裝和硫代膽堿檢測的原理示意2四氧化三鐵(Fe3O4)和Fe304/AuNPs磁性納米粒子的透射/掃描電鏡圖中圖a與圖c是Fe3O4和Fe304/AuNPs磁性納米粒子的透射電鏡圖，說明諸多顆粒狀金納米AuNPs存在；圖b與圖d是Fe3O4和Fe304/AuNPs的掃描射電鏡圖，顯示了金納米(AuNPs)均勻的包裹在四氧化三鐵(Fe3O4)的表面。圖30P_AChE加合物的檢測原理有機磷農藥和AChE結合形成加合物OP-AChE，抑制了酶的活性。使用碘解磷定 (Pralidoxime iodide, 2-PAM)后，被抑制的AChE的活性得以恢復。通過反應途徑①，測定被有機磷抑制的AChE樣品經2-PAM復活后酶的活性，得到AChE的總量；通過反應途徑②， 測定被農藥抑制后樣品中酶的活性。那么，被抑制的AChE的量，即形成加合物OP-AChE的含量，就等于總酶量減去活性酶量的差值。這種檢測機制是建立在復活劑對酶活恢復效率很高且可以把復活后的酶活作為基準的基礎上的。表IOP-AChE 的檢測通過AChE酶活的標準曲線計算得到的受不同濃度對氧磷抑制和復活后的樣品中 AChE的濃度，從而計算得到OP-AChE加合物的含量。測得結果如表1。表 權利要求
1.有機磷農藥生物標志物的檢測方法，其特征是電化學檢測方法，測定分兩個步驟 第一步乙酰膽堿酯酶加合物的復活及吸附分別取1. OmL濃度為0. lng/mL,0. 2ng/mL、0. 5ng/mL、lng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL 和 15ng/mL 的對氧磷抑制的乙酰膽堿酯酶混合液，與等體積的5mM碘解磷定混合反應15mi n，讓抑制的乙酰膽堿酯酶完全恢復活性， 然后加入50 μ L氯化乙酰硫代膽堿，氯化乙酰硫代膽堿的最終濃度為3mM，溫浴反應5min， 使其充分反應，產生硫代膽堿，再加入制備好的250 μ L濃度為lmg/mL Fe3O4AuNPs磁性納米粒子，震蕩搖勻30min，磁鐵磁分離，蒸餾水洗滌，形成待檢測的Fe304/AuNPS-硫代膽堿納米復合物；作為對照，未受對氧磷抑制的3nM乙酰膽堿酯酶與同樣濃度的氯化乙酰硫代膽堿混合后加入同樣的Fe304/AuNPs磁性納米粒子；第二步線性掃描法測定取20 μ L上述自組裝好的Fe304/AuNPS-硫代膽堿懸液滴于工作電極表面，印刷電極下放置一塊磁鐵，在外加磁場的作用下，Fe304/AuNPS-硫代膽堿緊附于工作電極表面，再滴加50 μ L磷酸緩沖溶液，用線性掃描法進行電化學檢測，在掃速為 50mV/s,電位掃描范圍0. 2 1. 2V條件下電化學進行檢測；作為對照，未受對氧磷抑制的 3nM乙酰膽堿酯酶與同樣濃度的氯代乙酰硫代膽堿混合后反應，用上述同樣的方式進行檢測，抑制率和復活率按如下公式計算 1%= (io-it)/ioX100% I1V0= (ir-it)/irX100% R%= (ir-it)/(i0-it) X100%其中i。和it分別來自未經過農藥抑制和經過農藥抑制后的乙酰膽堿酯酶和氯代乙酰硫代膽堿溶液反應的峰電流，k為乙酰膽堿酯酶復活后測得的峰電流。
2.權利要求1中所用Fe304/AuNPS磁性納米粒子制備方法，其特征在于，制備步驟如下1)將0.Olwt %的四氯化金IOOmL溶液在攪拌的條件下加熱煮沸，隨后一次性加入 1. Owt %檸檬酸三鈉溶液2. 5mL，待溶液顏色變成酒紅色金膠溶液后，使金膠溶液繼續(xù)攪拌 lOmin，再停止加熱使其冷卻至室溫，保存于4°C冰箱中備用；2)取IOmg羧基化磁性納米粒子加入到IOmL含0.20wt %聚二甲基二烯丙基氯化銨溶液的20mM Tris/NaCl溶液中，超聲振蕩30min，磁鐵磁分離、蒸餾水洗滌，棄去多余的PDDA， 得到潔凈的PDDA-Fe3O4磁性納米粒子；再把PDDA-Fe3O4和50mL步驟1)制備的金膠溶液進行混合攪拌30min，帶負電的金納米粒子自組裝到帶正電的PDDA-Fe3O4納米粒子表面，磁鐵磁分離，蒸餾水洗滌重懸浮，配成lmg/mLFe304/AuNPS核殼式磁性納米粒子。
全文摘要
本發(fā)明公開了有機磷農藥生物標志物的檢測方法。該方法利用肟類復活劑對抑制后乙酰膽堿酯酶(AChE)的復活作用，用線性掃描法分別測量復活前、后AChE的活性，根據兩者之間的活性差異，得到對應乙酰膽堿酯酶加合物OP-AChE含量，從而判斷農藥的接觸水平。該方法以復活后AChE含量作為個體自身的基準，消除了個體間正常水平AChE的變異性。
文檔編號G01N27/48GK102507714SQ20111034957
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月7日 優(yōu)先權日2011年11月7日
發(fā)明者張愛東, 杜丹, 陶媛 申請人:華中師范大學