專利名稱：檢測物的檢測裝置、電極、基板、檢查芯片及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測物的檢測裝置、電極基板、工作電極、檢查芯片、檢測物的檢測方法、以及受測物的檢測方法。更具體而言，本發(fā)明涉及的是用于檢測或定量受測物、并據(jù)此進(jìn)行疾病的臨床檢查及診斷等的檢測物的檢測裝置、電極基板、工作電極、檢查芯片、檢測物的檢測方法及受測物的檢測方法。
背景技術(shù)：
疾病的臨床檢查和診斷往往是如下進(jìn)行的用遺傳基因檢測方法和免疫學(xué)檢測方法等方法檢測生物試樣中含有的與疾病相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)等。在這種臨床檢查和診斷中，有人提出用光激勵具有光化學(xué)活性的標(biāo)記物，并用如此產(chǎn)生的電流檢測基因和蛋白質(zhì)等受測物(光電化學(xué)檢測方法)(例如參照美國公開專利第2009/294305號等)。
美國公開專利第2009/294305號公開的方法是用具有光化學(xué)活性的增感色素等檢測物，根據(jù)該檢測物的光激勵所產(chǎn)生的電流，檢測受測物。在此美國公開專利第 2009/294305號公開的方法中，首先要用具有光化學(xué)活性的檢測物標(biāo)記受測物。然后，用光照標(biāo)記后受測物，使標(biāo)記后受測物中所含增感色素產(chǎn)生光激勵。測定光激勵所產(chǎn)生的電流。 根據(jù)此電流的測定結(jié)果可以靈敏地檢測出受測物。然而，要檢測出更微量的受測物，檢測靈敏度還有待提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的范圍只由后附權(quán)利要求書所規(guī)定，在任何程度上都不受這一節(jié)發(fā)明內(nèi)容的陳述所限。
本發(fā)明正是鑒于上述情況，其目的在于提供可以一種能夠靈敏地檢測出檢測物的檢測物的檢測裝置、電極基板、工作電極、檢查芯片、以及受測物的檢測方法。
在提高光電化學(xué)檢測方法中受測物的檢測靈敏度的方法中，已知有一種方法是通過增加光源照射出的激勵光的強(qiáng)度，相對增強(qiáng)因檢測物等而產(chǎn)生的光電流。但是，在這種方法中，非因檢測物等而產(chǎn)生的光電流也會一起被相對增強(qiáng)，S/N比可能會惡化。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了以下事項(xiàng)，從而完成了本項(xiàng)發(fā)明將通過了工作電極主體的激勵光反射到工作電極主體上的檢測物，以此可以在不增加非因檢測物而產(chǎn)生的光電流的情況下，增加因檢測物而產(chǎn)生的光電流，。
本發(fā)明提供
(1) 一種檢測裝置，用光電化學(xué)法檢測因光激勵而產(chǎn)生電子的檢測物，該裝置包括工作電極主體，能夠容納所述檢測物產(chǎn)生的電子，并具有透光性；反電極；光源，向所述工作電極主體上的檢測物照射激勵光；及反射部件，用于將所述光源照射出的、并且通過了所述工作電極主體的激勵光反射到所述工作電極主體上的檢測物上。
(2) (1)所述檢測裝置，其中所述反射部件選自由白金、鋁、金、銀和銅所組成的群中的至少一種構(gòu)成。
(3)⑴所述檢測裝置，其中所述工作電極主體由導(dǎo)電層和電子容納層構(gòu)成。
(4) (1)所述檢測裝置，其中所述光源配置在用于容納所述工作電極主體上的檢測物的電子的電子容納面一側(cè)，所述反射部件設(shè)置在與所述電子容納面相反的一面。
(5) (4)所述檢測裝置，其中所述反射部件設(shè)置在遠(yuǎn)離所述工作電極主體的位置。
(6) (4)所述檢測裝置，其中所述反射部件通過具有透光性的絕緣層與所述工作電極主體成為一體。
(7) (6)所述檢測裝置，其中與所述工作電極主體上的所述電子容納面相反一側(cè)的表面有具有透光性的絕緣層。
(8) (6)所述檢測裝置，其中所述絕緣層是用于保持工作電極主體的形態(tài)的基板主體。
(9) (4)所述檢測裝置，其中所述反射部件設(shè)置在用于保持工作電極主體的形態(tài)的基板主體上。
(10) (1)所述檢測裝置，其中所述光源配置在用于容納所述工作電極主體上的檢測物的電子的電子容納面的相反一側(cè)，所述反射部件設(shè)在所述電子容納面一側(cè)中遠(yuǎn)離所述工作電極主體的位置。
(11) (10)所述檢測裝置，其中在與所述工作電極主體上的所述電子容納面相反一側(cè)的表面上設(shè)有具有透光性的絕緣層。
(12) 一種電極基板，用光電化學(xué)法檢測因光激勵而產(chǎn)生電子的檢測物，該基板包括基板主體；工作電極主體，位于所述基板主體上、能夠容納所述檢測物產(chǎn)生的電子，且具有透光性；及反射部件，位于所述基板主體上、能夠?qū)⒐庠凑丈涑龅?、透過了所述工作電極主體的激勵光反射到所述工作電極主體上的檢測物上。
(13) (12)所述電極基板，其中所述基板主體上有反電極。
(14) 一種工作電極，用光電化學(xué)法檢測因光激勵而產(chǎn)生電子的檢測物的，該電極包括工作電極主體，位于所述基板主體上、能夠容納所述檢測物產(chǎn)生的電子，且具有透光性；及反射部件，位于所述基板主體上，將光源照射出的、透過了所述工作電極主體的激勵光反射到所述工作電極主體上的檢測物上。
(15) 一種檢查芯片，用光電化學(xué)法檢測因光激勵而產(chǎn)生電子的檢測物，該芯片包括電極基板，由基板主體、工作電極主體、以及反射部件構(gòu)成，其中所述工作電極主體位于所述基板主體上，能夠容納所述檢測物產(chǎn)生的電子，且具有透光性；所述反射部件位于所述基板主體上，將光源照射出的、且透過了所述工作電極主體的激勵光反射到所述工作電極主體上的檢測物上；及反電極。
(16) 一種檢測物的檢測方法，用具有透光性的工作電極主體和反電極，對因光激勵而產(chǎn)生電子的檢測物進(jìn)行光電化學(xué)檢測，該方法包括使所述工作電極主體上存在有檢測物；向所述工作電極主體上的檢測物照射激勵光；將透過了所述工作電極主體的激勵光反射到所述工作電極主體上的檢測物上；及測定所述工作電極主體與反電極之間的電流。
(17) 一種受測物的檢測方法，用具有透光性的工作電極主體和反電極對受測物進(jìn)行光電化學(xué)檢測，該方法包括使受測物與標(biāo)記結(jié)合物接觸，形成受測物與標(biāo)記結(jié)合物的復(fù)合物，其中所述標(biāo)記結(jié)合物是用標(biāo)記物標(biāo)記用于捕捉此受測物的結(jié)合物而形成的；使所述工作電極主體上至少存在有標(biāo)記物；向所述工作電極主體上的標(biāo)記物照射激勵光；將透過了所述工作電極主體的激勵光反射到所述工作電極主體上的標(biāo)記物上；及測定所述工作電極主體與反電極之間的電流。
采用本發(fā)明的檢測物的檢測裝置、電極基板、工作電極、檢查芯片、以及受測物的檢測方法，可以高靈敏度地檢測出檢測物和受測物。


圖1為本發(fā)明一實(shí)施方式涉及的檢測物的檢測裝置的結(jié)構(gòu)斜視說明圖2為圖1所示檢測裝置的結(jié)構(gòu)框圖3為本發(fā)明另一實(shí)施方式涉及的檢測物的檢測裝置的結(jié)構(gòu)框圖4為本發(fā)明一實(shí)施方式涉及的檢查芯片的斜視說明圖5為圖4所示檢查芯片的AA—線的截面說明圖6A為圖4所示檢查芯片中所含上基板的平面說明圖6B為圖4所示檢查芯片中所含下基板的平面說明圖7(a)為圖4所示檢查芯片中含工作電極的部分的簡略示意圖、(b)為圖4所示檢查芯片中含工作電極的部分的變形例的簡略示意圖8為本發(fā)明其他實(shí)施方式涉及的檢查芯片的截面說明圖9(a)為圖8所示檢查芯片中含工作電極的部分的簡略示意圖、(b)為圖8所示檢查芯片中含工作電極的部分的另一例的簡略示意圖IOA為上基板變形例的平面說明圖IOB為下基板變形例的平面說明圖IlA為上基板變形例的平面說明圖IlB為下基板變形例的平面說明圖12A為上基板變形例的平面說明圖12B為下基板變形例的平面說明圖12C為間隔固定件的變形例斜視說明圖13為本發(fā)明一實(shí)施方式涉及的檢測物的檢測方法的處理步驟流程圖14為本發(fā)明一實(shí)施方式涉及的檢測物的檢測方法中各步驟的概要說明圖15為激勵光照射步驟及激勵光反射步驟中光源和反射部件的配置的變形例的簡要說明圖16為激勵光照射步驟及激勵光反射步驟中光源和反射部件的配置的變形例的簡要說明圖17為激勵光照射步驟及激勵光反射步驟中光源和反射部件的配置的變形例的簡要說明圖18為激勵光照射步驟及激勵光反射步驟中光源和反射部件的配置的變形例的簡要說明圖19為本發(fā)明其他實(shí)施方式涉及的檢測物的檢測方法的處理步驟流程圖20為本發(fā)明其他實(shí)施方式涉及的檢測物的檢測方法各步驟的概要說明圖21為本發(fā)明一實(shí)施方式涉及的受測物的檢測方法的處理步驟流程圖22為在本發(fā)明一實(shí)施方式涉及的受測物的檢測方法各步驟中，從受測物捕捉步驟到分離步驟的簡要說明圖23為本發(fā)明其他實(shí)施方式涉及的受測物的檢測方法的處理步驟流程圖M為本發(fā)明另一實(shí)施方式涉及的受測物檢測方法的處理步驟流程圖25為本發(fā)明再一實(shí)施方式涉及的受測物檢測方法的處理步驟流程圖2隊(duì)為制造例1獲得的電極基板的工作電極的結(jié)構(gòu)簡要說明圖^B為圖所示電極基板的BB —線的截面說明圖^C為圖26A所示電極基板的CC 一線的截面說明圖27為試驗(yàn)例1中對所用電極的種類(透過型和反射型)與光電流之間關(guān)系進(jìn)行調(diào)查所獲得的結(jié)果圖28A為試驗(yàn)例2對所用電極的種類和激勵光強(qiáng)度與光電流之間的關(guān)系進(jìn)行調(diào)查所獲得的結(jié)果圖28B為試驗(yàn)例2對所用電極的種類和激勵光強(qiáng)度與S/N比之間的關(guān)系進(jìn)行調(diào)查所獲得的結(jié)果圖四為試驗(yàn)例3中對所用電極的種類(透過型和反射型)與光電流之間關(guān)系進(jìn)行調(diào)查所獲得的結(jié)果圖30A為制造例4中獲得的電極基板的工作電極的結(jié)構(gòu)概要說明圖30B為圖30A所示電極基板的BB —線的截面說明圖30C為圖30A所示電極基板的CC 一線的截面說明圖31為試驗(yàn)例4中對所用電極的種類(透過型和反射型)與光電流之間關(guān)系進(jìn)行調(diào)查所獲得的結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式
下面參考附圖，就本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行說明。
[用詞的定義]
在本說明書中，“因光激勵而產(chǎn)生電子的檢測物，，是指在工作電極上進(jìn)行光電化學(xué)檢測的目標(biāo)物，包含標(biāo)記物。在此，標(biāo)記物為選自以下物質(zhì)組成的群中的至少其中之一金屬配合物、有機(jī)熒光體、量子點(diǎn)、及無機(jī)熒光體。標(biāo)記物的具體例子可以舉出金屬酞菁、釕配合物、鋨配合物、鐵配合物、鋅配合物、9-苯基氧雜蒽(phenylxanthene)類色素、花青色素、金屬花青(MetalloCyanine)色素、氧雜蒽類色素、三苯甲烷(triphenylmethane)類色素、氮蒽(acridine)類色素、惡嗪(Oxazine)類色素、香豆素類色素、部花青(Merocyanine) 類色素、若丹菁(rhodacyanine)類色素、聚甲炔(polymethine)類色素、嚇啉(porphyrin) 類色素、酞菁(phtharocyanine)類色素、若丹明類色素、氧雜蒽(xanthene)類色素、葉綠素類色素、曙紅(eosin)類色素、紅汞(mercurochrome)類色素、靛青(indigo)類色素、氟硼熒(BODIPY)類色素、卡爾科弗盧爾(CALFluor)類色素、俄勒岡綠(Oregongreen)類色素、 對甲氨基酚(Miodol)綠、德克薩斯紅、級聯(lián)藍(lán)(Cascade Blue)、核酸(DNA、RNA等)、硒化 fg (cadmiumselenide)(Cadmium telluride) > Ln203:Re> Ln202S:Re> Zn0> Caff04> MO · xA1203:Eu、Zn2Si04:Mn、LaP04:Ce、Tb、Cy3、Cy3. 5、Cy5、Cy5. 5、Cy7、Cy7. 5 及 Cy9 (全部為安瑪西亞生物科學(xué)公司(Amersham Biosciences)生產(chǎn))；Alexa Fluor 355, AlexaFluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor546、 Alexa Fluor 555、Alexa Fluor568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluo r 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fl uor 660、Alexa Fluor 680、AlexaFluor 700、Alexa Fluor 750 禾口 Alex a Fluor 790(全部為分子探針(Molecular Probes)公司生產(chǎn))；DY-610、DY-615、DY-630、 DY-631、DY-633、DY-635、DY-636、EVOblue 10、EVOblue 30、DY-647、DY-650、DY-651、 DY-800、DYQ-660 和 DYQ-661(全部由 Dyomics 公司生產(chǎn))；Atto 425,Atto 465,Att ο 488、 Atto 495、Atto 520、Atto 532、A tto 550、Atto 565、Atto 590、Atto 594、Atto 610、Atto 611X、Atto 620、Att ο 633、Atto 635、Atto 637、Atto 647、A tto 655、Atto 680、Atto 700, Atto 725 和 Atto 740 (全部由 Atto-TEC GmbH 公司生產(chǎn))；VivoTagS680、VivoTag680 和VivoTagS750(全部由VisEnMedical公司生產(chǎn))。Ln表示La、Gd、Lu或Y，Re表示鑭類元素，M表示堿土類金屬元素，χ表示0.5 1.5的數(shù)字。關(guān)于標(biāo)記物的其他例子，可以參考美國專利公報(bào)第2009/294305號、美國專利公報(bào)第5893999號、特愿(日本專利申請)第 2008-154179號公報(bào)等。
在本說明書中，檢測物可以是標(biāo)記物直接結(jié)合到受測物而形成的復(fù)合物。檢測物也可以是在固相上捕捉到受測物后，讓標(biāo)記物結(jié)合到與所捕捉的受測物的量相應(yīng)存在的物質(zhì)上而形成的復(fù)合物。在此，所謂固相是指由二氧化硅(玻璃)、金屬等無機(jī)材料、聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylene ter印hthalate)、聚酰亞胺(PI)樹脂等塑料材料構(gòu)成的基板或至少含有這些材料中的其中之一的基板；可以是管筒；纖維；薄膜；納米結(jié)構(gòu)物(如中孔硅(mesoporous silica)等二氧化硅類納米結(jié)構(gòu)物、多孔氧化鋁(porous alumina)等)；也可以是玻璃珠、磁珠、金屬粒子、塑料珠等粒子或至少含這些微珠中的其中之一的粒子等。
在本說明書中，所謂“誘導(dǎo)用修飾物”是指將檢測物和標(biāo)記物等誘導(dǎo)到工作電極附近的物質(zhì)。
[檢測裝置的結(jié)構(gòu)]
下面根據(jù)

本發(fā)明的檢測物的檢測裝置的一例。
圖1為本發(fā)明一實(shí)施方式涉及的檢測物的檢測裝置的斜視說明圖。此檢測裝置1 是用光電化學(xué)法檢測因光激勵而產(chǎn)生電子的檢測物的檢測裝置。
檢測裝置1包括用于插入檢查芯片20的芯片接受部件11、以及用于顯示檢測結(jié)果的顯示器12。
圖2為圖1所示檢測裝置1的結(jié)構(gòu)框圖。檢測裝置1有顯示器12、光源13、電流表(電流測定部件)14、電源(加電部件)15、A/D轉(zhuǎn)換部件16和控制部件17。
光源13向檢查芯片20的工作電極上的檢測物照射光線，激勵該檢測物。此光源 13可以配置在后述檢查芯片20的工作電極的電子容納面一側(cè)。光源13也可以配置在后述檢查芯片20的工作電極的電子容納面相反一側(cè)。光源13只要能產(chǎn)生激勵光的光源即可。 作為這種光源比如有熒光燈、不可見光、殺菌燈、白熾燈、低壓水銀燈、高壓水銀燈、氙氣燈、 水銀氙氣燈、鹵鎢燈、金屬鹵化物燈、LED (白色LED、藍(lán)色LED、綠色LED和紅色LED等)、激光(二氧化碳激光、色素激光、半導(dǎo)體激光)、太陽光等。在光源當(dāng)中，以熒光燈、白熾燈、氙氣燈、鹵鎢燈、金屬鹵化物燈、LED、激光或太陽光為宜。在光源當(dāng)中，以激光更為理想。也可以根據(jù)需要，通過分光器和帶通濾波器進(jìn)行調(diào)整，使光源只照射一定波長帶的光。
電流表14用于測量因被激勵的檢測物所釋放的電子而產(chǎn)生的、在檢查芯片20內(nèi)流動的電流。
電源15用于給檢查芯片20上的電極施加一定電位。
A/D轉(zhuǎn)換部件16用于對電流表14測量的光電流值進(jìn)行數(shù)字化。
控制部件17由CPU、ROM、RAM等構(gòu)成，用于控制顯示器12、光源13、電流表14和電源15的運(yùn)行。控制部件17通過A/D轉(zhuǎn)換部件16進(jìn)行了數(shù)字化的光電流值，根據(jù)預(yù)先制成的、用于反映光電流值與檢測物的量的關(guān)系的檢量線，估算檢測物的量。
顯示器12用于顯示控制部件17估算出的檢測物的量。
在檢測裝置1中，當(dāng)檢查芯片使用無反射部件的檢查芯片，即使用無反射層的檢查芯片時(shí)，也可以在通過檢查芯片與光源13相對的位置上設(shè)置反射部件18 (參照圖3)。此反射部件18由能夠反射激勵光的材料構(gòu)成。這種材料無特別限定，如可以是白金、鋁、金、 銀、銅等金屬、合金或金屬化合物。
下面說明本發(fā)明一實(shí)施方式涉及的檢查芯片的結(jié)構(gòu)。圖4為本發(fā)明一實(shí)施方式涉及的檢查芯片20的斜視說明圖。圖5為圖4所示檢查芯片20的從AA—線的截面說明圖。
檢查芯片20由上基板30、設(shè)在上基板30下方的下基板40、以及夾在上基板30與下基板40之間的間隔固定件50構(gòu)成。在檢查芯片20中，上基板30和下基板40在一側(cè)重疊配置。上基板30和下基板40重疊的部分中間有間隔固定件50。
上基板30如圖6 (A)所示，由基板主體30a構(gòu)成。此基板主體30a設(shè)有試樣注入口 30b，用于向內(nèi)部注入含檢測物的試樣等。此試樣注入口 30b在基板主體30a上位于設(shè)有間隔固定件50的部分的內(nèi)側(cè)。
基板主體30a呈矩形。此基板主體30a的形態(tài)無特別限定，也可以是多角形、圓盤形等。從便于基板制作和便于使用的觀點(diǎn)出發(fā)，最好是矩形。構(gòu)成基板主體30a的材料無特別限定，比如可以是玻璃、聚對苯二甲酸乙二酯、聚酰亞胺(PI)樹脂等塑料材料、金屬等無機(jī)材料。在這些材料當(dāng)中，從確保透光性、足夠的耐熱性、持久性和平滑性的觀點(diǎn)以及降低材料所需成本的觀點(diǎn)出發(fā)，以玻璃為宜。從確保足夠的持久性的觀點(diǎn)來看，基板主體30a 的厚度以0. 01 Imm為宜，0. 1 0. 7mm更好，最好是約0. 5mm?；逯黧w30a的大小無特別限定，在檢測多種檢測物和受測物(多項(xiàng)目)時(shí)，根據(jù)項(xiàng)目數(shù)量而定，通常為20mmX 20mm。
下基板40如圖6 (B)所示，具有基板主體40a、工作電極61、反電極66、以及參比電極69?；逯黧w40a為矩形，與上基板30的基板主體30a的大小基本相同。此基板主體 40a的表面上有工作電極61、與此工作電極61連接的電極導(dǎo)線71、反電極66、與此反電極 66連接的電極導(dǎo)線72、參比電極69、與此參比電極69連接的電極導(dǎo)線73。
構(gòu)成基板主體40a的材料無特別限定，比如可以是玻璃、聚對苯二甲酸乙二酯、聚酰亞胺(PI)樹脂等塑料材料、金屬等無機(jī)材料。在這些材料當(dāng)中，從確保足夠的透光性、耐熱性、持久性和平滑性等觀點(diǎn)以及從降低材料所需成本的觀點(diǎn)出發(fā)，以玻璃為宜。
基板主體40a的材料、厚度和大小與上基板30的基板主體30a的材料、基板主體 30a的厚度和大小相同。
工作電極61基本呈四角形。工作電極61配置于基板主體40a的一側(cè)[圖6 (B) 的右側(cè)]。電極導(dǎo)線71從工作電極61向基板主體40a的另一側(cè)[圖6 (B)的左側(cè)]延伸。 反電極66在基板主體40a上配置在工作電極61外側(cè)的位置[在圖6(B)中為工作電極61 的右側(cè)]。電極導(dǎo)線72從反電極66繞過工作電極61向基板主體40a的另一側(cè)[圖6 (B)的左側(cè)]延伸。參比電極69隔著工作電極61配置于與反電極66相對的位置上。電極導(dǎo)線73從參比電極69向基板主體40a的另一側(cè)[圖6 (B)的左側(cè)]延伸。工作電極61的電極導(dǎo)線71、反電極66的電極導(dǎo)線72、以及參比電極69的電極導(dǎo)線73在基板主體40a的另一側(cè)相互并列配置。
工作電極61如圖7(a)所示，由工作電極主體62、絕緣層65、反射層80構(gòu)成。在工作電極61中，基板主體40a的表面依次有充當(dāng)反射部件的反射層80、絕緣層65、以及工作電極主體62。
工作電極主體62由導(dǎo)電層63和位于此導(dǎo)電層63的表面的電子容納層64構(gòu)成。
導(dǎo)電層63由能使激勵光透過的導(dǎo)電材料(以下也稱“工作電極材料㈧”)構(gòu)成。 作為工作電極材料(A)如有含周期表12族元素、13族元素或14族元素的原子、且具有透光性和導(dǎo)電性的材料等。上述材料無特別限定，可以是摻雜硼的氧化鋅、摻雜鋁的氧化鋅、 摻雜鎵的氧化鋅、摻雜銦的氧化鋅等氧化鋅類材料；可以是氧化銦、摻雜錫的氧化銦等氧化銦類材料；可以是氧化錫、摻雜銻的氧化錫(ΑΤΟ)、摻雜氟的氧化錫(FTO)等氧化錫類材料； 也可以使摻雜鉭的氧化鈦、摻雜鈮的氧化鈦等氧化鈦類材料等。導(dǎo)電層63的厚度以1 IOOOnm為宜，最好是10 200nm。
導(dǎo)電層63只要具有透光性和導(dǎo)電性即可，也可以是在玻璃、塑料等具有透光性但不具有導(dǎo)電性的物質(zhì)組成的非導(dǎo)電性基材的表面上，加上由導(dǎo)電材料構(gòu)成的導(dǎo)電層，將以此形成的復(fù)合材質(zhì)作為導(dǎo)電層。導(dǎo)電層的形狀可以是薄膜狀和點(diǎn)狀中的任何一種。此時(shí)， 工作電極61的厚度以1 IOOOnm為宜，最好是10 200nm。構(gòu)成導(dǎo)電層的具有導(dǎo)電性的材料例如有摻雜錫的氧化銦、摻雜氟的氧化錫、摻雜銻的氧化錫、摻雜鎵的氧化鋅、摻雜鋁的氧化鋅等。其中最好是含有錫的氧化銦和含有氟的氧化錫。
導(dǎo)電層63可以采用適合構(gòu)成該導(dǎo)電層63的材料種類的膜成型法制作。膜成型法有蒸鍍法、濺射法、壓印法、絲網(wǎng)印刷法、鍍膜處理法、溶膠-凝膠法、旋壓覆蓋法(Spin Coat)、浸漬法、氣相蒸鍍法等。
電子容納層64具有透光性。電子容納層64含有可收納電子的物質(zhì)(電子受體)。 電子受體只要其能級(energy level)能夠從被光激勵的標(biāo)記物(后述)接受電子的注入即可。在此，在“能級(energylevel)能夠從被光激勵的標(biāo)記物(后述)接受電子的注入” 一句中，比如當(dāng)電子受體為半導(dǎo)體時(shí)，該能級指的是導(dǎo)帶(conductionband)。S卩，只要電子受體的能級比標(biāo)記物(后述)最低未占分子軌道(LUMO)的能級還低即可。電子受體無特別限定，比如有氧化銦、摻雜錫的氧化銦等氧化銦類材料；有氧化錫、摻雜銻的氧化錫(ATO)、 摻雜氟的氧化錫(FTO)等氧化錫類材料。其中摻雜錫的氧化銦或摻雜氟的氧化錫不僅能發(fā)揮電子受體的功能，還能發(fā)揮導(dǎo)電基材的功能。因此，使用這些材料，可以在不使用導(dǎo)電性基材的情況下，僅用電子容納層即可充當(dāng)工作電極。另外，當(dāng)導(dǎo)電層63為復(fù)合材料時(shí)，電子容納層64位于導(dǎo)電材質(zhì)層上。電子容納層64的厚度通常為0. 1 lOOnm，最好為0. 1 lOnm。根據(jù)構(gòu)成電子容納層64的材料的種類，可以用與制作導(dǎo)電層63的方法相同的方法制作此電子容納層64。
絕緣層65由絕緣體材料構(gòu)成。絕緣體材料只要是透明的即可，無特別限定。比如可以是玻璃、二氧化硅(Si02)、氟化物樹脂等的合成樹脂、塑料類等。這種絕緣層65可根據(jù)絕緣體材料的種類采取相應(yīng)制作方法。該方法比如有濺射法、蒸鍍法、絲網(wǎng)印刷法、旋壓覆10蓋法、壓印法、噴涂法等。
反射層80由可以反射激勵光的材料構(gòu)成。這種材料無特別限定，比如有白金、鋁、 金、銀、鉛、錫、鎳、銠等金屬、合金或金屬化合物等。反射層80的形狀和大小也可以與工作電極主體62相同。反射層80只要能反射透過工作電極主體62的激勵光即可。因此，反射層80的大小可以與工作電極主體62上的光照位置的大小相同或略大一些。反射層80可以通過濺射法、蒸鍍法、絲網(wǎng)印刷法、鍍膜處理法、壓印法、旋壓覆蓋法等制作。從高效地反射透過工作電極主體62的激勵光的觀點(diǎn)出發(fā)，反射層80的表面最好是平滑的。
在本發(fā)明中，如圖7(b)所示，工作電極61也可以由電子容納層64、絕緣層65和反射層80構(gòu)成。此時(shí)，在工作電極61中，基板主體40a的表面依次為反射層80、絕緣層65 和電子容納層64。
上述實(shí)施方式中的工作電極61如圖7(a)和(b)所示，基板主體40a的表面具有反射層，但不限于此，也可以基板主體40a兼設(shè)有反射層。此時(shí)，基板主體40a的材料可以使用金屬等無機(jī)材料。
工作電極61也可以用硅烷偶聯(lián)劑(silane coupling)進(jìn)行表面處理。通過此表面處理，可以適當(dāng)調(diào)節(jié)工作電極61的表面，使其具有親水性或疏水性。硅烷偶聯(lián)劑如有氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)等陽離子型硅烷偶聯(lián)劑等。
工作電極61的工作電極主體62的電子容納面6 上也可以固定捕捉物。捕捉物只要是能夠捕捉檢測物的物質(zhì)即可。捕捉物比如有核酸、蛋白質(zhì)、縮氨酸、糖鏈、抗體、具有特異性識別能力的納米結(jié)構(gòu)體等。這種捕捉物可以根據(jù)檢測物的種類適當(dāng)選擇。電子容納面6 上的捕捉物的量最好根據(jù)用途和目的適當(dāng)設(shè)定。將捕捉物固定到電子容納面6 上的這一作業(yè)可通過以化學(xué)方式吸附到工作電極主體62的結(jié)合基等實(shí)現(xiàn)。這種結(jié)合基如有硫醇基、羥基、磷酸基、羧基、羰基、醛基、磺酸基、氨基等。也可以使用光固化樹脂的方法和物理吸附法固定捕捉物。
反電極66由導(dǎo)電材料的金屬層構(gòu)成。導(dǎo)電材料如有金、銀、銅、碳、白金、鈀、鉻、 鋁、鎳等金屬或至少含這些金屬中的其中之一的合金、氧化銦錫、氧化銦、AT0、FT0等金屬氧化物、鈦、氧化鈦、氮化鈦等鈦化合物等。金屬層的厚度以1 IOOOnm為宜，最好是10 200nm。
參比電極69由導(dǎo)電材料的金屬層構(gòu)成。導(dǎo)電材料如有金、銀、銅、碳、白金、鈀、鉻、 鋁、鎳等金屬或至少含這些金屬中的其中之一的合金、氧化銦錫、氧化銦、AT0、FT0等金屬氧化物、鈦、氧化鈦、氮化鈦等鈦化合物等。金屬層的厚度以1 IOOOnm為宜，最好是10 200nm。在本實(shí)施方式中設(shè)有參比電極69，但本發(fā)明也可以不設(shè)參比電極69。這要根據(jù)反電極66所用的電極種類和膜的厚度而定，但當(dāng)測定電壓降低的影響微小的弱電流(如1μ A 以下)時(shí)，反電極66也可以兼作參比電極69。而當(dāng)測定較強(qiáng)的電流時(shí)，為控制電壓降低的影響，穩(wěn)定施加在工作電極61上的電壓，最好設(shè)置參比電極69。
間隔固定件50的形狀為矩形環(huán)狀，由絕緣體-硅膠構(gòu)成。此間隔固定件50包圍著工作電極61、反電極66和參比電極69彼此相對的區(qū)域(參照圖5和圖6)。在上基板 30和下基板40之間有與間隔固定件50厚度相等的間隔。以此，各電極61、66、69之間形成了用于容納試樣和電解液的空間20a(參照圖5)。間隔固定件50的厚度通常為0. 2 300 μ m。在本發(fā)明中，也可以用聚酯膜制成的兩面膠帶等取代硅膠，作為構(gòu)成間隔固定件50的材料。
[檢測裝置及檢查芯片的變形例]
在本發(fā)明中，反射部件在檢測裝置中也可以設(shè)置在遠(yuǎn)離工作電極主體的位置。具體而言，如圖8所示，充當(dāng)反射部件的反射層81也可以設(shè)置在與基板主體40a上有工作電極61的面相反的一面。此時(shí)，如圖9(a)所示，反射層81位于絕緣層，即基板主體40a的一面上，另一面依次設(shè)置有導(dǎo)電層63和電子容納層64。也可以如圖9(b)所示，反射層81位于絕緣層，即基板主體40a的一面上，另一面設(shè)有電子容納層64。在圖9 (a)和圖9(b)的結(jié)構(gòu)中，基板主體40a可以使用玻璃、塑料類等透明的絕緣材料。
在本發(fā)明中，工作電極61、反電極66和參比電極69配置在間隔固定件50的框架內(nèi)，使各電極不與其他電極接觸即可。因此，工作電極61、反電極66和參比電極69也可以位于不同的基板主體上。即，檢查芯片可以由上基板31(參照圖10(A))以及下基板41(參照圖10(B))構(gòu)成，其中所述上基板31的基板主體31a上有試樣注入口 31b和參比電極69， 所述下基板41的基板主體41a上有工作電極61和反電極66。檢查芯片也可以由上基板 32 (參照圖11 (A))以及下基板42 (參照圖11 (B))構(gòu)成，其中所述上基板32的基板主體3 上有試樣注入口 32b、反電極66和參比電極69，所述下基板42的基板主體4 上有工作電極61。
在本發(fā)明中，反電極66和參比電極69也可以不是設(shè)在基板主體上的薄膜狀電極。 即檢查芯片也可以具有以下部分基板主體33a上有試樣注入口 3 的上基板33 (參照圖 12(A))；基板主體43a上有工作電極61的下基板43(參照圖12(B))；以及固定件主體51a 上有反電極66和參比電極69的間隔固定件51。此時(shí)，只要反電極66和參比電極69中的至少一個(gè)設(shè)置在間隔固定件的固定件主體上即可。此外，在上基板和下基板中的某一個(gè)上設(shè)置固定件主體上的電極以外的電極即可。
在本發(fā)明中，絕緣層65也可以兼有基板主體的功能。此時(shí)，可以省略基板主體。
[檢測物的檢測方法]
在本發(fā)明中檢測物的檢測方法中，使用具有透光性的工作電極主體和反電極，以光電化學(xué)法檢測因光激勵而產(chǎn)生電子的檢測物，其包括以下步驟
(1-1)讓檢測物存在于工作電極主體上，
(1-2)向工作電極主體上的檢測物照射激勵光，
(1-3)將透過了工作電極主體的激勵光反射到工作電極主體上的檢測物上，以及
(1-4)測定工作電極主體和反電極之間的電流。
在方法1中可以使用上述檢測裝置和檢查芯片，但本發(fā)明不限于此。
方法1的一大特點(diǎn)在于，檢測檢測物時(shí)，將透過了工作電極主體的激勵光反射到工作電極主體上的檢測物上。
通常，在不反射透過了工作電極主體的激勵光的情況下，如果加大激勵光強(qiáng)度的話，在信號增強(qiáng)的同時(shí)，雜波也明顯增加。檢測靈敏度因此而顯著低降。
然而，在方法1中反射透過來的激勵光，與不反射透過了工作電極主體的激勵光相比，可以超出想象地抑制雜波的增加，同時(shí)使信號增強(qiáng)。因此，采用方法1可以確保高檢測靈敏度。
在方法1中，根據(jù)步驟(1-1)的操作方法，大致可分為以下方法1-1和方法1-2。方法1-1中使用了用于捕捉檢測物的捕捉物(參照圖13和圖14)。方法1-2是將檢測物誘導(dǎo)到工作電極主體的方法(參照圖19和圖20)。
先參照

方法1-1。圖13為本發(fā)明一實(shí)施方式涉及的檢測物的檢測方法 (方法1-1)的處理步驟流程圖。圖14為本發(fā)明一實(shí)施方式涉及的檢測物的檢測方法(方法1-1)各步驟的概要說明圖。在此所舉的例子中，用上述檢查芯片20，通過檢測裝置1檢測檢測物。
在方法1-1中，首先由用戶從檢查芯片20的試樣注入口 30b注入含檢測物的液體試樣。由此，固定有捕捉物210的工作電極主體62與檢測物201接觸。檢測物201被工作電極主體62上的捕捉物210捕捉到[對應(yīng)于步驟(1-1)，參照圖13中“檢測物捕捉步驟 (步驟S1-1) ”、以及圖1 和圖14b]。通過此步驟，可以使檢測物201存在于工作電極主體 62上。
在此步驟Sl-I中，可以在捕捉物210和檢測物201結(jié)合的條件下進(jìn)行檢測物的捕捉。上述條件可根據(jù)檢測物201的種類適當(dāng)選擇。比如，當(dāng)檢測物201含有核酸時(shí)，可以在有磷酸緩沖生理鹽水等溶液存在的條件下，進(jìn)行捕捉物210對檢測物201的捕捉。
在此，捕捉物210根據(jù)檢測物201的種類適當(dāng)選擇。比如，當(dāng)檢測物201含有核酸時(shí)，捕捉物210只要是與此核酸雜交的核酸探針或是此核酸的抗體即可。當(dāng)檢測物201含有蛋白質(zhì)或縮氨酸時(shí)，捕捉物210只要是此蛋白質(zhì)或縮氨酸的抗體、蛋白質(zhì)的配體、縮氨酸的受體蛋白質(zhì)等即可。
在此步驟S1-1，通過捕捉物210捕捉檢測物201所結(jié)合的受測物，但不限于此，也可以通過捕捉物210捕捉到受測物后，再用檢測物201修飾捕捉物210與受測物的復(fù)合物。
在此步驟S1-1，用戶也可以根據(jù)需要清洗工作電極61。這樣可以除去檢測物201 以外的物質(zhì)(雜質(zhì))。清洗可采取與捕捉物210和檢測物201的種類相應(yīng)的方法等進(jìn)行。 比如，當(dāng)捕捉物210和檢測物201都含有核酸時(shí)，清洗液可以使用含有SSC (IX SSC的構(gòu)成 0. 15M氯化鈉、0. 015M檸檬酸鈉、pH7. 0)和表面活性劑的溶液等。此時(shí)，這種清洗液中SSC 濃度越低、且表面活性劑濃度越高，越能高效地除去雜質(zhì)。
然后，用戶將步驟Sl-I之后的檢查芯片20插入檢測裝置1的芯片接受部件11。 然后，用戶啟動檢測裝置1。此時(shí)，首先檢測裝置1的光源13向工作電極主體62上的檢測物201照射激勵光[對應(yīng)于步驟(12)，參照圖13中“激勵光照射步驟(步驟S1-2)”及圖 14c中的“激勵光”]。透過工作電極主體62的激勵光被工作電極61的反射層80反射向工作電極主體62上的檢測物201 [對應(yīng)于步驟(1-3)，參照圖13中“激勵光反射步驟(步驟 S1-3)”和圖14c中的“反射光”]。再用電流表14測量檢測物201因光激勵而產(chǎn)生的光電流[對應(yīng)步驟(1-4)，參照圖13中電流測量步驟(步驟S1-4)]。
此步驟S1-2 步驟S1-4在有電解液存在的條件下進(jìn)行。在本說明書中，為方便起見分別就步驟S1-2 步驟S1-4進(jìn)行了說明。但是，實(shí)際上這些步驟S1-2 步驟S1-4 是同時(shí)進(jìn)行的。
電解液可以使用含有以下物質(zhì)的溶液由能向氧化狀態(tài)的標(biāo)記物提供電子的鹽構(gòu)成的電解質(zhì)、非質(zhì)子極性溶劑、質(zhì)子極性溶劑或非質(zhì)子極性溶劑與質(zhì)子極性溶劑的混合物。根據(jù)需求，此電解液還可含有其他成分。電解質(zhì)比如有碘化物、溴化物、金屬配合物、 硫代硫酸鹽、亞硫酸鹽及其混合物等。具體而言，電解質(zhì)如有碘化鋰、碘化鈉、碘化鉀、碘化銫、碘化鈣等金屬碘化物；四烷基碘化銨(Tetraalkyl Ammonium Iodide)、吡啶鹽碘化物 (pyridiniumiodide)、咪唑碘化物(imidazolium iodide)等四級氨化合物的碘鹽；溴化鋰、溴化鈉、溴化鉀、溴化銫、溴化鈣等金屬溴化物；四烷基溴化銨、吡啶鹽溴化物等四級氨化合物的溴鹽；氰亞鐵酸鹽(Ferrocyanides)、二戊鐵離子(ferricinium ion)等金屬配合物；硫代硫酸鈉、硫代硫酸銨、硫代硫酸鉀、硫代硫酸鈣等硫代硫酸鹽；亞硫酸鈉、亞硫酸鉀、亞硫酸銨、亞硫酸鐵、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈣等亞硫酸鹽；及其混合物等。其中最好是四丙基碘化銨。
電解液的電解質(zhì)濃度最好在0. 001 15M之間。
質(zhì)子極性溶劑可以用水和以水為主并混合有緩沖液成分的極性溶劑等。非質(zhì)子極性溶劑如有乙腈(CH3CN)等腈類；碳酸丙烯酯(propylene carbonate)、碳酸乙烯酯等碳酸鹽類、1，3 二甲基咪唑烷酮(l,3-dimethylimidazolidinone),3-甲基惡唑烷酮(3-methyloxazolinone)、二烷基咪唑鹽(dialkyllimidazolium)等雜環(huán)化合物 (heterocyclic compound) ；二甲基甲酉先胺(Dimethylformamide)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide)、環(huán)丁砜(sulfolane)等。非質(zhì)子極性溶劑中以乙腈較為理想。質(zhì)子極性溶劑和非質(zhì)子極性溶劑可以單獨(dú)使用或是將兩種混合使用。質(zhì)子極性溶劑和非質(zhì)子極性溶劑的混合物最好是水和乙腈的混合物。
在步驟S1-2，激勵光從電子容納面6 —側(cè)的光源13向工作電極主體62上的檢測物201照射?？筛鶕?jù)檢測物所含標(biāo)記物的種類等適當(dāng)選擇激勵光的種類。最好在可以抑制雜波發(fā)生的范圍內(nèi)適當(dāng)設(shè)定激勵光的照射量。
在步驟S1-3，透過來的激勵光被反射層80反射。反射光照到工作電極主體62上的檢測物201。如此用光激勵檢測物201。
在步驟S1-4，用上述檢測裝置1的電流表14測定光電流。在步驟Sl_4，光電流的測定值還用于進(jìn)行各種演算處理。首先，A/D轉(zhuǎn)換部件16將光電流的測定值(光電流值) 轉(zhuǎn)換成數(shù)字化格式。再向控制部件17輸入數(shù)字化的光電流值?？刂撇考?7根據(jù)預(yù)先制作的、用于反映光電流值和檢測物的量之間的關(guān)系的檢量線，從數(shù)字化的光電流值估算出檢測物的量。控制部件17再生成檢測結(jié)果界面，以便在顯示器2上顯示估算出的檢測物的量。 然后，控制部件17生成的檢測結(jié)果界面?zhèn)魉偷斤@示器2上。顯示器2顯示檢測結(jié)果界面。 處理結(jié)束。
在本實(shí)施方式中使用的檢測裝置1中，光源13配置在檢查芯片20的電子容納面 62a 一側(cè)。在本實(shí)施方式使用的檢查芯片20中，反射層80通過絕緣層65與工作電極主體 62形成一體。
但是，在本發(fā)明中，反射部件和光源的配置無特別限定。圖15 圖18顯示的是在激勵光照射步驟和激勵光反射步驟中，光源和反射部件的配置變形例的簡要說明圖。
在圖15所示變形例所使用的檢測裝置中，光源13配置在電子容納面6 —側(cè)。在此檢測裝置中，光源13設(shè)置在遠(yuǎn)離工作電極主體61的位置上。在圖15所示變形例所使用的檢查芯片中，反射部件18配置在與電子容納面6 相反一面的一側(cè)。此反射部件18設(shè)置在遠(yuǎn)離工作電極主體62的位置。在此變形例中，與工作電極主體62的電子容納面6 相反一側(cè)的表面也可以設(shè)置絕緣層65 (參照圖16)。
在圖17所示變形例所用檢測裝置中，光源13配置在與電子容納面6 相反的一側(cè)。在檢測芯片中，反射部件18在電子容納面6 上設(shè)于遠(yuǎn)離工作電極主體62的位置。在此變形例中，與工作電極主體62的電子容納面6 相反的一側(cè)的表面上也可以設(shè)置絕緣層 65 (參照圖18)。
下面，參照附圖，就方法1-2進(jìn)行說明。圖19為本發(fā)明另一實(shí)施方式涉及的檢測物的檢測方法(方法1- 的處理步驟流程圖。圖20為本發(fā)明一實(shí)施方式涉及的檢測物的檢測方法(方法1-2)各步驟的概要說明圖。
在方法1-2中，首先由用戶從上述檢查芯片20的試樣注入口 30b注入含檢測物的液體試樣。由此，檢測物201被誘導(dǎo)到?jīng)]有捕捉物的工作電極主體62 [對應(yīng)步驟(1-1)，參照圖19中“檢測物誘導(dǎo)步驟(步驟S2-1) ”、及圖20(a)和圖20 (b)]。通過步驟S2-1，可以使檢測物201存在于工作電極主體62上。
在此步驟S2-1，比如，用戶從上述檢查芯片20的試樣注入口 30b注入含檢測物 201和誘導(dǎo)液，該誘導(dǎo)液用于將檢測物201誘導(dǎo)至工作電極主體62上。以此，檢測物201被誘導(dǎo)到可與不存在捕捉物的工作電極61之間運(yùn)送電子的區(qū)域。
在此，所謂“可與不存在捕捉物的工作電極61之間運(yùn)送電子的區(qū)域”一般為與工作電極61的距離為0 IOnm的范圍區(qū)域。在本說明書中，所謂“不存在捕捉物”指“實(shí)質(zhì)上不存在捕捉物”。即“不存在捕捉物”這一概念中還包含以下情況在工作電極上僅有微量的捕捉物，其量之小對捕捉目標(biāo)物毫無幫助。
將檢測物201誘導(dǎo)到工作電極61時(shí)，可以利用檢測物201、誘導(dǎo)液和工作電極61 之間的疏水性相互作用或親水性相互作用，或者向工作電極61或反電極66施加電壓，并利用由此引起的電泳效果。
本誘導(dǎo)步驟比如可以通過以下二種方法實(shí)現(xiàn)
1)改變誘導(dǎo)液的疏水性或親水性，增大檢測物201和工作電極61之間的疏水性相互作用或親水性相互作用(誘導(dǎo)方法1)，
2)根據(jù)修飾檢測物201的電荷，對工作電極61施加正電壓或負(fù)電壓，以此增強(qiáng)電泳效果(誘導(dǎo)方法2)。誘導(dǎo)方法1和誘導(dǎo)方法2可分別單獨(dú)運(yùn)用，也可二者組合起來應(yīng)用。
在誘導(dǎo)方法1中，比如當(dāng)檢測物201含有核酸(DNA、RNA等)時(shí)，從加大檢測物201 和工作電極61之間的疏水性相互作用或親水性相互作用，以便更容易地使檢測物接近工作電極61這一觀點(diǎn)出發(fā)，誘導(dǎo)液最好含有離液序列高的離子。
離液序列高的離子如有碘化物離子、溴化物離子、胍離子、硫氰酸離子、三溴乙酸離子、三氯乙酸離子、高氯酸離子、二氯乙酸離子、硝酸離子、氯化物離子、乙酸離子、鋇離子、鈣離子、鋰離子、銫離子、鉀離子、鎂離子等。
當(dāng)誘導(dǎo)液含有離液序列高的離子時(shí)，誘導(dǎo)液中的離液序列高的離子的濃度因所用離液序列高的離子種類而不同。該濃度一般為1.0 8.0mol/L。當(dāng)離液序列高的離子為胍離子時(shí)，誘導(dǎo)液中的離液序列高的離子的濃度一般為4. 0 7. 5mol/L。當(dāng)離液序列高的離子為硫氰酸離子時(shí)，誘導(dǎo)液中的離液序列高的離子濃度一般為3. 0 5. 5mol/L。
此外，當(dāng)檢測物201含有核酸時(shí)，可以利用慣用的核酸提取和純化方法將檢測物 201誘導(dǎo)到工作電極61附近。
在核酸提取和純化方法中如有利用液相的方法和利用核酸結(jié)合用載體的方法等。 利用液相的方法如有酚/氯仿抽提法(〈Biochimicaet Biophysica acta〉，《生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)》，1963 年發(fā)行，第 72 卷，pp. 619-629)、堿 SDS 法 Nucleic AcidResearch), 《核酸研究》，1979年發(fā)行，第7卷，pp. 1513-1523)、在含有鹽酸胍的緩沖液中添加乙醇使核酸沉降的方法 Analytical Biochemistry〉，《分析生物化學(xué)》，162，1987，463)等。使用核酸結(jié)合用載體的方法中，比如有用玻璃粒子和碘化鈉溶液將核酸吸附到玻璃粒子上并進(jìn)行分離的方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA,《美國科學(xué)院院刊》，76-2 :615_619，1979)、以及使用二氧化二氧化硅粒子和離液序列高的離子的方法(如參照J(rèn). Clinical. Microbiology 《臨床微生物學(xué)雜志》，1990年發(fā)行，第28卷，pp. 495-503，專利第2680462號公報(bào)等)等。 在用二氧化二氧化硅粒子和離液序列高的離子的方法中，首先將核酸結(jié)合了的二氧化硅粒子、含有能夠游離試樣中的核酸的離液序列高的離子的溶液、以及試樣混合，使核酸結(jié)合到二氧化硅粒子上。然后，清洗除去雜質(zhì)。再回收結(jié)合到二氧化硅粒子上的核酸。用這些方法可以簡便快速地提取核酸。而且，這種方法不僅能提取DNA，還適合提取較為不穩(wěn)定的RNA， 可以獲得高純度核酸是其一大優(yōu)點(diǎn)。
因此，檢測物201含有核酸時(shí)，將用于核酸提取和提純方法的溶劑用作誘導(dǎo)液，可以將檢測物201誘導(dǎo)到工作電極61附近。此時(shí)，離液序列高的離子最好使用胍離子、碘化物離子、溴化物離子、硫氰酸離子或這些離子的任意組合，工作電極最好使用結(jié)合核酸的電極(比如含錫的氧化銦等)。
當(dāng)檢測物201含有核酸時(shí)，根據(jù)需要，誘導(dǎo)液也可以含有緩沖液。緩沖液使用用于保持核酸穩(wěn)定的普通緩沖液即可。從保持核酸穩(wěn)定的觀點(diǎn)來看，緩沖液的緩沖能最好接近中性、即pH5. 0 9. 0。緩沖液如有三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、四硼酸鈉-鹽酸、磷酸二氫鉀-四硼酸鈉緩沖液等。緩沖液的濃度最好為1 500mmol/L。
另一方面，在誘導(dǎo)方法2中，根據(jù)檢測物201的電荷，向工作電極施加正電壓或負(fù)電壓。比如，檢測物201含有核酸時(shí)，該檢測物201的核酸部分帶負(fù)電荷。因此，通過向工作電極61施加正電壓，可以將檢測物201誘導(dǎo)到工作電極61的附近。
用戶將步驟S2-1后的檢測芯片20插入檢測裝置1的芯片接受部件11。然后，用戶啟動檢測裝置1。此時(shí)，首先，檢測裝置1的光源13向工作電極主體62上的檢測物201 照射激勵光[對應(yīng)步驟(1-2)，參照圖19中“激勵光照射步驟(步驟S2-2) ”及圖20c中的 “激勵光”]。透過了工作電極主體62的激勵光被工作電極61的反射層80反射向工作電極主體62上的檢測物201 [對應(yīng)步驟(1-3)，參照圖19中“激勵光反射步驟(步驟S2-3)”和圖20c中的“反射光”]。再用檢測裝置1的電流表14測量檢測物201因光激勵而產(chǎn)生的光電流[對應(yīng)步驟(1-4)，參照圖19中的電流測量步驟(步驟S2-4)]。
此步驟S2-2 步驟S2-4要在有電解液存在的條件下進(jìn)行。因此，當(dāng)在步驟S2_l 中使用誘導(dǎo)液時(shí)，可根據(jù)需要將該誘導(dǎo)液換成電解液。如果誘導(dǎo)液具有向氧化狀態(tài)下的標(biāo)記物提供電子的性質(zhì)，且可以用光電化學(xué)法檢測出檢測物時(shí)，在檢測步驟也可以直接使用此誘導(dǎo)液。
步驟S2-2 步驟S2-4可以用與方法1_1的步驟S1-2 步驟S1-4同樣的方法實(shí)施。
另外，方法1-2使用的工作電極上沒有捕捉檢測物的捕捉物。因此，工作電極61可以簡便地清洗，可以再利用?？捎米贤饩€臭氧清洗技術(shù)(UV-03清洗)等清洗工作電極61。 在UV-03清洗中，在紫外線作用下，在有機(jī)化合物的分解以及03生成和分解過程中的強(qiáng)大的氧化作用會分解有機(jī)化合物，并將有機(jī)化合物從電極表面去除。
當(dāng)檢測物含有核酸時(shí)，在適當(dāng)?shù)娜芤褐校ㄟ^給工作電極施加負(fù)電壓，也可以從工作電極61中離解修飾檢測物MOa。這是因?yàn)楹怂釒ж?fù)電。上述溶液如可以是磷酸緩沖生理鹽水(PBS)、TEB[組成IOmM三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液、ImMEDTA]水等。
在方法1-2中，也可以在步驟S2-1中將誘導(dǎo)用修飾物附加到檢測物201上，使用所獲得的修飾檢測物。誘導(dǎo)用修飾物比如可以是DNA、RNA等核酸等。
[受測物的檢測方法]
下面說明本發(fā)明的受測物的檢測方法。
本發(fā)明的受測物的檢測方法是用具有透光性的工作電極主體和反電極，用光電化學(xué)方法檢測受測物，它包括以下步驟
(2-1)讓受測物與標(biāo)記結(jié)合物接觸，形成受測物與標(biāo)記結(jié)合物的復(fù)合物，其中所述標(biāo)記結(jié)合物是用標(biāo)記物標(biāo)記用于捕捉上述受測物的結(jié)合物而形成的；
(2-2)使工作電極主體上至少存在有標(biāo)記物；
(2-3)向工作電極主體上的標(biāo)記物照射激勵光；
(2-4)將透過了工作電極主體的激勵光反射到工作電極主體上的標(biāo)記物上；及
(2-5)測定工作電極主體和反電極之間的電流。
本發(fā)明一實(shí)施方式涉及的受測物的檢測方法[稱為“方法2”]的處理步驟如圖21 所示。方法2可以使用上述檢測裝置、檢查芯片和檢測配套設(shè)施(SET)，但本發(fā)明不限于此。
方法2根據(jù)步驟(2- 的技巧種類大致可分為以下方法2-1和方法2-2。方法2_1 中使用了用于捕捉受測物的捕捉物(參照圖21)。方法2-2是將受測物誘導(dǎo)到工作電極主體的方法(參照圖23)。
首先，參照附圖就方法2-1進(jìn)行說明。圖21是本發(fā)明一實(shí)施方式涉及的受測物的檢測方法(方法2-1)的處理步驟流程圖。圖22是本發(fā)明一實(shí)施方式涉及的受測物的檢測方法(方法2-1)中各步驟的簡要說明圖。
方法2-1是與方法1-1相對應(yīng)的方法。方法2-1與方法1_1的不同點(diǎn)在于其包含以下步驟
-用捕捉受測物的固相捕捉此受測物[圖21中受測物捕捉步驟(步驟S3-1)]；
-在受測物上附加標(biāo)記結(jié)合物，其中此標(biāo)記結(jié)合物是用標(biāo)記物標(biāo)記捕捉此受測物的結(jié)合物而形成的[圖21中標(biāo)記結(jié)合物附加步驟(步驟S3-2)]；
-提取含有受測物的固相[圖21中提取步驟(步驟S3-3)]；及
-根據(jù)受測物的量，至少從固相中分離出標(biāo)記物[圖21中分離步驟(步驟S3-4)]。 在此，以用上述檢查芯片20、通過檢測裝置1檢測受測物為例進(jìn)行說明。
在方法2-1中，首先，用戶讓受測物S與捕捉受測物S的固相220接觸[步驟S3_l， 參照圖22a]。通過此步驟，可以讓固相220捕捉到受測物S[參照圖22b]。
固相220由固定了捕捉物221的固相主體230構(gòu)成，其中所述捕捉物221用于捕捉受測物S。捕捉物221可以是與方法1-1中所使用的捕捉物210相同的物質(zhì)。用于固相 220的捕捉物221和后述捕捉步驟(步驟S34)中使用的捕捉物是不同種類的物質(zhì)，或者是受測物中的識別部位互不相同的物質(zhì)。
受測物S和固相220的接觸可以在容器內(nèi)進(jìn)行?？梢栽谑軠y物S與捕捉物221結(jié)17合的條件下進(jìn)行受測物S和固相220的接觸。上述條件可以根據(jù)受測物S和捕捉物221的種類適當(dāng)選擇。
然后，用戶在捕捉了受測物S的固相220上附加標(biāo)記結(jié)合物(檢測物201)[步驟 S3-2]。以此獲得含有標(biāo)記結(jié)合物(檢測物201)與受測物S的復(fù)合物的固相231 [參照圖 22c]。
可以在受測物S與標(biāo)記結(jié)合物(檢測物201)結(jié)合的條件下使標(biāo)記結(jié)合物(檢測物201)附加到固相220。上述條件可以根據(jù)受測物S和標(biāo)記結(jié)合物(檢測物201)的種類適當(dāng)選擇。
接著，用戶提取含有標(biāo)記結(jié)合物(檢測物201)與受測物S的復(fù)合物的固相231 [步馬聚S3-3]ο
在步驟S3-3中，固相231的提取方法可以根據(jù)固相主體222的種類等適當(dāng)選擇。 比如，當(dāng)固相主體222為磁珠時(shí)，可以用磁塊吸附固相231。此時(shí)，可以用磁塊輕松地提取固相231。當(dāng)固相主體222為基板時(shí)，可以將基板上的溶液換成新溶液，以此除去受測物S以外的成分。此時(shí)，可以通過置換溶液輕松地提取固相231。
接下來，用戶從固相231上分離出與受測物的量相應(yīng)的標(biāo)記結(jié)合物(檢測物201) [步驟S3-4，參照圖22d]。
在在步驟S3-4中，用戶使用與步驟S3-2中所用標(biāo)記結(jié)合物(檢測物201)的種類相應(yīng)的分離方法，分離出與受測物的量相應(yīng)的標(biāo)記結(jié)合物(檢測物201)。比如，當(dāng)受測物S 為核酸，且使用的標(biāo)記結(jié)合物(檢測物)含有核酸、該核酸具有與受測物S互補(bǔ)的序列時(shí)， 加熱含有固相主體222上的復(fù)合物的溶液，即可輕松地從固相231分離出與受測物的量相應(yīng)的標(biāo)記結(jié)合物(檢測物201)。當(dāng)標(biāo)記結(jié)合物(檢測物201)與受測物S的復(fù)合物含有可切斷的核酸時(shí)，用限制性內(nèi)切酶切斷上述可切斷的核酸中的識別序列，就可獲得與受測物的量相應(yīng)的標(biāo)記結(jié)合物(檢測物201)或其中的一部分。
其后，用戶從檢查芯片20的試樣注入口 30b注入在步驟S3-4中分離出的標(biāo)記結(jié)合物(檢測物201)。再將檢查芯片20插入檢測裝置1的芯片接受部件11。用戶啟動檢測裝置1。捕捉步驟(步驟S34)、激勵光照射步驟(步驟S3-6)、激勵光反射步驟(步驟 S3-7)和電流測量步驟(步驟S3-8)可以以與下述步驟同樣的方法進(jìn)行1-1中的檢測物捕捉步驟(步驟S1-1)、激勵光照射步驟(步驟S1-2)、激勵光反射步驟(步驟S1-3)和電流測量步驟(步驟S1-4)。在方法2-1中，提取步驟之后也可以進(jìn)行標(biāo)記結(jié)合物附加步驟。步驟S3-1 步驟S3-4也可以全部在檢查芯片20內(nèi)進(jìn)行。
另一方面，方法2-2是與方法1-2相對應(yīng)的方法。方法2-2與方法1_2的不同之處在于其包含以下步驟
-用捕捉受測物的固相捕捉此受測物[圖23中受測物捕捉步驟(步驟S4-1)]；
-在受測物上附加標(biāo)記結(jié)合物，其中，所述標(biāo)記結(jié)合物是用標(biāo)記物標(biāo)記用于捕捉此受測物的結(jié)合物而形成的[圖23中標(biāo)記結(jié)合物附加步驟(步驟S4-2)]；
-提取含有受測物的固相[圖23中提取步驟(步驟S4-3)]；及
-根據(jù)受測物的量，從固相中至少分離出標(biāo)記物[圖23中分離步驟(步驟S4-4)]。 可以用與方法2-1中的步驟S3-1 步驟S3-4同樣的方法進(jìn)行這些步驟S4-1 步驟S4-4。
誘導(dǎo)步驟(步驟S4-5)、激勵光照射步驟(步驟S4-6)、激勵光反射步驟(步驟S4-7)和電流測量步驟(步驟S4-8)可以用與下述步驟同樣的方法進(jìn)行方法1-2中的檢測物誘導(dǎo)步驟(步驟S2-1)、激勵光照射步驟(步驟S2-2)、激勵光反射步驟(步驟S2-3)和電流測量步驟(步驟S2-4)。在方法2-2中，也可以在提取步驟之后進(jìn)行標(biāo)記結(jié)合物附加步馬聚ο
本發(fā)明的受測物的檢測方法利用具有透光性的工作電極主體和反電極，通過光電化學(xué)方法，檢測在光電化學(xué)方面具有活性的受測物，它還包括具有以下步驟的受測物檢測方法(稱為“方法3”)
(3-1)讓工作電極主體上存在有受測物；
(3-2)向工作電極主體上的受測物照射激勵光；
(3-3)將透過了工作電極主體的激勵光反射到工作電極主體上的受測物；及
(3-4)測量工作電極主體和反電極之間的電流。
根據(jù)步驟(3-1)的實(shí)施方法的不同，方法3大致可分為以下方法3-1和方法3-2。 方法3-1中使用了用于捕捉受測物的捕捉物(參照圖24)。方法3-2是將受測物誘導(dǎo)到工作電極主體的方法(參照圖25)。
此方法3-1和方法3-2可以在受測物是具有光電化學(xué)活性的物質(zhì)時(shí)進(jìn)行。受測物本身會在光激勵下產(chǎn)生電流。因此，不同于方法2-1和方法2-2，方法3-1和方法3-2中也可以不在受測物上附加標(biāo)記結(jié)合物。因此，只要用受測物取代方法1-1和方法1-2中的檢測物，即可用同樣方法實(shí)施方法3-1和方法3-2。S卩，在方法3-1的步驟S5-1 步驟S5-4 中，除用受測物取代方法1-1中的檢測物外，均可采用與方法1-1的步驟Sl-I 步驟S1-4 同樣的操作。在方法3-2的步驟S6-1 步驟S6-4中，除用受測物取代方法1-2中的檢測物外，均可采用與方法1-2的步驟S2-1 步驟S2-4同樣的操作。
[實(shí)施例]
下面通過實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受此實(shí)施例的限制。
(制造例1)
(1)制作電極和反射部件
運(yùn)用濺射法，在二氧化硅(玻璃)制成的基板主體141a的表面制作工作電極 161 [參照圖^A]，其中所述工作電極161是由涂布有錫的氧化銦材質(zhì)薄膜(厚度約200nm) 構(gòu)成的。薄膜兼具導(dǎo)電層和電子容納層。為了方便，將工作電極161分為第一區(qū)161a和第二區(qū)161b。再通過濺射法，在與基板主體141a的工作電極161同一表面(以下稱“電極面”) 上設(shè)置白金薄膜制成的反電極166和白金薄膜制成的參比電極169[參照圖^A]。然后，用濺射法在與基板主體141a的電極面相反的一面上設(shè)置白金薄膜制成的反射層181 [參照圖 26C]。反射層181位于與工作電極161的第二區(qū)161b相應(yīng)的位置，與工作電極161的第二區(qū)161b的大小相同。在工作電極161的第一區(qū)161a，有激勵光通過[參照圖^B]。另一方面，在工作電極161的第二區(qū)161b中，通過了工作電極161的激勵光被反射層181反射到工作電極161的第二區(qū)161b上的檢測物上[參照圖^C]。
(2)涂覆硅烷偶聯(lián)劑
將上述(1)中獲得的基板主體141a在硅烷偶聯(lián)劑溶液[含有1體積％ APTES的甲苯溶液]中浸泡一小時(shí)。取出基板主體141a，在甲苯中清洗二遍。然后，將基板主體141a 在110°C加熱10分鐘，使APTES結(jié)合到基板主體141a的表面。再將基板主體141a浸在甲苯中，進(jìn)行5分鐘超聲波清洗。超聲波清洗進(jìn)行三次。再用脫水乙醇沖洗基板主體141a，使未結(jié)合的APTES結(jié)合到基板主體141a的表面。用吹風(fēng)機(jī)除去殘留的乙醇。
(3)固定捕捉物質(zhì)
以1 9(體積比)的比例混合含有捕捉物，即含有捕獲DNA探針的水溶液[100 μ M DNA]和UV交聯(lián)試劑[通用電氣醫(yī)療集團(tuán)英國公司制(GE Healthcare UK Limited)，商品名微陣列交聯(lián)試劑D (Microarray crosslinking reagent D)]，獲得10 μ M探針溶液。將獲得的探針溶液中的6μ L滴到工作電極的第一、二區(qū)161a、161b的表面上。再用UV照射裝置[商品名UV交聯(lián)系統(tǒng)]向工作電極的第一、二區(qū)161a、161b照射160mJ/cm2的紫外線。以此將捕獲DNA探針固定在工作電極的第一、二區(qū)161a、161b的表面上。用超純水沖洗工作電極的第一、二區(qū)161a、161b的表面。再用吹風(fēng)機(jī)去除殘留在工作電極的第一、二區(qū) 161a、161b表面的超純水。
(4)去除未固定的DNA探針
僅進(jìn)行上述(3)的操作的話，有可能工作電極的第一、二區(qū)161a、161b表面上還殘留有未固定的捕獲DNA探針。因此，進(jìn)行以下步驟來除去未固定的捕獲DNA探針。
先在基板主體141a周圍配置硅膠(厚度0. Imm)作為隔板。在用硅膠圍起來的空間內(nèi)注入6μ L雜交用溶液。雜交用溶液是超純水和雜交緩沖劑[美國昂飛公司 (Affymetrix, Inc.)制，商品名 雜交緩沖劑(2xHybridization buffer)]按 1 1(體積比)的比例混合而成。再在硅膠上蓋上玻璃罩，以免溶液蒸發(fā)。然后，將基板主體141a在 45°C中靜置1小時(shí)。再用清洗用緩沖劑[美國昂飛公司制，商品名洗滌劑A(Wash buffer A)]和超純水清洗基板主體141a。用吹風(fēng)機(jī)除去殘留在基板主體141a表面上的超純水。
(制造例2)
將乙腈(AN)和碳酸乙烯酯(EC)按2 3[AN EC(體積比)]混合。在所獲混合液中溶解充當(dāng)電解質(zhì)鹽的四丙基碘化銨，直至濃度變?yōu)?. 6M。然后在所得溶液中溶解充當(dāng)電解質(zhì)的碘直至濃度變?yōu)?.06M。以此獲得電解液。
(試驗(yàn)例1)
(1)捕捉檢測物
在制造例1中獲得的電極基板141的工作電極的第一、二區(qū)161a、161b的周圍配置硅膠(厚度0. 2mm)作為隔板。然后，在此電極基板141上裝上雜交盒。通過硅膠。向雜交盒和電極基板141圍成的空間中注入20 μ L雜交溶液。雜交溶液是向雜交緩沖劑[美國昂飛公司制，商品名 雜交緩沖劑((2x Hybridization buffer))]中添加用標(biāo)記物Alexa Fluor750標(biāo)記的靶DNA (檢測物)，并使?jié)舛冗_(dá)到OnM或InM而得到的。用蓋子蓋住雜交盒注入口，以免溶液蒸發(fā)。雜交是將雜交盒在45°C中靜置1小時(shí)進(jìn)行。然后，用清洗用緩沖劑 [美國昂飛公司制，商品名洗滌劑A(Wash buffer A)]和超純水清洗電極基板141。用吹風(fēng)機(jī)除去殘留在電極基板141表面的超純水。
(2)測量光電流
將間隔固定件、即硅膠(厚度0. 2mm)圍在實(shí)施了上述(1)后的電極基板141的工作電極的第一、二區(qū)161a、161b的周圍。在硅膠圍成的空間中注入12. 5μ L制造例2中獲得的電解液。以此使工作電極、反電極和參比電極接觸上述電解液。
用玻璃蓋從電極基板141上面蓋住上述空間，將其密封起來。以此防止電解液漏出或蒸發(fā)。以參比電極為標(biāo)準(zhǔn)，向工作電極的第一、二區(qū)161a、161b施加OV電壓。與此同時(shí)，向工作電極的第一、二區(qū)161a、161b的一定位置(圖沈中，光照位1 4)照射激勵光 [波長約781nm、激勵光強(qiáng)度約13mW的激光]。讓激光按一定周期(IHz)開關(guān)(開/關(guān))， 測定工作電極的第一區(qū)161a或工作電極的第二區(qū)161b與反電極之間的光電流。在試驗(yàn)例 1，調(diào)查了所用電極的種類(透過型和反射型)與光電流之間的關(guān)系，其結(jié)果見圖27。在圖 27中，“透過型”指工作電極的第一區(qū)161a?！胺瓷湫汀敝腹ぷ麟姌O的第二區(qū)161b。
從圖27所示結(jié)果可以看出，當(dāng)檢測物的濃度為InM時(shí)，與實(shí)驗(yàn)號為1和2(透過型)的光電流相比，實(shí)驗(yàn)號為3和4(反射型)的光電流分別顯著增強(qiáng)。當(dāng)檢測物的濃度為 OnM時(shí)，實(shí)驗(yàn)號為3和4(反射型)的光電流分別等于實(shí)驗(yàn)號為1和2號(透過型)的光電流。從此結(jié)果可以知道，向工作電極上的檢測物反射透過了工作電極的光，可以明顯增強(qiáng)光電流。
(試驗(yàn)例2)
在試驗(yàn)例2，除向工作電極161的第一區(qū)161a照射強(qiáng)度為5. 67mW或10. 9Imff的激光以及向工作電極161的第二區(qū)161b照射激勵光強(qiáng)度為5. 67mW的激勵光(激光)外，進(jìn)行了與試驗(yàn)例1同樣的操作，測量光電流。算出S/N比。S/N比是根據(jù)以下公式(1)算出的。
[數(shù)1]
(檢測物濃度InM時(shí)的光電流)-(檢測物濃度OnM時(shí)的光屯流)(檢測物濃度OnM時(shí)的光電流)(1)
在試驗(yàn)例2，調(diào)查了所用電極的種類和激勵光強(qiáng)度與光電流之間的關(guān)系，其結(jié)果見圖洲々。實(shí)驗(yàn)號9是向工作電極的第一區(qū)161a(透過型)照射激勵光強(qiáng)度為5. 67mW的激勵光(激光)時(shí)的光電流的測定結(jié)果。實(shí)驗(yàn)號10是向工作電極的第一區(qū)161a(透過型) 照射激勵光強(qiáng)度為10. 91mW的激勵光(激光)時(shí)的光電流的測定結(jié)果。實(shí)驗(yàn)號11是向工作電極的第二區(qū)161b(反射型)照射激勵光強(qiáng)度為5. 67mff的激勵光(激光)時(shí)的光電流的測定結(jié)果。另外，圖中“雜波”是指檢測物濃度OnM時(shí)的光電流(即非起因于檢測物的雜波)?！靶盘枴笔侵笝z測物濃度為InM時(shí)的光電流(即起因于檢測物的信號)。
從圖28A所示結(jié)果可以看出，實(shí)驗(yàn)號10中的“信號”的光電流約是實(shí)驗(yàn)號9中的 “信號”的光電流的2倍。從圖28A所示結(jié)果可以得知，實(shí)驗(yàn)號10中的“雜波”的光電流約是實(shí)驗(yàn)號9中的“雜波”的光電流的2倍。從這些結(jié)果可以知道，增強(qiáng)激勵光的強(qiáng)度時(shí)，會增強(qiáng)檢測物產(chǎn)生的信號，但與此同時(shí)，不是由檢測物產(chǎn)生的雜波也會增加。
另一方面，從圖28A所示結(jié)果可以看出，實(shí)驗(yàn)號11中的“信號”的光電流大約為實(shí)驗(yàn)號9的“信號”的光電流的2. 6倍。從圖28A所示結(jié)果可以看出，實(shí)驗(yàn)號11中的“雜波” 的光電流與實(shí)驗(yàn)號9中的“雜波”的光電流相等。從這些結(jié)果可以知道，當(dāng)使用有反射部件的工作電極時(shí)，可以使檢測物產(chǎn)生的信號增強(qiáng)，同時(shí)可以在很大程度上控制不是由檢測物產(chǎn)生的雜波。
根據(jù)圖28A所示結(jié)果，算出S/N比。在試驗(yàn)例2中，調(diào)查了所使用的電極種類和激勵光強(qiáng)度與S/N比的關(guān)系，其結(jié)果見圖^B。
從圖28B所示結(jié)果可以看出，實(shí)驗(yàn)號為11的S/N比大于實(shí)驗(yàn)號為9的S/N比。但是，實(shí)驗(yàn)號為10的S/N比小于實(shí)驗(yàn)號為9的S/N比。因此，從這些結(jié)果可以知道，當(dāng)使用具有反射部件的工作電極時(shí)，檢測靈敏度有所提高。
(試驗(yàn)例3)
除通過蒸鍍法制成由金薄膜(膜厚50. 9nm)構(gòu)成的反射層181這一點(diǎn)外，以與制造例1同樣的方法制成了電極和反射部件。然后，用與制造例1同樣的方法進(jìn)行硅烷偶聯(lián)劑的涂覆、捕捉物的固定及未固定DNA探針的去除，獲得電極基板141 (參照圖2躺。
使用此電極基板141 ；除此之外，將標(biāo)記物Alexa four750標(biāo)記的靶DNA(檢測物)添加到雜交緩沖劑[美國昂飛公司制，商品名 雜交緩沖劑Ox Hybridization buffer)]中，并使其濃度達(dá)到OnM或ΙΟηΜ，將如此制作的溶液作為雜交溶液。除上述兩點(diǎn)外，采用與試驗(yàn)例1同樣的方法進(jìn)行檢測物的捕捉和光電流的測量。所得結(jié)果見圖四。
從圖四所示結(jié)果可以看出，當(dāng)檢測物濃度為IOnM時(shí)，與實(shí)驗(yàn)號12和13 (透過型) 的光電流相比，實(shí)驗(yàn)號14和15(反射型)各自的光電流分別有明顯增加。當(dāng)檢測物濃度為OnM時(shí)，實(shí)驗(yàn)號18和19(反射型)的光電流分別與實(shí)驗(yàn)號16和17(透過型)的光電流相同。由此結(jié)果可知，將電極制作成反射型，向工作電極上的檢測物反射透過了工作電極的光，可以僅增大來源于色素的光電流。
(試驗(yàn)例4)
將鋁箔粘在基板背面，以此形成由鋁制成的反射層181，除這一點(diǎn)外，其余均采用與制造例1同樣的方法制作電極和反射部件。在試驗(yàn)例4中，不進(jìn)行制造例1中的涂覆硅烷偶聯(lián)劑的操作、固定捕捉物的操作及去除未固定DNA探針的操作，取而代之，用UV/03(UV-1 型，Samco (莎姆克株式會社))清洗電極表面10分鐘，以此獲得電極基板141 (參照圖30A)。
用硅膠(厚度0.2mm)充當(dāng)間隔固定件，并圍在所得的電極基板141的工作電極的第一、二區(qū)161a、161b的周圍。向硅膠圍成的空間中注入12. 5 μ L的溶液，該溶液是如下制成的在制造例2獲得的電解液中加入標(biāo)記物Alexa Flour750標(biāo)記的靶DNA (檢測物)，直至其濃度達(dá)到OnM或ΙΟηΜ。以此使工作電極、反電極和參比電極接觸同一電解液。用玻璃蓋從電極基板141的上面蓋住上述空間，將其密封起來。以此防止在測量光電流的過程中電解液漏出或干燥。
然后以與試驗(yàn)例1同樣的方法測定光電流。所得結(jié)果見圖31。從圖31所示結(jié)果可以看出，當(dāng)檢測物的濃度為InM時(shí)，與實(shí)驗(yàn)號20和21 (透過型)的光電流相比，實(shí)驗(yàn)號22 和23(反射型)的光電流分別明顯增大。當(dāng)檢測物的濃度為OnM時(shí)，實(shí)驗(yàn)號沈和27 (反射型)的光電流分別與實(shí)驗(yàn)號M和25 (透過型)的光電流相同。由此結(jié)果可知，將電極制作成反射型，向工作電極上的檢測物反射透過了工作電極的光，可以僅增大來源于色素的光電流。
權(quán)利要求
1.一種檢測裝置，用光電化學(xué)法檢測因光激勵而產(chǎn)生電子的檢測物，該裝置包括 工作電極主體，能夠容納所述檢測物產(chǎn)生的電子，并具有透光性；反電極；光源，向所述工作電極主體上的檢測物照射激勵光；及反射部件，用于將所述光源照射出的、并且通過了所述工作電極主體的激勵光反射到所述工作電極主體上的檢測物上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測裝置，其特征在于所述反射部件選自由白金、鋁、金、銀和銅所組成的群中的至少一種構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測裝置，其特征在于 所述工作電極主體由導(dǎo)電層和電子容納層構(gòu)成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測裝置，其特征在于所述光源配置在用于容納所述工作電極主體上的檢測物的電子的電子容納面一側(cè)， 所述反射部件設(shè)置在與所述電子容納面相反的一面。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測裝置，其特征在于 所述反射部件設(shè)置在遠(yuǎn)離所述工作電極主體的位置。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測裝置，其特征在于所述反射部件通過具有透光性的絕緣層與所述工作電極主體成為一體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測裝置，其特征在于與所述工作電極主體上的所述電子容納面相反一側(cè)的表面有具有透光性的絕緣層。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測裝置，其特征在于所述絕緣層是用于保持工作電極主體的形態(tài)的基板主體。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測裝置，其特征在于所述反射部件設(shè)置在用于保持工作電極主體的形態(tài)的基板主體上。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測裝置，其特征在于所述光源配置在用于容納所述工作電極主體上的檢測物的電子的電子容納面的相反一側(cè)，所述反射部件設(shè)在所述電子容納面一側(cè)中遠(yuǎn)離所述工作電極主體的位置。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的檢測裝置，其特征在于在與所述工作電極主體上的所述電子容納面相反一側(cè)的表面上設(shè)有具有透光性的絕緣層。
12.一種電極基板，用光電化學(xué)法檢測因光激勵而產(chǎn)生電子的檢測物，該基板包括 基板主體；工作電極主體，位于所述基板主體上、能夠容納所述檢測物產(chǎn)生的電子，且具有透光性；及反射部件，位于所述基板主體上、能夠?qū)⒐庠凑丈涑龅?、透過了所述工作電極主體的激勵光反射到所述工作電極主體上的檢測物上。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的電極基板，其特征在于 所述基板主體上有反電極。
14.一種工作電極，用光電化學(xué)法檢測因光激勵而產(chǎn)生電子的檢測物的，該電極包括工作電極主體，位于所述基板主體上、能夠容納所述檢測物產(chǎn)生的電子，且具有透光性；及反射部件，位于所述基板主體上，將光源照射出的、透過了所述工作電極主體的激勵光反射到所述工作電極主體上的檢測物上。
15.一種檢查芯片，用光電化學(xué)法檢測因光激勵而產(chǎn)生電子的檢測物，該芯片包括 電極基板，由基板主體、工作電極主體、以及反射部件構(gòu)成，其中所述工作電極主體位于所述基板主體上，能夠容納所述檢測物產(chǎn)生的電子，且具有透光性；所述反射部件位于所述基板主體上，將光源照射出的、且透過了所述工作電極主體的激勵光反射到所述工作電極主體上的檢測物上；及反電極。
16.一種檢測物的檢測方法，用具有透光性的工作電極主體和反電極，對因光激勵而產(chǎn)生電子的檢測物進(jìn)行光電化學(xué)檢測，該方法包括使所述工作電極主體上存在有檢測物； 向所述工作電極主體上的檢測物照射激勵光；將透過了所述工作電極主體的激勵光反射到所述工作電極主體上的檢測物上；及測定所述工作電極主體與反電極之間的電流。
17.一種受測物的檢測方法，用具有透光性的工作電極主體和反電極對受測物進(jìn)行光電化學(xué)檢測，該方法包括使受測物與標(biāo)記結(jié)合物接觸，形成受測物與標(biāo)記結(jié)合物的復(fù)合物，其中所述標(biāo)記結(jié)合物是用標(biāo)記物標(biāo)記用于捕捉此受測物的結(jié)合物而形成的； 使所述工作電極主體上至少存在有標(biāo)記物； 向所述工作電極主體上的標(biāo)記物照射激勵光；將透過了所述工作電極主體的激勵光反射到所述工作電極主體上的標(biāo)記物上；及測定所述工作電極主體與反電極之間的電流。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠靈敏地檢測出檢測物和受測物的檢測物的檢測裝置、電極基板、工作電極、檢查芯片、檢測物的檢測方法以及受測物的檢測方法；為達(dá)到上述目的，在工作電極上設(shè)置反射部件(反射層)，該反射部件將光源照射出的、且透過了工作電極主體的激勵光反射到工作電極主體上的檢測物上。
文檔編號G01N27/327GK102539741SQ20111033315
公開日2012年7月4日 申請日期2011年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月29日
發(fā)明者堀信康, 桐村浩哉 申請人:希森美康株式會社