專利名稱：一種檢測凝血酶的電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分析化學(xué)與電化學(xué)發(fā)光傳感器領(lǐng)域，具體為一種檢測凝血酶的電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法及應(yīng)用。另外，本發(fā)明還涉及采用所述的電化學(xué)發(fā)光傳感器檢測凝血酶的方法。
背景技術(shù)：
凝血酶(Thombin)作為一種重要的蛋白酶，在血液凝固、炎癥和創(chuàng)傷愈合等生理及病理過程中發(fā)揮著重要作用。由于惡性腫瘤患者常有不同程度的出血傾向，腫瘤組織對周圍組織侵襲、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移以及腫瘤組織和腫瘤患者血液本身的變化，均可改變患者的凝血機(jī)制。衡量凝血機(jī)制的重要指標(biāo)之一就是檢測凝血酶的濃度，這為揭示腫瘤的發(fā)生機(jī)制， 以及作為臨床早期診斷、療效及預(yù)后判斷具有重大意義。目前測定凝血酶的傳統(tǒng)方法主要有熒光法和發(fā)色底物法，其靈敏度不高，不滿足實(shí)際檢測要求。適體是利用指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, SELEX)技術(shù)篩選出來的。能夠與目標(biāo)蛋白等進(jìn)行高親合性、高特異性的結(jié)合，其特異性可與抗原抗體相媲美。同時(shí)適體穩(wěn)定、便宜、易合成、可再生， 因而近年來成為蛋白分析的有力工具之一。目前利用適體的識別進(jìn)行凝血酶檢測方法主要為二茂鐵淬滅釕聯(lián)吡啶電化學(xué)發(fā)光等方法[Yan Li, Honglan Qi, Yage Peng, Qiang Gao, Chengxiao Zhang. Electrochem. Commun. , 2008, 10, 1322-1325; Hongying Zhu, Jonathan D. Suter, Ian Μ. White, Xudong Fan. Sensors 2006, 6(8)，785-795; Anna Pasternak, Frank J. Hernandez, Lars M. Rasmussen, Birte Vester, Jesper Wenge1. Nuc 1. Acids Res. 2011，39(3)，1155-1164]。這些方法各有其優(yōu)點(diǎn)，能不同程度的滿足對凝血酶的檢測要求，但方法的靈敏度不高。所以必須發(fā)展一種靈敏度高，簡單的新型檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測凝血酶的電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法及應(yīng)用，以及提供一種采用所述的電化學(xué)發(fā)光傳感器檢測凝血酶的方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的
一種檢測凝血酶的電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法，包括如下步驟
(1)將金電極浸入0.5X 10_7 1.5 X IO-7M的DNAl中，37°C固定4 h后，在金電極表面形成自組裝膜，用PBS溶液沖洗，再用0. 5 X 10_3 1. 5 X 10_3 M的巰基己醇封板，用PBS溶液沖洗金電極；
(2)取DNA雜交液于小樣品管中，37°C浸泡金電極進(jìn)行雜交，之后用PBS沖洗金電極；(3)取發(fā)光探針溶液于小樣品管中，將金電極插入其中在37°C浸泡進(jìn)行再雜交，然后用 PBS緩沖液沖洗金電極，從而制得電化學(xué)發(fā)光生物傳感器；
其中所述的DNA雜交液按如下方法制備而成在小樣品管中加入DNA1，然后再加入 DNA2，37°C下雜交后，向其中加入凝血酶，室溫下反應(yīng)后再加入DNA3，37°C下反應(yīng)后加入 Tris-HCl緩沖液、dNIPs、DNA聚合酶Wii 29，37°C反應(yīng)；然后加入iTris-HCl緩沖液、DNA剪切酶Nb.BbvCI，37°C條件下反應(yīng)，即得；
所述的發(fā)光探針溶液按如下方法制備而成在小樣品管中加入依次加入pH為8. 2的 1Tris-HCl、TCEP、DNA4、巰基乙胺，室溫放置20-60min后加入金納米粒子，室溫下反應(yīng)10-14 h后加入pH為9. 0的硼酸緩沖液，取活化的聯(lián)吡啶釕，室溫下震蕩反應(yīng)過夜，將溶液于4 oC,10000 r/min下離心，棄去上清液，加入Tris-HCl緩沖液洗滌后定容，即得； 所述的 DNAl 的部分序列為 5—-CCAACCACACCAACCCAC-3—； 所述的 DNA2 的部分序列為 3:GGTTGGTGTGGTTGGGTGCTC-5~ ； 所述的DNA3的部分序列為
-ATTGTGGTTGGGTGCGACTCCAACTAGCTGAAGT-5、； 所述的DNA4的部分序列為3—-SH-CAGACTCCAACT-5—。優(yōu)選地，上述的電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法，其中所述的金納米粒子按如下方法制備而成在圓底燒瓶中加入100 mL、0. 01%的HAuCl4，攪拌加熱至沸騰，然后快速加入 1. 8 mL、l%的Na3C6H5O7，再加熱、攪拌10分鐘，冷卻至室溫，即得。優(yōu)選地，上所述的電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法，其中所述的活化的聯(lián)吡啶釕按如下方法制備而成
(1)在100mL圓底燒瓶中分別加入0. 3992 g RuCl3 · χΗ20和0. 6324 g 2，2-聯(lián)吡啶， 再加40 mL乙二醇加熱回流6 h后，冷卻至室溫，用20 mL丙酮和40 mL乙醚萃取、抽濾，用無水乙醇沖洗三次，得到氯化二聯(lián)吡啶釕；
(2)取0. 16 g 氯化二聯(lián)吡啶釕，以及 0. 16 g NaHCO3,0. 12 g 4，4，- 二羧基-2，2，-聯(lián)吡啶，加到10 mL甲醇溶液中(Vfs=4:1)，將混合液轉(zhuǎn)移到50 mL三口燒瓶中加熱回流4 h，然后冰浴下保存7 h，用HCl混合物調(diào)節(jié)pH至4. 4，抽濾混合物后，再用甲醇沖洗三次，然后取2.0 g NaPF6溶于14 mL水中，加入到上述濾液中，反應(yīng)生成沉淀，過濾并干燥沉淀，得到二聯(lián)吡啶_4，4’ - 二羧基-2，2’ -聯(lián)吡啶合釕(II)六氟磷酸鹽；
(3)在10mL小燒杯中加入1. 0 mL含0. 1532 g上述產(chǎn)物的DMF溶液，再加入1. 5 mL 含0.23 g EDC和0.119 g NHS的DMF溶液，攪拌反應(yīng)5 h后即得到活后的聯(lián)吡啶釕。優(yōu)選地，上述的電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法，其中所述的金電極按如下方法預(yù)處理金電極經(jīng)α -Al2O3拋光粉拋光后，用二次蒸餾水沖洗干凈，并在超聲波水浴中超聲5 min，用高純氮?dú)獯蹈?；采用三電極系統(tǒng)檢測，工作電極為金電極，對電極為鉬絲電極，參比電極為Ag/AgCl電極，在K3 [Fe (CN)6]溶液中，設(shè)置電壓為0 0. 8 V，對金電極進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，測完后，用二次水沖洗電極，吹干電極表面，備用。一種利用上述方法制備的電化學(xué)發(fā)光傳感器檢測凝血酶含量的方法，使用不同濃度的凝血酶會得到不同濃度的雜交液，當(dāng)加入10 μ L—定濃度的凝血酶時(shí)，獲得雜交液，經(jīng)此雜交液反應(yīng)制得的電化學(xué)傳感器再經(jīng)電化學(xué)發(fā)光檢測，準(zhǔn)確移取1 mL 0. 1 M TPA (用pH 為7. 4的PBS溶液配制)到檢測池中，以具備電化學(xué)發(fā)光生物傳感器功能的金電極作為工作電極，以電化學(xué)發(fā)光信號S (S為施加電壓后30 s內(nèi)的電化學(xué)發(fā)光積分值)為分析信號，進(jìn)行凝血酶的測定，參數(shù)設(shè)置為高壓800 v，放大級數(shù)為3。由于上述方法制備的電化學(xué)發(fā)光傳感器可以檢測凝血酶，因此，本發(fā)明提供了上述的電化學(xué)發(fā)光傳感器在檢測凝血酶含量中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明涉及的電化學(xué)發(fā)光傳感器具有如下優(yōu)點(diǎn)和顯著地進(jìn)步 金納米粒子提供相對大的比表面積用于負(fù)載電化學(xué)發(fā)光試劑，酶切循環(huán)使信號進(jìn)一步放大，使得本發(fā)明設(shè)計(jì)的電化學(xué)發(fā)光適體傳感器具有高靈敏度。另外，根據(jù)實(shí)驗(yàn)發(fā)光強(qiáng)度(圖 8)可以看出，當(dāng)本發(fā)明的傳感器用于檢測溶菌酶、牛血清白蛋白和免疫球蛋白G時(shí)，其發(fā)光強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于檢測凝血酶的發(fā)光強(qiáng)度，這說明該傳感器具有很高的選擇性檢來測凝血酶。 因此，本發(fā)明涉及的電化學(xué)發(fā)光傳感器在構(gòu)建檢測蛋白質(zhì)的研究方法中體現(xiàn)出良好的發(fā)展前景。


圖1為本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)原理圖。圖2為不同修飾階段的電極的電化學(xué)阻抗。圖3為電化學(xué)發(fā)光適體傳感器的電化學(xué)行為。圖4為凝血酶與其適體結(jié)合時(shí)間。圖5為檢測體系的pH。圖6為不同濃度凝血酶的電化學(xué)發(fā)光信號。圖7為電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與凝血酶濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，插圖為凝血酶濃度為 3. OX 10_14飛.OX 10_12 M與電化學(xué)發(fā)光信號線性關(guān)系的放大圖。圖8相同濃度凝血酶、溶菌酶、牛血清白蛋白和免疫球蛋白G的檢測結(jié)果比較。
具體實(shí)施例方式以下是本發(fā)明涉及的具體實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步作描述，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于這些實(shí)施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明涉及的一種檢測凝血酶的電化學(xué)發(fā)光傳感器，將帶有活性基團(tuán)的聯(lián)吡啶釕修飾到金納米粒子表面形成電化學(xué)發(fā)光納米粒子探針，對電化學(xué)發(fā)光起放大作用，在工作電極表面上修飾上部分DNA單鏈，組成電化學(xué)發(fā)光傳感器。將目標(biāo)分析物凝血酶與部分DNA 雙鏈作用，再與DNA聚合酶和Nb. BbvCI切口酶、部分DNA單鏈作用，得DNA雜交液，將其加到傳感器中，使得電極表面電化學(xué)發(fā)光納米粒子探針增加，導(dǎo)致電化學(xué)發(fā)光信號增強(qiáng)。以此現(xiàn)象實(shí)現(xiàn)對凝血酶的測定。本發(fā)明是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的一種檢測凝血酶的電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法，包括以下步驟
(1)利用現(xiàn)有方法，制備出合適粒徑的金納米粒子；
(2)利用巰基與金的作用，將一端巰基，另一端羧基的烷烴修飾在金納米粒子表面；(3)利用羧基和氨基作用，將氨基化的聯(lián)吡啶釕連接在烷烴修飾的金納米粒子上制備電化學(xué)發(fā)光探針；
(4)利用靶標(biāo)與適體的特異性識別作用、Nb.BbvCI切口酶切割作用和DNA聚合酶聚合作用，制備DNA的雜交液；
(5)利用雜交技術(shù)，構(gòu)建電化學(xué)發(fā)光傳感器。所述金納米粒子電化學(xué)發(fā)光納米粒子探針和傳感器的制備包括以下步驟
(1)工作電極表面經(jīng)1μπι、0. 3 μπι,Ο. 05 μ m的α-Al2O3拋光粉拋光后，用二次蒸餾水沖洗干凈，并在超聲波水浴中超聲5分鐘，用二次水徹底沖洗后，吹干；
(2)將工作電極浸入100μ L (LOXlO-7M)的部分DNA單鏈溶液中，37°C雜交反應(yīng)4 h，用PBS溶液清洗電極，再用巰基己醇(MCH，200 μ L，10_3 Μ)浸泡30分鐘，用PBS溶液清洗電極；
(3)取50μ L已制備好的雜交液于2 mL小樣品管中，浸泡工作電極1 h (37°C)進(jìn)行雜交，之后用PBS清洗電極；
(4)取100μ L已制備好的電化學(xué)發(fā)光探針溶液于2 mL小樣品管中，37 ！下將工作電極浸入進(jìn)行雜交1 h，然后用PBS清洗電極。(5) DNA雜交液的制備采用以下步驟在2 mL的小樣品管中加入DNAl (10 μ L， 10" Μ)，然后再加入DNA2 (10 μ L，10_7 Μ)，37°C下雜交60 min，形成部分DNA雙鏈。向其中加入10 μ L不同濃度的凝血酶。室溫下反應(yīng)40 min。再加入部分DNA3單鏈(10 μ L, I(T7M), 37°C下反應(yīng) 1 h。加入 7.5 μ L 的 iTris-HCl 緩沖液，6 μ L 的 10 * buffer2,6 μ L 的dNIPs,然后加入0.5 μ L DNA聚合酶Phi 29，37°〇反應(yīng)1 h。加入2. 5 μ L Tris-HCl 緩沖液，7 yL的10 * buffer2，再加入0. 5 μ L DNA剪切酶Nb. BbvCI，37°C條件下反應(yīng)1 h。上述雜交液于4°C下保存?zhèn)溆?。具體實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示。不同修飾階段的電極的電化學(xué)阻抗如圖2所示。電化學(xué)發(fā)光適體傳感器的電化學(xué)行為如圖3所示。本發(fā)明中的電化學(xué)發(fā)光檢測條件，具體特征如下
(1)凝血酶與其適體結(jié)合時(shí)間。優(yōu)選的，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度在10 40 min內(nèi)隨著結(jié)合時(shí)間增長而增加，在40 min達(dá)到最大值，而在40 60 min內(nèi)隨著結(jié)合時(shí)間增加，發(fā)光強(qiáng)度反而略有下降。這可能是在較長的時(shí)間條件下，凝血酶及凝血酶-適體結(jié)合物吸附或包埋住部分DNA洗脫液，造成最終信號強(qiáng)度略減。優(yōu)選的，最佳結(jié)合時(shí)間為40-50 min。(2)檢測體系的pH。優(yōu)選的，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。當(dāng)pH為7. 0-8. O時(shí)，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度較大。所以，優(yōu)選的，實(shí)驗(yàn)用PH為7.0-8.0。
實(shí)施例基于酶切循環(huán)信號放大技術(shù)標(biāo)記電化學(xué)發(fā)光傳感器檢測凝血酶 1.實(shí)驗(yàn)部分 1.1儀器與試劑
MPI-E型電致化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)(西安瑞邁分析儀器有限公司)；THZ-82A氣浴恒溫振蕩器(全壇市醫(yī)療儀器廠);CHI660B電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司);Anke-TGL-16C飛翁牌高速離心機(jī)(上海市安亭科學(xué)儀器廠)；PHS-3D型酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)；實(shí)驗(yàn)采用三電極系統(tǒng)金電極及修飾金電極為工作電極，Ag/AgCl (飽和KCl)電極為參比電極，鉬絲電極為對電極。巰基己醇(HS-(CH2)6-OH)購自Aldrich公司；NaH2PO4 · 2H20購自天津市廣成化學(xué)試劑有限公司；妝2朋04*12!120購自天津市紅巖化學(xué)試劑廠；^^ ，三(羥甲基)氨基甲烷 (Tris)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯金酸(HAuCl4),檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7)均購于天津市博迪化工有限公司；鐵氰化鉀(KJFe(CN)6])購自天津市博迪化工有限公司；亞鐵氰化鉀(K4[Fe (CN)6] ·3Η20)購自天津市廣成化學(xué)試劑有限公司；氧化鋁粉末(α-Al2O3),購自CH Instruments, Inc ；三丙胺(TPA)購自上海阿拉丁試劑公司；DNA聚合酶(phi 29.)， DNA限制性內(nèi)切酶(Nb. BbvCI)購自北京百靈威科技有限公司；凝血酶購于Haematologic Technologies, Inc.(美國);水合氯化釕，2，2_聯(lián)吡啶，4，4’ - 二羧基_2，2’ -聯(lián)吡啶，六氟磷酸鈉均購自上海阿拉丁試劑公司；1- (3-二甲氨基醛)-3-乙基二亞胺鹽酸鹽(EDC)購自天津市巴斯夫化工有限公司；N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)購自天津市巴斯夫化工有限公司。所用人工合成DNA序列(北京賽百盛生物工程有限公司購得)如下。部分DNAl :(凝血酶適體互補(bǔ)鏈)，5、-CCA ACC ACA CCA ACC CAC-3、； 部分 DNA2 :(凝血酶適體)，3~-GGT TGG TGT GGT TGG GTG CTC-5、； 部分DNAl與部分DNA2形成部分DNA雙鏈。部分DNA3單鏈3~_AT T GTG GTT GGG TGCGAC TCC AAC TAG CTG AAGT-5、；(粗體部分與DNAl雜交)，
部分 DNA4 單鏈(3、-SH，與金電極連接)，3:SH-CAG ACT CCA ACT-5、；
1. 2實(shí)驗(yàn)步驟
1. 2. 1金納米粒子的制備
制備、儲存金膠溶液所用的玻璃容器(容量瓶，棕色廣口瓶，圓底燒瓶等)用王水(鹽酸硝酸比例為1:3)泡洗30分鐘，然后用二次水沖洗干凈，烘干備用。在250 mL圓底燒瓶中加入100 mL, 0. 01%的HAuCl4,攪拌加熱至沸騰，然后快速加入1. 8 mL, 1%的Na3C6H5O7，再加熱、攪拌10分鐘，冷卻至室溫。轉(zhuǎn)移到棕色瓶中于陰涼處保存。1. 2. 2聯(lián)吡啶釕的合成與活化
(1)在100 mL圓底燒瓶中分別加入0. 3992 g RuCl3 · χΗ20和0. 6324 g 2，2-聯(lián)吡啶， 再加40 mL乙二醇加熱回流6 h后，冷卻至室溫，用20 mL丙酮和40 mL乙醚萃取、抽濾，用無水乙醇沖洗三次，得到氯化二聯(lián)吡啶釕。(2)取上述方法制得的0. 16 g Ru(bpy)2Cl2，以及0. 16 g NaHCO3,0. 12 g 4，4，-二羧基-2，2，-聯(lián)吡啶，加到10 mL甲醇溶液中(Vw/水=4:1)。將混合液轉(zhuǎn)移到50 mL三口燒瓶中加熱回流4 h，然后冰浴下保存7 h，用HCl混合物調(diào)節(jié)pH至4. 4，抽濾混合物后，再用甲醇沖洗三次。然后取2.0 g NaPF6溶于14 mL水中，加入到上述濾液中，反應(yīng)生成沉淀。過濾并干燥沉淀，得到二聯(lián)吡啶_4，4’ - 二羧基-2，2’ -聯(lián)吡啶合釕(II)六氟磷酸鹽 (Ru(bpy)2(dcbpy) (PF6)。(3)在10 mL小燒杯中加入1.0 mL含0. 1532 g上述產(chǎn)物的DMF溶液，再加入 1.5 mL含0.23 g EDC和0.119 g NHS的DMF溶液，攪拌反應(yīng)5 h后即得到活后的聯(lián)吡啶釕-Ru(bpy)2(dcbpy)NHS。
1. 2. 3電化學(xué)發(fā)光探針的制備
取 2 mL 的樣品管，依次加入 1.5 μ L，500 mM 的 Tris-HCl (pH 為 8. 2)，6 μ L，10 mM 的 TCEP，7. 2 μ L，Kr4 M 的DNA4，7. 2 μ L，1(Γ4 M 的巰基乙胺，室溫放置 30 min后加入 1 mL Au NPs，室溫下反應(yīng)12 h。再加入120 yL,0. 1 M的硼酸緩沖液(pH為9. 0)，取8 μ L上一步活化的聯(lián)吡啶釕，室溫下震蕩反應(yīng)過夜。將溶液于4 oC,10000 r/min下離心30 min，棄去上清液，加入800 μ L Tris-HCl緩沖液(500 mM, pH為8. 2)洗3次。使用Tris-HCl緩沖液定容至1 mL，4 °C儲存?zhèn)溆谩?. 2. 4 DNA雜交液的制備
在2 mL的小樣品管中加入DNAl (10 μ L，1(Γ7 Μ)，然后再加入DNA2 (10 μ L，1(Γ7 Μ)， 37°C下雜交60 min。向其中加入10 μ L不同濃度的凝血酶。室溫下反應(yīng)40 min。再加入 DNA3 (10 μ L，I(T7M), 37°C下反應(yīng) 1 h。加入 7. 5 μ L 的 iTris-HCl 緩沖液，6 μ L 的 10 * buffer2 (buffer2為商品化DNA限制性內(nèi)切酶(Nb. BbvCI)附帶溶液)，6 μ L的dNIPs，然后加入0.5 μ L DNA聚合酶Phi 29，37°C反應(yīng)1 h。加入2. 5 μ L Tris-HCl緩沖液，7 μ L 的10 * buffer2，再加入0. 5 μ L DNA剪切酶Nb. BbvCI，37°C條件下反應(yīng)1 h。上述雜交液于4°C下保存?zhèn)溆谩?. 2. 5電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建
1.金電極的預(yù)處理。金電極經(jīng)α-Al2O3拋光粉拋光后，用二次蒸餾水沖洗干凈，并在超聲波水浴中超聲5 min，用高純氮?dú)獯蹈?。采用三電極系統(tǒng)檢測，工作電極為金電極，對電極為鉬絲電極，參比電極為Ag/AgCl電極，在K3 [Fe (CN)6]溶液中，設(shè)置電壓為0 0. 8 V, 對金電極進(jìn)行循環(huán)伏安(CV)掃描。測完后，用二次水沖洗電極，吹干電極表面，備用。2.電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備。將金電極浸入100 μ L (LOXlO-7M)的DNAl中， 固定4 h (37°C)后，在Au電極表面形成自組裝膜，用0. 1 MPBS (pH 7. 4,Na2HPO4- NaH2PO4) 溶液沖洗二次，再用MCH (200 μ L，10_3 Μ)封板半小時(shí)，用PBS溶液沖洗電極二次。取50 μ L已制備好的雜交液于2 mL小樣品管中，浸泡金電極1 h(37°C)進(jìn)行雜交，之后用PBS沖洗電極二次。取100 μ L已制備好的探針溶液于2 mL小樣品管中，將金電極浸入1 h (37 °C)進(jìn)行再雜交，然后用PBS緩沖液沖洗電極二次。從而制得電化學(xué)發(fā)光生物傳感器。1. 2. 6電化學(xué)發(fā)光法檢測凝血酶
使用不同濃度的凝血酶會得到不同濃度的雜交液，當(dāng)加入10 μ L —定濃度的凝血酶時(shí)，獲得雜交液，經(jīng)此雜交液反應(yīng)制得的電化學(xué)傳感器再經(jīng)電化學(xué)發(fā)光檢測。準(zhǔn)確移取1 HiL 0. 1 M TPA (用PH為7. 4的PBS溶液配制)到檢測池中，以具備電化學(xué)發(fā)光生物傳感器功能的金電極作為工作電極，以電化學(xué)發(fā)光信號S (S為施加電壓后30 S內(nèi)的電化學(xué)發(fā)光積分值)為分析信號，進(jìn)行凝血酶的測定。參數(shù)設(shè)置為高壓800 ν，放大級數(shù)為3。1. 3結(jié)果與討論
本發(fā)明在優(yōu)選的最佳的實(shí)驗(yàn)條件下，研究了不同濃度凝血酶與發(fā)光強(qiáng)度之間的關(guān)系， 得到了檢測凝血酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍及線性方程。在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下，當(dāng)凝血酶的濃度在3. OX 10_14 6. OX 10, M之間時(shí)，隨著凝血酶濃度的變化，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度有明顯變化。經(jīng)計(jì)算得到檢測凝血酶的非線性方程為 Δ Iecl = - 0.0138 C2 + 17.6762 C + 83. 5496 ( Δ Im是體系的相對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度；C是凝血酶的濃度，ΙΟ43 M ;n=12，R2=O. 9919)溶菌酶的濃度在3. 0 X 10 6. 0 X 1(Γ12 M范圍內(nèi)與發(fā)光強(qiáng)度呈一定的線性關(guān)系，其線性回歸方程是八Iecl = 22.8575 C + 10.8689 ( Δ Iecl 是體系的相對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度；C是凝血酶的濃度，10_13 Μ;η=9)，線性相關(guān)系數(shù)R= 0.9991， 檢測限是1.8Χ10_14 M (3 ο )，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明該方案比大多數(shù)現(xiàn)有腺苷適體傳感器更靈敏。 該方法的精密度通過對濃度為3. OX 10_12 M的凝血酶進(jìn)行11次平行測定而計(jì)算得出，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%。表明本法有較好的重現(xiàn)性。選擇性是衡量傳感器性能的重要指標(biāo)。為檢驗(yàn)該傳感器的選擇性，選擇牛血清白蛋白和溶菌酶作為檢測適體傳感器對檢測凝血酶的對比物。將修飾好的傳感器檢測濃度為 3. OX ΙΟ"12 M溶菌酶、牛血清白蛋白和免疫球蛋白G，并將發(fā)光強(qiáng)度與檢測凝血酶的發(fā)光強(qiáng)度比較。發(fā)光強(qiáng)度如圖8所示，可以看出，檢測溶菌酶、牛血清白蛋白和免疫球蛋白G的發(fā)光強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于檢測凝血酶的發(fā)光強(qiáng)度，說明該傳感器具有很高的選擇性來測凝血酶。本發(fā)明是基于酶切循環(huán)信號放大技術(shù)標(biāo)記電化學(xué)發(fā)光機(jī)制研制了一種高靈敏檢測凝血酶的新型生物傳感器。研制的傳感器具有如下優(yōu)勢金納米提供相對大的比表面積用于負(fù)載電化學(xué)發(fā)光試劑；酶切循環(huán)使信號進(jìn)一步放大，設(shè)計(jì)的電化學(xué)發(fā)光適體傳感器具有高靈敏度。因此，所設(shè)計(jì)的電化學(xué)發(fā)光傳感器在構(gòu)建檢測蛋白質(zhì)的研究方法中體現(xiàn)出良好的發(fā)展前景。
權(quán)利要求
1.一種檢測凝血酶的電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法，包括如下步驟(1)將金電極浸入0.5X 10_7 1.5 X IO-7M的DNAl中，37°C固定4 h后，在金電極表面形成自組裝膜，用PBS溶液沖洗，再用0. 5 X 10_3 1. 5 X 10_3 M的巰基己醇封板，用PBS溶液沖洗金電極；(2)取DNA雜交液于小樣品管中，37°C浸泡金電極進(jìn)行雜交，之后用PBS沖洗金電極；(3)取發(fā)光探針溶液于小樣品管中，將金電極插入其中在37°C下浸泡進(jìn)行再雜交，然后用PBS緩沖液沖洗金電極，從而制得電化學(xué)發(fā)光生物傳感器；其中所述的DNA雜交液按如下方法制備而成在小樣品管中加入DNA1，然后再加入 DNA2，37°C下雜交后，向其中加入凝血酶，室溫下反應(yīng)后再加入DNA3，37°C下反應(yīng)后加入 Tris-HCl緩沖液、dNIPs、DNA聚合酶Wii 29，37°C反應(yīng)；然后加入iTris-HCl緩沖液、DNA剪切酶Nb.BbvCI，37°C條件下反應(yīng)，即得；所述的發(fā)光探針溶液按如下方法制備而成在小樣品管中加入依次加入pH為8. 2的 1Tris-HCl、TCEP、DNA4、巰基乙胺，室溫放置20-60min后加入金納米粒子，室溫下反應(yīng)10-14 h后加入pH為9. 0的硼酸緩沖液，取活化的聯(lián)吡啶釕，室溫下震蕩反應(yīng)過夜，將溶液于4 oC,10000 r/min下離心，棄去上清液，加入Tris-HCl緩沖液洗滌后定容，即得；所述的 DNAl 的部分序列為 5—-CCAACCACACCAACCCAC-3—；所述的 DNA2 的部分序列為 3:GGTTGGTGTGGTTGGGTGCTC-5~ ；所述的 DNA3 的部分序列為 3~-ATTGTGGTTGGGTGCGACTCCAACTAGCTGAAGT-5—；所述的DNA4的部分序列為3—-SH-CAGACTCCAACT-5—。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法，其特征在于所述的金納米粒子按如下方法制備而成在圓底燒瓶中加入100 mL、0. 01%的HAuCl4,攪拌加熱至沸騰，然后快速加入1. 8 mL、l%的Na3C6H5O7，再加熱、攪拌10分鐘，冷卻至室溫，即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法，其特征在于所述的活化的聯(lián)吡啶釕按如下方法制備而成(1)在100mL圓底燒瓶中分別加入0. 3992 g RuCl3 · χΗ20和0. 6324 g 2，2-聯(lián)吡啶， 再加40 mL乙二醇加熱回流6 h后，冷卻至室溫，用20 mL丙酮和40 mL乙醚萃取、抽濾，用無水乙醇沖洗三次，得到氯化二聯(lián)吡啶釕；(2)取0. 16 g 氯化二聯(lián)吡啶釕，以及 0. 16 g NaHCO3,0. 12 g 4，4，- 二羧基-2，2，-聯(lián)吡啶，加到10 mL甲醇溶液中(Vfs=4:1)，將混合液轉(zhuǎn)移到50 mL三口燒瓶中加熱回流4 h，然后冰浴下保存7 h，用HCl混合物調(diào)節(jié)pH至4. 4，抽濾混合物后，再用甲醇沖洗三次，然后取2.0 g NaPF6溶于14 mL水中，加入到上述濾液中，反應(yīng)生成沉淀，過濾并干燥沉淀，得到二聯(lián)吡啶_4，4’ - 二羧基-2，2’ -聯(lián)吡啶合釕(II)六氟磷酸鹽；(3)在10mL小燒杯中加入1. 0 mL含0. 1532 g上述產(chǎn)物的DMF溶液，再加入1. 5 mL 含0.23 g EDC和0.119 g NHS的DMF溶液，攪拌反應(yīng)5 h后即得到活后的聯(lián)吡啶釕。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法，其特征在于所述的金電極按如下方法預(yù)處理金電極經(jīng)α-Al2O3拋光粉拋光后，用二次蒸餾水沖洗干凈，并在超聲波水浴中超聲5 min，用高純氮?dú)獯蹈桑徊捎萌姌O系統(tǒng)檢測，工作電極為金電極，對電極為鉬絲電極，參比電極為Ag/AgCl電極，在K3 [Fe (CN) 6]溶液中，設(shè)置電壓為0 0. 8 V，對金電極進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，測完后，用二次水沖洗電極，吹干電極表面，備用。
5.一種利用權(quán)利要求1制備的電化學(xué)發(fā)光傳感器檢測凝血酶含量的方法，其特征在于使用不同濃度的凝血酶會得到不同濃度的雜交液，當(dāng)加入10 μ L—定濃度的凝血酶時(shí)，獲得雜交液，經(jīng)此雜交液反應(yīng)制得的電化學(xué)傳感器再經(jīng)電化學(xué)發(fā)光檢測，準(zhǔn)確移取1 mL 0. 1 M TPA (用PH為7. 4的PBS溶液配制)到檢測池中，以具備電化學(xué)發(fā)光生物傳感器功能的金電極作為工作電極，以電化學(xué)發(fā)光信號S (S為施加電壓后30 S內(nèi)的電化學(xué)發(fā)光積分值)為分析信號，進(jìn)行凝血酶的測定，參數(shù)設(shè)置為高壓800 ν，放大級數(shù)為3。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)發(fā)光傳感器在檢測凝血酶含量中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測凝血酶的電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法及應(yīng)用，將帶有活性基團(tuán)的聯(lián)吡啶釕修飾到金納米粒子表面形成電化學(xué)發(fā)光納米粒子探針，對電化學(xué)發(fā)光起放大作用，在工作電極表面上修飾上部分DNA單鏈，組成電化學(xué)發(fā)光傳感器。將目標(biāo)分析物凝血酶與部分DNA雙鏈作用，再與DNA聚合酶和Nb.BbvCI切口酶、部分DNA單鏈作用，得DNA雜交液，將其加到傳感器中，使得電極表面電化學(xué)發(fā)光納米粒子探針增加，導(dǎo)致電化學(xué)發(fā)光信號增強(qiáng)，以此現(xiàn)象實(shí)現(xiàn)對凝血酶的測定。本發(fā)明的傳感器具有很高的選擇性和檢測靈敏度。
文檔編號G01N21/76GK102507689SQ201110317670
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月19日
發(fā)明者混旭, 王衛(wèi), 陳懷成 申請人:青島科技大學(xué)