專(zhuān)利名稱(chēng)：一種固定化綠藻細(xì)胞的生物電極及其使用和測(cè)試方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種固定化綠藻細(xì)胞的生物電極及其使用方法，即在平面多孔電極材料上使用硅溶膠-凝膠方法固定綠藻細(xì)胞，構(gòu)建綠藻生物電極。在電解液中加入電子介體實(shí)現(xiàn)綠藻細(xì)胞光反應(yīng)中心與電極間的電子傳遞，以三電極體系并外加電壓對(duì)電極進(jìn)行測(cè)試。
背景技術(shù)：
綠藻制氫是目前制氫領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。綠藻在光合作用II過(guò)程中能將水分解成氧氣、質(zhì)子和電子，電子經(jīng)過(guò)光合系統(tǒng)I的電子傳遞鏈及鐵氧化還原蛋白傳遞給氫酶，氫酶將質(zhì)子還原為氫氣。綠藻產(chǎn)氫過(guò)程中，產(chǎn)氫電子來(lái)源包括依賴(lài)于PS II的直接途徑和不依賴(lài)于PS II的間接途徑，二者的分配比例以及具體的電子傳遞機(jī)理對(duì)產(chǎn)氫藻株的調(diào)控改造及規(guī)模產(chǎn)氫的實(shí)用化具有重要意義，相關(guān)研究尚未有確定性結(jié)果。由于微藻細(xì)胞內(nèi)部生化反應(yīng)及代謝網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，同時(shí)其反應(yīng)中心往往附著于生物膜與外界隔離，無(wú)法直接得到其內(nèi)環(huán)境的信息，包括氧化還原電位與代謝產(chǎn)物的影響等等無(wú)法直接考察，以細(xì)胞作為對(duì)象研究其關(guān)鍵反應(yīng)中心動(dòng)力學(xué)變化規(guī)律在現(xiàn)階段受到極大限制。而以生物燃料電池或電解電池技術(shù)研究綠藻產(chǎn)氫代謝中電子傳遞，即通過(guò)電子介體將生化反應(yīng)中心，尤其是光合系統(tǒng)產(chǎn)生電子直接傳遞至電極并加以檢測(cè)考察，對(duì)深入研究綠藻產(chǎn)氫過(guò)程中代謝機(jī)理，以及與其他代謝網(wǎng)絡(luò)的相互關(guān)系具有重要意義。例如Torimura等以藍(lán)藻為研究對(duì)象，使用DMBQ作為光誘導(dǎo)電子的傳遞介體，在懸浮體系及碳糊電極系統(tǒng)下實(shí)現(xiàn)了基于微藻的生物光電轉(zhuǎn)換，獲得了大約I微安量級(jí)的光誘導(dǎo)電流。綜觀這些類(lèi)似的研究，其中的關(guān)鍵問(wèn)題在于如何實(shí)現(xiàn)電子在生化反應(yīng)中心與電池的電極間的高效傳遞，在此問(wèn)題上藻細(xì)胞懸浮體系及碳糊電極系統(tǒng)由于擴(kuò)散限制以及由此導(dǎo)致的還原態(tài)介體重新與氧結(jié)合的增強(qiáng)，均會(huì)大大降低電子的傳遞效率。將微藻細(xì)胞固定于電極材料上則可有效地解決這一問(wèn)題，現(xiàn)有研究中藻細(xì)胞的固定化雖有大量報(bào)道，但以硅溶膠-凝膠方法固定藻細(xì)胞在電極材料上制備綠藻生物電極并結(jié)合介體的使用應(yīng)用于光誘導(dǎo)電子傳遞的研究，在國(guó)內(nèi)外均未有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種固定化綠藻細(xì)胞的生物電極及其使用和測(cè)試方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種固定化綠藻細(xì)胞的生物電極，將綠藻細(xì)胞與硅溶膠混合涂層固定于電極材料上，構(gòu)建綠藻生物電極。該生物電極是在平面多孔電極材料上采用硅溶膠-凝膠固定綠藻細(xì)胞制備而成。在平面多孔電極材料上采用硅溶膠-凝膠方法固定綠藻細(xì)胞；具體操作步驟如下I)硅溶膠的制備取四乙氧基硅烷、PH = 2-3的HCl水溶液在室溫下強(qiáng)烈攪拌形成酸性硅溶膠，用NaOH將硅溶膠pH調(diào)整為7. 5-8. 5備用；2)取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)后期的綠藻藻細(xì)胞，重懸在一定體積的硅溶膠中，充分混勻，用移液器吸取一定體積的混合液平鋪在多孔電極材料上，在空氣中風(fēng)干，即制備了綠藻生物電極。步驟(I)中硅溶膠的制備取四乙氧基硅烷、PH = 2-3的HCl水溶液體積比為I 8-10，攪拌時(shí)間為24-72h，酸性硅溶膠pH為2. 2-2. 4。調(diào)硅溶膠pH所用NaOH為1M。步驟(2)中取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)后期，濃度約1-6X 106cells/mL的綠藻，經(jīng)1500_4000r/min離心濃縮2-5min，倒掉上層水后，即得所述的藻細(xì)胞。電極材料為碳紙、不銹鋼網(wǎng)或鈦電極，電極面積為O. 5_24cm2,移液器吸取藻-娃溶膠的混合液體積為25-300 μ L。所述的固定化綠藻細(xì)胞的生物電極的使用方法，以制備的綠藻生物電極作為工作電極，對(duì)電極是鉬電極或鈦電極，將工作電極和對(duì)電極置于添加有電解質(zhì)溶液的電解池中；在可見(jiàn)光存在下，在電解質(zhì)溶液中加入電子介體實(shí)現(xiàn)綠藻細(xì)胞光反應(yīng)中心與電極間的電子傳遞，在工作電極和對(duì)電極間可形成電勢(shì)差；加入電子介體終濃度為10-400 μ Μ。所述電解質(zhì)溶液為鹽·度為20-35。綠藻為海水綠藻采用滅菌海水為電解質(zhì)溶液，綠藻為淡水綠藻采用磷酸緩沖液為電解質(zhì)溶液。所述的固定化綠藻細(xì)胞的生物電極的測(cè)試方法，以三電極體系并外加電壓對(duì)電極進(jìn)行測(cè)試；以綠藻生物電極作為工作電極，與對(duì)電極及參比電極構(gòu)成三電極體系，在電解池溶液中加入電子介體，在電化學(xué)工作站上進(jìn)行測(cè)試。具體為；制備的綠藻生物電極作為工作電極，與對(duì)電極及參比電極構(gòu)成三電極體系，并在電解質(zhì)溶液體系中加入終濃度為10-400 μ M電子介體，使用電化學(xué)工作站對(duì)電極進(jìn)行測(cè)試；測(cè)試前通隊(duì)排氧20min，且在整個(gè)測(cè)試過(guò)程中保持電解池?cái)嚢梵w系無(wú)氧；對(duì)電極是鉬電極或鈦電極，參比電極是Ag/AgCl電極或甘汞電極；電解質(zhì)溶液為鹽度為20-35 ;綠藻為海水綠藻采用滅菌海水為電解質(zhì)溶液，綠藻為淡水綠藻采用磷酸緩沖液為電解質(zhì)溶液。磷酸緩沖液濃度為50mM，pH7. 0-8. O。電解池溶液體積為50_500ml，對(duì)電極及參比電極測(cè)試前均經(jīng)酸洗處理。電子介體為對(duì)苯醌、2，6- 二甲氧基-1，4-苯醌或2，6- 二氯_1，4_苯醌中的一種或二種以上。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)1.使用硅溶膠-凝膠方法固定化綠藻細(xì)胞，有良好的透光性、機(jī)械強(qiáng)度和生物相容性。2.縮小了電子介體的擴(kuò)散距離，降低了還原性的介體與氧重新結(jié)合的風(fēng)險(xiǎn)，提高了電子傳遞及光電轉(zhuǎn)化的效率。3.具有靈敏的光響應(yīng)能力，可以得到較高的光誘導(dǎo)電流，達(dá)到70微安的量級(jí)，穩(wěn)定性及重復(fù)性較好。4.可以達(dá)到超過(guò)1%的光子-電子轉(zhuǎn)換效率。5.可實(shí)現(xiàn)生物光合系統(tǒng)與電化學(xué)系統(tǒng)高效耦聯(lián)，表征生物體系光誘導(dǎo)電子傳遞過(guò)程，實(shí)現(xiàn)基于綠藻細(xì)胞的直接光電或光能-氫能轉(zhuǎn)化，高效低成本且簡(jiǎn)單易行。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，操作方便，綠藻固定在電極上能有效提高電子傳遞效率，可用于綠藻光誘導(dǎo)電子傳遞研究。


圖1為實(shí)施例1中綠藻生物電極對(duì)光的響應(yīng)曲線；圖2為實(shí)施例2中不同光強(qiáng)下的光響應(yīng)曲線；圖3為實(shí)施例2中光電流對(duì)光強(qiáng)的擬合；圖4為對(duì)比實(shí)施例3中懸浮藻液的光響應(yīng)曲線。實(shí)施案例下面詳細(xì)介紹本發(fā)明的兩個(gè)實(shí)施例。實(shí)施例1亞心型四月藻生物電極對(duì)光的響應(yīng)(I)硅溶膠的制備在60mL水、30mL O. OlM HCl的攪拌體系中緩慢滴入IOmL四乙氧基硅烷，反應(yīng)50h后，用IM NaOH溶液調(diào)整pH為7. 50，接著反應(yīng)48h，硅溶膠的pH為7. 81，制備好的硅溶膠備用。(2)取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)后期，濃度約3. 50X 106cells/mL的亞心型四爿藻57mL，經(jīng)2000r/min離心濃縮lmin，倒掉上清液后，即得所述的藻細(xì)胞。將離心得到的藻細(xì)胞重懸在2mL硅溶膠中，移液器吸取藻-硅溶膠的混合液體積為50 μ L，在空氣中風(fēng)干，即為綠藻生物電極。(3)三電極體系中，工作電極是綠藻生物電極，對(duì)電極是鉬電極或鈦電極，參比電極是Ag/AgCl電極或甘汞電極，電極材料為碳紙，電極面積為2. 4cm2，滅過(guò)菌的天然海水為電解池溶液，電解池溶液體積 為IOOmL。(4)在暗條件下，三電極電解池中通氮?dú)?0min后，進(jìn)行電化學(xué)阻抗譜，隨后進(jìn)行O. 5V恒電位掃描；待基線穩(wěn)定之后，加入電子介體對(duì)苯醌，終濃度為200 μ M，電流平穩(wěn)之后進(jìn)行光照，光響應(yīng)曲線如圖1所示。光電流達(dá)到94. 2微安。實(shí)施例2不同光強(qiáng)下的光響應(yīng)(I)硅溶膠的制備在60mL水、30mL O. OlM HCl的攪拌體系中緩慢滴入IOmL四乙氧基硅烷，反應(yīng)48h后，用IM NaOH溶液調(diào)整pH為7. 49，接著反應(yīng)4天，硅溶膠的pH為8. 0，制備好的硅溶膠備用。(2)取濃度約2. 64X 106cells/mL的亞心型四爿藻38mL，藻細(xì)胞的Fv/Fm = O. 754，yield = O. 606,經(jīng)2000r/min離心濃縮lmin,倒掉上清液后，即得所述的藻細(xì)胞。將離心得到的藻細(xì)胞重懸在ImL娃溶膠中,移液器吸取藻-娃溶膠的混合液體積為50 μ L,在空氣中風(fēng)干，即為綠藻生物電極。(3)三電極體系中，工作電極是綠藻生物電極，對(duì)電極是鉬電極或鈦電極，參比電極是Ag/AgCl電極或甘汞電極，電極材料為碳紙，電極面積為2. 4cm2，滅過(guò)菌的天然海水為電解池溶液，電解池溶液體積為IOOmL。(4)在暗條件下，三電極電解池中通氮?dú)?0min后，進(jìn)行電化學(xué)阻抗譜，隨后進(jìn)行O. 5V恒電位掃描；待基線穩(wěn)定之后，加入電子介體對(duì)苯醌，終濃度為300 μ M，電流平穩(wěn)之后進(jìn)行光照，改變不同的光強(qiáng)，光響應(yīng)曲線如圖2所示。經(jīng)圖3光電流對(duì)光強(qiáng)進(jìn)行線性擬合，得到直線斜率O. 2611 μ A/μ E，R2為O. 9976，斜率與電極面積(2. 4cm2)的比值，得到1. 13%的光子-電子轉(zhuǎn)換效率。
對(duì)比實(shí)施例3懸浮藻液的光響應(yīng)(I)取濃度約3. OOX 106cells/mL的亞心型四爿藻IOOmL,經(jīng)2000r/min離心濃縮lmin，倒掉上清液后，即得所述的藻細(xì)胞。(2)三電極體系中，對(duì)電極是鉬電極或鈦電極，參比電極是Ag/AgCl電極，工作電極材料為碳紙，電極面積為2. 4cm2，將離心得到的藻細(xì)胞重懸在IOOmL電解池溶液，電解液為滅過(guò)菌的天然海水。(3)在暗條件下，三電極電解池中通氮?dú)?0min后，進(jìn)行電化學(xué)阻抗譜，隨后進(jìn)行O. 5V恒電位掃描；待基線穩(wěn)定之后，加入電子介體對(duì)苯醌，終濃度為100 μ M，電流平穩(wěn)之后進(jìn)行光照光響應(yīng)曲線如圖4所示。對(duì)比實(shí)施例3中光電流為3. 8微安，實(shí)施例1的結(jié)果是它的大約25倍，充分展示出本發(fā)明具有的更 靈敏、高效的優(yōu)點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.一種固定化綠藻細(xì)胞的生物電極，其特征在于 將綠藻細(xì)胞與硅溶膠混合涂層固定于多孔電極材料上，構(gòu)建綠藻生物電極。
2.按照權(quán)利要求1所述的生物電極，其特征在于 在平面多孔電極材料上采用硅溶膠-凝膠方法固定綠藻細(xì)胞； 具體操作步驟如下 1)硅溶膠的制備取四乙氧基硅烷、PH= 2-3的HCl水溶液在室溫下強(qiáng)烈攪拌形成酸性硅溶膠，用NaOH將硅溶膠pH調(diào)整為7. 5-8. 5備用； 2)取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)后期的綠藻藻細(xì)胞，重懸在硅溶膠中，充分混勻，用移液器吸取混合液平鋪在多孔電極材料上，在空氣中風(fēng)干，即制備了綠藻生物電極。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于 步驟⑴中硅溶膠的制備取四乙氧基硅烷、PH = 2-3的HCl水溶液體積比為1 8-10，攪拌時(shí)間為24-72h，酸性硅溶膠pH為2. 2-2.4。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中電極材料為碳紙、不銹鋼網(wǎng)或鈦電極；混合液平鋪在多孔電極材料上的厚度1-15微米。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中綠藻藻細(xì)胞在硅溶膠中的濃度為4000-30000萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/mL。
6.一種權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的固定化綠藻細(xì)胞的生物電極的使用方法，其特征在于 以制備的綠藻生物電極作為工作電極，對(duì)電極是鉬電極或鈦電極，將工作電極和對(duì)電極置于添加有電解質(zhì)溶液的電解池中；在可見(jiàn)光存在下，在電解質(zhì)溶液中加入電子介體實(shí)現(xiàn)綠藻細(xì)胞光反應(yīng)中心與電極間的電子傳遞，在工作電極和對(duì)電極間可形成電勢(shì)差； 加入電子介體終濃度為10-400 μ M。
7.按照權(quán)利要求6所述的使用方法，其特征在于 電解質(zhì)溶液為鹽度為20-35。
8.按照權(quán)利要求6或7所述的使用方法，其特征在于 綠藻為海水綠藻采用滅菌海水為電解質(zhì)溶液，綠藻為淡水綠藻采用磷酸緩沖液為電解質(zhì)溶液。
9.一種權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的固定化綠藻細(xì)胞的生物電極的測(cè)試方法，其特征在于 以三電極體系并外加電壓對(duì)電極進(jìn)行測(cè)試； 制備的綠藻生物電極作為工作電極，與對(duì)電極及參比電極構(gòu)成三電極體系，并在電解質(zhì)溶液體系中加入終濃度為10-400 μ M電子介體，使用電化學(xué)工作站對(duì)電極進(jìn)行測(cè)試；測(cè)試前通N2排氧20min，且在整個(gè)測(cè)試過(guò)程中保持電解池?cái)嚢梵w系無(wú)氧；對(duì)電極是鉬電極或鈦電極，參比電極是Ag/AgCl電極或甘汞電極； 電解質(zhì)溶液為鹽度為20-35 ； 綠藻為海水綠藻采用滅菌海水為電解質(zhì)溶液，綠藻為淡水綠藻采用磷酸緩沖液為電解質(zhì)溶液。
10.按照權(quán)利要求5或8所述的方法，其特征在于電子介體為對(duì)苯醌、2，6_二甲氧基-1，4-苯醌或2，6_ 二甲氧基-1，4-苯醌中的一種或二種以上。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種固定化綠藻細(xì)胞的生物電極及其使用方法。該生物電極是在平面多孔電極材料上采用硅溶膠-凝膠方法固定綠藻細(xì)胞制備而成。制備的綠藻生物電極作為工作電極，與對(duì)電極和參比電極構(gòu)成三電極體系，并在電解液中加入電子介體，外加電壓對(duì)電極進(jìn)行光響應(yīng)測(cè)試。利用所制備的綠藻生物電極可以實(shí)現(xiàn)綠藻光合系統(tǒng)與電化學(xué)系統(tǒng)間的電子傳遞，并可得到94.2微安的光電流，是藻細(xì)胞懸浮體系的光電流的25倍，國(guó)際上尚無(wú)相關(guān)的硅溶膠固定化微藻制備生物電極用于光電流研究的技術(shù)報(bào)道。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)生物光合系統(tǒng)與電化學(xué)系統(tǒng)高效耦聯(lián)，表征生物體系光誘導(dǎo)電子傳遞過(guò)程，實(shí)現(xiàn)基于綠藻細(xì)胞的直接光電或光能-氫能轉(zhuǎn)化，具有高效低成本且簡(jiǎn)單易行的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N27/327GK103048370SQ20111030839
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2011年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月12日
發(fā)明者陳兆安, 呂艷霞, 陸洪斌, 周建男 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所