專利名稱：從裂壺藻藻渣中提取生物蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取生物蛋白質(zhì)的方法，尤其是一種從裂壺藻藻渣中提取生物蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
魚粉作為重要的飼料原料之一，具有蛋白質(zhì)含量高、營(yíng)養(yǎng)均衡、利于飼養(yǎng)動(dòng)物的吸收利用；魚類脂肪中含較大比例的多不飽和脂肪酸，如二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)，對(duì)飼養(yǎng)動(dòng)物幼體的正常生長(zhǎng)發(fā)育具有良好促進(jìn)作用；魚粉也是良好的鈣、磷、碘、硒等礦物質(zhì)的來源，此外，魚粉還含有多種維生素，因此魚粉是廣泛使用且難以替代的優(yōu)良飼料原料。然而隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及資源的過度掠奪，有限的魚粉資源逐漸耗竭，已經(jīng)帶來較嚴(yán)重的生態(tài)問題。對(duì)疾病的水平及垂直傳播的擔(dān)憂以及環(huán)境污染的持續(xù)惡化，水產(chǎn)品變得越來越多地被有毒化合物如重金屬、PCB、農(nóng)藥等污染，迫切需要發(fā)展可以替代魚粉的新型蛋白質(zhì)飼料資源。盡管已經(jīng)開展了很多利用植物蛋白資源替代魚粉的研究，然而很難達(dá)到完美替代魚粉的效果，主要有如下原因氨基酸組成的均衡性(魚粉含有高水平的必需氨基酸及含硫氨基酸)，蛋白質(zhì)的生物利用度(魚粉中氨基酸主要以非常容易消化吸收的小肽形式存在)，必需的多不飽和脂肪酸含量(魚粉中含有較多的多不飽和脂肪酸，如二十二碳六烯酸DHA的含量為O. 03% O. 9%)等。海洋產(chǎn)油微藻中含有豐富的脂肪酸、蛋白質(zhì)和維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，是一種很好的可再生資源，也是魚類體內(nèi)的多不飽和脂肪酸的原始來源。以裂壺藻(Aurantiochytriumsp)為例，其油脂含量可達(dá)細(xì)胞干重的50%以上，其中二十二碳六烯酸(DHA)的含量可占到脂肪酸含量的50%左右。提取脂肪酸的藻渣中蛋白質(zhì)含量大幅提高，高達(dá)50 60%左右，同時(shí)還有殘存的多不飽和脂肪酸，是一種很好的可以全面替代魚粉的蛋白質(zhì)飼料資源。裂壺藻制備多不飽和脂肪酸以及藻體作為水產(chǎn)餌料的安全性己經(jīng)被廣泛認(rèn)可，如何最大限度的利用產(chǎn)油微藻提取多不飽和脂肪酸生產(chǎn)過程的單細(xì)胞蛋白副產(chǎn)物是一個(gè)需要解決的問題。由此可見，現(xiàn)有技術(shù)有待于更進(jìn)一步的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷提出了一種從裂壺藻藻渣中提取生物蛋白質(zhì)的方法，該生物蛋白質(zhì)可以作為魚粉蛋白質(zhì)飼料的添加劑，該方法采用的原料為廢棄的裂壺藻藻渣，既節(jié)約能源又可以變廢為寶。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明方案包括—種從裂壺藻藻渣中提取生物蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括以下步驟向裂壺藻藻洛中加入O.1 1. 5%的果膠酶,溫度40 60°C,水解2 5h ;然后加入O.1 1. 5%的蛋白酶，溫度40 60°C，水解2 5h ;噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度140 190°C，出風(fēng)溫度60 90°C，最后制得含有生物蛋白質(zhì)的干粉。上述裂壺藻藻渣是按照下述方法制備得到的
I)對(duì)裂壺藻菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)的步驟；2)對(duì)得到的發(fā)酵液進(jìn)行分離，收集藻體，將收集的藻體進(jìn)行洗滌、油脂提取后得毛油；3)將步驟2)制得的毛油經(jīng)堿煉、脫色和脫臭后得到裂壺藻油脂，剩余的即為裂壺
藻藻渣。上述裂壺藻菌株發(fā)酵培養(yǎng)是按照下述方法制備得到的:I)將保存在甘油管的菌株接入裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，在20 30°C的搖床中，以150 200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)24 48h，獲得一級(jí)種子液；2)將上述一級(jí)種子液接入裝有IOOml種子培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，在20 30°C的搖床中，轉(zhuǎn)速150 200rpm，培養(yǎng)24 48h，獲得二級(jí)種子液；3)將二級(jí)種子液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量2 10%v/v，通氣量
0.2 2vvm，轉(zhuǎn)速200 800rpm，罐溫20 30°C，pH6 7，得到裂壺藻油脂。上述種子培養(yǎng)基中碳源含量為30 60g/L，氮源含量為10 20g/L，溶劑為海水和蒸餾水的混合物，所述海水和蒸餾水按照質(zhì)量比為1:1進(jìn)行混合；所述碳源為葡萄糖、甘油、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉糖化液或木質(zhì)纖維素糖化液；所述氮源為有機(jī)氮源或無機(jī)氮源，所述有機(jī)氮源為酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米漿、牛肉浸膏、大豆蛋白、谷氨酸鈉或尿素，所述無機(jī)氮源為氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、氨水或硝酸鉀。上述發(fā)酵培養(yǎng)基中包括如下組分:葡萄糖20 60g/L，酵母提取物5 30g/L，蛋白胨5 20g/L，磷 酸二氫鉀0.5 8g/L，硫酸鎂0.5 5g/L，檸檬酸鈉0.5 5g/L，海水晶5 3(^/1，維生素則10 100mg/L，維生素B610 100mg/L，維生素B123 50mg/L，生物素2 50mg/L。上述步驟3)中的發(fā)酵方式為分批發(fā)酵、補(bǔ)料-分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵或半連續(xù)發(fā)酵。上述步驟2)中的分離為離心分離、板框過濾或膜過濾；所述油脂提取為機(jī)溶劑萃取、聞壓均質(zhì)破壁或蛋白酶水解破壁。上述有機(jī)溶劑為環(huán)己烷、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、石油醚、乙醚、甲苯、氯仿、或幾種的混合物。上述生物蛋白質(zhì)可作為魚粉蛋白質(zhì)飼料添加劑。本發(fā)明提供了一種利用自主篩選的裂壺藻高產(chǎn)菌株經(jīng)過發(fā)酵獲得的裂壺藻藻渣，并利用該裂壺藻藻渣提取生物蛋白質(zhì)的方法，其藻渣經(jīng)過二次酶解，蛋白質(zhì)含量達(dá)50%以上，大部分蛋白質(zhì)均以非常容易消化的小肽形式存在，多不飽和脂肪酸DHA含量為
0.029Γ2%，是一種很好的魚粉蛋白質(zhì)飼料添加劑；本發(fā)明充分利用提取脂肪酸后廢棄的藻渣，變廢為寶增加了經(jīng)濟(jì)效益，而且實(shí)現(xiàn)了微藻細(xì)胞的綜合利用，實(shí)現(xiàn)多不飽和脂肪酸的清潔生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法做進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不局限于此。下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和原料，如無特別說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
實(shí)施例中所用的裂壺藻藻渣是裂壺藻菌株(該裂壺藻菌株可從現(xiàn)有渠道中獲得)經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)完成后，將得到的發(fā)酵液進(jìn)行分離，收集藻體，將收集的藻體進(jìn)行洗滌、油脂提取后得毛油；將得的毛油經(jīng)堿煉、脫色和脫臭后得到裂壺藻油脂和裂壺藻藻渣。具體制備方法如下一級(jí)種子液的制備將保存在甘油管的裂壺藻菌株接入裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，在20 30°C的搖床中，以150 200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)24 48h，獲得一級(jí)種子液，上述種子培養(yǎng)基含有30 60g/L的碳源，10 20g/L的氮源，溶劑為海水和蒸餾水的混合物，海水和蒸餾水按照質(zhì)量比為1:1進(jìn)行混合；碳源可以采用葡萄糖、甘油、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉糖化液或木質(zhì)纖維素糖化液；氮源可采用有機(jī)氮源或無機(jī)氮源，有機(jī)氮源為酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米漿、牛肉浸膏、大豆蛋白、谷氨酸鈉或尿素，無機(jī)氮源為氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、氨水或硝酸鉀。二級(jí)種子液的制備將上述一級(jí)種子液接入裝有IOOml種子培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，在20 30°C的搖床中，轉(zhuǎn)速150 200rpm，培養(yǎng)24 48h，獲得二級(jí)種子液，上述種子培養(yǎng)基和一級(jí)種子液所米用的培養(yǎng)基相同。將二級(jí)種子液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量2 10%v/v，通氣量O. 2 2vvm,轉(zhuǎn)速200 800rpm，罐溫20 30°C，pH6 7，得到裂壺藻油脂，上述發(fā)酵培養(yǎng)基中包括如下組分葡萄糖20 60g/L,酵母提取物5 30g/L,蛋白胨5 20g/L,磷酸二氫鉀
O.5 8g/L，硫酸鎂O. 5 5g/L，檸檬酸鈉O. 5 5g/L，海水晶5 30g/L，維生素BllO 100mg/L，維生素B610 100mg/L，維生素B123 50mg/L，生物素2 50mg/L，上述發(fā)酵方式可以為分批發(fā)酵、補(bǔ)料-分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵或半連續(xù)發(fā)酵。在上述發(fā)酵過程中，還可以增加補(bǔ)糖操作，保證葡萄糖的濃度為20 60g/L，所述發(fā)酵時(shí)間為80 110h，發(fā)酵結(jié)束時(shí)葡萄糖濃度不高于10g/L。裂壺藻油脂的精制及其裂壺藻藻渣的收集在以下具體實(shí)施例中詳細(xì)說明。實(shí)施例1 :對(duì)上述發(fā)酵液進(jìn)行離心分離，并洗滌不溶物2次，收集不溶物藻體，加入適量水調(diào)節(jié)粘度，進(jìn)行高壓均質(zhì)破壁，壓力40Mpa，循環(huán)2次；加入正己烷及乙醇萃取3次，有機(jī)相蒸干溶劑，得毛油，經(jīng)堿煉、脫色和脫臭后得到多不飽和脂肪酸精煉油562克，含DHA38. 5% ；剩余藻渣加入1%果膠酶，50°C水解3小時(shí)，再加入1%蛋白酶，溫度50°C，作用時(shí)間3小時(shí)，噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度160°C，出風(fēng)溫度80°C，得干粉約350克，蛋白質(zhì)含量約56. 5%，DHA含量0. 02%，可以作為蛋白質(zhì)飼料添加劑。實(shí)施例2 對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心分離，并洗滌不溶物2次，收集不溶物藻體，加入適量水調(diào)節(jié)粘度，進(jìn)行酶法破壁；加入正己烷及乙醇萃取3次，有機(jī)相蒸干溶劑，得毛油，經(jīng)堿煉、脫色和脫臭后得到多不飽和脂肪酸精煉油551克，含DHA38. 3% ；剩余藻渣加入0. 1%果膠酶，60°C水解5小時(shí)，再加入0. 1%蛋白酶，60°C水解5小時(shí)，噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度190°C，出風(fēng)溫度90°C，得干粉約354克，蛋白質(zhì)含量約56. 9%，DHA含量0. 05%，可以作為蛋白質(zhì)飼料添加劑。實(shí)施例3
對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心分離，并洗滌不溶物2次，收集不溶物藻體，加入適量水調(diào)節(jié)粘度，進(jìn)行酶法破壁，再進(jìn)行高壓均質(zhì)破壁，壓力40Mpa，循環(huán)I次；離心分離游離油及乳化層，凍融破乳后得毛油，經(jīng)堿煉、脫色和脫臭后得到多不飽和脂肪酸精煉油502克，含DHA40.1% ；剩余藻渣加入1.5%果膠酶，40°C水解2小時(shí)，再加入1.5%蛋白酶，40°C水解2小時(shí)，噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度140°C，出風(fēng)溫度60°C，得干粉約392克，蛋白質(zhì)含量約52.6%，DHA含量2%，可以作為蛋白質(zhì)飼料添加劑。表I為制得的蛋白質(zhì)飼料氨基酸和總蛋白分析數(shù)據(jù)，其中，1-16采用GB/T5009.124-2003 測(cè)數(shù)據(jù)，17 采用 GB/T6432-1994 測(cè)數(shù)據(jù)。表1蛋白生物飼料氨基酸和總蛋白組成分析
權(quán)利要求
1.一種從裂壺藻藻渣中提取生物蛋白質(zhì)的方法，其特征在于:所述方法包括以下步驟:向裂壺藻藻洛中加入0.1 1.5%的果膠酶,溫度40 60°C,水解2 5h ;然后加入0.1 1.5%的蛋白酶，溫度40 60°C，水解2 5h ;噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度140 190°C，出風(fēng)溫度60 90°C，制得含有生物蛋白質(zhì)的干粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從裂壺藻藻渣中提取生物蛋白質(zhì)的方法，其特征在于:所述裂壺藻藻渣是按照下述方法制備得到的:1)對(duì)裂壺藻菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)的步驟；2)對(duì)得到的發(fā)酵液進(jìn)行分離，收集藻體，將收集的藻體進(jìn)行洗滌、油脂提取后得毛油；3)將步驟2)制得的毛油經(jīng) 堿煉、脫色和脫臭后得到裂壺藻油脂，剩余的即為裂壺藻藻渣。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種從裂壺藻藻渣中提取生物蛋白質(zhì)的方法，其特征在于:所述裂壺藻菌株發(fā)酵培養(yǎng)是按照下述方法制備得到的:1)將保存在甘油管的菌株接入裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，在20 30°C的搖床中，以150 200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)24 48h，獲得一級(jí)種子液；2)將上述一級(jí)種子液接入裝有IOOml種子培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，在20 30°C的搖床中，轉(zhuǎn)速150 200rpm，培養(yǎng)24 48h，獲得二級(jí)種子液；3)將二級(jí)種子液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量2 10%v/v，通氣量0.2 2vvm,轉(zhuǎn)速200 800rpm，罐溫20 30°C，pH6 7，得到裂壺藻油脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種從裂壺藻藻渣中提取生物蛋白質(zhì)的方法，其特征在于:所述種子培養(yǎng)基中碳源含量為30 60g/L，氮源含量為10 20g/L，溶劑為海水和蒸餾水的混合物，所述海水和蒸餾水按照質(zhì)量比為1:1進(jìn)行混合；所述碳源為葡萄糖、甘油、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉糖化液或木質(zhì)纖維素糖化液；所述氮源為有機(jī)氮源或無機(jī)氮源，所述有機(jī)氮源為酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米漿、牛肉浸膏、大豆蛋白、谷氨酸鈉或尿素，所述無機(jī)氮源為氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、氨水或硝酸鉀。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種從裂壺藻藻渣中提取生物蛋白質(zhì)的方法，其特征在于:所述步驟3)的發(fā)酵培養(yǎng)基中包括如下組分:葡萄糖20 60g/L，酵母提取物5 30g/L，蛋白胨5 20g/L，磷酸二氫鉀0.5 8g/L，硫酸鎂0.5 5g/L，檸檬酸鈉0.5 5g/L，海水晶5 3(^/1，維生素則10 100mg/L，維生素B610 100mg/L，維生素B123 50mg/L，生物素2 50mg/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種從裂壺藻藻渣中提取生物蛋白質(zhì)的方法，其特征在于:所述步驟3)中的發(fā)酵方式為分批發(fā)酵、補(bǔ)料-分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵或半連續(xù)發(fā)酵。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種從裂壺藻藻渣中提取生物蛋白質(zhì)的方法，其特征在于:所述步驟2)中的分離為離心分離、板框過濾或膜過濾；所述油脂提取為機(jī)溶劑萃取、高壓均質(zhì)破壁或蛋白酶水解破壁。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種從裂壺藻藻渣中提取生物蛋白質(zhì)的方法，其特征在于:所述有機(jī)溶劑為環(huán)己烷、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、石油醚、乙醚、甲苯、氯仿、或幾種的混合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的生物蛋白質(zhì)，其特征在于:所述生物蛋白質(zhì)可.作為魚粉蛋白質(zhì)飼料添加劑。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種從裂壺藻藻渣中提取生物蛋白質(zhì)的方法，所述方法將裂壺藻菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，對(duì)得到的發(fā)酵液進(jìn)行分離處理，收集藻體，將收集的藻體進(jìn)行洗滌、油脂提取后得毛油；將制得的毛油經(jīng)堿煉、脫色和脫臭后得到裂壺藻油脂和裂壺藻藻渣，該裂壺藻藻渣經(jīng)過二次酶解，蛋白質(zhì)含量達(dá)50%以上，大部分蛋白質(zhì)均以非常容易消化的小肽形式存在，多不飽和脂肪酸DHA含量為0.02%~2%，是一種很好的魚粉蛋白質(zhì)飼料添加劑；本發(fā)明充分利用提取裂壺藻油脂后廢棄的藻渣，變廢為寶增加了經(jīng)濟(jì)效益，而且實(shí)現(xiàn)了微藻細(xì)胞的綜合利用，實(shí)現(xiàn)多不飽和脂肪酸的清潔生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A23K1/16GK103070293SQ20131002171
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2013年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月22日
發(fā)明者李悅明, 崔球, 張希銘, 宋曉金, 徐建春, 高莽, 夏修巒 申請(qǐng)人:青島瑯琊臺(tái)集團(tuán)股份有限公司