專(zhuān)利名稱：ABO、RhD血型定型檢測(cè)卡的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種ABO、RhD血型定型檢測(cè)卡的制備方法，是對(duì)現(xiàn)有制備方法的改進(jìn)，屬于醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人類(lèi)紅細(xì)胞血型是同種異型抗原，是人類(lèi)遺傳多態(tài)性標(biāo)志之一。輸血前血型定型和交叉配血是人類(lèi)安全輸血的保證，血型相容性檢測(cè)是確保安全輸血的最重要條件之一。Rh血型系統(tǒng)是僅次于ABO血型系統(tǒng)的重要血型系統(tǒng)，也是紅細(xì)胞血型系統(tǒng)中最為復(fù)雜的一個(gè)系統(tǒng)，目前國(guó)際輸血協(xié)會(huì)(ISBT)已確認(rèn)的Mi血型抗原有48個(gè)。其中D、C、c、 Ε、e五種抗原抗原性最強(qiáng)，而D抗原抗原性又最強(qiáng)。由于MiD血型不合所引起的輸血反應(yīng)最為常見(jiàn)。微柱凝膠免疫檢測(cè)技術(shù)是20世紀(jì)90年代產(chǎn)生的一種免疫檢測(cè)技術(shù)，其基本原理是利用分子篩技術(shù)，離心技術(shù)和特異性免疫反應(yīng)技術(shù)原理，把血型血清學(xué)技術(shù)與凝膠分子篩技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來(lái)，可靈敏地檢測(cè)出可能存在的微弱血型抗原抗體反應(yīng)，被認(rèn)為是血型血清學(xué)檢驗(yàn)的里程碑。目前已有類(lèi)似方法提出申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)枮?00910234608. X)，但是與本發(fā)明相比，其制備工藝不同，選用凝膠不同，并且在處理凝膠過(guò)程中本發(fā)明采用生理鹽水進(jìn)行處理，既能夠達(dá)到是凝膠充分膨脹的作用，又能夠節(jié)約生產(chǎn)成本。此外，在特異性抗體的選擇配置過(guò)程中，本發(fā)明采用比較合理的溶液配比能夠達(dá)到較好的檢測(cè)結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種ABO、MiD血型定型檢測(cè)卡，具有靈敏度高、特異性好、質(zhì)量穩(wěn)定、 易于操作、易于標(biāo)準(zhǔn)化、能同時(shí)進(jìn)行正反定型的ABO、RhD血型定型。本發(fā)明還提供了上述檢測(cè)卡的制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明提供一種ABO、RhD血型定型檢測(cè)卡，具有以下結(jié)構(gòu) 一種ABO、RhD血型定型檢測(cè)卡，其特征在于
第一個(gè)微管中灌注抗A單克隆抗體微柱凝膠； 第二個(gè)微管中灌注抗B單克隆抗體微柱凝膠； 第三個(gè)微管中灌注抗D單克隆抗體微柱凝膠； 第四至第六個(gè)微管中灌注中性膠； 第四個(gè)微管作為陰性對(duì)照； 第五、第六微管作為反定型。本發(fā)明所述ABO、IihD血型定型檢測(cè)卡的制備方法，包括以下步驟 凝膠制備
將葡聚糖凝膠干粉用3 5倍體積的生理鹽水凝膠懸浮溶液浸泡M 48小時(shí)，待凝膠充分膨脹后，用凝膠懸浮溶液洗滌5次，然后再用蒸餾水洗滌5次，除去凝膠破損碎片和聚集的凝膠顆粒以及凝膠中過(guò)多的鹽離子；收集得到顆粒大小均勻的、且完整呈球形凝膠顆粒；選用生理鹽水進(jìn)行凝膠的制備具有如下優(yōu)點(diǎn)
1.既能夠達(dá)到是凝膠充分膨脹的作用，又能夠節(jié)約生產(chǎn)成本；
2.浸泡M 48小時(shí)，能夠使得凝膠充分溶脹，使得凝膠的膨脹率達(dá)到最佳，并減少凝膠的損失。特異性抗體配制
取甘氨酸 1.5X10—3 g/ml、氯化鈉 0. 85X10—3 g/ml、磷酸二氫鈉 2. 4X 10_3 g/ml、磷酸二氫鈉4. 8X10—3 g/ml、牛血清白蛋白0. 5 1% (每IOOml特異性抗體溶液中含有0. 5 Ig牛血清白蛋白)，以上試劑用蒸餾水溶解后，調(diào)PH為6. 6 6. 8，然后將其與抗A單克隆抗體混合，使得抗A單克隆抗體效價(jià)> 128 ；
同樣配方配制抗B單克隆抗體、抗D溶液?jiǎn)慰寺】贵w，使得抗B單克隆抗體效價(jià)> 128， 抗D單克隆抗體效價(jià)> 128；
本發(fā)明配方進(jìn)行抗體配置具有如下優(yōu)點(diǎn)
在節(jié)約生產(chǎn)成本的基礎(chǔ)之上，能夠使得抗體溶液達(dá)到最佳的反應(yīng)條件，并且能夠最大限度的保護(hù)抗體，使得抗體效價(jià)在1 2年內(nèi)，仍然抗A效價(jià)> 128，抗B效價(jià)> 128，抗D 效價(jià)> 1280特異性凝膠配制
分別取抗A單克隆抗體、抗B單克隆抗體和抗D單克隆抗體與已溶脹的葡聚糖凝膠按照1 1 6:1比例混合，間斷攪拌均勻25 35分鐘，即為半成品特異性膠；
中性膠配制用生理氯化鈉溶液與溶脹葡聚糖凝膠按照1 1 6 1混合，間斷攪拌均勻 1 2小時(shí)，即得半成品的中性膠；
本發(fā)明特異性凝膠配置，抗A、抗B和抗D特異性凝膠采用間斷均勻25 35分鐘，中性膠采用間斷攪拌均勻1 2小時(shí)，能夠使得抗體溶液與凝膠充分混勻，這樣更加有利于檢測(cè)時(shí)抗原抗體的充分反應(yīng)，使得檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可信。半成品檢定
半成品檢定主要進(jìn)行特異性檢測(cè)和抗體效價(jià)測(cè)定。分裝
按照每管M 沈μ 1凝膠液，進(jìn)行分裝。采取本發(fā)明使得特異性抗體具有如下特點(diǎn)
1.具有較強(qiáng)的緩沖能力，有利于保持整個(gè)反應(yīng)體系處于要求的緩沖范圍，同時(shí)保證反應(yīng)體系的離子強(qiáng)度；
2.本發(fā)明具有獨(dú)特的潤(rùn)滑系統(tǒng)，采用一定濃度的牛血清白蛋白，使得紅細(xì)胞通過(guò)凝膠間隙時(shí)獲得合適的潤(rùn)滑能力，并且比例適中，恰好使得無(wú)凝集的紅細(xì)胞能夠更加順利的通過(guò)凝膠間隙，而凝集的紅細(xì)胞團(tuán)塊則不能通過(guò)；
3.本發(fā)明的另一關(guān)鍵在于反應(yīng)介質(zhì)的選擇，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)最終選擇顆粒大小適中的葡聚糖凝膠，而不是大多數(shù)廠家使用的聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠，使得檢測(cè)準(zhǔn)確性靈敏度更高。同時(shí)，應(yīng)用生理鹽水溶液作為凝膠懸浮介質(zhì)，用于凝膠處理，在節(jié)約生產(chǎn)成本的同時(shí)，又達(dá)到維持凝膠穩(wěn)定的效果。適當(dāng)?shù)钠暇厶悄z浸泡時(shí)間，對(duì)于凝膠的充分膨脹非常重要。經(jīng)過(guò)合理配比方式，使得凝膠能夠滿足制備ABO、RhD血型定型檢測(cè)卡的需要，并且能夠保證其產(chǎn)品質(zhì)量。本發(fā)明的積極效果是選用葡聚糖凝膠較之使用聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠靈敏度準(zhǔn)確性更高。應(yīng)用生理鹽水溶液作為凝膠懸浮介質(zhì)，用于凝膠處理，在節(jié)約生產(chǎn)成本的同時(shí)， 又達(dá)到維持凝膠穩(wěn)定的效果。適當(dāng)?shù)钠暇厶悄z浸泡時(shí)間，對(duì)于葡聚糖凝膠的充分膨脹非
常重要。


圖1:陽(yáng)性反應(yīng)圖片；
圖2 可疑陽(yáng)性反應(yīng)圖片； 圖3:陰性反應(yīng)圖片； 圖4 溶血反應(yīng)圖片； 圖5 混合反應(yīng)圖片； 圖6 實(shí)施例1卡式法檢測(cè)結(jié)果； 圖7 實(shí)施例1試管法檢測(cè)結(jié)果； 圖8 實(shí)施例2卡式法檢測(cè)結(jié)果； 圖9 實(shí)施例2試管法檢測(cè)結(jié)果； 圖10 實(shí)施例3卡式法檢測(cè)結(jié)果； 圖11 實(shí)施例3試管法檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)具體實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施和所具有的有益效果。但不限定本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)的內(nèi)容。實(shí)施例1 凝膠懸浮溶液的配制
本發(fā)明所述凝膠懸浮溶液為生理鹽水，配方如下
氯化鈉8. 5g ；加入蒸餾水溶解后，用蒸餾水定容1，000ml，使其終濃度為0. 85%。凝膠的制備
選擇顆粒大小適中的葡聚糖凝膠。將葡聚糖凝膠干粉，用3倍體積的步驟一中的凝膠懸浮溶液浸泡M小時(shí)，待凝膠充分膨脹后，用凝膠懸浮溶液洗滌5次，然后再用蒸餾水洗滌 5次。除去凝膠破損碎片和聚集的凝膠顆粒以及凝膠中過(guò)多的鹽離子。收集得到顆粒大小均勻的、且完整呈球形凝膠顆粒?？贵w的選擇
抗A單克隆抗體、抗B單克隆抗體，由長(zhǎng)春博德生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，效價(jià)
^ 128 ο抗D單克隆抗體，由BiotestAG生產(chǎn)，由長(zhǎng)春生物制品研究所經(jīng)銷(xiāo)，效價(jià)彡128。特異性抗體溶液配方如下
甘氨酸 1.5X10-3 g/ml、氯化鈉 0.85X10-3 g/ml、磷酸二氫鈉 2. 4X 10-3 g/ml、磷酸二氫鈉4. 8X 10-3 g/ml、牛血清白蛋白0. 8% (每IOOml特異性抗體溶液中含有
0. 8g牛血清白蛋白);
5以上試劑用蒸餾水溶解后，調(diào)PH為6. 6。然后將其與抗A單克隆抗體混合，使得抗A效價(jià)彡128ο同樣配方配制抗B單克隆抗體、抗D單克隆抗體溶液，使得抗B效價(jià)》128，抗D 效價(jià)> 1280特異性膠及中性膠的配制
特異性膠配制分別取抗A單克隆抗體、抗B單克隆抗體和抗D單克隆抗體與已溶脹的葡聚糖凝膠按照1 1比例混合，間斷攪拌均勻25分鐘，即為半成品特異性膠。中性膠配制用生理氯化鈉溶液與溶脹葡聚糖凝膠按照2: 1比例混合，間斷攪拌均勻1小時(shí)，即為半成品的中性膠。半成品檢定 1.特異性檢定 1. 1材料
(1)試劑AB0、I hD血型定型檢測(cè)卡。(2)紅細(xì)胞標(biāo)本健康人 A” A1BJ2J2BaCK B、ODCe/Dce^R^hOdcE/DcE (OR2R2)； Odce/dce (R0r) ODCe/dce (^r) Odce/dce (Or，r) Odce/dce (Orr)分別用生理鹽水溶液配制成0. 5%紅細(xì)胞懸液。(3)已知A型和B型血清用于反定型。1. 2 試驗(yàn)
每型0. 5%紅細(xì)胞懸液加入一個(gè)卡的第一至第四支微管中各50 μ 1 ；向第五、六支微管中加入已知A型和B型血清各50 μ 1，再向第五支微管中加入A型0.5%紅細(xì)胞懸液50 μ 1， 第六支微管中加入B型0. 5%紅細(xì)胞懸液50 μ 1。用專(zhuān)用離心機(jī)離心5分鐘，900 rpm 2分鐘，1，500 rpm 3分鐘，肉眼觀察結(jié)果。1. 3結(jié)果判定
(1)陽(yáng)性結(jié)果和陰性結(jié)果判定
陽(yáng)性結(jié)果紅細(xì)胞抗原與相應(yīng)抗體在微柱凝膠中形成的特異性抗原抗體復(fù)合物浮在凝膠表面或膠中，為陽(yáng)性反應(yīng)。陰性結(jié)果被檢紅細(xì)胞抗原無(wú)相應(yīng)的抗體結(jié)合，不出現(xiàn)特異性抗原抗體復(fù)合物，紅細(xì)胞沉于微柱凝膠的尖底部。溶血結(jié)果凝膠上清呈透明紅色。(2)特異性結(jié)果判定，見(jiàn)表1。陽(yáng)性結(jié)果的卡間差異不超1A+ ；陰性結(jié)果不應(yīng)出現(xiàn)凝集或溶血。表1 ABO、RhD血型檢定微柱凝膠試劑特異性檢測(cè)
權(quán)利要求
1.一種ABO、RhD血型定型檢測(cè)卡，其特征在于 第一個(gè)微管中灌注抗A單克隆抗體微柱凝膠； 第二個(gè)微管中灌注抗B單克隆抗體微柱凝膠； 第三個(gè)微管中灌注抗D單克隆抗體微柱凝膠； 第四至第六個(gè)微管中灌注中性膠；第四個(gè)微管作為陰性對(duì)照； 第五、第六微管作為反定型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述ABO、RhD血型定型檢測(cè)卡的制備方法，包括以下步驟 凝膠制備將葡聚糖凝膠干粉用3 5倍體積的生理鹽水凝膠懸浮溶液浸泡M 48小時(shí)，待凝膠充分膨脹后，用凝膠懸浮溶液洗滌5次，然后再用蒸餾水洗滌5次，除去凝膠破損碎片和聚集的凝膠顆粒以及凝膠中過(guò)多的鹽離子；收集得到顆粒大小均勻的、且完整呈球形凝膠顆粒；特異性抗體配制取甘氨酸 1.5X10—3 g/ml、氯化鈉 0. 85X10—3 g/ml、磷酸二氫鈉 2. 4X 10_3 g/ml、磷酸二氫鈉4. 8X 10_3 g/ml、牛血清白蛋白0. 5 1% (每IOOml特異性抗體溶液中含有0. 5 Ig牛血清白蛋白)，以上試劑用蒸餾水溶解后，調(diào)PH為6. 6 6. 8，然后將其與抗A單克隆抗體混合，使得抗A單克隆抗體效價(jià)> 128 ；同樣配方配制抗B單克隆抗體、抗D溶液?jiǎn)慰寺】贵w，使得抗B單克隆抗體效價(jià)>128， 抗D單克隆抗體效價(jià)> 128； 特異性凝膠配制分別取抗A單克隆抗體、抗B單克隆抗體和抗D單克隆抗體與已溶脹的葡聚糖凝膠按照1 1 6:1比例混合，間斷攪拌均勻25 35分鐘，即為半成品特異性膠；中性膠配制用生理氯化鈉溶液與溶脹葡聚糖凝膠按照1 1 6 1混合，間斷攪拌均勻 1 2小時(shí)，即得半成品的中性膠； 半成品檢定半成品檢定主要進(jìn)行特異性檢測(cè)和抗體效價(jià)測(cè)定； 按照每管M 沈μ 1凝膠液，進(jìn)行分裝。
全文摘要
本發(fā)明提供ABO、RhD血型定型檢測(cè)卡的制備方法，選用葡聚糖凝膠較之使用聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠靈敏度準(zhǔn)確性更高。應(yīng)用生理鹽水溶液作為凝膠懸浮介質(zhì)，用于凝膠處理，在節(jié)約生產(chǎn)成本的同時(shí)，又達(dá)到維持凝膠穩(wěn)定的效果。
文檔編號(hào)G01N33/80GK102435756SQ201110281800
公開(kāi)日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月21日
發(fā)明者萬(wàn)俊波, 馮立崗, 劉春光, 孫啟和, 莊賈明, 李凌波, 李秋生, 楊明, 楊洪存, 王冬倩, 賈天冰, 趙繼巖, 郭廣英, 陳云聲, 陳維佳 申請(qǐng)人:長(zhǎng)春博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司