專利名稱：白血病細胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種白血病細胞內(nèi)融合蛋白的檢測方法。
背景技術(shù)：
流式液相陣列(又稱流式微球陣列)是能保證信息質(zhì)量和提供相對高通量的分子探測平臺，與其技術(shù)原理相同的液相芯片技術(shù)是美國FDA2001年批準的首個臨床型陣列分析技術(shù)。流式液相陣列中，微球錨定的捕獲分子(抗體或核酸探針)捕獲靶點分子，熒光標記的報道分子(抗體或核酸探針)報道靶點分子，一種或幾種不同濃度熒光編碼的微球組建陣列即可進行多參數(shù)并行分析。陣列解碼常用生物醫(yī)學(xué)工程儀器流式細胞儀或?qū)Ｓ靡合嘈酒瑑x。流式液相陣列具有靈敏度高、特異性強、數(shù)據(jù)圖像化及多任務(wù)定量的顯著優(yōu)點。流式液相陣列已廣泛應(yīng)用于分子診斷、藥物發(fā)現(xiàn)、檢驗檢疫、免疫技術(shù)和細胞學(xué)等領(lǐng)域。以熒光編碼微球和核酸探針構(gòu)建的流式液相陣列可以實施白血病診斷和微小殘留病監(jiān)測；基于流式液相陣列的分子結(jié)合分析能夠同步篩選配基競爭性和ATP競爭性受體酪氨酸激酶拮抗劑，“敲除”藥物抵抗先導(dǎo)物，避免放射法污染，可以快速、準確、有效地發(fā)現(xiàn)抗腫瘤先導(dǎo)藥物；此外探測細胞信號通路傳導(dǎo)的流式液相陣列也見諸報道。相比其它生物分子檢測手段，基于熒光編碼微球的流式液相陣列和液相芯片具有下述突出優(yōu)點(1)相對高通量?？梢圆⑿袡z測多個參數(shù)；(2)靈敏度高。檢測下限約為10pg/mL;(3)微量檢測。所需樣本少，特別是臨床檢驗只需幾微升血液樣品，即可快速完成多個并行臨床參數(shù)檢測。白血病存在因染色體畸變而產(chǎn)生的融合基因和融合蛋白，異常染色體、融合基因和融合蛋白分別是白血病細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)特異性標志。目前白血病細胞內(nèi)融合蛋白表達水平常用的檢測方法為逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)、定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative Polymerase Chain Reaction，Q-PCR)、細胞遺傳學(xué)、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)和單群微球流式分析。研究表明，RT-PCR技術(shù)簡易，但檢測的是mRNA 逆轉(zhuǎn)錄cDNA拷貝，易受反應(yīng)條件影響，產(chǎn)生假陰性或假陽性結(jié)果；Q-PCR檢測敏感性超過 ΙΟ"4,達到10_5分子水平緩解標準，但只有管家基因mRNA拷貝數(shù)高于2. 5x10s,結(jié)果才有效； 染色體核型分析數(shù)目少，定量困難；非流式FISH技術(shù)3%左右的假陽性率過高，不適用于白血病細胞內(nèi)融合蛋白表達檢測；白血病細胞內(nèi)融合蛋白的單群微球流式分析方法變異系數(shù)大。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有檢測方法的不足，本發(fā)明提供了一種白血病細胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測方法，可以快速、準確地檢測白血病細胞內(nèi)融合蛋白含量。術(shù)語說明FITC 異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)；Alexa Fluor 488熒光一種熒光染料的商品名稱，本領(lǐng)域公知產(chǎn)品；
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Sulfo-NHS =N 一羥基硫代琥珀酰亞胺；EDC:碳二亞胺；MES 2-(N- 0 !^ ) Z.WM, 2- (N-Morpholino) ethanesulfonic acid hydrate, 簡稱MESPBS 磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline, PBS)；ΡΕ:藻紅蛋白(Phycoerythrin, ΡΕ)；PBS-2% BSA 溶液含 2%牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)的磷酸鹽緩7中液(phosphate-buffered saline, PBS)；AEBSF :4- -氨乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽，4_ Q-Aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride hydrochloride,簡稱 AEBSF ；wella :a 孑L ；wellb :b 孑L ；wellc :c 孑L ；HBSS，s 液=Hank‘ s 平衡鹽溶液，Hank，s balanced salt solution，簡稱 HBSS，s液。本發(fā)明的技術(shù)方案如下白血病細胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測方法，包括兩種濃度FITC或兩種濃度Alexa Fluor 488熒光標記的微球、融合蛋白捕獲抗體、融合蛋白報道抗體、同型對照抗體、PE熒光標記的二抗、緩沖液和流式細胞儀檢測，其特點在于以包被融合蛋白捕獲抗體的一種濃度的FITC或Alexa Fluor 488熒光標記的微球工、包被同型對照抗體的另一種濃度的FITC或Alexa Fluor 488熒光標記的微球2組建檢測白血病細胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列，流式細胞儀檢測陣列所得微球的PE熒光強度與微球2的PE熒光強度的二者比值為融合蛋白表達值。白血病細胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測方法，包括步驟如下(1)利用現(xiàn)有技術(shù)抽提白血病細胞內(nèi)融合蛋白；備用。(2) 二元流式液相陣列的組建10000 100000個一種濃度的FITC或Alexa Fluor 488熒光標記的微球工加入到96孔微孔濾膜板wella中，10000 100000個另一種濃度FITC或Alexa Fluor 488熒光標記的微球2加入到96孔微孔濾膜板wellb中，用200 μ L MES緩沖液(ρΗ 6. 0)洗滌微球工和微球2各2次，真空抽濾收集微球；wella 和 wellb 孔中分別加入含 0.0001 0. Olg Sulfo-NHS 和 0. 0001 0. Olg EDC的200 μ L的MES緩沖液(ρΗ 6. 0)，混勻、室溫、振蕩、避光孵育20分鐘；wella,wellb孔中的微球、微球2分別用200 μ L PBS緩沖液(ρΗ 7. 2)洗滌2次， 真空抽濾收集微球；含微球工的wella孔中加入1 50 μ g融合蛋白捕獲抗體，含微球2的 wellb孔中加入1 50 μ g同型對照抗體，wella和wellb孔再分別加入PBS緩沖液(ρΗ 7. 2) 補充體積至200 μ L并混勻，避光、4°C孵育2小時；(3)白血病細胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測，選自下列方案之一方案1 將步驟(1)制備的0. 5 50 μ L白血病細胞內(nèi)融合蛋白抽提液加入到96孔微孔濾膜板well?？字?，再將步驟( 制備的包被抗體的微球1、微球2各1000 10000個混合并加入到well?？字?，加入PBS-2% BSA溶液補足體積至150 μ L，混勻，室溫、避光孵育 1小時；將所得微球洗滌2次并重懸于100 μ L的PBS-2% BSA溶液中，再加入0. 1 10 μ g 融合蛋白報道抗體，混勻，避光、室溫孵育1小時；將所得微球洗滌2次并重懸于100μ L的 PBS-2% BSA溶液中，加入0. 1 10 μ gPE熒光標記的二抗，混勻，避光、室溫孵育30分鐘；將所得微球洗滌2次并重懸于100 μ L鞘液中，流式細胞儀以FITC或Alexa Fluor 488 versus PE點圖檢測微球工和微球2的PE熒光強度。方案2 將步驟(1)制備的0. 5 50 μ L白血病細胞內(nèi)融合蛋白抽提液加入到96 孔微孔濾膜板well。孔中，再將步驟⑵制備的包被抗體的微球1、微球2各1000 10000 個混合并加入到well?？字?，加入0. 1 IOyg PE熒光標記的融合蛋白報道抗體，加入 PBS-2% BSA溶液補足體積至150 μ L，混勻、室溫、避光孵育2小時；將所得微球洗滌2次并重懸于100 μ L鞘液中，流式細胞儀FITC或Alexa Fluor 488 versus PE點圖檢測微球和微球2 WPE熒光強度。(4)按以下公式計算得白血病細胞內(nèi)融合蛋白定量數(shù)據(jù)白血病細胞內(nèi)融合蛋白表達值=微球工的PE熒光強度+微球2的PE熒光強度， 或微球2的PE熒光強度+微球工的PE熒光強度。上述步驟(1)中所述融合蛋白提取自白血病患者細胞、白血病細胞系、白血病細胞株的細胞質(zhì)中或/和細胞核中的融合蛋白。上述步驟O)中所用微球的平均直徑均為1 10微米，同時含有氨基和羧基集團。標記微球的熒光濃度范圍為0. 1 1000 μ g/mL ；標記微球i和微球2的熒光兩種濃度之差為4-2500倍。上述步驟O)中所述融合蛋白捕獲抗體是一種能夠特異性識別融合蛋白表位的抗體。依據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，具體選自可識別融合蛋白的C端或N端的抗體。本發(fā)明以實施例1中anti-PML作為優(yōu)選的白血病細胞M4融合蛋白PML-RARa捕獲抗體，以實施例2中anti-BCR作為優(yōu)選的白血病細胞K562融合蛋白BCR-ABL捕獲抗體，詳見Chan H. Ε. H. , Jilani I. , Chang R. , Albitar Μ. Detection of Chromosome Translocations by Bead-Based Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology, 2007, 378 :Monoclonal Antibodies :Methods and Protocols. Edited by :M. Albitar.上述步驟(3)中所述融合蛋白報道抗體是一種能夠特異性識別融合蛋白另一個表位的抗體。依據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，具體選自可識別融合蛋白的N端(捕獲抗體識別C端)或C 端(捕獲抗體識別N端)的抗體。本發(fā)明以實施例1中anti-RARa作為優(yōu)選的白血病細胞NB4融合蛋白PML-RARa報道抗體，以anti_ABL抗體作為優(yōu)選的白血病細胞K562融合蛋白 BCR-ABL 報道抗體，詳見Chan H. Ε. H.，Jilani I.，Chang R.，Albitar Μ. Detection of Chromosome Translocations by Bead-Based Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology,2007,378 :Monoclonal Antibodies :Methods and Protocols. Edited by: M. Albitar.上述步驟(3)中所述PE熒光標記的二抗是一種能夠識別融合蛋白報道抗體的標記PE熒光的抗體。本發(fā)明以實施例1中PE熒光標記的抗RAR α抗體的抗體作為優(yōu)選的可識別白血病細胞NB4融合蛋白PML-RAR α報道抗體的抗體，詳見=Chan H. Ε. H.，Jilani I.，Chang R.，Albitar M. Detection of Chromosome Translocations by Bead-Based Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology，2007，378 :Monoclonal Antibodies :Methods and Protocols. Edited by :M. Albitar.上述步驟(4)中所述微球i的PE熒光強度、微球2的PE熒光強度是指流式細胞儀測定的PE熒光染料的算術(shù)平均熒光強度(mean fluorescence intensity,MFI)或PE熒光 ^ 14WHm^i^^ft^fS. (geo mean fluorescence intensity)。上述步驟(1)白血病細胞內(nèi)融合蛋白抽提可采用現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明優(yōu)選如下白血病細胞收集后，計數(shù)，用冷的PBS緩沖液洗滌白血病細胞系一次，1200 2000 轉(zhuǎn)/分鐘離心3 10分鐘，除去上清液，收集1 5X IO6個細胞，手指用力彈散細胞，加入含10 IOOmMAEBSF的ImL PBS緩沖液預(yù)處理細胞，渦旋振蕩器振蕩細胞10秒，冰上反應(yīng) 15分鐘；離心收集細胞，使用現(xiàn)有商品化細胞蛋白抽提試劑盒提取細胞內(nèi)融合蛋白，-70°C 凍存，用于所述步驟(3)的流式液相陣列檢測。在本發(fā)明中，所述的微球、微球2是使用兩種不同的濃度FITC或Alexa Fluor 488 熒光標記。標記微球的熒光染料兩種濃度之差約為4-2500倍。所述的微球材料為聚苯乙烯、聚苯乙烯共聚物，在微球材料內(nèi)部或表面攜帶氨基基團和羧基基團的微球，或者是在所述的微球材料內(nèi)部和表面均攜帶氨基基團和羧基基團的微球。優(yōu)選的，所述的微球是4 10微米直徑、氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球。本發(fā)明所述的熒光標記的微球可以通過市場購買，也可以使用常規(guī)方法制備，例如以下方法單分散法制備熒光標記的、氨基化和羧基化聚苯乙烯微球，步驟如下在帶有攪拌裝置、通氮氣溶液的三口燒瓶中，加入穩(wěn)定劑和溶劑，升溫并攪拌成無顆粒均相體系，再加入引發(fā)劑、單體、帶有氨基基團(-NH2)的有機化合物、帶有羧基基團 (-C00H)的有機化合物、熒光染料和交聯(lián)劑，保持溫度、氮氣氣氛和攪拌速度，聚合8-72小時，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，將聚合得到的樣品用離心機分離，棄去上層清液，然后洗滌下層微球，再離心，如此反復(fù)3次洗滌，干燥微球，收集樣品并存貯在IOOmL棕色瓶中。詳見 馮愛玲，吳道澄，吳紅，楊青艷.熒光素三元共聚納米微粒的合成及其熒光性質(zhì).第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2005 36 ) :325-329o本發(fā)明的上述方法，使用二元流式液相陣列，可實現(xiàn)白血病細胞內(nèi)融合蛋白的檢測。本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案如下(1)白血病細胞內(nèi)融合蛋白抽提細胞收集后，計數(shù)，用冷的PBS緩沖液洗滌白血病細胞系一次，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，除去上清液，收集1. 25 X IO6個細胞，手指用力彈散細胞，加入含60mM AEBSF的ImL PBS緩沖液預(yù)處理細胞，渦旋振蕩器振蕩細胞10秒， 冰上反應(yīng)15分鐘，離心收集細胞，使用現(xiàn)有商品化細胞蛋白抽提試劑盒抽提細胞內(nèi)融合蛋白，-70°C凍存，用于后面的液相陣列檢測。所述的融合蛋白選自白血病細胞NB4融合蛋白PML-RAR α，白血病細胞Κ562融合蛋白 BCR-ABL。(2) 二元流式液相陣列的組建
微球i是濃度2. 5 500 μ g/mL的FITC或Alexa Fluor 488熒光標記的直徑1 10微米、氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球，微球2是濃度0. 2 10 μ g/mL的FITC或Alexa Fluor 488熒光標記的直徑1 10微米、氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球，或微球工是濃度 0. 2 10 μ g/mL的FITC或Alexa Fluor 488熒光標記的直徑1 10微米、氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球，微球2是濃度2. 5 500 μ g/mL的FITC或Alexa Fluor 488熒光標記的直徑1 10微米、氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球；標記微球工和微球2的熒光染料兩種濃度之差為12. 5-50倍；20000個微球i加入到96孔微孔濾膜板wella中，20000個微球2加入到96孔微孔濾膜板wellb中，200μ L MES緩沖液(ρΗ 6.0)洗滌微球工和微球2各2次，真空抽濾收集微球；含微球的wella和wellb孔中再分別加入含0. OOlg Sulfo-NHS和0. OOlg EDC的 200 μ L MES緩沖液(ρΗ 6. 0)，混勻，室溫、振蕩、避光孵育20分鐘；再將微球工、微球2分別用200 μ L PBS緩沖液(ρΗ 7.2)洗滌2次，真空抽濾收集微球；含微球工的wella孔中加入 20 yg融合蛋白捕獲抗體，含微球2的wellb孔中加入20 μ g同型對照抗體，wella和wellb 孔再分別加入PBS緩沖液(ρΗ 7. 2)補充體積至200yL并混勻，避光、4°C孵育2小時；(3)白血病細胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測方案1 將步驟(1)制備的50 μ L融合蛋白抽提液加入到96孔微孔濾膜板well。 孔中，再將步驟⑵制備的包被抗體的微球、微球2各5000個混合并加入到well?？字校尤隤BS-2% BSA溶液補足體積至150 μ L，混勻，室溫、避光孵育1小時；微球洗滌2次并重懸于100 μ L的PBS-2% BSA溶液中，再加入0. 25 μ g融合蛋白報道抗體，混勻，避光室溫孵育1小時；微球洗滌并重懸于100 μ L的PBS-2% BSA溶液中，加入2. 5 μ g PE熒光標記的二抗，混勻，避光、室溫孵育30分鐘；微球洗滌2次并重懸于100μ L鞘液中，流式細胞儀以 FITC或Alexa Fluor 488 versus PE點圖檢測微球和微球2的PE熒光強度。方案2 將步驟(1)制備的50 μ L融合蛋白抽提液加入到96孔微孔濾膜板well。 孔中，再將步驟⑵制備的包被抗體的微球、微球2各5000個混合并加入到well?？字?，加入0. 25 μ g PE熒光標記的融合蛋白報道抗體，加入PBS-2% BSA溶液補足體積至150 μ L， 混勻、室溫、避光孵育2小時；微球洗滌2次并重懸于100 μ L鞘液中，流式細胞儀以FITC或 Alexa Fluor 488 vers PE點圖檢測微球和微球2PE熒光強度。(4)按以下公式計算得白血病細胞內(nèi)融合蛋白定量數(shù)據(jù)白血病細胞內(nèi)融合蛋白表達值=微球工的PE熒光強度+微球2的PE熒光強度， 或微球2的PE熒光強度+微球工的PE熒光強度。本發(fā)明白血病細胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測方法，以包被融合蛋白捕獲抗體的一種濃度FITC或Alexa Fluor 488熒光標記的微球工、包被同型對照抗體的另一種濃度FITC或Alexa Fluor 488熒光標記的微球2組建檢測白血病細胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列，微球工、微球2、融合蛋白、報道抗體和/或PE熒光標記的二抗共孵育后，流式細胞儀檢測二元流式液相陣列，融合蛋白表達值表示為微球工的PE熒光強度與微球2的 PE熒光強度二者的比值，該方法能夠應(yīng)用于白血病病理、分子診斷和抗白血病藥物發(fā)現(xiàn)等生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。本發(fā)明的白血病細胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測方法能夠有效消除系統(tǒng)誤差，具有快速、準確的優(yōu)點。


圖1是FITC熒光標記的二元流式液相陣列流式點圖，上方微球包被anti-PML捕獲抗體，下方微球包被同型對照抗體；圖2是白血病NB4細胞系融合蛋白PML-RAR α的二元流式液相陣列流式檢測點圖， 白血病細胞M4融合蛋白PML-RARa表達值=微球i (上方)的PE熒光強度+微球2 (下方)的PE熒光強度。
具體實施例方式下面給出本發(fā)明的實施例，這是對本發(fā)明的進一步說明，而不是限制本發(fā)明的范圍。實施例中使用的熒光標記的微球工和微球2是按現(xiàn)有技術(shù)制備的，其中，微球是5. 4 微米氨基化和羧基化聚苯乙烯微球，制備方法參見馮愛玲，吳道澄，吳紅，楊青艷.熒光素三元共聚納米微粒的合成及其熒光性質(zhì).第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2005 ;26 (4) :325-3四。利用本發(fā)明人在先申請專利文件進行微球FITC熒光標記，參見CN101846676A —種氨基化微球的熒光編碼方法，申請?zhí)?01010166375. 7。實施例中使用的anti-PML、anti-RAR α及其同型對照抗體為Santa cruz biotechnology公司產(chǎn)品，anti-BCR、anti-ABL及其同型對照抗體同樣為Santa cruz biotechnology公司產(chǎn)品；NB4細胞系、K562細胞系和HL-60細胞系由浙江大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤中心提供，流式細胞儀為BD Bioscience公司產(chǎn)品。實施例1、白血病細胞NB4融合蛋白PML-RAR α的二元流式液相陣列檢測方法(1)正常人血液中單個核細胞的收集取新鮮的抗凝樣本血樣，與HBSS’s液1 1 混勻后，小心加于細胞分離液的液面上，以1500轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，此時離心管中由上至下細胞分四層，收集第二層細胞，細胞沉淀用HBSS’ s液反復(fù)洗滌2次即得所需細胞。(2)白血病細胞NB4內(nèi)融合蛋白PML-RARa的抽提NB4細胞、K562細胞、HL-60細胞和正常人單個核細胞收集后，計數(shù)，用冷的PBS緩沖液洗滌細胞一次，2000轉(zhuǎn)/分鐘、3分鐘離心，除去上清液收集細胞；將M4細胞與步驟(1)收集的正常人單個核細胞混合，M4細胞所占百分比分別為0.01%、0. 1%、1%、10%和100% ；收集約1.25X 106個混合細胞，移液槍盡可能吸取上清，手指用力彈散細胞，各加入含60mM AEBSF的ImL PBS緩沖液預(yù)處理細胞，渦旋振蕩器振蕩細胞10秒，冰上反應(yīng)15分鐘，離心收集細胞，取細胞核蛋白提取試劑盒中45 μ L冰的細胞質(zhì)蛋白提取液至細胞離心管中，混勻細胞，渦旋振蕩器振蕩15秒，將離心管冰上孵育10分鐘，加入5 μ L酶抑制劑，渦旋振蕩器振蕩15秒混勻，室溫反應(yīng)10分鐘， 然后冰上孵育1分鐘，15000轉(zhuǎn)/分鐘、4°C離心5分鐘；沉淀重懸于50 μ L細胞核蛋白提取液，再加入2. 5μ L蛋白酶抑制劑，渦旋振蕩器振蕩15秒，將離心管置于冰上孵育，每隔10 分鐘振蕩混勻一次，共孵育40分鐘，15000轉(zhuǎn)/分鐘、4°C離心5分鐘，立即吸取上清至一預(yù)冷的離心管中，即為細胞核蛋白抽提液，-70°C凍存，用于后續(xù)的二元流式液相陣列檢測。(3)檢測白血病細胞NB4內(nèi)融合蛋白PML-RARa的二元流式液相陣列的組建(圖 1)微球i按CN101846676A實施例1中2. 5 μ g/mL FITC熒光標記方法制備，微球2按 CN101846676A實施例1中0. 2 μ g/mL FITC熒光標記制備。
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20000個微球i加入到96孔微孔濾膜板wella中，20000個微球2加入到96孔微孔濾膜板wellb中，200μ L MES緩沖液(ρΗ 6.0)洗滌微球工和微球2各2次，真空抽濾收集微球；含微球的wella和wellb孔中再分別加入含0. OOlg Sulfo-NHS和0. OOlg EDC的 200 μ L MES緩沖液(ρΗ 6. 0)，混勻、室溫、振蕩、避光孵育20分鐘；再將微球工、微球2分別用200 μ L PBS緩沖液(ρΗ 7.2)洗滌2次，真空抽濾收集微球；含微球工的wella孔中加入 20 yg anti-PML抗體，含微球2 Wwellb孔中加入20yg同型對照抗體，WeIljnweIl1^L 再分別加入PBS緩沖液(ρΗ 7. 2)補充體積至200yL并混勻，避光、4°C孵育2小時；(4)白血病細胞NB4內(nèi)融合蛋白PML-RARa的二元流式液相陣列的檢測(圖2): 將步驟⑵制備的50 μ L細胞核蛋白抽提液加入到96孔微孔濾膜板well?？字?，再將步驟 (3)制備的包被抗體的微球i、微球2各5000個混合并加入到well。孔中，加入PBS_2% BSA 溶液補足體積至150 μ L，混勻、室溫、避光孵育1小時；微球洗滌2次并重懸于100 μ L的 PBS-2% BSA溶液中，再加入0. 25 μ g anti-RARa抗體，混勻、避光室溫孵育1小時；微球洗滌并重懸于IOOyL的PBS-2% BSA溶液中，加入2. 5 μ g PE熒光標記的二抗，混勻、避光室溫孵育30分鐘；微球洗滌2次并重懸于100 μ L鞘液中，流式細胞儀以FITC vers PE點圖檢測微球工和微球2的PE熒光強度。(5)按以下公式計算得白血病細胞NB4內(nèi)融合蛋白PML-RARa定量數(shù)據(jù)白血病細胞NB4內(nèi)融合蛋白PML-RAR α表達值=微球i的PE熒光強度+微球2的 PE熒光強度。(6)標準曲線的繪制log M4細胞濃度vers log PML-RARα融合蛋白表達值繪制標準曲線，計算分析靈敏度。本實施例的二元流式液相陣列檢測中，50μ L正常人單個核細胞核蛋白提取液的微球工的PE熒光強度與微球2的PE熒光強度的比值為1. 31 士0. 07 (平均值士標準差)， 50 μ L白血病細胞M4核蛋白提取液的微球工熒光強度與微球2的PE熒光強度的比值為56. 08 士 6. 66 (平均值士標準差)，融合蛋白PML-RARa表達值以其劑量依賴方式增加， 分析靈敏度以(空白值均數(shù)+3x標準差)帶入標準曲線方程計算為0.65% (M4細胞數(shù)百分比)，未能在K562或HL-60細胞中檢測到PML-RAR α融合蛋白。實施例2、本實施例中的微球和微球熒光編碼同實施例1。白血病細胞K562融合蛋白BCR-ABL的二元流式液相陣列檢測方法，步驟如下(1)正常人血液中單個核細胞的收集取新鮮的抗凝樣本血樣，與HBSS’s液1 1 混勻后，小心加于細胞分離液的液面上，以1500轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，此時離心管中由上至下細胞分四層。收集第二層細胞，細胞沉淀用HBSS’ s液反復(fù)洗滌2次即得所需細胞。(2)白血病細胞K562內(nèi)融合蛋白BCR-ABL的提取K562細胞、NB4細胞、HL-60細胞和正常人單個核細胞收集后，計數(shù)，用冷的PBS緩沖液洗滌細胞一次，2000轉(zhuǎn)/分鐘、3分鐘離心，除去上清液收集細胞；Κ562細胞與步驟(1)收集的正常人單個核細胞混合，Κ562細胞所占百分比分別為0.01%、0. 1%、1%、10%和100% ；收集約1.25Χ106個混合細胞，移液槍盡可能吸取上清，手指用力彈散細胞，各加入含60mM AEBSF的ImL PBS緩沖液預(yù)處理細胞，渦旋振蕩器振蕩細胞10秒，冰上反應(yīng)15分鐘；離心收集細胞，加入全細胞蛋白提取試劑盒中50 μ L冰的RIPA裂解液，渦旋振蕩器振蕩15秒，將離心管冰上孵育10分鐘，15000 轉(zhuǎn)/分鐘、4°C離心5分鐘，立即吸取上清至一預(yù)冷的離心管中，即為抽提得到的全細胞蛋
11白，"70 V凍存，用于后面的二元流式液相陣列檢測。(3)檢測白血病細胞K562內(nèi)融合蛋白BCR-ABL的二元流式液相陣列的組建微球i按CN101846676A實施例1中2. 5 μ g/mL FITC熒光標記方法制備，微球2按 CN101846676A實施例1中0. 2 μ g/mL FITC熒光標記制備。20000個微球i加入到96孔微孔濾膜板wella中，20000個微球2加入到96孔微孔濾膜板wellb中，200μ L MES緩沖液(ρΗ 6.0)洗滌微球工和微球2各2次，真空抽濾收集微球；含微球的wella和wellb孔中再分別加入含0. OOlg Sulfo-NHS和0. OOlg EDC的 200 μ L MES緩沖液(ρΗ 6. 0)，混勻，室溫、振蕩、避光孵育20分鐘；再將微球工、微球2分別用200 μ L PBS緩沖液(ρΗ 7.2)洗滌2次，真空抽濾收集微球；含微球工的wella孔中加入 20 yg anti-BCR抗體，含微球2 Wwellb孔中加入20yg同型對照抗體，恥1込和Well1^L 再分別加入PBS緩沖液(ρΗ 7. 2)補充體積至200yL并混勻，避光、4°C孵育2小時；(4)白血病細胞K562內(nèi)融合蛋白BCR-ABL的二元流式液相陣列檢測將步驟(2) 制備的50 μ L融合蛋白抽提液加入到96孔微孔濾膜板well?？字校賹⒉襟E(3)制備的包被抗體的微球、微球2各5000個混合并加入到well。孔中，加入0. 25 μ g PE熒光標記的 anti-ABL抗體，加入PBS_2% BSA溶液補足體積至150 μ L，混勻、室溫、避光孵育2小時；微球洗滌2次并重懸于100 μ L鞘液中，流式細胞儀以FITC vers PE點圖檢測微球i和微球 2PE熒光強度。(5)按以下公式計算得白血病細胞內(nèi)融合蛋白定量數(shù)據(jù)白血病細胞內(nèi)融合蛋白表達值=微球工WPE熒光強度+微球2 WPE熒光強度。(6)標準曲線的繪制log K562細胞濃度vers log BCR-ABL融合蛋白表達值繪制標準曲線，計算分析靈敏度。本實施例的二元流式液相陣列檢測中，50μ L正常人單個核細胞蛋白抽提液的微球工WPE熒光強度與微球2 WPE熒光強度的比值為1. 士 0. 09(平均值士標準差)， 50 μ L白血病細胞Κ562蛋白抽提液的微球工的PE熒光強度與微球2的PE熒光強度的比值為62. 15 士 5. 97 (平均值士標準差)，融合蛋白BCR-ABL表達值以其劑量依賴方式增加，分析靈敏度以(空白值均數(shù)+3x標準差)帶入標準曲線方程計算為為0.51% (K562細胞數(shù)百分比)，未能在NB4或HL-60細胞中檢測到BCR-ABL融合蛋白。
權(quán)利要求
1.白血病細胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測方法，包括兩種濃度FITC或兩種濃度Alexa Fluor 488熒光標記的微球、融合蛋白捕獲抗體、融合蛋白報道抗體、同型對照抗體、PE熒光標記的二抗、緩沖液和流式細胞儀檢測，其特點在于以包被融合蛋白捕獲抗體的一種濃度的FITC或Alexa Fluor 488熒光標記的微球、包被同型對照抗體的另一種濃度的FITC或Alexa Fluor 488熒光標記的微球2組建檢測白血病細胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列，流式細胞儀檢測陣列所得微球的PE熒光強度與微球2的PE熒光強度的二者比值為融合蛋白表達值。
2.如權(quán)利要求1所述的白血病細胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測方法，包括步驟如下(1)利用現(xiàn)有技術(shù)抽提白血病細胞內(nèi)融合蛋白；(2)二元流式液相陣列的組建10000 100000個一種濃度的FITC或Alexa Fluor 488熒光標記的微球加入到96 孔微孔濾膜板wella中，10000 100000個另一種濃度的FITC或Alexa Fluor 488熒光標記的微球2加入到96孔微孔濾膜板Wellb中，200 μ L MES緩沖液(ρΗ 6. 0)洗滌微球工和微球2各2次，真空抽濾收集微球；含微球的wella和wellb孔中再分別加入含0. 0001 0. Olg Sulfo-NHS和0. 0001 0. Olg EDC的200 μ LMES緩沖液(ρΗ 6. 0)，混勻、室溫、振蕩、避光孵育20分鐘；再將微球工、微球2分別用200 μ L PBS緩沖液(ρΗ 7. 2)洗滌2次，真空抽濾收集微球；含微球工的wella孔中加入1 50 μ g融合蛋白捕獲抗體，含微球2的wellb孔中加入1 50 μ g同型對照抗體，wella和wellb孔再分別加入PBS緩沖液(pH7. 2)補充體積至200μ L并混勻，避光、4°C孵育2小時；得包被融合蛋白捕獲抗體的微球工和包被同型對照抗體的微球2;(3)白血病細胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測，選自下列方案之一方案1 將步驟(1)制備的0.5 50 μ L白血病細胞內(nèi)融合蛋白抽提液加入到96孔微孔濾膜板well。孔中，再將步驟( 制備的包被抗體的微球1與微球2各1000 10000個混合并加入到well?？字校尤隤BS-2% BSA溶液補足體積至150 μ L，混勻、室溫、避光孵育 1小時；將所得微球洗滌2次并重懸于100 μ L的PBS-2% BSA溶液中，再加入0. 1 10 μ g 融合蛋白報道抗體，混勻、避光室溫孵育1小時；將所得微球洗滌2次并重懸于100 μ L的 PBS-2% BSA溶液中，加入0. 1 10 μ g PE熒光標記的二抗，混勻、避光室溫孵育30分鐘； 將所得微球洗滌2次并重懸于100 μ L鞘液中，用流式細胞儀以FITC或Alexa Fluor 488 versus PE點圖檢測微球工和微球2PE熒光強度；方案2 將步驟(1)制備的0. 5 50 μ L白血病細胞內(nèi)融合蛋白抽提液加入到96孔微孔濾膜板well?？字?，再將步驟( 制備的包被抗體的微球1與微球2各1000 10000個混合并加入到well。孔中，加入0. 1 IOyg PE熒光標記的融合蛋白報道抗體，加入PBS_2% BSA溶液補足體積至150 μ L，混勻、室溫、避光孵育2小時；將所得微球洗滌2次并重懸于 100 μ L鞘液中，用流式細胞儀以FITC或Alexa Fluor 488 vers PE點圖檢測微球i和微球 2PE熒光強度；(4)按以下公式計算得白血病細胞內(nèi)融合蛋白定量數(shù)據(jù)白血病細胞內(nèi)融合蛋白表達值=微球工的PE熒光強度+微球2的PE熒光強度，或微球2的PE熒光強度+微球工的PE熒光強度。
3.如權(quán)利要求1或2所述的白血病細胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測方法，其特征在于所述微球的平均直徑均為1 10微米，F(xiàn)ITC或Alexa Fluor 488熒光染料濃度范圍為0. 1 1000 μ g/mL,熒光染料兩種濃度之差為4-2500倍。
4.如權(quán)利要求1或2所述的白血病細胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測方法，其特征在于步驟O)中所用的捕獲抗體是以anti-PML、anti-BCR分別作為白血病細胞肌4融合蛋白PML-RARa、白血病細胞K562融合蛋白BCR-ABL的捕獲抗體。
5.如權(quán)利要求1或2所述的白血病細胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測方法，其特征在于步驟(3)中所用的報道抗體是以anti-RARa、anti-ABL分別作為白血病細胞NB4 融合蛋白PML-RARa、白血病細胞K562融合蛋白BCR-ABL的報道抗體。
6.如權(quán)利要求1或2所述的白血病細胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測方法，其特征在于所用微球工是一種濃度FITC或Alexa Fluor 488熒光標記的微球；所用微球2是另一種濃度FITC或Alexa Fluor 488熒光標記的微球；標記微球工和微球2的熒光染料兩種濃度之差為4-2500倍。
7.如權(quán)利要求1或2所述的白血病細胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測方法，其特征在于所述微球的材料為聚苯乙烯、聚苯乙烯共聚物之一或組合，在微球材料內(nèi)部或表面攜帶氨基基團和羧基基團，或者是在所述的微球材料內(nèi)部和表面均攜帶氨基基團和羧基基團的微球。
8.如權(quán)利要求1或2所述的白血病細胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測方法，其特征在于步驟中白血病細胞內(nèi)融合蛋白表達值=微球工WPE熒光強度+微球2 WPE 熒光強度，或微球2的PE熒光強度+微球工的PE熒光強度。
9.如權(quán)利要求1或2所述的白血病細胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測方法，其特征在于步驟(4)中所述微球i的PE熒光強度和微球2的PE熒光強度是指流式細胞儀測定的PE熒光染料的算術(shù)平均熒光強度或PE熒光染料的幾何平均熒光強度。
10.如權(quán)利要求1或2所述的白血病細胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測方法，其特征在于步驟如下(1)白血病細胞內(nèi)融合蛋白抽提細胞收集后，計數(shù)，用冷的PBS緩沖液洗滌白血病細胞系一次，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，除去上清液，收集1. 25 X IO6個細胞，手指用力彈散細胞，加入含60mM AEBSF的ImL PBS緩沖液預(yù)處理細胞，渦旋振蕩器振蕩細胞10秒，冰上反應(yīng) 15分鐘，離心收集細胞，使用現(xiàn)有商品化細胞蛋白抽提試劑盒抽提細胞內(nèi)融合蛋白，-70°C 凍存，用于后面的液相陣列檢測；(2)二元流式液相陣列的組建微球是濃度2. 5 500 μ g/mL的FITC或Alexa Fluor 488熒光標記的直徑1 10 微米、氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球，微球2是濃度0. 2 10 μ g/mL的FITC或Alexa Fluor 488熒光標記的直徑1 10微米、氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球，或微球工是濃度 0. 2 10 μ g/mL的FITC或AlexaFluor 488熒光標記的直徑1 10微米、氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球，微球2是濃度2. 5 500 μ g/mL的FITC或Alexa Fluor 488熒光標記的直徑1 10微米、氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球；標記微球工和微球2的熒光染料兩種濃度之差為12. 5-50倍；20000個微球1加入到96孔微孔濾膜板wella中，20000個微球2加入到96孔微孔濾膜板wellb中，200yL MES緩沖液(pH 6.0)洗滌微球工和微球2各2次，真空抽濾收集微球；含微球的wella*wellb孔中再分別加入含0. OOlg Sulfo-NHS和0. OOlg EDC的200 μ L MES緩沖液(pH 6.0)，混勻，室溫、振蕩、避光孵育20分鐘；再將微球工、微球2分別用200 μ L PBS緩沖液(pH 7. 2)洗滌2次，真空抽濾收集微球；含微球J^wella孔中加入20 μ g融合蛋白捕獲抗體，含微球2的wellb孔中加入20 μ g同型對照抗體，wella和wellb孔再分別加入PBS緩沖液(pH 7. 2)補充體積至200 μ L并混勻，避光、4°C孵育2小時；(3)白血病細胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測方案1:將步驟(1)制備的50 μ L融合蛋白抽提液加入到96孔微孔濾膜板well?？字校賹⒉襟E⑵制備的包被抗體的微球、微球2各5000個混合并加入到well。孔中，加入 PBS-2% BSA溶液補足體積至150 μ L，混勻、室溫、避光孵育1小時；微球洗滌2次并重懸于 100 μ L的PBS-2% BSA溶液中，再加入0. 25 μ g融合蛋白報道抗體，混勻、避光室溫孵育1 小時；微球洗滌并重懸于100 μ L的PBS-2% BSA溶液中，加入2. 5 μ g PE熒光標記的二抗， 混勻、避光室溫孵育30分鐘；微球洗滌2次并重懸于100 μ L鞘液中，流式細胞儀以FITC或 Alexa Fluor 488 vers PE點圖檢測微球和微球2的PE熒光強度；方案2 將步驟⑴制備的50yL融合蛋白抽提液加入到96孔微孔濾膜板well。孔中， 再將步驟⑵制備的包被抗體的微球工與微球2各5000個混合并加入到well?？字?，加入 0.25 yg PE熒光標記的融合蛋白報道抗體，加入PBS-2% BSA溶液補足體積至150 μ L，混勻、室溫、避光孵育2小時；微球洗滌2次并重懸于100 μ L鞘液中，流式細胞儀以FITC或 Alexa Fluor 488 vers PE點圖檢測微球和微球2的PE熒光強度；(4)按以下公式計算得白血病細胞內(nèi)融合蛋白定量數(shù)據(jù)白血病細胞內(nèi)融合蛋白表達值=微球工的PE熒光強度+微球2的PE熒光強度，或微球2的PE熒光強度+微球工的PE熒光強度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種白血病細胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列檢測方法，以包被融合蛋白捕獲抗體的FITC或Alexa Fluor 488熒光標記的微球1、包被同型對照抗體的另一種濃度FITC或Alexa Fluor 488熒光標記的微球2組建檢測白血病細胞內(nèi)融合蛋白的二元流式液相陣列，微球1、微球2、融合蛋白、報道抗體和/或PE熒光標記的二抗共孵育后，流式細胞儀檢測二元流式液相陣列，融合蛋白表達值表示為微球1的PE熒光強度與微球2的PE熒光強度的二者比值。該方法能夠應(yīng)用于白血病病理、分子診斷和抗白血病藥物發(fā)現(xiàn)等生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。本發(fā)明的方法能夠有效消除系統(tǒng)誤差，具有快速、準確的優(yōu)點。
文檔編號G01N21/64GK102353793SQ20111018998
公開日2012年2月15日 申請日期2011年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月7日
發(fā)明者蘭文軍, 王哲理, 王海燕, 閆磊 申請人:山東輕工業(yè)學(xué)院