專利名稱：：一種液相蛋白芯片的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種液相蛋白芯片的制備方法。技術(shù)背景生物芯片是上世紀(jì)90年代初發(fā)展起來的一種生物檢測技術(shù)，其原理是在約l2cn^大小的玻璃片、硅片、尼龍膜、凝膠或者金屬等支持介質(zhì)上，以微陣列的形式在不同位置固定上不同的生物分子探針(蛋白質(zhì)、核酸等)，這些探針分子可以與溶液中的目的分子相互作用(如雜交、抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)等)，反應(yīng)完成后通過洗片洗去未反應(yīng)的分子。目的分子可以事先標(biāo)記，也可以在與探針分子反應(yīng)后進(jìn)行染色，然后通過信號收集設(shè)備(如熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、芯片掃描儀等)檢測反應(yīng)信號的有無或強(qiáng)弱，經(jīng)計算機(jī)數(shù)據(jù)分析后得到相關(guān)的生物信息。由于生物芯片高通量、高效率、并行化的特點，極大簡化和縮短了實驗研究進(jìn)程，隨著人類基因組計劃提前完成和后基因組計劃啟動，生物芯片迅速在生物學(xué)領(lǐng)域得到較廣泛的應(yīng)用。根據(jù)芯片表面固定的分子及檢測對象的不同，一般可將其分為基因芯片、蛋白質(zhì)芯片和組織芯片幾類。雖然多數(shù)生物芯片的基片采用價格便宜的玻璃片，但是由于芯片制備需要專門的設(shè)備和技術(shù)、制備過程比較復(fù)雜、樣品的準(zhǔn)備與標(biāo)記較為繁瑣等多種因素，因而造成芯片的成本較高，而結(jié)果的重復(fù)性較差。另外，芯片使用過程是在基片的表面點加含有目的分子的溶液，目的分子需經(jīng)過較長距離的擴(kuò)散才能與探針在固-液相界面相互作用，因此反應(yīng)檢側(cè)時間較長，靈敏度有待進(jìn)一步提高。1997年，一種兼具核酸和蛋白質(zhì)等生物分子分析功能的新一代高通量檢測技術(shù)平臺誕生了，它就是由美國Luminex公司開發(fā)出來的xMAP(flexibleMulti-AnalyteProfiling)技術(shù)，基于該技術(shù)的液相芯片(也稱為微球體懸浮芯片，suspensionarray)是繼基因芯片、蛋白芯片之后的新型生物芯片。它是在不同熒光編碼的微球上進(jìn)行抗原-抗體、酶-底物、配體-受體的結(jié)合反應(yīng)及核酸雜交反應(yīng)，通過紅、綠兩束激光分別檢測微球編碼和熒光信號來達(dá)到定性和定量的目的，一個反應(yīng)孔內(nèi)可以完成多達(dá)100種不同生物學(xué)反應(yīng)。具體說來，液相芯片體系由許多大小均一的圓形微球(microspheres,直徑為5.55.6pm)為主要基質(zhì)構(gòu)成，每一種微球都有一個獨特的色彩編號，或稱光學(xué)編碼。在微球的制造過程中，按照精確的比例摻入了紅色和橙色兩種熒光染料(這兩種染料各有IO種不同區(qū)分)，從而把微球分為100種不同的顏色，形成一個具有獨特光譜地址的含有100種不同微球的陣列。每種微球上可分別固定不同的探針分子，如各種蛋白、肽、多糖、脂類、寡核苷酸等生物分子，然后將這100種微球混合后懸浮于一個液相體系中，加入待測樣品，不同的探針可以和樣品中的不同目的分子結(jié)合，并使固定有探針的微球攜帶上報告分子藻紅蛋白(R-Phycoerythrin)。反應(yīng)結(jié)束后，儀器Luminex100可同時對100種微球上的100種分子進(jìn)行實時分析。Luminex100是采用微流技術(shù)使微球快速單列通過檢測通道，并使用紅綠雙色激光同時對單個微球上的分類熒光和報告分子上的報告熒光進(jìn)行檢測。其中635nm紅色激光激發(fā)的是微球內(nèi)的紅色和橙色分類熒光分子，根據(jù)微球分類熒光信號強(qiáng)度的不同將微球分類，從而鑒定各個不同的反應(yīng)類型，即定性。綠色激光激發(fā)的是結(jié)合在微球表面上的橙色報告熒光分子，目的是確定微球上結(jié)合的報告熒光分子的數(shù)量，從而確定微球上結(jié)合的目的分子的數(shù)量，即定量。因此，通過紅綠雙色激光的同時檢測，高速數(shù)字信號處理器將微球上的熒光信號強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的數(shù)字信號，就可以確定被結(jié)合的目的分子的種類和數(shù)量，完成對反應(yīng)的實時、定性和定量分析。液相芯片技術(shù)與傳統(tǒng)免疫學(xué)、核酸檢測方法相比具有以下幾個顯著優(yōu)點(1)高通量從理論上說，如果不存在交叉反應(yīng)，檢測的通量等于微球的種類數(shù)，目前最多可達(dá)到100種。這遠(yuǎn)勝過一次只能檢測1個項目的傳統(tǒng)免疫分析法。(2)樣本用量少由于在同一個反應(yīng)孔中可以同時完成100種不同的生物學(xué)反應(yīng)，所以檢測多指標(biāo)時大大節(jié)省了樣本用量，非常適合分析小體積稀有樣品。(3)操作簡單、快速由于是基于液相反應(yīng)動力學(xué)，因此反應(yīng)速度快，孵育時間比傳統(tǒng)的固相檢測短。進(jìn)行免疫學(xué)分析時，若使用高親和力抗體，23小時內(nèi)即完成檢測，而核酸雜交分析在PCR擴(kuò)增后1小時內(nèi)可得到結(jié)果。(4)檢測范圍廣可達(dá)35個數(shù)量級，樣品無需濃縮或稀釋。(5)準(zhǔn)確性好由于液相芯片技術(shù)的檢測范圍大，因此不需要象ELISA檢測中樣本需多倍稀釋，從而減小了誤差。(6)重復(fù)性好這是由于第一，與ELISA依靠酶放大作用的比色讀數(shù)相比，液相芯片技術(shù)中的熒光讀值更加直接、穩(wěn)定、靈敏；第二，每種微球檢測100個，最終取熒光強(qiáng)度的中值作為結(jié)果，這相當(dāng)于對每個樣本重復(fù)檢測了100次，而ELISA僅為雙復(fù)孔或三復(fù)孔。(7)費用低同時檢測一個樣本中的多項指標(biāo)可節(jié)約時間、樣本、試劑、耗材和勞動(比ELISA法低10100倍)，降低檢測成本，同時還提高了分析效率，通過少量樣本即可獲得大里fe息o與平面芯片(基因芯片、蛋白芯片)相比，液相芯片技術(shù)也更勝一籌(1)靈敏度更高微球表面積大，每個微球上可固定大約100，000個捕獲抗體，如此高密度的捕獲抗體保證了能夠最大程度地與樣本中的抗原分子結(jié)合，提高檢測靈敏度。最低檢測濃度可達(dá)到l(T13g/mL。(2)特異性強(qiáng)只讀取單個微球上的熒光信號，信噪比高。(3)重復(fù)性更好不存在平面芯片因其固有的生產(chǎn)工藝問題而影響重復(fù)性的現(xiàn)象。(4)更加靈活使用者自行組合或自行制備固定探針的微球和標(biāo)記分子即可滿足不同檢測項目的需要，而平面芯片則需要另行制作一張新的芯片。液相芯片技術(shù)以其高通量、快速、靈活、準(zhǔn)確、靈敏、操作簡便、重復(fù)性好、可定性定量等顯著優(yōu)點成為一種極具吸引力的大規(guī)模生物檢測平臺，幾乎可用于任何分子相互作用的檢測。迄今為止不到十年的時間，全球已有數(shù)百套基于xMAP技術(shù)的檢測平臺用于免疫學(xué)、蛋白質(zhì)、核酸檢測、基因研究等領(lǐng)域，該技術(shù)已成為一種新的蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)研究工具。其主要用途有篩選過敏原、檢測自身抗體、生物標(biāo)志物、細(xì)胞因子、激素、HLA、病原微生物、基因突變等以及基因表達(dá)分析、酶/底物研究、DNA-蛋白相互作用分析等。癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)是臨床常用的腫瘤標(biāo)志物，前者血清含量升高主要見于消化道腫瘤尤其是結(jié)腸癌，而后者是原發(fā)性肝癌最靈敏、最特異的標(biāo)志。檢測腫瘤標(biāo)志物對于腫瘤的早期診斷、良惡性鑒別、臨床分期、療效監(jiān)測和預(yù)后判斷具有重要價值。這兩種腫瘤標(biāo)志物也是健康體檢和腫瘤篩査中最常用的指標(biāo)。乙型肝炎表面抗原(HBsAg)與肝硬變、肝癌的發(fā)病密切相關(guān)，并已從多方面得到證實。臨床上我國肝癌患者中約85%有乙肝病毒感染史。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，肝癌高發(fā)區(qū)人群HBsAg陽性率高于肝癌低發(fā)區(qū)。病理學(xué)檢查也發(fā)現(xiàn)肝癌患者HBsAg陽性率顯著高于對照組。所以目前乙型肝炎-肝硬變-肝癌的致病模式已為人們所認(rèn)識。由于在慢性乙肝病毒攜帶者(HBsAg陽性)中，肝癌發(fā)生的危險性比HBsAg陰性者高約200倍，因此，有人建議高危人群(肝炎高發(fā)區(qū)的居民和有肝炎病史或HBsAg陽性者)應(yīng)定期檢測AFP。檢測CEA、AFP、HBsAg的傳統(tǒng)方法有酶聯(lián)免疫吸附測定、放射免疫測定法、化學(xué)發(fā)光免疫測定法、時間分辨熒光免疫測定等。這些方法存在一個共同缺陷均為單指標(biāo)檢測，信息量小，需檢測多個項目時標(biāo)本用量大、檢測費用高，而且均有其局限性(如標(biāo)記步驟復(fù)雜、試劑和儀器昂貴、操作繁瑣、靈敏度低、重復(fù)性差、易污染等)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種可聯(lián)合檢測人血清CEA、AFP、HBsAg的液相蛋白芯片，包括其制備方法。本發(fā)明在3種具有不同熒光編碼的微球上分別偶聯(lián)CEA、AFP、HBsAg的特異性抗體(捕獲抗體)，偶聯(lián)反應(yīng)中的微球為2.5><106個，捕獲抗體濃度為28pg/ml，室溫反應(yīng)2小時。本發(fā)明中針對CEA、AFP、HBsAg的檢測抗體采用生物素或者藻紅蛋白標(biāo)記。本發(fā)明的另一目的是提供一種液相蛋白芯片的使用方法。本發(fā)明中液相蛋白芯片的使用方法包括(1)配制含有3種抗體偶聯(lián)微球的混合液；(2)在96孔濾膜板中分別加入25pi抗原標(biāo)準(zhǔn)品和1:25稀釋的血清樣品；(3)各孔加入25^微球混合液，室溫振搖反應(yīng)60分鐘；(4)洗滌液洗板3次；(5)各孔加入25pl生物素標(biāo)記抗體混合液或者藻紅蛋白標(biāo)記抗體混合液，室溫振搖反應(yīng)60分鐘；(若第5步加入藻紅蛋白標(biāo)記抗體混合液，則省略第6、7步)(6)洗滌液洗板3次；(7)各孔加入25藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉親和素，室溫振搖反應(yīng)1530分鐘；(8)洗滌液洗板3次，用125pl洗滌液重懸微球；(9)在儀器上檢測熒光信號，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。本發(fā)明聯(lián)合檢測人血清CEA、AFP、HBsAg水平，可用于健康體檢以及高危人群的普查。聯(lián)合檢測這3項與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的指標(biāo)可起到對機(jī)體健康狀況的預(yù)警作用，有助于腫瘤的及早發(fā)現(xiàn)和及時治療。本發(fā)明的優(yōu)點是采用最新的xMAP技術(shù)，每次僅需lpl標(biāo)本，即可在34小時內(nèi)同時完成血清CEA、AFP、HBsAg水平的三項檢測。不僅大大節(jié)省了標(biāo)本和試劑用量，而且減少了操作時間，提高了檢測效率。儀器在檢測熒光信號后自動根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得出待測物濃度，實現(xiàn)定性和定量分析。此外，本發(fā)明使用96孔濾膜板代替微量滴定板作為反應(yīng)容器，每步反應(yīng)完成后洗去未結(jié)合的分子，可降低背景熒光，提高靈敏度和檢測范圍，而且重復(fù)性更好，結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。鑒于液相芯片無與倫比的技術(shù)優(yōu)勢，可以預(yù)見，快速、靈敏、高通量的液相蛋白芯片將是今后臨床檢驗和疾病診斷試劑的發(fā)展方向之一。圖1是本發(fā)明聯(lián)合檢測CEA、AFP、HBsAg的標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實施方式實施例l:液相蛋白芯片的制備1、抗體偶聯(lián)微球的制備(1)取2.5><106個羧基化微球(購自Luminex公司)于1.5ml微量離心管中，13，000轉(zhuǎn)/分離心4分鐘，棄上清。(2)加入100pl去離子水，漩渦振蕩并超聲處理20秒使微球重懸。13,000轉(zhuǎn)/分離心4分鐘，棄上清。(3)加入100^d活化緩沖液(0.1mol/LNaH2P04,pH6.2)，漩渦振蕩并超聲處理20秒使微球重懸。13,000轉(zhuǎn)/分離心4分鐘，棄上清。(4)加入80pl活化緩沖液，漩渦振蕩并超聲處理20秒使微球重懸。(5)分別稱取適量N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)和碳二亞胺(EDC)，用去離子水配成50mg/ml的濃度(現(xiàn)配現(xiàn)用)。(6)在微球懸液中加入10piSulfo-NHS溶液，輕輕混勻后，馬上加入10plEDC溶液，輕輕混勻，室溫下避光靜置20分鐘，中間混勻一次。(7)將微球13,000轉(zhuǎn)/分離心4分鐘，棄上清。(8)加入150pl交聯(lián)緩沖液(50mmol/L2-嗎啉乙磺酸(MES)，pH5.0)，漩渦振蕩并超聲處理20秒使微球重懸。13,000轉(zhuǎn)/分離心4分鐘，棄上清。(9)重復(fù)步驟8—次。(10)加入100^d交聯(lián)緩沖液，漩渦振蕩并超聲處理20秒使微球重懸。(11)在已活化的微球懸液中加入14pg捕獲抗體(預(yù)先經(jīng)透析或過柱去除疊氮鈉、雜蛋白等)，并用交聯(lián)緩沖液補(bǔ)足體積至500^1，混勻，室溫避光溫和振蕩2小時。(12)將微球13,000轉(zhuǎn)/分離心4分鐘，棄上清。(13)加入500pl封閉液(0.8o/oNaCl，0.02%KC1，0.29%Na2HP04,0.024%KH2P04,1%BSA,0.05%Tween20,0.05%疊氮鈉，pH7.4)，室溫避光振蕩30分鐘。(14)將微球13，000轉(zhuǎn)/分離心4分鐘，棄上清。(15)將微球用500plPBS-TBN(0.8%NaCl，0.02%KC1，0.29%Na2HPO4,0.024%KH2P04，0.1%BSA，0.02%Tween20，0.05%疊氮鈉，pH7.4)洗滌2次。(16)最后加入400600^ilPBS-TBN,漩渦振蕩并超聲處理20秒使微球重懸。(17)取少量微球懸液用水適當(dāng)稀釋后，顯微鏡下計數(shù)微球個數(shù)，計算微球懸液的濃度。(18)將抗體偶聯(lián)微球4'C避光保存。2、生物素標(biāo)記抗體的制備(1)取0.5lmg抗體加入帶濾膜離心管(MicroconYM-50，購自Milliporc公司)中，8,000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。(2)用50mmoI/LNaHCO3(pH8.8)反復(fù)洗滌5次并調(diào)整濃度至2mg/ml。(3)用二甲基甲酰胺(DMF)配制IOmg/m性物素-N-羥基琥珀酰亞胺酯，并取適量加入單抗溶液中，使生物素與單抗的質(zhì)量比為1:5，混勻，室溫靜置60分鐘。(4)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)物于PBS中透析24小時，除去游離的生物素。(5)將生物素標(biāo)記抗體分裝，4'C保存。3、藻紅蛋白標(biāo)記抗體的制備(1)取0.51mg抗體加入帶濾膜離心管(MicroconYM-50,購自Millipore公司)中，8,000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。(2)用PBS(0.8%NaCl，0.02%KC1，0.29%Na2HPO4，0.024%KH2P04，pH7.4)反復(fù)洗滌5次并調(diào)整濃度至l10mg/ml。(3)在純化后的抗體溶液中加入1mol/L二硫蘇糖醇(DTT)，使DTT終濃度為20mmol/L,蓋緊微量離心管蓋，混勻，室溫靜置30分鐘。(4)將經(jīng)DTT處理的抗體過SephadexG-25層析柱，洗脫液為50mmol/LMES，2mmol/LEDTA(pH6.0)，收集流出液，立即進(jìn)行以下操作。(5)在每1mg抗體中加入3.2mg活化藻紅蛋白U0mg/ml，購自Prozyme公司)，混勻，室溫避光振蕩反應(yīng)60分鐘。(6)在每lmg抗體中加入34嗎N-乙烷基順丁烯抱亞胺(NEM，10mg/ml)，混勻，室溫避光振蕩反應(yīng)20分鐘。(7)將反應(yīng)物用SephacrylS-300層析柱進(jìn)行純化，PBS洗脫。首先是藻紅蛋白標(biāo)記抗體出峰，其后依次是游離藻紅蛋白和未標(biāo)記抗體。(8)收集標(biāo)記抗體，fC避光保存。實施例2:反應(yīng)所需溶液的制備1、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的制備按以下配方配制標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液0.8%NaCl，0.02%KCl,0.29%Na2HP04,0.024%KH2P04，1.57.5%BSA，0.01%Tween20，0.05%疊氮鈉,pH7.4。2、標(biāo)準(zhǔn)品的制備分別取適量含高濃度CEA、AFP、HBsAg抗原的貯存液，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液按下表所示濃度配制同時含有上述3種抗原的標(biāo)準(zhǔn)品16(Std1Std6)，標(biāo)準(zhǔn)品7(Std7)為不含任何抗原的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3、分析緩沖液的制備按以下配方配制分析緩沖液0.8%NaCl，0.02%KC1,0.29%Na2HPO4,0.024%KH2P04，1%BSA，0.05%疊氮鈉，pH7.4。4、洗滌液的制備按以下配方配制洗漆液-0.80/oNaCl,0.02%KC1，0.29%Na2HP04，0.024%KH2P04，0.05%Tween20，pH7.4。實施例3:液相蛋白芯片的使用方法1、將CEA、AFP、HBsAg的抗體偶聯(lián)微球漩渦振蕩并超聲處理20秒，使其重懸。2、各取適量微球懸液，用分析緩沖液配制成每nl含有80100個不同熒光編碼微球的稀釋微球混合液。3、在96孔濾膜板(MultiScreenMABVN1.2nm)所需反應(yīng)孔中加入100nl/孔的分析緩沖液預(yù)濕，其余孔用封板膜封住，真空抽濾去除液體。4、在濾膜板標(biāo)準(zhǔn)品孔(可設(shè)雙復(fù)孔)、樣品孔中分別加入25nl/孔的標(biāo)準(zhǔn)品和血清標(biāo)本(預(yù)先用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋25倍)。5、在上述孔中加入25nl/孔的稀釋微球混合液。6、封板膜封住反應(yīng)孔，室溫避光振蕩孵育60分鐘。7、真空抽濾去除孔內(nèi)液體，用100pl/孔的洗滌液洗板3次并抽干。8、用分析緩沖液配制含有CEA、AFP、HBsAg3種生物素標(biāo)記抗體的混合液或者3種藻紅蛋白標(biāo)記抗體的混合液，濃度均為12pg/ml。9、加入25pl/孔的生物素標(biāo)記抗體混合液或者藻紅蛋白標(biāo)記抗體混合液，封板膜封住反應(yīng)孔，室溫避光振蕩孵育60分鐘。(若第9步加入藻紅蛋白標(biāo)記抗體混合液，則省略第1012步)10、真空抽濾去除孔內(nèi)液體，用100)al/孔的洗滌液洗板3次并抽干。11、用分析緩沖液配制20pg/ml藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉親和素(SA-PE)溶液。12、加入25nl/孔的SA-PE，封板膜封住反應(yīng)孔，室溫避光振蕩孵育1530分鐘。13、真空抽濾去除孔內(nèi)液體，用100pl/孔的洗滌液洗板3次并抽干。14、加入125nl/孔的洗滌液重懸微球。15、在Bio-Plex檢測系統(tǒng)或LuminexlOO上讀取各孔熒光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度得出待測物濃度值。權(quán)利要求1、一種液相蛋白芯片，主要由偶聯(lián)特異抗體的微球和標(biāo)記生物素或藻紅蛋白的檢測抗體組成，其特征在于，所用微球大小相同，而具有不同熒光編碼，檢測的目標(biāo)蛋白為癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)和乙肝表面抗原(HBsAg),檢測反應(yīng)在96孔濾膜板中進(jìn)行。2、如權(quán)利要求l所述的一種液相蛋白芯片，其特征在于，微球為直徑5.55.6nm的聚苯乙烯微球，其內(nèi)部用兩種熒光染料按不同比例染色，因而具有不同的熒光編碼。3、如權(quán)利要求l所述的一種液相蛋白芯片，其特征在于，特異抗體是通過與微球上的羧基發(fā)生縮合反應(yīng)而偶聯(lián)至微球上。4、如權(quán)利要求l所述的一種液相蛋白芯片，其特征在于，偶聯(lián)于微球的捕獲抗體及用于標(biāo)記的檢測抗體是針對CEA、AFP和HBsAg的特異性單克隆抗體。5、如權(quán)利要求1所述的一種液相蛋白芯片，其特征在于，檢測抗體可采用生物素或者藻紅蛋白標(biāo)記。6、如權(quán)利要求1所述的一種液相蛋白芯片，其特征在于，檢測靈敏度分別為CEA8.90pg/ml、AFP0.013U/ml、HBsAg0.24ng/ml。7、如權(quán)利要求1所述的一種液相蛋白芯片的使用方法，其特征在于，反應(yīng)在96孔濾膜板中進(jìn)行，每步反應(yīng)完成后用洗滌液洗板3次。8、如權(quán)利要求1所述的一種液相蛋白芯片的使用方法，其特征在于，血清標(biāo)本用量為1^，可同時定性定量分析CEA、AFP和HBsAg。9、如權(quán)利要求1所述的一種液相蛋白芯片的使用方法，其特征在于，用Bio-Plex檢測系統(tǒng)或LuminexlOO檢測熒光信號，自動做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出標(biāo)本中待測物的濃度。全文摘要本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明公開了一種可同時檢測人血清癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)和乙肝表面抗原(HBsAg)的液相蛋白芯片及其制備和使用方法，它將CEA、AFP和HBsAg的特異性抗體偶聯(lián)在不同的熒光微球上，利用生物素或者藻紅蛋白標(biāo)記的檢測抗體以雙抗體夾心法快速定性和定量分析上述三項指標(biāo)。檢測時使用濾膜板，每步反應(yīng)完成后洗板3次，從而增強(qiáng)信號，提高靈敏度。本發(fā)明不僅具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好等優(yōu)點，而且操作簡便，一次只需1μl血清標(biāo)本即可同時檢測三項指標(biāo)，適用于健康體檢和高危人群的普查及臨床檢測，有助于腫瘤的早期診斷和早期治療。文檔編號G01N33/546GK101144815SQ20061012211公開日2008年3月19日申請日期2006年9月13日優(yōu)先權(quán)日2006年9月13日發(fā)明者吳英松,明李,瑋陳申請人:廣州市達(dá)瑞抗體工程技術(shù)有限公司