專利名稱：從生物體液樣本中富集與檢測(cè)稀有細(xì)胞的整合方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及從生物體液樣本中富集與檢測(cè)稀有細(xì)胞的整合方法。
背景技術(shù)：
自從美國(guó)國(guó)家食品藥品管理局于2004年審批通過(guò)美國(guó)Immimicon/ Veridex (Philadelphia, USA)公司的直接捕獲人外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的技術(shù)后，有關(guān)獲取及檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞，循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞，以及某些免疫細(xì)胞的重要的科研及臨床意義已不斷的被廣泛報(bào)道(Cristofanilli et al，2004 New Eng J. Med. 351 :781 ；Braun and Marth，2004 New Eng. J. Med. 351 :824).然而這種利用抗體偶聯(lián)磁珠直接捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法有著盡人皆知的缺點(diǎn) (Mocellin et al，2006 Trends in Molecular Medicinel2 :130)鑒于腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)的異質(zhì)性，所以許多腫瘤細(xì)胞不能被此種方法所捕獲，這已被許多臨床病例所證明；除此之外，由于腫瘤細(xì)胞被抗體偶聯(lián)的磁珠“觸及”并被刺激，致使這些捕獲的被大量免疫顆粒包被的腫瘤細(xì)胞已不再是處于自然狀態(tài)的細(xì)胞，從而很難對(duì)其進(jìn)行后續(xù)分析與研究。有鑒于此，人們開(kāi)始尋求其它的替代手段以獲取循環(huán)稀有細(xì)胞。與直接捕獲細(xì)胞技術(shù)相比， 現(xiàn)已公認(rèn)通過(guò)去除紅細(xì)胞及白細(xì)胞從而達(dá)到富集循環(huán)稀有細(xì)胞的方法是最為有效可行的替代手段。雖然某些去除或分離特定細(xì)胞群的單一實(shí)驗(yàn)方法已經(jīng)有所報(bào)道，諸如密度離心法(U. S. Pat. No. 4，927，750)，免疫磁性顆粒法(U. S. Pat. No. 4，177，145)，紅細(xì)胞裂解法，以及必須借助特殊細(xì)胞分離管的免疫磁性顆粒與密度離心的初步結(jié)合方法(U. S. Pat. No. 5，840，50 ，但所有這些方法已被證明耗時(shí)長(zhǎng)，白細(xì)胞及紅細(xì)胞去除率低，靶細(xì)胞回收率低，以及因需要某些特殊器材而帶來(lái)的操作不便?；谏鲜鲈?，本發(fā)明對(duì)現(xiàn)有的幾種互不關(guān)聯(lián)的技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化組合，從而提供了一套新穎獨(dú)特的整合方法，包括去除血漿蛋白， 加紅細(xì)胞裂解，加抗體包被的免疫微球，加基于獨(dú)特的細(xì)胞分離介質(zhì)而成的密度離心分離方法。源于此一獨(dú)特的整合試驗(yàn)方法的不可預(yù)知的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)被證明能夠非?？焖俑咝Ъ案咛禺愋缘氐厝コ獫{蛋白，白細(xì)胞及紅細(xì)胞，從而達(dá)到有效富集循環(huán)稀有細(xì)胞的目的， 而且可以始終維持很高的稀有細(xì)胞回收率。迄今為止，人們所采用的所有有關(guān)從富集樣品中檢測(cè)循環(huán)稀有細(xì)胞包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞及剩余白細(xì)胞的方法都是基于免疫熒光染色。然而，其不可避免的高非特異染色信號(hào)， 昂貴的熒光顯微鏡，以及必需但不便利的工作環(huán)境(例如暗室)極大地限制了基于免疫熒光法進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞及循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞檢測(cè)工作的開(kāi)展。本發(fā)明提供了基于堿性磷酸酶和過(guò)氧化物酶酶標(biāo)抗體的特異組合進(jìn)行雙色或多色染色，從而達(dá)到檢測(cè)富集的循環(huán)稀有細(xì)胞的目的。經(jīng)此新方法染色過(guò)的循環(huán)稀有細(xì)胞具有很好的細(xì)胞形態(tài)，并可借助普通光學(xué)顯微鏡或掃描儀進(jìn)行觀察與分析，從而能快速簡(jiǎn)便地從剩余白細(xì)胞中檢測(cè)出富集的循環(huán)稀有細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一套新穎獨(dú)特的整合方法包括去除血漿蛋白，紅細(xì)胞裂解，加入免疫微球或免疫材料以去除白細(xì)胞，加入基于獨(dú)特的細(xì)胞分離介質(zhì)而成的密度離心以從生物體液標(biāo)本中分離循環(huán)稀有細(xì)胞。由濃縮與富集構(gòu)成的本方法能夠快速地從生物體液標(biāo)本， 如外周血中，富集循環(huán)稀有細(xì)胞，且回收率高。富集的細(xì)胞具有可用于影像學(xué)分析的很好的細(xì)胞形態(tài)。同時(shí)，病人標(biāo)本中的大部分白細(xì)胞亦可被高效回收以應(yīng)用于其它研究分析，例如基因譜的研究。在本項(xiàng)發(fā)明中，任何特殊器材如細(xì)胞分離管或磁鐵均不需要。本發(fā)明中，從人或動(dòng)物收集的所述生物體液標(biāo)本包括但并不局限于以下來(lái)源外周循環(huán)血，臍帶血，尿液，精液，骨髓，羊水，脊髓及胸腔積液，腹水，痰液，處理過(guò)并/或勻漿化的人或動(dòng)物組織，培養(yǎng)的人或動(dòng)物細(xì)胞。所述免疫微球由特異性識(shí)別白細(xì)胞標(biāo)示物的抗體與微球表面進(jìn)行共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)而形成，所述微球的表面可經(jīng)過(guò)或沒(méi)有經(jīng)過(guò)化學(xué)處理以適于與蛋白質(zhì)相偶聯(lián)，所述微球的直徑介于10納米-100微米，即IOnm-IOO μ m，所述微球包含或部分包含任何一種下列成份二氧化硅(silica)，右旋糖苷(dextran)，瓊脂糖(s印harose，agarose)，或交聯(lián)葡聚糖(sephadex)。用于制備所述免疫微球的微球?yàn)榇判曰蚍谴判浴Ｔ诒景l(fā)明中，用于制備免疫微球的抗體特異性地識(shí)別下述但不局限于這些白細(xì)胞表面標(biāo)示物:CD3,⑶31，⑶34，⑶45，⑶50，⑶69，CD84，或CD102等。制備免疫微球過(guò)程中， 或是識(shí)別這些CD分子中的任意一種的抗體，或是識(shí)別這些CD分子中任意兩種或兩種以上的抗體的組合與任何適宜偶聯(lián)的固體表面進(jìn)行共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)，例如直徑介于10納米到100微米(IOnm-IOOym)的磁性或非磁性微球。本發(fā)明中，所述免疫吸附劑是將任何經(jīng)過(guò)或沒(méi)有經(jīng)過(guò)化學(xué)處理的適宜結(jié)合蛋白的固體表面如硅玻璃片(Silicon glass slide)與配體(Iigand)或特異的單克隆或多克隆抗體包括抗白細(xì)胞表面標(biāo)示物如CD45的抗體進(jìn)行共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)而制備而成。本發(fā)明中，所述獨(dú)特的細(xì)胞分離介質(zhì)在20 °C溫度下比重范圍介于 1.07256-1. 07638克/毫升(gr/ml or gr/cm3)，這一特定范圍內(nèi)的密度適于將幾乎所有有核細(xì)胞與紅細(xì)胞及免疫微球進(jìn)行分離。所述細(xì)胞分離介質(zhì)包含下列任何一種或任意兩種或兩種以上的試劑成份聚乙烯吡咯烷包被的膠質(zhì)二氧化硅(polyvinylpyrrolidinecoated colloidal silica)；多聚糖(polysucrose)力口泛景i酸納(sodiumdiatrizoate)或其衍生物；由蔗糖和表氯醇組成的非離子聚合物(nonionic polymer consisting of sucrose and epichlorohydrin)；或任何一種含糖的溶液，如右旋糖苷或蔗糖(sucrose)；碘化小分子化合物(如甲泛影酰胺(metrizamide))；或任意蛋白溶液，所述細(xì)胞分離介質(zhì)的比重可用任何滲透壓介于280-320m0sm/kg H20, pH6. 8-7. 8的緩沖液在20°C溫度下調(diào)制在 1.07256-1. 07638克/毫升(gr/ml or gr/cm3)范圍內(nèi)。所述免疫微球的比重高于所述細(xì)胞分離介質(zhì)的比重?；谒黾?xì)胞分離介質(zhì)的離心在普通商品化的離心管內(nèi)進(jìn)行。本發(fā)明的用于從生物體液中富集稀有細(xì)胞的方法還包括，將通過(guò)基于所述細(xì)胞分離介質(zhì)的離心得到的沉積細(xì)胞以上的所有上清液全部收集。本發(fā)明的用于從生物體液中富集稀有細(xì)胞的方法，其中，所述裂解紅細(xì)胞以去除紅細(xì)胞的步驟在所述加入免疫微球或免疫吸附劑進(jìn)行孵育的步驟之前、之后或者同時(shí)進(jìn)行。如果本發(fā)明的方法不包括加入紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行紅細(xì)胞裂解的步驟，則可以通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的離心來(lái)分離去除紅細(xì)胞。本發(fā)明方法富集的循環(huán)稀有細(xì)胞可以應(yīng)用于以下方面通過(guò)免疫熒光或免疫組化加普通光學(xué)顯微鏡或可見(jiàn)光掃描儀對(duì)所述富集的循環(huán)稀有細(xì)胞的計(jì)數(shù)；PCR ；流式細(xì)胞儀檢測(cè)；基因表達(dá)譜分析；蛋白表達(dá)譜分析；酶學(xué)測(cè)定；腫瘤病人體外化療藥物的篩選；有關(guān)腫瘤病人化療方案的制定與指導(dǎo)化療的進(jìn)行；對(duì)腫瘤病人體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞使用化療藥物及 /或一種或多種治療腫瘤抗體效果的評(píng)估；體內(nèi)或體外培養(yǎng)富集的稀有細(xì)胞；在富集的稀有細(xì)胞上鑒定及確認(rèn)現(xiàn)有的或新發(fā)現(xiàn)的腫瘤細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)示物；富集的稀有細(xì)胞應(yīng)用于臨床治療；監(jiān)測(cè)腫瘤病人的腫瘤復(fù)發(fā)；開(kāi)發(fā)新的治療腫瘤的藥物；作為腫瘤診斷的輔助手段；健康人群體檢；以及基于循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞的有關(guān)心臟病的診斷與治療。迄今所有檢測(cè)循環(huán)稀有細(xì)胞的技術(shù)手段都基于免疫熒光方法。但來(lái)源于熒光染料自身負(fù)電荷引起的與靶細(xì)胞的非特異結(jié)合這一主要缺點(diǎn)卻無(wú)可避免。此一缺點(diǎn)給人們?cè)趨^(qū)分真假陽(yáng)性染色信號(hào)的過(guò)程中帶來(lái)了極大的困擾。本發(fā)明提供了一整套優(yōu)化過(guò)的新穎的基于免疫組化的多色染色方法，從而能夠克服免疫熒光帶來(lái)的非特異染色，并使得對(duì)染色的循環(huán)稀有細(xì)胞的檢測(cè)得以在普通光學(xué)顯微鏡下或者基于顯微鏡原理的掃描儀下進(jìn)行。此方法已被證明為一種高特異性，快速，簡(jiǎn)單，低成本的技術(shù)手段，而且不再需要任何熒光染料及昂貴的熒光顯微鏡。本發(fā)明對(duì)富集的稀有細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)的方法還可以包括染色體熒光原位雜交。所述雙色染色是指對(duì)所述稀有細(xì)胞的標(biāo)示物如一種或多種角蛋白，以及白細(xì)胞的標(biāo)示物如CD45分別進(jìn)行染色，所述稀有細(xì)胞和所述白細(xì)胞被染成不同的顏色；所述三色染色是指在所述雙色染色的基礎(chǔ)上對(duì)所述稀有細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行另外一種顏色的染色，或?qū)λ鱿∮屑?xì)胞的其他標(biāo)示物進(jìn)行第三種顏色的染色，所述染色包括將特異性識(shí)別所述稀有細(xì)胞標(biāo)示物的一抗單克隆或多克隆抗體以及特異性識(shí)別所述白細(xì)胞的一抗單克隆或多克隆抗體與所述富集的稀有細(xì)胞進(jìn)行孵育。所述特異性識(shí)別所述稀有細(xì)胞標(biāo)示物的一抗單克隆或多克隆抗體以及所述特異性識(shí)別所述白細(xì)胞標(biāo)示物的一抗單克隆或多克隆抗體分別與不同的小分子相共價(jià)偶聯(lián)，所述小分子選自包括以下物質(zhì)的組羅丹明(rhodamine)，生物素(biotin)，異羥基洋地黃甙 (digoxigenin)，Alexa Fluor 系列分子，F(xiàn)ITC，及 iTexas Red，但不限于這些物質(zhì)。在本發(fā)明的某些具體實(shí)施方式
中，可識(shí)別角蛋白8，18，19或廣譜角蛋白中任意一種或任意兩種或兩種以上的一抗單克隆或多克隆抗體被用于識(shí)別從具有上皮來(lái)源的任何實(shí)體腫瘤脫落入血的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。另外一株可識(shí)別白細(xì)胞表面標(biāo)志CD45的單克隆或多克隆抗體用于白細(xì)胞染色以區(qū)分假陽(yáng)性。所述染色包括加入可特異性識(shí)別所述小分子的與不同的酶相偶聯(lián)的二抗單克隆或多克隆抗體。所述偶聯(lián)的酶是過(guò)氧化物酶，或堿性磷酸酶，所述堿性磷酸酶被用于檢測(cè)所富集的稀有細(xì)胞?？梢栽谳d玻片上或在溶液中對(duì)用本發(fā)明的方法富集的稀有細(xì)胞進(jìn)行染色。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式
中，將抗所述稀有細(xì)胞的標(biāo)示物與抗白細(xì)胞的標(biāo)示物的一抗抗體按任意順序與所述富集的稀有細(xì)胞一起進(jìn)行孵育，或?qū)煞N抗體制備成混合液同時(shí)與所述富集的稀有細(xì)胞進(jìn)行孵育。本發(fā)明中，所述稀有細(xì)胞或其它細(xì)胞既可直接被共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)于任意適宜固體表面的抗體所捕獲，也可通過(guò)本發(fā)明的富集方法所富集。本發(fā)明的染色方法還包括聯(lián)合使用免疫熒光染色與基于免疫組化的染色及可見(jiàn)光下的觀察，所述免疫熒光用于檢測(cè)富集的循環(huán)稀有細(xì)胞，而所述基于免疫組化的染色則用于白細(xì)胞染色。在本發(fā)明的某個(gè)具體實(shí)施方式
中，識(shí)別角蛋白的一抗抗體被標(biāo)記上熒光分子，而抗CD45的一抗則被標(biāo)記上小分子以用于過(guò)氧化物酶催化的基于免疫組化的可見(jiàn)光顏色反應(yīng)。本發(fā)明獨(dú)特的富集與染色兩種方法的結(jié)合可以極大地促進(jìn)檢測(cè)血中稀有細(xì)胞如循環(huán)腫瘤細(xì)胞的普及應(yīng)用。該新穎獨(dú)特的富集與染色方法已被證明成本低，且能快速高效及高特異性地富集并定量檢測(cè)血中的稀有細(xì)胞。本發(fā)明還涉及一種對(duì)富集的稀有細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)的方法，包括進(jìn)行染色體熒光原位雜交，以及利用熒光或普通光學(xué)顯微鏡或基于顯微鏡原理的掃描儀進(jìn)行觀察鑒定。本發(fā)明的目的還在于一種用于從生物體液中富集稀有細(xì)胞的試劑盒，包括紅細(xì)胞裂解液，免疫微球或者免疫吸附劑，獨(dú)特的細(xì)胞分離介質(zhì)。試劑盒還包括說(shuō)明書(shū)用于說(shuō)明試劑盒的使用。本發(fā)明還涉及一種用于檢測(cè)富集的稀有細(xì)胞的試劑盒，包括特異性識(shí)別所述稀有細(xì)胞標(biāo)示物的共價(jià)偶聯(lián)了小分子的一抗單克隆或多克隆抗體，可識(shí)別所述小分子的偶聯(lián)了酶的二抗單克隆或多克隆抗體以及所述酶的相應(yīng)底物。該試劑盒可選地包括免疫熒光染料標(biāo)記的抗體。該試劑盒還包括用于染色體熒光原位雜交的探針及試劑。該試劑盒還包括說(shuō)明書(shū)，用于說(shuō)明試劑盒的使用。本發(fā)明還涉及一種用于從生物體液樣本中富集循環(huán)稀有細(xì)胞的自動(dòng)化系統(tǒng)，包括用于自動(dòng)去除血漿蛋白的離心機(jī)，用于自動(dòng)加入紅細(xì)胞裂解液的裝置，用于自動(dòng)加入免疫微球或免疫吸附劑的裝置，用于自動(dòng)加入一種細(xì)胞分離介質(zhì)的裝置，密度離心裝置以及自動(dòng)收集上清的裝置。本發(fā)明還涉及一種對(duì)富集的稀有細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)的自動(dòng)化系統(tǒng)，包括基于免疫組化的雙色或多色染色的裝置，普通光學(xué)顯微鏡或基于顯微鏡原理的自動(dòng)掃描裝置。所述染色裝置包括自動(dòng)加樣器，孵育器和自動(dòng)清洗裝置。名詞解釋稀有細(xì)胞其在采集的體液樣本內(nèi)的所有有核細(xì)胞中的占有比例小于0. 1%0它們包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞，循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞，干細(xì)胞，及某些免疫細(xì)胞等。循環(huán)稀有細(xì)胞循環(huán)稀有細(xì)胞是指存在于體液中的稀有細(xì)胞。生物體液標(biāo)本其為從人或動(dòng)物體中收集的液體，它們包括但并不局限于以下來(lái)源外周循環(huán)血，臍帶血，尿液，精液，骨髓，羊水，脊髓及胸腔積液，腹水，痰液，處理過(guò)的人或動(dòng)物組織，培養(yǎng)的人或動(dòng)物細(xì)胞。紅細(xì)胞裂解(hemolysis)在低滲條件下裂解紅細(xì)胞。免疫組化(IHC)通過(guò)偶聯(lián)于抗體上的酶與底物的反應(yīng)顯現(xiàn)光學(xué)顯微鏡下可觀察到的顏色。
免疫熒光將抗體標(biāo)記熒光分子


圖1是將乳腺癌病人外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞經(jīng)本發(fā)明方法富集后，再經(jīng)本發(fā)明的基于免疫組化的方法進(jìn)行三色染色后獲得的圖像。圖2是用染色體熒光原位雜交方法檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞得到的圖像。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明首次將四種互不關(guān)聯(lián)的單一實(shí)驗(yàn)手段(即去除血漿蛋白，裂解紅細(xì)胞，抗體包被的免疫微球及基于特殊細(xì)胞分離介質(zhì)的密度離心)進(jìn)行了改進(jìn)與優(yōu)化組合從而提供了一套新穎獨(dú)特的可快速高效地從外周血或其它體液樣本中富集循環(huán)稀有細(xì)胞的方法。 富集后的循環(huán)稀有細(xì)胞不需經(jīng)免疫熒光染色，而是用本發(fā)明中由免疫組化優(yōu)化衍生而成的技術(shù)進(jìn)行雙色或多色染色，并可借助普通光學(xué)顯微鏡或掃描儀完成對(duì)染色的稀有細(xì)胞的觀察，圖像采集與分析處理。其中稀有細(xì)胞包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞，循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞，干細(xì)胞，及某些免疫細(xì)胞，其中所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞來(lái)自于具有或不具有上皮來(lái)源的任何實(shí)體瘤，如黑色素瘤。1.用于富集血中循環(huán)稀有細(xì)胞包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞及循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞的方法與試劑本發(fā)明中的技術(shù)手段可從源于體內(nèi)或體外的體液標(biāo)本中富集或分離任意所需的稀有細(xì)胞。體液標(biāo)本包括但并不局限于以下來(lái)源外周循環(huán)血，臍帶學(xué)，尿液，精液，骨髓，羊水，脊髓及胸腔積液，腹水，痰液，處理過(guò)的人或動(dòng)物組織，培養(yǎng)的人或動(dòng)物細(xì)胞。在本發(fā)明的某些具體實(shí)施方式
中，血液被收集于任意一種商品化的采血管中(如 BD, New Jersey, USA ；Cyto-Chex, Iowa, USA)。這些采血管含有任何一種下述抗凝劑枸櫞酸葡萄糖(A⑶)，乙二胺四乙酸(EDTA)，肝素(h印arin)等。標(biāo)本應(yīng)在72小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行處理。在本發(fā)明的其它某些具體實(shí)施方式
中，本方法將去除血漿蛋白，裂解紅細(xì)胞，加入抗體包被的免疫磁珠，及基于特殊細(xì)胞分離介質(zhì)的密度離心進(jìn)行了組合優(yōu)化從而可有效地去除血漿蛋白，紅細(xì)胞和白細(xì)胞。作為替代手段，富集手段也可簡(jiǎn)化為由兩個(gè)步驟組成，即免疫微球加紅細(xì)胞裂解；或免疫微球加基于特殊細(xì)胞分離介質(zhì)的密度離心。不同于其它常規(guī)的用密度離心法分離細(xì)胞后只能費(fèi)時(shí)費(fèi)力且非精確地收集不同比重的分界相溶液，本發(fā)明中沉積細(xì)胞以上的所有上清液全部被收集。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，免疫微球的制備是將單克隆或多克隆抗體與任何經(jīng)過(guò)或沒(méi)有經(jīng)過(guò)化學(xué)處理的適宜結(jié)合蛋白的固體表面(例如直徑介于IOnm-IOO μ m的微球)進(jìn)行共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)。這些微球包含或部分包含任何一種下列成份二氧化硅(silica)，右旋糖苷(dextran)，瓊脂糖(s印harose，agarose)，或交聯(lián)葡聚糖(s印hadex)。這些微球可以是磁性的，也可為非磁性的。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，免疫微球可由免疫吸附劑所替代。免疫吸附劑的制備是將特異的單克隆或多克隆抗體與任何經(jīng)過(guò)或沒(méi)有經(jīng)過(guò)化學(xué)處理的適宜結(jié)合蛋白的固體表面進(jìn)行共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)，如硅玻璃片(silicon glass slide).在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，用于密度離心的特殊細(xì)胞分離介質(zhì)具有特定范圍的比重，S卩1.07256-1. 07638克/毫升(gr/ml or gr/cm3)，在此比重范圍內(nèi)的細(xì)胞分離介質(zhì)可用于分離所需的細(xì)胞。本項(xiàng)發(fā)明中的細(xì)胞分離介質(zhì)包含下列任何一種或任意兩種以上的試劑成份聚乙烯吡咯烷包被的膠質(zhì)二氧化硅(polyvinylpyrrolidinecoated colloidal silica)；多聚糖(polysucrose)加泛影酸鈉或其衍生物；由蔗糖和表氯醇組成的非離子聚合物(nonionic polymerconsisting of sucrose and epichlorohydrin)； 任何一種含糖的溶液，如右旋糖苷或蔗糖(sucrose)；碘化小分子化合物(如甲泛影酰胺(metrizamide))；和/或任意蛋白溶液。細(xì)胞分離介質(zhì)的比重可用任何滲透壓介于 280-320m0sm/kg H20, pH 6. 8-7. 8 的緩沖液調(diào)制而成。免疫微球的比重高于細(xì)胞分離介質(zhì)的比重。在本發(fā)明的實(shí)施方法中，血漿蛋白可用離心方法去除。本發(fā)明中首次使用紅細(xì)胞裂解法與基于特殊細(xì)胞分離介質(zhì)的密度離心相結(jié)合以快速高效地去除紅細(xì)胞。本發(fā)明中首次使用免疫微球與基于特殊細(xì)胞分離介質(zhì)的密度離心相結(jié)合以快速高效地去除白細(xì)胞。作為替代手段，本發(fā)明中的去除白細(xì)胞亦可簡(jiǎn)化為只使用免疫微球或免疫吸附劑。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，用于制備免疫微球或免疫吸附劑的抗體既可以是特異性地識(shí)別任意下述白細(xì)胞表面標(biāo)示物的一種抗體，或是識(shí)別任意兩種或兩種以上下述白細(xì)胞表面標(biāo)示物的抗體CD3，CD31, CD34, CD45, CD50, CD69, CD84，或 CD102 等。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，紅細(xì)胞與白細(xì)胞的去除可以以任意適宜的順序進(jìn)行。它們既可同時(shí)去除，亦可紅細(xì)胞或白細(xì)胞先被去除。富集的循環(huán)稀有細(xì)胞可用于一系列后續(xù)分析，包括免疫熒光分析，基于免疫組化的染色分析，PCR，體外或體內(nèi)培養(yǎng)富集的循環(huán)稀有細(xì)胞等。2.檢測(cè)富集的循環(huán)稀有細(xì)胞包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞目前所有發(fā)表的有關(guān)檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法都基于免疫熒光染色。然而免疫熒光染色不可避免的主要缺點(diǎn)，即人們熟之為“鬼影”的非特異性染色卻給人們?cè)谂袛嗾婕訇?yáng)性細(xì)胞的過(guò)程中帶來(lái)了極大的困擾。本發(fā)明提供了一整套優(yōu)化后的基于免疫組化的多色染色方法。通過(guò)本發(fā)明試驗(yàn)手段富集的循環(huán)稀有細(xì)胞經(jīng)此方法染色后，可極大地消除非特異染色。此染色方法與普通光學(xué)顯微鏡相結(jié)合，為不同領(lǐng)域的人們開(kāi)展檢測(cè)循環(huán)稀有細(xì)胞提供了極大的便利。在本發(fā)明的某一具體實(shí)施方式
中，經(jīng)本方法富集的循環(huán)稀有細(xì)胞用2%多聚甲醛 (paraformaldehyde)固定。在本發(fā)明的其它具體實(shí)施方式
中，可識(shí)別角蛋白8，18，19或廣譜角蛋白中任意一種或任意兩種或兩種以上的一抗單克隆或多克隆抗體被用于識(shí)別循環(huán)腫瘤細(xì)胞，這些血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞脫落于具有上皮來(lái)源的任何實(shí)體瘤。另外一株可識(shí)別白細(xì)胞表面標(biāo)志CD45 的單克隆或多克隆抗體被用于區(qū)分假陽(yáng)性。在本發(fā)明的其它一些具體實(shí)施方式
中，抗角蛋白或CD45的一抗單克隆或多克隆抗體分別與下述任意一種小分子進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)，它們包括但不局限于羅丹明 (rhodamine)，生物素(biotin)，異羥基洋地黃甙(digoxigenin)，Alexa Fluor 系列分子， FITC，及 iTexasRed 等。
在本發(fā)明的其它具體實(shí)施方式
中，可特異識(shí)別標(biāo)記在一抗抗體上的小分子的二抗單克隆或多克隆抗體分別與堿性磷酸酶，過(guò)氧化物酶或其它酶相共價(jià)偶聯(lián)。在本發(fā)明的某個(gè)具體實(shí)施方式
中，作為另外一種選擇的替代方法，免疫熒光可與經(jīng)可見(jiàn)光識(shí)別的免疫組化法相結(jié)合。在此方法中，識(shí)別角蛋白的一抗單克隆或多克隆抗體被標(biāo)記上任何顏色的熒光分子，如Alexa Fluor系列，Quantum dot, FITC等，而抗⑶45的一抗被標(biāo)記上上述小分子以用于過(guò)氧化物酶催化的免疫組化可見(jiàn)光顏色反應(yīng)。這種組合可極大地降低由免疫熒光引起的白細(xì)胞表面標(biāo)示物CD45的非特異染色。自動(dòng)染色裝置包括自動(dòng)加樣裝置，孵育裝置和自動(dòng)清洗裝置。實(shí)施例實(shí)施例1.從乳腺癌病人外周血中富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞采集5ml人外周血于含有乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝劑的采血管中(BD，New Jersey,USA) 0離心血樣(700xg，10分鐘)后，可以使用吸液管或者自動(dòng)吸液裝置來(lái)吸除上清以去掉血漿蛋白。將離心后得到的沉淀物重懸于30毫升紅細(xì)胞裂解液(BD Pharmingen, California,USA)后，孵育20分鐘。進(jìn)行標(biāo)本離心(700xg，10分鐘)以便分離出在上清液中的被裂解的紅細(xì)胞碎片。去掉上清后，將沉淀物(即沉積細(xì)胞)重懸于5毫升磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)。向其中加入0. 5毫升包被有抗白細(xì)胞表面抗原例如CD45的單克隆抗體的磁珠后(Invitrogen，California, USA)，室溫孵育30分鐘。將所有反應(yīng)液加到普通50毫升離心管內(nèi)的5毫升細(xì)胞分離介質(zhì)的頂層，離心400xg，10分鐘。收集所有上清液。上清液離心900xg，10分鐘。離心后得到的沉積細(xì)胞重懸于磷酸鹽緩沖液后可做進(jìn)一步分析。該實(shí)施例中的細(xì)胞分離介質(zhì)是這樣制備的5.7%多聚糖(polysucrose)與 9%泛影酸鈉(Sigma，Missouri, UDA)的混合物在高精度數(shù)字密度儀(型號(hào)DMA 4500， Anton-Paar，Virginia，USA)于 20°C監(jiān)測(cè)下，用 PBS 將其密度調(diào)至成 1. 07256-1. 07638 克 / 毫升(gr/ml or gr/cm3)。實(shí)施例2.三色法染色從乳腺癌病人外周血中富集的循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集的循環(huán)腫瘤細(xì)胞置于載玻片上，用由磷酸鹽緩沖液配制而成的2%多聚甲醛(paraformaldehyde)室溫固定2小時(shí)后，用磷酸鹽緩沖液沖洗3遍。細(xì)胞與含生物素 (Pierce, Illinois, USA)標(biāo)記的抗角蛋白 8+18+19 單克隆抗體(Abeam, UK, 1 μ g/ml)及羅丹明(Pierce，Illinois, USA)標(biāo)記的抗CD45單克隆抗體(Abcam，UK, 1 μ g/ml)混合液(由磷酸鹽緩沖液稀釋而成)在室溫孵育30分鐘。載玻片用磷酸鹽緩沖液沖洗3遍后，與含堿性磷酸酶標(biāo)記的抗生物素單抗(Sigma，Missouri, USA, 1 μ g/ml)及過(guò)氧化物酶(Pierce，Illinois, USA)標(biāo)記的抗羅丹明單抗(Abcam，UK, 1 μ g/ml)混合液(由磷酸鹽緩沖液稀釋而成)室溫孵育30分鐘。載玻片用磷酸鹽緩沖液沖洗3遍后，用Vector Laboraories (California, USA)出產(chǎn)的紅色速染細(xì)胞核試劑盒，堿性磷酸酶及過(guò)氧化物酶底物試劑盒進(jìn)行顯色反應(yīng)。染色結(jié)果見(jiàn)附圖。參見(jiàn)附圖1，通過(guò)本發(fā)明中的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)乳腺癌病人外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行富集后，再用基于免疫組化的三色染色法進(jìn)行染色。圖中所示為普通光學(xué)顯微鏡下觀察到的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。大細(xì)胞乳腺癌細(xì)胞(tumor cell)，其角蛋白染成藍(lán)色，細(xì)胞核為粉紅色；小細(xì)胞白細(xì)胞(WBC)，其表面CD45被染成棕色。實(shí)施例3.染色體熒光原位雜交法檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞
將富集的腫瘤細(xì)胞作為標(biāo)本置于載玻片上。染色后的標(biāo)本用20毫克/毫升的RNA 酶處理1小時(shí)后，使用SSC緩沖液漂洗玻片。標(biāo)本用無(wú)水乙醇脫水10分鐘后，加熱到70°C 持續(xù)5分鐘變性。標(biāo)本再用無(wú)水乙醇脫水10分鐘，并于45°C與探針雜交孵育過(guò)夜。標(biāo)本用SSC緩沖液洗滌后，用熒光顯微鏡觀察。該標(biāo)本可以是經(jīng)實(shí)例2中的方法染色后的富集腫瘤細(xì)胞，進(jìn)行染色體熒光原位雜交的目的是進(jìn)一步確定基于免疫組化的三色染色檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的真實(shí)性。為了便于快速診斷，標(biāo)本亦可不經(jīng)抗體染色，而直接進(jìn)行染色體熒光原位雜交。染色體熒光原位雜交的結(jié)果見(jiàn)附圖2。細(xì)胞的染色體顯示為紅色和綠色。從紅色或綠色的數(shù)目可以判斷是否染色體發(fā)生變異，是否為腫瘤細(xì)胞。實(shí)施例4.檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞應(yīng)用于臨床快速評(píng)估抗腫瘤化療藥物的療效及腫瘤復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)目前臨床上評(píng)估化療藥物的療效的常用方法是每3個(gè)月為病人做一次CT檢查。如此長(zhǎng)的時(shí)間間隔對(duì)與那些化療效果不佳的病人所造成的傷害是致命性的。而每1-2周進(jìn)行的檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞則在化療開(kāi)始2-4周后即可為醫(yī)生提供準(zhǔn)確的評(píng)估數(shù)據(jù)。循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目的降低意味著化療藥物的有效性。反之，如果循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有明顯的改變甚至增高，則意味著病人需接受不同的化療藥物治療。腫瘤復(fù)發(fā)意味著原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶的腫瘤又進(jìn)入了活躍期。此時(shí)病人血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目會(huì)明顯升高。對(duì)經(jīng)過(guò)治療后出院的腫瘤病人進(jìn)行長(zhǎng)期的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的跟蹤觀察(一般為每3個(gè)月檢查一次)，可以為早期判斷腫瘤是否復(fù)發(fā)提供非常用力的證據(jù)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明了，上述優(yōu)選實(shí)施例只是對(duì)本發(fā)明的具體說(shuō)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)需要可以對(duì)其進(jìn)行多種改進(jìn)，組合，亞組合以及變換，所有的改進(jìn)， 組合，亞組合、變換以及等效替換都落入在所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種對(duì)富集的稀有細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)的方法，包括基于免疫組化的染色與免疫熒光相結(jié)合，或基于免疫組化的雙色、三色、或多色染色，以及利用熒光或普通光學(xué)顯微鏡或基于顯微鏡原理的掃描儀進(jìn)行觀察鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，還包括染色體熒光原位雜交。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述雙色染色是指對(duì)所述稀有細(xì)胞的標(biāo)示物如一種或多種角蛋白，以及白細(xì)胞的標(biāo)示物如CD45分別進(jìn)行染色，所述稀有細(xì)胞和所述白細(xì)胞被染成不同的顏色；所述三色染色是指在所述雙色染色的基礎(chǔ)上對(duì)所述稀有細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行另外一種顏色的染色，或?qū)λ鱿∮屑?xì)胞的其他標(biāo)示物進(jìn)行第三種顏色的染色，所述染色包括將特異性識(shí)別所述稀有細(xì)胞標(biāo)示物的一抗單克隆或多克隆抗體以及特異性識(shí)別所述白細(xì)胞的一抗單克隆或多克隆抗體與所述富集的稀有細(xì)胞進(jìn)行孵育。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述特異性識(shí)別所述稀有細(xì)胞標(biāo)示物的一抗單克隆或多克隆抗體以及所述特異性識(shí)別所述白細(xì)胞標(biāo)示物的一抗單克隆或多克隆抗體分別與不同的小分子相共價(jià)偶聯(lián)，所述小分子選自以下物質(zhì)羅丹明、生物素、異羥基洋地黃甙、Alexa Fluor系列分子、FITC、及Texas Red，以及類(lèi)似物質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述染色包括加入可特異性識(shí)別所述小分子的與不同的酶相偶聯(lián)的二抗單克隆或多克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，所述偶聯(lián)的酶是過(guò)氧化物酶，或堿性磷酸酶，所述堿性磷酸酶被用于檢測(cè)所富集的稀有細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括聯(lián)合使用免疫熒光染色與基于免疫組化的染色及可見(jiàn)光下的觀察，所述免疫熒光用于檢測(cè)所述富集的稀有細(xì)胞，而所述基于免疫組化的染色則用于白細(xì)胞染色。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，將抗所述稀有細(xì)胞的標(biāo)示物與抗白細(xì)胞的標(biāo)示物的一抗抗體按任意順序與所述富集的稀有細(xì)胞一起進(jìn)行孵育，或?qū)煞N抗體制備成混合液同時(shí)與所述富集的稀有細(xì)胞進(jìn)行孵育。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，在載玻片上或在溶液中對(duì)所述富集的稀有細(xì)胞進(jìn)行染色。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述稀有細(xì)胞或其它細(xì)胞既可直接被共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)于任意適宜固體表面的抗體所捕獲，也可從生物體液樣本中富集。
11.一種對(duì)富集的稀有細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)的方法，包括進(jìn)行染色體熒光原位雜交，以及利用熒光或普通光學(xué)顯微鏡或基于顯微鏡原理的掃描儀進(jìn)行觀察鑒定。
12.一種用于檢測(cè)富集的稀有細(xì)胞的試劑盒，包括特異性識(shí)別所述稀有細(xì)胞標(biāo)示物的共價(jià)偶聯(lián)了小分子的一抗單克隆或多克隆抗體，可識(shí)別所述小分子的偶聯(lián)了酶的二抗單克隆或多克隆抗體以及所述酶的相應(yīng)底物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的試劑盒，還包括免疫熒光染料標(biāo)記的抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的試劑盒，還包括用于染色體熒光原位雜交的探針及試劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求12至14中任一項(xiàng)所述的試劑盒，還包括說(shuō)明書(shū)，用于說(shuō)明試劑盒的使用。
16.一種對(duì)富集的稀有細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)的自動(dòng)化系統(tǒng)，包括基于免疫組化的雙色或多色染色的裝置，普通光學(xué)顯微鏡或基于顯微鏡原理的自動(dòng)掃描裝置。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的自動(dòng)化系統(tǒng)，所述染色裝置包括自動(dòng)加樣器，孵育器和自動(dòng)清洗裝置。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種對(duì)富集的稀有細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)的方法，包括進(jìn)行基于免疫組化的染色與免疫熒光相結(jié)合，或基于免疫組化的雙色、三色、或多色染色，以及利用熒光或普通光學(xué)顯微鏡或基于顯微鏡原理的掃描儀進(jìn)行觀察鑒定。本發(fā)明新穎獨(dú)特的富集與染色方法已被證明成本低，且能快速高效及高特異性地富集并定量檢測(cè)血中的稀有細(xì)胞。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102313813SQ20111018266
公開(kāi)日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2008年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月20日
發(fā)明者林平 申請(qǐng)人:北京萊爾生物醫(yī)藥科技有限公司