專利名稱：一種檢測食品中腐敗菌氨基酸脫羧酶活性的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于農產品技術研究領域，具體涉及食品中腐敗菌氨基酸脫羧酶活性的檢測方法。
背景技術：
生物胺是由于微生物的活動使得某些氨基酸發(fā)生脫羧化而產生的一類低分子有機堿。適量的生物胺有助于人類及動物的正常生理功能，然而人體器官內生物胺含量過度增加則會干擾神經、胃腸道系統(tǒng)以及血壓的正常功能。某些生物胺還是亞硝胺的前體，后者具有致癌效應，因此消費者攝入較多的生物胺會對健康帶來不良影響。肉制品中的某些腐敗微生物會在氨基酸脫羧酶的作用下使得游離氨基酸發(fā)生脫羧反應形成生物胺，從而給產品的安全性帶來隱患。只有弄清產生生物胺的主要微生物組成，才能有針對性地采取保鮮措施，控制生物胺的累積。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種食品中腐敗菌氨基酸脫羧酶活性的快速檢測方法。本發(fā)明包括以下步驟
1)從食品中分離出腐敗菌，經發(fā)酵取得菌株發(fā)酵液，將菌株發(fā)酵液按照1%接種量接種到含有氨基酸的液體培養(yǎng)基中，取得生物胺檢測用腐敗菌發(fā)酵液，再通過離心取得無菌體的上清，在上清和生物胺混合標準溶液中分別加入Na2HPCV NaOH和丹磺酰氯溶液，然后在 55°C水浴避光條件下分別取得腐敗菌生物胺的衍生樣品和標準生物胺的衍生樣品；
2)將G60硅膠板在105°C下活化；
3)將由氯仿、乙醚和三乙胺混合制成的展開劑預飽和；
4)使用自動點樣臺點樣，腐敗菌生物胺的衍生樣品和標準生物胺的衍生樣品的上樣量為2PL，間隔1.5cm，待樣點干燥后，置入展開槽內，待展開劑擴展到距樣點17cm處取出，通風廚內干燥，在366nm紫外燈下使用自動凝膠成像分析分別拍照，通過比對，根據(jù)Rf值確定樣品中生物胺的種類，判斷菌株的氨基酸脫羧酶活性。本發(fā)明提供了一種食品中腐敗菌菌株氨基酸脫羧酶活性的快速檢測方法，該方法具有以下的優(yōu)點
(1)方便快捷，成本較低，需要的配套設備較低，普通實驗室以及食品企業(yè)的品控部門都可以進行該試驗。(2)各種生物胺的分離效果較好，并且對生物胺的檢測限同高效液相色譜的檢測限可媲美，可以準確實現(xiàn)對生物胺的定性檢測。本發(fā)明所述含有氨基酸的液體培養(yǎng)基是將L-賴氨酸鹽酸鹽、L-酪氨酸二鈉鹽、 L-苯丙氨酸、L-組氨酸鹽、L-精氨酸、L-鳥氨酸鹽酸鹽和L-色氨酸加入選擇性培養(yǎng)基中滅菌取得，其中每IOOOmL選擇性培養(yǎng)基中加入的L-賴氨酸鹽酸鹽、L-酪氨酸二鈉鹽、L-苯丙氨酸、L-組氨酸鹽、L-精氨酸、L-鳥氨酸鹽酸鹽和L-色氨酸分別為lg。
本發(fā)明所述生物胺檢測用腐敗菌發(fā)酵液的取得方法是將篩選好的菌株的在其適宜的培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)，等單菌落長出后挑選單菌落到不含氨基酸前體的液體培養(yǎng)基中， 適溫下培養(yǎng)1 后，再按照1%接種量轉接到含有氨基酸的液體培養(yǎng)基中，適溫下培養(yǎng)4飛天后獲得。本發(fā)明中，將生物胺檢測用腐敗菌發(fā)酵液在低溫條件下IOOOOrpm離心5min，取無菌體的上清，并將該上清500μ 和生物胺混合標準溶液分別與500μ 0. 25mol/L的Na2HPO4, 50μ 4mol/L的NaOH，ImL 2. 5mg/L的丹磺酰氯溶液加入離心管，然后在離心管外邊包上錫箔紙避光，放入到55°C水浴鍋中避光衍生lh，分別取得腐敗菌生物胺的衍生樣品和標準生物胺的衍生樣品，并將分別取得腐敗菌生物胺的衍生樣品和標準生物胺的衍生樣品置于 4°C保存。本發(fā)明所述氯仿、乙醚和三乙胺的混合投料體積比為8 1 2。


圖1為不同濃度的混合生物胺標準品的衍生樣品的薄層層析檢測后的紫外成像圖。圖2為部分單一生物胺標準品的衍生樣品的薄層層析檢測后的紫外成像圖。圖3為腐敗菌發(fā)酵液中生物胺衍生樣品的薄層層析檢測后的紫外成像圖。圖4為鹽水鴨樣品中某些腐敗菌發(fā)酵液中生物胺檢測的高效液相色譜圖。圖5為鹽水鴨樣品中某些腐敗菌發(fā)酵液中生物胺檢測的高效液相色譜圖。圖6為本發(fā)明的操作步驟圖。
具體實施例方式下邊結合圖6對本發(fā)明提出的一種食品中腐敗菌菌株氨基酸脫羧酶活性的快速檢測方法進行詳細的說明。一、普通需氧菌的檢測
1、準確稱取色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺的標準品各50mg， 用0. 4mol/L的高氯酸(HClO4)定容到50mL，配成lmg/mL儲備液備用。分別取以上標準品儲備液，用 0. 4mol/L HClO4 配制成質量濃度分別為 2. 5Pg/mL、5. OPg/mLUO. (^g/mL、25. 0μδ/ mL、5(^g/mL、lOOPg/mL的生物胺混合標準溶液。將制得的不同濃度的生物胺混合標準溶液置于各離心管，在各離心管中加入 500μ 0. 25mol/L 的 Νει2ΗΡ04、50μ 4mol/L 的 NaOH 和 ImL 2. 5mg/L 的丹磺酰氯溶液，在各離心管外邊包上錫箔紙避光，放入到55°C水浴鍋中避光衍生lh，取得標準生物胺的衍生樣品，然后將標準生物胺的衍生樣品置于4°C避光保存?zhèn)溆谩?、無菌條件下從每只鹽水鴨中取5g鴨脖和鴨翅肉，15g鴨胸肉，IOg鴨腿肉及IOg 鴨背肉，共40克混合搗碎，每個鹽水鴨的鴨肉作為一個試驗樣品。無菌條件下取25g樣品加入225mL滅菌生理鹽水(含lg/L蛋白胨、9g/LNaCl)搖床振搖30min后，取ImL上清液依次進行10倍梯度稀釋，選擇合適的稀釋度涂布于平板計數(shù)(PCA)培養(yǎng)基中，于37°C下培養(yǎng)48h，挑選特征性菌落進行劃線分離，然后將純化好的菌落接種到PCA液體培養(yǎng)中，37 V 220rpm振蕩培養(yǎng)12h，取得菌株發(fā)酵液。
3、分別稱取0. Ig的L-賴氨酸鹽酸鹽、L-酪氨酸二鈉鹽、L-苯丙氨酸、L-組氨酸鹽、L-精氨酸、L-鳥氨酸鹽酸鹽和L-色氨酸，并分別加入到IOOmL PCA液體培養(yǎng)基中滅菌， 取得含有氨基酸的PCA液體培養(yǎng)基。將上述步驟2培養(yǎng)好的菌株發(fā)酵液按照1%接種量接種到含有氨基酸的PCA液體培養(yǎng)基中，220rpm振蕩培養(yǎng)4到6天，取得發(fā)酵液。4、將步驟3獲得的發(fā)酵液低溫下IOOOOrpm離心5min，取無菌體的上清500μ ， 加入到 IOmL 離心管中，再加入 500μ 0. 25mol/L 的 Na2HPO4,50μ 4mol/L 的 NaOH 和 ImL 2. 5mg/L的丹磺酰氯溶液，在離心管外邊包上錫箔紙避光，放入到55°C水浴鍋中避光衍生 lh，得到腐敗菌生物胺的衍生樣品，然后將腐敗菌生物胺的衍生樣品置于4°C避光保存。5、預先配好由氯仿、乙醚和三乙胺以體積比例為8 1 2混合成的展開液。先將G60硅膠板(5cm*10cm)在105°C下活化lh。將配好的25mL展開劑倒入展開缸中預飽和0.釙。使用自動點樣臺點樣，取步驟4制成的腐敗菌生物胺的衍生樣品和步驟1制成的標準生物胺的衍生樣品分別上樣，上樣量為2PL，間隔1.5cm，待樣點干燥后，置入展開槽內，待展開劑擴展到距樣點17cm處取出，通風廚內干燥，在366nm紫外燈下觀察，然后使用自動凝膠成像分析分別拍照。通過比對，確定菌株發(fā)酵中生物胺的種類，從而判斷菌株的氨基酸脫羧酶活性。二、厭氧乳酸菌的檢測
1、準確稱取色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺的標準品各50mg， 用0. 4mol/L的高氯酸(HClO4)定容到50mL，配成lmg/mL儲備液備用。分別取以上標準品儲備液，用 0. 4 mol/LHC104 配制成質量濃度分別為 2. 5Pg/mL、5. OPg/mLUO. (^g/mL、25. 0μδ/ mL、5(^g/mL、lOOPg/mL的生物胺混合標準溶液。將制得的不同濃度的生物胺混合標準溶液分別加入500μ 0. 25mol/L的Na2HP04、 50μ 4mol/L的NaOH和ImL 2. 5mg/L的丹磺酰氯溶液，在離心管外邊包上錫箔紙避光，放入到55°C水浴鍋中避光衍生lh，取得標準生物胺的衍生樣品，然后將標準生物胺的衍生樣品置于4°C避光保存?zhèn)溆谩?、無菌條件下從每只鹽水鴨中取5g鴨脖和鴨翅肉，15g鴨胸肉，IOg鴨腿肉及IOg 鴨背肉，共40克混合搗碎，每個鹽水鴨的鴨肉作為一個試驗樣品。無菌條件下取25 g樣品加入225mL滅菌生理鹽水(含lg/L蛋白胨、9g/LNaCl)搖床振搖30min。取1 mL上清液依次進行10倍梯度稀釋，選擇合適的稀釋度涂布于乳酸菌選擇性培養(yǎng)基(MRS)中，于30°C厭氧培養(yǎng)48h，挑選特征性菌落進行劃線分離，然后將純化好的菌落接種到MRS液體培養(yǎng)中， 30°C培養(yǎng)12h，取得菌株發(fā)酵液。3、分別稱取0. Ig的L-賴氨酸鹽酸鹽、L-酪氨酸二鈉鹽、L-苯丙氨酸、L-組氨酸鹽、L-精氨酸、L-鳥氨酸鹽酸鹽和L-色氨酸，并分別加入到IOOmLMRS液體培養(yǎng)基中滅菌， 取得含有氨基酸的MRS液體培養(yǎng)基。將步驟2培養(yǎng)好的菌株發(fā)酵液按照1%接種量接種到含有氨基酸的MRS液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)4到6天，取得發(fā)酵液。4、將步驟3獲得的發(fā)酵液低溫下IOOOOrpm離心5min，分別取無菌體的上清 500μ ，再加入 500μ 0. 25mol/L 的 Νει2ΗΡ04、50μ 4mol/L 的 NaOH 禾口 ImL 2. 5mg/L 的丹磺酰氯溶液，在離心管外邊包上錫箔紙避光，放入到55°C水浴鍋中避光衍生Ih得到腐敗菌生物胺的衍生樣品，然后將腐敗菌生物胺的衍生樣品置于4°C避光保存。5、預先配好由氯仿、乙醚和三乙胺以體積比例為8 1 2混合成的展開液。先將G60硅膠板(5cm*10cm)在105°C下活化lh。將配好的25mL展開劑倒入展開缸中預飽和0.證。使用自動點樣臺點樣，取步驟4 和步驟1分別制成的樣品分別上樣，上樣量為2PL，間隔1. 5cm，待樣點干燥后，置入展開槽內，待展開劑擴展到距樣點17cm處取出，通風廚內干燥，在366nm紫外燈下觀察，然后使用自動凝膠成像分析分別拍照。通過比對，根據(jù)Rf值確定菌株發(fā)酵液中生物胺的種類，從而判斷菌株的氨基酸脫羧酶活性。圖1至5的分析
圖1為不同濃度的生物胺混合標樣的TLC檢測結果，其中，泳道1到6代表混合標樣中各生物胺濃度分別為 0. 5Pg/mL、l. 0Pg/mL、2. 0Pg/mL、5. OPg/mLUO. OPg/mL 和 20. OPg/mL， 上樣量為2PL。腐胺(Put)；尸胺(Cad)；亞精胺(Spd)；精胺(Spm)；酪胺(Tyr) ；2-苯乙胺 (Phe)0由圖1可見當展開劑氯仿、乙醚、三乙胺比例為8 1 2時，可以將這8種生物胺較為明顯的分離出來。每個生物胺的檢測限值不同，腐胺的檢測限值最低。圖2為部分單一生物胺標準品的TLC分析結果，其中，1為腐胺(Put) ；2為尸胺 (Cad);3為亞精胺(Spd);4為精胺(Spm);5為酪胺(Tyr);6為2-苯乙胺(Phe)。各單標質量濃度為5(^g/mL，上樣量為2PL。由酪胺的標準品檢測也可知，酪胺檢測后存在兩個亮點。由圖2可見當展開劑氯仿、乙醚、三乙胺比例為8:1:2時的單一生物胺標準品的薄層層析分析結果，通過該結果可以確定各生物胺表示的亮點所處的位置。圖3為品中生物胺的檢測結果，從1到6分別對應的是6株乳酸菌發(fā)酵液中生物胺的檢測結果。由圖3可見通過比對Rf值，確定樣品1和樣品3分別含有酪胺和苯乙胺，判斷菌株具備酪氨酸脫羧酶活性和苯丙氨酸脫羧酶活性；樣品4和5含有酪胺，判斷菌株具備酪氨酸脫羧酶活性；而樣品2和6不含有生物胺，判斷菌株不具備氨基酸脫羧酶活性。其中樣品2和6中存在的亮點為發(fā)酵液其他物質的干擾。通過HPLC對處理液中的生物胺進行檢測，驗證了本發(fā)明獲得的結果。圖4為樣品1生物胺處理液的HPLC檢測結果。由圖4可見利用高效液相方法，采用C18譜柱柱，以乙腈和水為流動相梯度洗脫對樣品1生物胺處理液進行檢查，檢測到了酪胺和苯乙胺，驗證了圖3薄層層析的檢測結圖5樣品4生物胺處理液的HPLC檢測結果。由圖5可見利用高效液相方法，采用C18譜柱柱，以乙腈和水為流動相梯度洗脫對樣品4生物胺處理液進行檢查，檢測到了酪胺，驗證了圖3薄層層析的檢測結果。
權利要求
1.一種檢測食品中腐敗菌氨基酸脫羧酶活性的方法，其特征在于包括以下步驟1)從食品中分離出腐敗菌，經發(fā)酵取得菌株發(fā)酵液，將菌株發(fā)酵液按照1%接種量接種到含有氨基酸的液體培養(yǎng)基中，取得生物胺檢測用腐敗菌發(fā)酵液，再通過離心取得無菌體的上清，在上清和生物胺混合標準溶液中分別加入Na2HPCV NaOH和丹磺酰氯溶液，然后在 55°C水浴避光條件下分別取得腐敗菌生物胺的衍生樣品和標準生物胺的衍生樣品；2)將G60硅膠板在105°C下活化；3)將由氯仿、乙醚和三乙胺混合制成的展開劑預飽和；4)使用自動點樣臺點樣，腐敗菌生物胺的衍生樣品和標準生物胺的衍生樣品的上樣量為2PL，間隔1.5cm，待樣點干燥后，置入展開槽內，待展開劑擴展到距樣點17cm處取出，通風廚內干燥，在366nm紫外燈下使用自動凝膠成像分析分別拍照，通過比對，根據(jù)Rf值確定樣品中生物胺的種類，判斷菌株的氨基酸脫羧酶活性。
2.根據(jù)權利要求1所述檢測食品中腐敗菌氨基酸脫羧酶活性的方法，其特征在于所述含有氨基酸的液體培養(yǎng)基是將L-賴氨酸鹽酸鹽、L-酪氨酸二鈉鹽、L-苯丙氨酸、L-組氨酸鹽、L-精氨酸、L-鳥氨酸鹽酸鹽和L-色氨酸加入選擇性培養(yǎng)基中滅菌取得，其中每IOOOmL 選擇性培養(yǎng)基中加入的L-賴氨酸鹽酸鹽、L-酪氨酸二鈉鹽、L-苯丙氨酸、L-組氨酸鹽、 L-精氨酸、L-鳥氨酸鹽酸鹽和L-色氨酸分別為lg。
3.根據(jù)權利要求1所述食品中腐敗菌氨基酸脫羧酶活性的方法，其特征在于所述生物胺檢測用腐敗菌發(fā)酵液的取得方法是將篩選好的菌株的在培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)，等單菌落長出后挑選單菌落到不含氨基酸前體的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1 后，再按照1%接種量轉接到含有氨基酸的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4飛天后獲得。
4.根據(jù)權利要求1所述檢測食品中腐敗菌氨基酸脫羧酶活性的方法，其特征在于將生物胺檢測用腐敗菌發(fā)酵液在低溫條件下IOOOOrpm離心5min，取無菌體的上清，并將該上清500μ 和生物胺混合標準溶液分別與500μ 0. 25mol/L的Na2HPO4, 50μ 4mol/L的 NaOH, ImL 2. 5mg/L的丹磺酰氯溶液加入離心管，然后在離心管外邊包上錫箔紙避光，放入到55°C水浴鍋中避光衍生lh，分別取得腐敗菌生物胺的衍生樣品和標準生物胺的衍生樣品，并將分別取得腐敗菌生物胺的衍生樣品和標準生物胺的衍生樣品置于4°C保存。
5.根據(jù)權利要求1所述檢測食品中腐敗菌氨基酸脫羧酶活性的方法，其特征在于所述氯仿、乙醚和三乙胺的混合投料體積比為8 1 2。
全文摘要
一種檢測食品中腐敗菌氨基酸脫羧酶活性的方法，屬農產品技術領域，先從食品中分離出腐敗菌，經發(fā)酵取得菌株發(fā)酵液，再接種到含有氨基酸的液體培養(yǎng)基中，取得生物胺檢測用腐敗菌發(fā)酵液，再通過離心取得無菌體的上清，在上清和生物胺混合標準溶液中分別加入Na2HPO4、NaOH和丹磺酰氯，在水浴避光條件下分別取得腐敗菌生物胺的衍生樣品和標準生物胺的衍生樣品；經點樣干燥后，置入展開槽內，待展開劑擴展到距樣點17cm處取出干燥，然后在紫外燈下使用自動凝膠成像分析分別拍照，通過比對，根據(jù)Rf值確定樣品中生物胺的種類，判斷菌株的氨基酸脫羧酶活性。本發(fā)明方便快捷，成本較低，可以準確實現(xiàn)對生物胺的定性檢測。
文檔編號G01N21/84GK102297864SQ20111013947
公開日2011年12月28日 申請日期2011年5月27日 優(yōu)先權日2011年5月27日
發(fā)明者劉芳, 徐為民, 王道營, 諸永志, 陸鵬 申請人:江蘇省農業(yè)科學院