專利名稱：用于檢測抗原的免疫傳感器敏感膜的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測抗原的免疫傳感器敏感膜的制備方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗儀器和環(huán)境監(jiān)測儀器領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的針對抗原的醫(yī)學(xué)檢測手段儀器昂貴，過程復(fù)雜，耗時，不易于攜帶，單次檢測費用較高。提供一種價格低廉，方便快捷的高靈敏抗原免疫傳感檢測手段成為必然。生物傳感器是一種將生物敏感元件與物理元件相結(jié)合而制成的分析檢測器件，其基本原理是將生物敏感元件發(fā)生的特異性反應(yīng)及信號經(jīng)由物理元件(換能器)轉(zhuǎn)變?yōu)楣?、電、聲等易檢測信號，從而獲知待測物的有關(guān)信號。免疫傳感器利用抗原抗體之間高度的特異性結(jié)合能力，在傳感器換能器敏感膜上固定抗體，可以高效實時的檢測抗原。近年的研究中免疫生物傳感器更是由于其價格低廉，反應(yīng)閾值低，響應(yīng)速度快，高選擇性，在醫(yī)療檢驗，環(huán)境監(jiān)測等多個領(lǐng)域都有很多研發(fā)應(yīng)用的必要。敏感膜制備方法有化學(xué)性修飾敏感膜制備方法，比如非共價靜電吸附，共價結(jié)合，雙功能化學(xué)物質(zhì)介導(dǎo)；以及生物性修飾敏感膜制備方法，比如蛋白質(zhì)介導(dǎo)。所制備敏感膜的穩(wěn)定性和生物活性對于傳感器檢測的線性范圍，檢測限，使用壽命，靈敏度起著關(guān)鍵作用。但是現(xiàn)在傳感器仍然存在固定不牢，反應(yīng)活性差等尚未克服的缺陷。比如化學(xué)性修飾敏感膜制備方法，會破壞抗體活性，降低檢測靈敏度的缺陷；而生物性修飾敏感膜制備方法，抗體固定不牢固，成膜不穩(wěn)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種成本低、不需要高精尖昂貴配套檢測儀器、制備簡單、活性高、穩(wěn)定性好的用于檢測抗原的免疫傳感器敏感膜的制備方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是該用于檢測抗原的免疫傳感器敏感膜的制備方法包括如下步驟
(1)將基底依次在乙醇溶液、去離子水中進(jìn)行超聲處理，直至基底表面潔凈，再用氮氣吹干備用；
(2)將干燥的基底浸入食人魚洗液中進(jìn)行氧化直至在所述基底的表面均勻分布有羥基，接著將基底取出并用去離子水沖洗，后再用氮氣吹干備用；
(3)將3-氨丙基三乙氧基硅烷和乙酸混合進(jìn)行水解反應(yīng)，后再加入步驟(2)所得到的基底靜置，以使該基底表面上的羥基與水解后的3-氨丙基三乙氧基硅烷進(jìn)行反應(yīng)直至基底表面均勻生長有3-氨丙基三乙氧基硅烷納米顆粒，接著對生長有3-氨丙基三乙氧基硅烷納米顆粒的基底進(jìn)行固化處理；
(4)在步驟(3)得到的基底表面上滴加蛋白A溶液或蛋白G溶液，并靜置直至該基底表面上的3-氨丙基三乙氧基硅烷納米顆粒與所述蛋白A或蛋白G相結(jié)合，后沖洗去除未結(jié)合的蛋白A或蛋白G ；(5)在步驟(4)得到的基底表面上滴加與待檢測的抗原對應(yīng)的抗體，并靜置直至所述蛋白A或蛋白G與所述抗體相結(jié)合，后沖洗去除未結(jié)合的抗體。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法的有益效果是由于本發(fā)明利用了一種化學(xué)雙功能高聚物(APTES)納米顆粒基團(tuán)跟生物大分子(蛋白A或蛋白G)共同介導(dǎo)的復(fù)合膜技術(shù)，具體地說是利用化學(xué)雙功能基團(tuán)兩端相異的官能團(tuán)分別能與基底和生物分子之間產(chǎn)生強(qiáng)大的化學(xué)結(jié)合力，從而克服了抗體分子連接不牢的缺點；再通過生物大分子蛋白A或蛋白G的介導(dǎo)，以及APTES高聚物納米顆粒對基底表面粗糙度及性能表現(xiàn)的提高，有效保持了抗體反應(yīng)分子的活性；并且利用蛋白A跟蛋白G的特異性定向作用，通過有效控制抗體取向一致性提高了抗體抗原結(jié)合的有效性，從而提高了傳感器的敏感性。本發(fā)明在傳感換能器表層合成由含有化學(xué)雙功能基團(tuán)的分子高聚物納米顆粒和生物大分子共同介導(dǎo)的復(fù)合納米敏感膜，檢測閾值低、靈敏度高、穩(wěn)定性好、制備簡單、不需要高精尖昂貴的配套檢測儀器，在醫(yī)學(xué)檢測、環(huán)境監(jiān)控等相關(guān)領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。


圖1是測抗原的高靈敏免疫傳感器敏感膜制備過程示意圖。
具體實施例方式如圖1所示，本發(fā)明用于檢測抗原的免疫傳感器敏感膜的制備方法具體包括如下步驟
1.基底的清潔
本發(fā)明所用基底通常為無機(jī)材料(如硅片、石英、玻璃纖維、硅酸鹽、金屬及其氧化物等)，以下以單晶硅片為例進(jìn)行說明。將單晶硅片先用乙醇棉花反復(fù)擦拭干凈，后在乙醇溶液(分析純)中超聲10分鐘， 換液，再超聲10分鐘；接著在去離子水中超聲10分鐘，換水，再超聲10分鐘，反復(fù)進(jìn)行多次，直至硅片表面潔凈，用氮氣吹干備用。2.硅片的親水化處理
將干燥的硅片基底浸入食人魚(piranha)洗液中進(jìn)行氧化30分鐘，使基底的表面均勻分布有羥基，接著將硅片基底取出并用去離子水沖洗30秒，后再用氮氣吹干備用。其中食人魚(piranha)洗液配制方法如下敞口燒杯至于水槽中以便散熱，在燒杯中倒入一體積的30%H202，然后緩慢加入三倍體積于H2A的濃&S04，邊加入邊攪拌，現(xiàn)用現(xiàn)配。食人魚起到兩個作用第一，食人魚洗液強(qiáng)氧化性對硅片表面進(jìn)行進(jìn)一步清潔去除有機(jī)污染，第二，食人魚強(qiáng)氧化性使硅片表面發(fā)生氧化作用，表面氫鍵氧化生成羥基。形成羥基后的親水性表層，更利于蛋白生物活性的保持，但是卻變得更難結(jié)合蛋白質(zhì)，減少了非特異性結(jié)合。3.雙功能高聚物(APTES)納米顆粒的僑聯(lián)
將3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和乙酸混合進(jìn)行水解反應(yīng)約3-5分鐘，3-氨丙基三乙氧基硅烷與乙酸溶液的體積比為1:99，其中乙酸溶液的pH為3-4 ；后再加入步驟2所得到的基底靜置10分鐘，以使該基底表面上的羥基與水解后的3-氨丙基三乙氧基硅烷進(jìn)行反應(yīng)直至基底表面均勻生長有3-氨丙基三乙氧基硅烷納米顆粒，接著將生長有3-氨丙基
4三乙氧基硅烷納米顆粒的基底放入干燥箱100攝氏度固化2小時，以實現(xiàn)APTES分子的固化和硅烷化。這樣，兩端帶有不同化學(xué)官能團(tuán)的雙功能硅烷化試劑APTES—端的三個乙氧基水解后有一個與硅片基底上羥基通過縮水反應(yīng)實現(xiàn)牢固的硅烷化連接，另外兩個則與其他 APTES分子發(fā)生縮合反應(yīng)形成高聚物納米顆粒，起到提高基底表面粗糙度及性能表現(xiàn)的作用；另一端的NH4基團(tuán)則實現(xiàn)與蛋白A及蛋白G的化學(xué)交聯(lián)作用。除了化學(xué)交聯(lián)作用以外， APTES高聚物納米顆粒增加了硅片表面的粗糙度，也會促進(jìn)蛋白A及蛋白G的吸附。4.生物大分子(蛋白A)的固定化
在步驟3得到的基底表面上滴加125 μ g/ml的蛋白A溶液(溶劑為PBS緩沖液)15 μ 1， 并靜置30分鐘以使該基底表面上的3-氨丙基三乙氧基硅烷納米顆粒與所述蛋白A相結(jié)合，后用PBS緩沖液沖洗去除未結(jié)合的蛋白Α。本發(fā)明中，蛋白A溶液可用蛋白G溶液替代。5.抗體的固定
在步驟4得到的基底表面上滴加將100 μ g/ml的Hbs抗體10 μ 1，并靜置30分鐘，以使蛋白A或蛋白G與Hbs抗體相結(jié)合，后用PBS緩沖液沖洗沖洗去除未結(jié)合的抗體。這樣就實現(xiàn)了抗體的定向固定，制備得到可用于檢測抗原的免疫傳感器敏感膜。以上使用Hbs抗體可使制備得到的敏感膜用于檢測Hbs抗原。本發(fā)明方法除了可使用以上Hbs抗體外，根據(jù)待檢測的抗原的不同，還可使用其他對應(yīng)的抗體。使用本發(fā)明方法制備得到的免疫傳感器敏感膜時，可將商用檢測相應(yīng)抗原的酶聯(lián)免疫吸附劑測定試劑盒，并將酶聯(lián)免疫吸附劑測定試劑盒的酶標(biāo)試劑加在敏感膜上，然后洗去；接著，依次加酶聯(lián)免疫吸附劑測定試劑盒中的顯色劑A和B，并用吸頭吸一部分顯色液到酶聯(lián)免疫吸附劑測定試劑盒酶標(biāo)板的孔里，加終止液終止反應(yīng)，測定吸光度值，經(jīng)過體積校正后與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，從而確定所檢測的抗原的量。
權(quán)利要求
1. 一種用于檢測抗原的免疫傳感器敏感膜的制備方法，其特征是包括如下步驟(1)將基底依次在乙醇溶液、去離子水中進(jìn)行超聲處理，直至基底表面潔凈，再用氮氣吹干備用；(2)將干燥的基底浸入食人魚洗液中進(jìn)行氧化直至在所述基底的表面均勻分布有羥基，接著將基底取出并用去離子水沖洗，后再用氮氣吹干備用；(3)將3-氨丙基三乙氧基硅烷和乙酸混合進(jìn)行水解反應(yīng)，后再加入步驟(2)所得到的基底靜置，以使該基底表面上的羥基與水解后的3-氨丙基三乙氧基硅烷進(jìn)行反應(yīng)直至基底表面均勻生長有3-氨丙基三乙氧基硅烷納米顆粒，接著對生長有3-氨丙基三乙氧基硅烷納米顆粒的基底進(jìn)行固化處理；(4)在步驟(3)得到的基底表面上滴加蛋白A溶液或蛋白G溶液，并靜置直至該基底表面上的3-氨丙基三乙氧基硅烷納米顆粒與所述蛋白A或蛋白G相結(jié)合，后沖洗去除未結(jié)合的蛋白A或蛋白G ；(5)在步驟(4)得到的基底表面上滴加與待檢測的抗原對應(yīng)的抗體，并靜置直至所述蛋白A或蛋白G與所述抗體相結(jié)合，后沖洗去除未結(jié)合的抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用于檢測抗原的免疫傳感器敏感膜的制備方法。它是將干燥的基底浸入食人魚洗液中進(jìn)行氧化直至在所述基底的表面均勻分布有羥基，后使基底表面上的羥基與水解后的3-氨丙基三乙氧基硅烷進(jìn)行反應(yīng)直至基底表面均勻分布有3-氨丙基三乙氧基硅烷納米顆粒，接著使基底表面上的3-氨丙基三乙氧基硅烷納米顆粒與蛋白A或蛋白G相結(jié)合，后通過在上述基底表面上滴加與待檢測的抗原對應(yīng)的抗體，使蛋白A或蛋白G與抗體相結(jié)合。本發(fā)明方法克服了抗體分子連接不牢的缺點，有效保持抗體反應(yīng)分子的活性，并利用蛋白A跟蛋白G的特異性定向作用，通過有效控制抗體取向一致性提高了抗體抗原結(jié)合的有效性，從而提高傳感器的敏感性。
文檔編號G01N33/68GK102262160SQ20111010236
公開日2011年11月30日 申請日期2011年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月24日
發(fā)明者葉學(xué)松, 徐小媛, 胡一川 申請人:浙江大學(xué)