專利名稱：一種手工半定量液基細胞學制片方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種適用于婦科體檢、宮頸癌篩查的液基細胞學制片方法，屬細胞學制片技術領域。
背景技術：
液基細胞學檢查是采用液基細胞學制片和染色技術檢測宮頸脫落細胞并進行細胞學診斷，它是目前國際上較先進的一種宮頸癌細胞學檢查技術，與傳統(tǒng)的宮頸刮片巴氏涂片檢查相比明顯提高了標本的滿意度及宮頸異常細胞的檢出率。液基細胞學制片技術，是一種將脫落細胞保存在液體中，并通過特殊途徑將細胞均勻分散貼附在載玻片上制成涂片的技術。液基細胞學制片技術誕生于1991年美國等發(fā)達國家，率先應用 于婦科細胞學檢查，國內從2001年開始進行液基細胞學篩查宮頸癌的研究，使該項技術得到迅速發(fā)展，為脫落細胞學診斷作出了重大貢獻。傳統(tǒng)的液基細胞學制片技術包括有膜式過濾法薄層制片技術(TCT)、自動離心沉降法制片技術(LCT)、離心甩片法制片技術以及利普手工離心涂片技術(LPT)。這些制片技術存在設備昂貴，試劑耗材成本高、陽性率低、質量不穩(wěn)定等缺陷，確實有必要加以改進。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種手工半定量液基細胞學制片方法，其是一種成本低廉、高效可重復、可受控的宮頸液基細胞學制片技術，以解決目前進口自動制片設備價格昂貴，配套試劑耗材成本過高，國產制片系統(tǒng)價格高，制片質量不穩(wěn)定，以及傳統(tǒng)手工滴片法制片粗糙的問題。為了達成上述目的，本發(fā)明的技術方案是
一種手工半定量液基細胞學制片方法，以液基保存的宮頸脫落細胞為標本來源，經離心處理后，進行半定量稀釋，按一定量加入細胞分散劑中進行懸浮和混勻，取數(shù)滴細胞懸液滴于玻片表面，細胞自然沉降晾干后進行固定、染色，其方法是按下列步驟進行的
步驟1，標本確認并編號取待檢標本管和申請單，分別用記號筆在標本管和申請單上標上流水號，在試管架中準備好與標本管相對應的I支標準尖底離心管(12ml)和I支圓底試管(5ml)，并進行編號；
步驟2，添加細胞分散劑分別向每個圓底試管中加入IOOiU的細胞分散劑(美國Synermed 公司)；
步驟3，轉移標本、離心將標本瓶放在點觸式混勻器上振蕩3-5秒，緩緩向尖底離心管中倒入6ml左右(6ml±lml)的標本溶液；1500轉/分鐘條件下離心5分鐘；
步驟4，倒上清逐個將離心管中的上清液倒出，并在濾紙上盡量吸盡管內的殘余液
體；
步驟5，稀釋細胞沉淀針對每個標本，觀察其離心管中細胞沉淀團塊的大小，按2. 5±0. 5倍體積加入蒸餾水進行稀釋；步驟6，轉移細胞懸液振蕩3-5秒，用吸管吸取細胞懸液，向對應的圓底試管中加入2滴細胞懸液；
步驟7，滴片再次振蕩混勻3-5秒，用吸管從中吸取適量的細胞懸液，于相應載玻片正上方約5cm處，垂直滴2滴±1滴的細胞懸液至載玻片中心，完成制片。采用上述方案后，本發(fā)明與傳統(tǒng)液基學制片技術相比，具有以下優(yōu)點
一、本發(fā)明無需特殊的專門設備，僅需一臺振蕩器、一臺普通離心機及少量配套試劑和耗材即可開展工作，而TCT、LCT等自動制片技術需要昂貴的制片系統(tǒng)(如TCT法需要膜式制片機，LCT法需要全自動制片染色一體機，離心甩片法需要涂片離心機等)，因此，本發(fā)明是目前最經濟的液基學制片技術，更利于在各級醫(yī)院和醫(yī)療機構迅速普及和推廣；
二、本發(fā)明可以實現(xiàn)半定量化操作，可以對涂片細胞的濃度進行準確的控制，大大減少上述傳統(tǒng)制片方法中所制玻片細胞密度不均一、細胞數(shù)量過少或密度過大造成的細胞重疊、厚薄不一的現(xiàn)象，極大的改善制片的均一性、穩(wěn)定性和滿意度，并能顯著提高細胞病理 學醫(yī)生或自動閱片系統(tǒng)的閱片效率；
三、本發(fā)明操作簡便、高效，僅需離心、稀釋、分散、滴片幾步操作，易于迅速掌握，并具有很強的可重復性和靈活性，一份標本可以同時制成多張涂片，滿足不同檢測的需求，同一個標本即使不同人來進行制片，也能獲得幾乎完全一致的制片效果，同時，使用本發(fā)明進行制片，平均一小時可以制片30張以上，效率高于目前絕大多數(shù)的制片技術；
四、與TCT制片技術相比，本發(fā)明具有更高的效率和更高的陽性檢出率，TCT一次只能制片一張，并且需要進口濾膜，耗材成本過高，國產的濾膜和TCT制片機穩(wěn)定性較差，經常出現(xiàn)濾膜被堵、白膜、爆膜以及掉片的情況，且絕大多數(shù)國產TCT在制片過程中陽性細胞丟失的情況時有發(fā)生，而本發(fā)明的半定量滴片可以一次處理1-24張玻片，并且不會出現(xiàn)掉片的情況，陽性細胞保存完好，此外本發(fā)明在保持細胞完整性上也優(yōu)于TCT，因為TCT采用的是物理壓的方式進行細胞印片，這樣會容易破壞細胞膜的完整性；另外，TCT無法保證每次都抽取足夠多的細胞進行制片，而本發(fā)明可以對細胞進行半定量，根據不同標本的細胞濃度調整上樣量，保證制片的穩(wěn)定性和滿意度；
五、與LCT制片技術相比，本發(fā)明具有成本上的巨大優(yōu)勢，普通的一臺LCT全自動制片系統(tǒng)就需要80萬左右的經費投入，而且其耗材和試劑(如緩沖液、梯度離心液、離心管、沉降管、加樣器、玻片、制片板)均要求是進口的原裝產品，對于長期進行宮頸癌篩查的醫(yī)院來說，成本過高；而本發(fā)明對于設備的依賴性很小，設備故障的風險幾乎為零，且大部分試劑和耗材都無需依賴進口 ；此外，本發(fā)明的制片方式還保留了標本中具有診斷意義的炎細胞以及微生物，而LCT則去除了大部分的炎細胞，這就使細胞病理醫(yī)生無法對標本進行炎癥分級，同時，運用LCT法對標本進行處理會丟失大量的滴蟲感染等眾多微生物信息，影響了病理醫(yī)生診斷的準確性；
六、與傳統(tǒng)的離心甩片法相比，本發(fā)明在制片的均一性、背景的干凈程度以及防脫片方面都具有優(yōu)勢，常規(guī)的離心甩片法經常會出現(xiàn)玻片上細胞過少或過多的情況，細胞過少無法獲得足夠的診斷細胞，細胞過多則容易產生細胞重疊，陽性細胞被遮蓋從而影響閱片，而本發(fā)明的技術則很好的克服了這一缺點，通過振蕩、分散步驟，可以使細胞呈現(xiàn)出單個散在的分布形式，很少發(fā)生細胞重疊，細胞被干擾成分遮蓋的情況；
七、與LPT制片技術相比，本發(fā)明不僅能獲得與其幾乎媲美的涂片背景和標本處理滿意度，而且還提出了該方法以及其他上述方法所無法具有的“半定量”的理念，可以使不同的標本獲得幾乎一致的上樣濃度，從而獲得均一的制片效果；
八、本發(fā)明有很大的兼容性和可拓展性，其使用的耗材能和大多數(shù)的國內外液基學制片耗材兼容，并可以配合各種血液、黏液、炎細胞、離心沉淀等處理技術應用于痰液標本、口腔脫落細胞標本、細針穿刺細胞學標本、胸腹水標本的液基細胞學檢查；
九、綜上所述，與其它液基細胞學制片技術相比，本發(fā)明的技術方案在節(jié)省費用、可重復性、效率、穩(wěn)定性、制片的滿意度以及可拓展性等方面均具有明顯的優(yōu)勢。
圖I是離心管中細胞沉淀體積與加入水體積的位置示意圖。
具體實施例方式本發(fā)明具體實施例的步驟如下
一、標本采集
用宮頸采樣器采集宮頸口的脫落細胞，將宮頸采樣器的刷頭取下并置于標本瓶中的細胞保存液內。二、細胞學制片
(I)標本確認并編號
取待檢標本管和申請單，分別用記號筆在標本管和申請單上標上流水號，在試管架中準備好與標本管相對應的I支標準尖底離心管(12ml)和I支圓底試管(5ml)，離心管和圓底試管上用記號筆標上編號，此編號與標本管編號應一致。(2)添加細胞分散劑
分別向每個圓底試管中加入IOOii I的細胞分散劑(美國Synermed公司)。(3)轉移標本、離心
將標本瓶放在點觸式混勻器上振蕩3-5秒，緩緩向尖底離心管中倒入6ml的標本溶液。離心管經平衡后放入離心機，離心速度設置為1500轉/分鐘，時間設置為5分鐘，開始離心。(4)倒上清
離心完成后，逐個將離心管中的上清液倒出，并在濾紙上盡量吸盡管內的殘余液體，此時可觀察到離心管底部有沉淀的細胞團塊。(5)稀釋細胞沉淀。針對每個標本，觀察其離心管中細胞沉淀的大小，并將其與示意圖上的模擬標本體積逐個進行對比(操作前可按離心管的實際大小打印圖1，細胞沉淀的體積可參考圖I的標記“ I ”所示)，確定所需的稀釋體積，原則上稀釋體積為細胞沉淀體積的2. 5-3倍，見下表。
細胞沉淀的體積 U I|20丨40 160 |80 IlOO Il20 Il40 Il60 Il80 |200
加入水的體積 U I|5o|lQQ |l50 |200 |250 |300 |350 |400 |450 |500根據確定的稀釋體積，用可調式移液器向相應的尖底離心管中加入定量的蒸餾水，如果沒有可調式移液器，也可以直接用定量移液器或吸管向離心管中逐滴加水至圖I中黑線標識的位置(可參考圖I的標記“2”所示位置)。
(6)轉移細胞懸液
所有離心管中的標本經稀釋后，先將第一個標本的離心管放在點觸式混勻器上振蕩3-5秒，用吸管吸取適量細胞懸液，向對應的圓底試管中加入2滴細胞懸液，然后用同樣的方法轉移下一個標本的細胞懸液，直至所有標本都轉移完成。(7)滴片
針對每個標本，將相應的圓底試管于混勻器上再次振蕩混勻3-5秒，用吸管從中吸取適量的細胞懸液，于相應載玻片正上方約5cm處,垂直滴2滴細胞懸液至載玻片中心,完成制片。(8)晾干
玻片在室溫下自然晾干。
三、晾干后的玻片可進行巴氏或HE染色(中文名蘇木精-伊紅染色)用于常規(guī)細胞學診斷，也可進行DNA的特異染色用于細胞DNA的倍體分析。
權利要求
1.一種手工半定量液基細胞學制片方法，其特征在于以液基保存的宮頸脫落細胞為標本來源，經離心處理后，進行半定量稀釋，加入細胞分散劑中進行懸浮和混勻，取細胞懸液滴于玻片表面，細胞自然沉降晾干后進行固定、染色，其方法是按下列步驟進行的 步驟1，標本確認并編號取待檢標本管和申請單，各準備好I支與標本管相對應的尖底離心管和圓底試管，分別進行編號； 步驟2，添加細胞分散劑向每個圓底試管中加入100 ill的細胞分散劑； 步驟3，轉移標本、離心將標本瓶放在點觸式混勻器上振蕩3-5秒，向尖底離心管中倒A 6ml±lml的標本溶液；1500轉/分鐘條件下離心5分鐘； 步驟4，倒上清將離心管中的上清液倒出，并在濾紙上吸盡管內的殘余液體； 步驟5，稀釋細胞沉淀觀察離心管中細胞沉淀團塊的大小，按2. 5±0. 5倍體積加入蒸餾水進行稀釋； 步驟6，轉移細胞懸液振蕩3-5秒，用吸管吸取細胞懸液，向對應的圓底試管中加入2滴細胞懸液； 步驟7，滴片再次振蕩混勻3-5秒，用吸管從中吸取細胞懸液，于相應載玻片正上方約5cm處，垂直滴2滴±1滴的細胞懸液至載玻片中心，完成制片。
全文摘要
本發(fā)明公開一種手工半定量液基細胞學制片方法，以液基保存的宮頸脫落細胞為標本來源，經離心處理后，進行半定量稀釋，加入細胞分散劑中進行懸浮和混勻，取細胞懸液滴于玻片表面，細胞自然沉降晾干后進行固定、染色，其方法是按下列步驟進行的標本確認并編號；添加細胞分散劑；轉移標本、離心；倒上清；稀釋細胞沉淀；轉移細胞懸液；滴片，完成制片。本發(fā)明是一種成本低廉、高效可重復、可受控的宮頸液基細胞學制片技術，解決了目前進口自動制片設備價格昂貴，配套試劑耗材成本過高，國產制片系統(tǒng)價格高，制片質量不穩(wěn)定，以及傳統(tǒng)手工滴片法制片粗糙的問題，適合在各級醫(yī)院或醫(yī)療機構尤其是基層進行推廣。
文檔編號G01N1/28GK102749230SQ20111010225
公開日2012年10月24日 申請日期2011年4月22日 優(yōu)先權日2011年4月22日
發(fā)明者唐劍 申請人:麥克奧迪(廈門)醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司