專(zhuān)利名稱(chēng)：一種萊克多巴胺免疫層析檢測(cè)試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種萊克多巴胺免疫層析檢測(cè)試紙條。
背景技術(shù)：
常見(jiàn)的興奮劑有克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等，克侖特羅俗稱(chēng)“瘦肉精”。隨著中國(guó)對(duì)克侖特羅監(jiān)管力度的加大，克倫特羅的使用逐漸減少，其他興奮劑的使用逐漸增加。萊克多巴胺(ract0pamine，RAC)是美國(guó)最新研制出的一種β -興奮劑，1999年12 月美國(guó)食品與藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)萊克多巴胺可以使用在豬養(yǎng)殖，萊克多巴胺也是歐盟惟一允許使用的興奮劑。中國(guó)也有研制專(zhuān)利報(bào)道，萊克多巴胺正作為克侖特羅的替代品被廣泛使用。但中國(guó)農(nóng)業(yè)部、衛(wèi)生部、國(guó)家藥品監(jiān)督管理局明文禁止萊克多巴胺用于動(dòng)物養(yǎng)殖，因此開(kāi)發(fā)萊克多巴胺的快速、準(zhǔn)確的測(cè)定試劑盒是當(dāng)務(wù)之急，而研制出高質(zhì)量的檢測(cè)原材料(抗原及抗體)是重中之重。萊克多巴胺是一類(lèi)結(jié)構(gòu)和功能類(lèi)似腎上腺素的苯乙醇胺類(lèi)衍生物，是小分子物質(zhì) (分子量< 1000)，本身不具有誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的能力，因此，為了建立此類(lèi)物質(zhì)的免疫分析方法，首先必須制備出效價(jià)高特異性強(qiáng)的抗體，設(shè)法將萊克多巴胺小分子與大分子(載體蛋白質(zhì))偶聯(lián)制備出人工完全抗原，從而開(kāi)始研制相關(guān)產(chǎn)品快速檢測(cè)研究的基礎(chǔ)。以此制備多種高特異性單克隆抗體，研制膠體金/膠乳快速一步檢測(cè)方法，能實(shí)現(xiàn)對(duì)各種檢測(cè)簡(jiǎn)單快速的一步檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果直觀易讀。此快速檢測(cè)法將推動(dòng)萊克多巴胺殘留量分析檢測(cè)的擴(kuò)大使用，符合萊克多巴胺危害現(xiàn)狀，方便現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。在現(xiàn)有技術(shù)中，張漫、羅曉琴等(《動(dòng)物保健》2006年09期，《萊克多巴胺殘留檢測(cè)方法》)認(rèn)為在萊克多巴胺的殘留檢測(cè)方法中，抗酶聯(lián)免疫方法是目前最理想的檢測(cè)方法， 具有快速、簡(jiǎn)便、操作簡(jiǎn)單以及一次檢測(cè)樣品量大的特點(diǎn)，可以直接對(duì)尿液、飼料樣品進(jìn)行檢測(cè)。申請(qǐng)?zhí)枮?00510071059. 0的發(fā)明專(zhuān)利，涉及一種萊克多巴胺RCT檢測(cè)方法，是利
用免疫親和層析柱及酶聯(lián)免疫吸附的方法來(lái)檢測(cè)食品中的萊克多巴胺殘留，首先通過(guò)合成抗原、包被抗原、動(dòng)物免疫、抗體純化等步驟制備多克隆抗體，再將此抗體交聯(lián)到瓊脂糖凝膠上，制備免疫親和層析柱。被檢樣品處理后，通過(guò)親和柱以富集其中的萊克多巴胺，收集親和柱的洗脫液進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)，以確定其中的萊克多巴胺的含量，萊克多巴胺酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。但是上述兩種方法均是液相檢測(cè)，溶液操作，以吸光度來(lái)定量檢測(cè)萊克多巴胺，不便于在現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模篩查和地域偏遠(yuǎn)不發(fā)達(dá)的地區(qū)使用。申請(qǐng)?zhí)枮?00520136528. 8，發(fā)明名稱(chēng)為萊克多巴胺膠體金免疫層析檢測(cè)試紙的實(shí)用新型專(zhuān)利，是由樣液吸收層、膠體金標(biāo)記層、檢測(cè)反應(yīng)層以及吸水層依次設(shè)置在背襯上組成。但是以膠體金法檢測(cè)，缺點(diǎn)是靈敏性較差，檢測(cè)限較難控制。另有申請(qǐng)?zhí)枮?200910027587. 4，發(fā)明名稱(chēng)為一種快速檢測(cè)萊克多巴胺的免疫磁珠層析試紙條及制備方法，該發(fā)明采用磁膠乳顆粒為標(biāo)記物，利用磁信號(hào)檢測(cè)儀，進(jìn)一步將電信號(hào)輸出實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，其缺點(diǎn)是需要儀器操作，且利用磁微粒標(biāo)記，造價(jià)成本較高，對(duì)于應(yīng)急性大面積篩查，性價(jià)比較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種成本低廉、操作簡(jiǎn)便、靈敏性高的萊克多巴胺免疫層析檢測(cè)試紙條。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案一種萊克多巴胺免疫層析檢測(cè)試紙條，所述試紙條由樣品墊、玻璃纖維膜標(biāo)記墊、 硝酸纖維素包被膜、吸水紙順次搭接粘貼在底板上構(gòu)成，所述玻璃纖維膜標(biāo)記墊上涂覆有彩色膠乳顆粒標(biāo)記的萊克多巴胺多克隆抗體，硝酸纖維素包被膜包括檢測(cè)區(qū)和控制區(qū)，所述檢測(cè)區(qū)包被有萊克多巴胺全抗原，所述控制區(qū)包被抗鼠抗體IgG ；所述彩色乳膠顆粒為粒徑100-500nm的聚苯乙烯顆粒，所述聚苯乙烯顆粒表面修飾有-COOH、-NH2或-SH基團(tuán)。優(yōu)選地，所述萊克多巴胺多克隆抗體由與牛血清蛋白偶聯(lián)的萊克多巴胺免疫制得；所述萊克多巴胺全抗原由萊克多巴胺與卵清蛋白偶聯(lián)制得。優(yōu)選地，所述萊克多巴胺多克隆抗體與彩色膠乳顆粒的比例為75 150 μ g/100 μ g，所述彩色膠乳顆粒標(biāo)記的萊克多巴胺多克隆抗體涂敷在玻璃纖維膜上的稀釋參數(shù)為25cm2/ml 35cm2/ml。優(yōu)選地，所述萊克多巴胺全抗原在所述檢測(cè)區(qū)的用量為15_20μ l/35cm ；所述抗鼠抗體IgG的濃度為18 30 μ g/ml，在所述控制區(qū)的用量為25 μ l/35cm。萊克多巴胺為小分子化合物，抗原性弱，不能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須把其連接到大分子物質(zhì)(如載體蛋白質(zhì))上，才能形成較為理想的免疫原。常用的蛋白質(zhì)偶聯(lián)方法主要有碳二亞胺(EDC)法、混合酸酐法(MA)、戊二醛法、N-羥基琥珀酰亞胺(MB)法、 琥珀酸酐法和重氮法等。本發(fā)明的萊克多巴胺免疫層析試劑條是建立在免疫層析的競(jìng)爭(zhēng)抑制性原理上，利用化學(xué)合成的方法將萊克多巴胺小分子由不同位點(diǎn)連接到大分子載體蛋白上合成萊克多巴胺人工全抗原；采用與BSA偶聯(lián)的萊克多巴胺全抗原制備高靈敏度的萊克多巴胺多克隆抗體；利用彩色膠乳標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記萊克多巴胺多克隆抗體，與OVA偶聯(lián)的萊克多巴胺全抗原組成層析裝置，對(duì)樣本中的萊克多巴胺小分子進(jìn)行定性檢測(cè)。針對(duì)現(xiàn)有萊克多巴胺檢測(cè)技術(shù)的不足和缺陷，提供采用競(jìng)爭(zhēng)抑制性固相免疫層析原理的試劑條，即樣品中的萊克多巴胺小分子和固定在包被膜上的萊克多巴胺全抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合彩色膠乳標(biāo)記的萊克多巴胺多克隆抗體的固相檢測(cè)免疫層析檢測(cè)試紙條，且優(yōu)化了工藝流程和參數(shù)，提高了檢測(cè)的靈敏度，使用更加便捷。當(dāng)試紙條以樣品墊末端浸入樣本后，樣品溶液沿著試紙條通過(guò)毛細(xì)作用從下向上流動(dòng)，溶解標(biāo)記墊上涂覆的彩色膠乳顆粒標(biāo)記的抗體。如果待測(cè)的樣品中不含有萊克多巴胺時(shí)，彩色膠乳顆粒標(biāo)記的抗體會(huì)和包被在硝酸纖維素包被膜檢測(cè)區(qū)T線處的萊克多巴胺全抗原發(fā)生反應(yīng)，從而聚集彩色膠乳顆粒，在檢測(cè)區(qū)T線處顯色，未與萊克多巴胺全抗原反應(yīng)的彩色膠乳顆粒標(biāo)記的抗體繼續(xù)向前，與控制區(qū)C線上的抗鼠抗體發(fā)生反應(yīng)，在C線處顯色，因此在硝酸纖維素包被膜上呈現(xiàn)兩條色帶，表示樣品為萊克多巴胺陰性；若待測(cè)樣品中含有萊克多巴胺，則彩色膠乳顆粒標(biāo)記的萊克多巴胺抗體首先與樣品中的小分子發(fā)生反應(yīng)，檢測(cè)區(qū)T線處不顯色，當(dāng)反應(yīng)后的彩色膠乳顆粒標(biāo)記的抗體和抗原復(fù)合物流動(dòng)到控制區(qū)C線處時(shí)，與C線處包被的抗鼠抗體反應(yīng)，C線處顯色，硝酸纖維素包被膜上只呈現(xiàn)一條色帶，說(shuō)明檢測(cè)樣品為陽(yáng)性。由此可見(jiàn)，無(wú)論檢測(cè)樣品中是否含有萊克多巴胺小分子，控制區(qū)C線處均顯色，如果C線無(wú)色帶產(chǎn)生，則說(shuō)明試紙條失效或者操作有誤。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果采用本發(fā)明的試紙條進(jìn)行定性檢測(cè)不需要任何輔助儀器，操作簡(jiǎn)便，一步完成，檢測(cè)時(shí)間為5 15min ；可以檢測(cè)動(dòng)物飼料、肌肉組織等處理檢材，檢測(cè)靈敏度達(dá)到5ng/mL ； 準(zhǔn)確率大于97%。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1本發(fā)明的一種萊克多巴胺免疫層析檢測(cè)試紙條，是由樣品墊、玻璃纖維膜標(biāo)記墊、 硝酸纖維素包被膜、吸水紙順次搭接粘貼在底板上構(gòu)成，所述玻璃纖維膜標(biāo)記墊上涂覆有彩色膠乳顆粒標(biāo)記的萊克多巴胺多克隆抗體，硝酸纖維素包被膜包括檢測(cè)區(qū)和控制區(qū)，所述檢測(cè)區(qū)包被萊克多巴胺全抗原，所述控制區(qū)包被抗鼠抗體IgG ；所述彩色乳膠顆粒為粒徑100-500nm的聚苯乙烯顆粒，所述聚苯乙烯顆粒表面修飾有-COOH、-NH2或-SH基團(tuán)。在該實(shí)施例中，免疫用萊克多巴胺全抗原的載體蛋白為牛血清蛋白BSA，包被用萊克多巴胺全抗原的載體蛋白為卵清蛋白OVA。萊克多巴胺全抗原在所述檢測(cè)區(qū)的用量為 15μ l/35cm ；所述抗鼠抗體IgG的濃度為18 μ g/ml，在所述控制區(qū)的用量為25 μ l/35cm。在該實(shí)施例中，所述萊克多巴胺多克隆抗體與彩色膠乳顆粒的比例為 100 μ g/100 μ g，所述彩色膠乳顆粒標(biāo)記的萊克多巴胺多克隆抗體涂敷在玻璃纖維膜標(biāo)記墊上的稀釋參數(shù)為30cm2/ml。該實(shí)施例的試紙條是由以下方法制備而得A.合成萊克多巴胺人工全抗原(免疫抗原RAC-BSA和包被抗原RAC-0VA)1)合成半抗原；將萊克多巴胺首先引入活性基團(tuán)羧基(引入羧基的方法有很多種)，合成含羧基的RAC半抗原；在該實(shí)施例中，稱(chēng)取萊克多巴胺30mg溶在2ml吡啶中，加入9mg 丁二酸酐， 室溫下攪拌12小時(shí)，此反應(yīng)產(chǎn)物為萊克多巴胺-半丁二酸酐。2)半抗原與載體蛋白偶聯(lián)采用混合酸酐法(MA)將RAC半抗原分別與牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白 (Ovalbumin, OVA)偶聯(lián)合成人工免疫原BSA-RAC和包被抗原0VA-RAC。在該實(shí)施例中，將步驟1)的萊克多巴胺-半丁二酸酐溶解于anl N, N-二甲基甲酰胺和aiil 1，4- 二氧六環(huán)混合物中，加入25ul的三正丁胺，在冰浴中攪拌lOmin，再加氯甲酸異丁酯15ul室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)，逐滴加入預(yù)冷的蛋白溶液(溶解于0. ΙΜ,ρΗ 8的硼酸鈉溶液中的IOOmgOVA)室溫反應(yīng)過(guò)夜，在PBS中透析72小時(shí)以上，測(cè)定全抗原RAC-OVA的濃度和紫外吸收光譜的變化。采取同樣的方法合成全抗原RAC-BSA。用紫外(UV)和蛋白凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行鑒定，計(jì)算分子結(jié)合比，以確定萊克多巴胺小分子是否與載體蛋白偶聯(lián)成功。B.制備萊克多巴胺多克隆抗體以步驟A生產(chǎn)的人工全抗原RAC-BSA免疫小鼠，選擇高效價(jià)小鼠，取血清，然后通過(guò)飽和硫胺沉淀和proteinA-S印harose 4B的方法對(duì)抗體進(jìn)行純化，所得的抗體需對(duì)RAC 有較高的特異性和靈敏性。C.篩選直徑為100-500nm的、表面修飾有-C00H，-NH2, -SH等基團(tuán)的彩色乳膠顆粒，將彩色膠乳顆粒與步驟B制得的RAC多克隆抗體相偶聯(lián)，并涂覆到玻璃纖維膜標(biāo)記墊上。D.將全抗原RAC-OVA噴膜于硝酸纖維素包被膜的檢測(cè)區(qū)，將抗鼠抗體包被于包被膜的控制區(qū)，并在35-40°C烘箱干燥15分鐘。E.將涂覆有彩色膠乳顆粒標(biāo)記的RAC多克隆抗體的玻璃纖維素膜標(biāo)記墊、包被有 RAC-OVA和抗鼠抗體的包被膜、吸水紙依次搭接在底板上，即得。使用方法及結(jié)果判斷加樣后，反應(yīng)5分鐘內(nèi)即可看到檢測(cè)區(qū)(T線)和控制區(qū)(C線)相應(yīng)的位置上呈色情況，如果C線和T線均出現(xiàn)顏色條帶，結(jié)果為陰性，說(shuō)明樣品中不含有萊克多巴胺小分子；T線不出現(xiàn)顏色條帶，C線出現(xiàn)顏色條帶，結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明樣品中含有萊克多巴胺小分子；C線不出現(xiàn)顏色條帶，說(shuō)明試紙條失效。實(shí)施例2 該實(shí)施例中的試紙條結(jié)構(gòu)均與實(shí)施例1相同。在該實(shí)施例中，免疫用萊克多巴胺全抗原的載體蛋白為卵清蛋白0VA，包被用萊克多巴胺全抗原的載體蛋白為牛血清蛋白BSA。萊克多巴胺全抗原在所述檢測(cè)區(qū)的用量為 18μ l/35cm;所述抗鼠抗體IgG的濃度為25 μ g/ml，在所述控制區(qū)的用量為25 μ l/35cm。 所述萊克多巴胺多克隆抗體與彩色膠乳顆粒的比例為75μ g/ΙΟΟμ g，所述彩色膠乳顆粒標(biāo)記的萊克多巴胺多克隆抗體涂敷在玻璃纖維膜標(biāo)記墊上的稀釋參數(shù)為25cm2/ml。其余均與實(shí)施例1相同，使用方法也與實(shí)施例1相同。實(shí)施例3該實(shí)施例中的試紙條結(jié)構(gòu)均與實(shí)施例1相同。在該實(shí)施例中，萊克多巴胺全抗原在所述檢測(cè)區(qū)的用量為20μ l/35cm ；所述抗鼠抗體IgG的濃度為30 μ g/ml，在所述控制區(qū)的用量為25μ l/35cm。在該實(shí)施例中，所述萊克多巴胺多克隆抗體與彩色膠乳顆粒的比例為150 μ g/ΙΟΟμ g，所述彩色膠乳顆粒標(biāo)記的萊克多巴胺多克隆抗體涂敷在玻璃纖維膜標(biāo)記墊上的稀釋參數(shù)為35cm2/ml。其余均與實(shí)施例1相同，使用方法也與實(shí)施例1相同。
權(quán)利要求
1.一種萊克多巴胺免疫層析檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述試紙條由樣品墊、玻璃纖維膜標(biāo)記墊、硝酸纖維素包被膜、吸水紙順次搭接粘貼在底板上構(gòu)成，所述玻璃纖維膜標(biāo)記墊上涂覆有彩色膠乳顆粒標(biāo)記的萊克多巴胺多克隆抗體，硝酸纖維素包被膜包括檢測(cè)區(qū)和控制區(qū)，所述檢測(cè)區(qū)包被有萊克多巴胺全抗原，所述控制區(qū)包被抗鼠抗體IgG ；所述彩色乳膠顆粒為粒徑100-500nm的聚苯乙烯顆粒，所述聚苯乙烯顆粒表面修飾有-C00H、-NH2或-SH 基團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的萊克多巴胺免疫層析檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述萊克多巴胺多克隆抗體由與牛血清蛋白偶聯(lián)的萊克多巴胺免疫制得；所述萊克多巴胺全抗原由萊克多巴胺與卵清蛋白偶聯(lián)制得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的萊克多巴胺免疫層析檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述萊克多巴胺多克隆抗體與彩色膠乳顆粒的比例為75 150μ g/ΙΟΟμ g，所述彩色膠乳顆粒標(biāo)記的萊克多巴胺多克隆抗體涂敷在玻璃纖維膜上的稀釋參數(shù)為25cm2/ml 35cm2/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的萊克多巴胺免疫層析檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述萊克多巴胺全抗原在所述檢測(cè)區(qū)的用量為15-20μ l/35cm ；所述抗鼠抗體IgG的濃度為18 30 μ g/ml，在所述控制區(qū)的用量為25μ l/35cm。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種萊克多巴胺免疫層析檢測(cè)試紙條，所述試紙條由樣品墊、玻璃纖維膜標(biāo)記墊、硝酸纖維素包被膜、吸水紙順次搭接粘貼在底板上構(gòu)成，所述玻璃纖維膜標(biāo)記墊上涂覆有彩色膠乳顆粒標(biāo)記的萊克多巴胺多克隆抗體，硝酸纖維素包被膜包括檢測(cè)區(qū)和控制區(qū)，所述檢測(cè)區(qū)包被萊克多巴胺全抗原，所述控制區(qū)包被抗鼠抗體IgG；所述彩色乳膠顆粒為粒徑為100-500nm的聚苯乙烯顆粒，所述聚苯乙烯顆粒表面修飾有-COOH、-NH2或-SH基團(tuán)。采用本發(fā)明的試紙條進(jìn)行定性檢測(cè)不需要任何輔助儀器，操作簡(jiǎn)便，一步完成，可以檢測(cè)動(dòng)物飼料、肌肉組織等處理檢材，檢測(cè)靈敏度達(dá)到5ng/mL，準(zhǔn)確率大于97％。
文檔編號(hào)G01N33/558GK102183641SQ20111003832
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月28日
發(fā)明者王繼華 申請(qǐng)人:王繼華