專利名稱：惡性腫瘤的診斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及惡性腫瘤的存在、嚴(yán)重程度、治療方法的選擇或者效果判定、復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性或者是否復(fù)發(fā)的判定方法以及診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
近年來，在世界上被診斷為惡性腫瘤的人達(dá)到1000萬(wàn)人/年以上，惡性腫瘤為死因的人也超過700萬(wàn)人/年，均存在增加趨勢(shì)。作為與惡性腫瘤患者的生存有關(guān)的重要因素，認(rèn)為是正確的診斷、適當(dāng)?shù)闹委熂捌湫Ч卸?、?fù)發(fā)的預(yù)知 防止等。為了獲得在這些之中有用的信息，單獨(dú)或者組合地采用組織病理診斷、基因檢查、圖像診斷、利用了血液的臨床檢查等。其中，血液中的腫瘤標(biāo)記的測(cè)定簡(jiǎn)便性良好，是比較廉價(jià)的檢查。
惡性腫瘤大致被劃分為上皮性惡性腫瘤(carcinoma)和非上皮性惡性腫瘤(sarcoma)。屬于非上皮性惡性腫瘤的一種的造血器官腫瘤在新WHO分類中大體上被劃分為白血病和惡性淋巴瘤。白血病分為發(fā)展快的急性白血病和發(fā)展比較慢的慢性白血病，急性白血病進(jìn)一步分為急性淋巴性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)。ALL根據(jù)白血病細(xì)胞的起源進(jìn)一步分為T細(xì)胞性和B細(xì)胞性。另一方面，在骨髓中確認(rèn)20%以上的原始細(xì)胞(芽球)時(shí)分類為AML，低于20%的情況被分類為骨髓增生異常綜合癥(MDS)。急性白血病(AL)時(shí)，由于病情發(fā)展快，因此重要的是立刻開始治療。在懷疑是AL時(shí)、懷疑有復(fù)發(fā)的可能性時(shí)進(jìn)行骨髓穿刺檢查并分析骨髓細(xì)胞來進(jìn)行診斷，但該檢查對(duì)于患者的侵襲性非常高而無法頻繁實(shí)施。另外，對(duì)于與AL不同、保持著分化 成熟能力的慢性白血病(CL)，慢性骨髓性白血病(CML)被列入骨髓增殖性疾病(MPD )，慢性淋巴性白血病(CLL)被列入惡性淋巴瘤。CL時(shí)，缺乏癥狀，病情的進(jìn)展緩慢，長(zhǎng)期來說有時(shí)會(huì)引起AL化(急性轉(zhuǎn)化)，因而在治療中或者結(jié)束后也要進(jìn)行定期的過程觀察。另一方面，惡性淋巴瘤大致劃分為霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在日本，約90%的惡性淋巴瘤被列入NHL，緩慢發(fā)展的低惡性程度的濾泡性淋巴瘤、發(fā)展更快的中惡性程度的彌漫性大B細(xì)胞性淋巴瘤的病例很多。NHL的治療根據(jù)階段分類、惡性程度的不同而異，尤其是低惡性程度的淋巴瘤具有發(fā)展慢治療難以起效的特征，也會(huì)呈現(xiàn)惡性程度發(fā)展、向白血病轉(zhuǎn)移，因此必需對(duì)病情的過程注意。另外，由于成為惡性淋巴瘤病灶的淋巴結(jié)遍布全身，因此與白血病相比難以特定具體的病灶部位。尤其在已復(fù)發(fā)時(shí)，實(shí)際情況是難以發(fā)現(xiàn)具體的病灶部位。所以，知悉疾病在身體的何處、蔓延多廣是非常重要的，從而需要進(jìn)行CT、MRI、PET等昂貴的圖像診斷、侵襲性大的骨髓穿刺檢查。另外，作為反映疾病的范圍、趨勢(shì)、治療效果的檢查,可進(jìn)行乳酸脫氫酶(LDH)、C反應(yīng)性蛋白(CRP)、3 2-微球蛋白、鐵蛋白、可溶性白細(xì)胞介素-2受體(SIL-2R)等血液檢查。但是，已知這些血液檢查項(xiàng)目在肝功能障礙、腎功能障礙、細(xì)菌感染、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或SLE等膠原病等中也為高值。因此，在造血器官腫瘤診斷中應(yīng)用這些血液檢查項(xiàng)目時(shí)，必需注意如上所述的高值化因素。作為以肝癌、胰腺癌、大腸癌等為代表的上皮性惡性腫瘤所涉及的腫瘤標(biāo)記，在臨床檢查中利用a -胎球蛋白、CEA、CA19-9等，但單獨(dú)利用時(shí)經(jīng)常會(huì)臟器特異性、惡性腫瘤檢測(cè)靈敏度不足，將多個(gè)腫瘤標(biāo)記組合來進(jìn)行測(cè)定的病例也屢見不鮮。因此，希望開發(fā)出能夠成為新的腫瘤標(biāo)記的測(cè)定項(xiàng)目。LRlI(LDL receptor relative with 11 ligand-binding repeats)是作為在 LDL受體家族中具有特征性的結(jié)構(gòu)的新型LDL受體類似蛋白質(zhì)被鑒定了的物質(zhì)(專利文獻(xiàn)1，非專利文獻(xiàn)I)。報(bào)道了該LRll在由平滑肌細(xì)胞游離和增殖而引起的血管內(nèi)膜肥厚部位表達(dá)特異性地亢進(jìn)(非專利文獻(xiàn)2)。另外，已知在哺乳動(dòng)物的血液中存在著可溶性LR11、以及動(dòng)脈硬化性疾病患者中的可溶性LRll濃度與健康的正常人相比有意義地高值化(專利文獻(xiàn) 2)、成為對(duì)頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度(MT)進(jìn)行規(guī)定的獨(dú)立的說明要素(非專利文獻(xiàn)3)等。另夕卜，也已知簡(jiǎn)單正確地測(cè)定血液、腦脊髓液中的可溶性LRll的方法(專利文獻(xiàn)3、非專利文獻(xiàn)4)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :日本特開平9-163988號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 :W02008/155891專利文獻(xiàn)3 W02009/116268非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I J. Biol. Chem. 1996; 271，24761-24768非專利文獻(xiàn)2 Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1999; 19, 2687-2695非專利文獻(xiàn)3 J. Clin. Invest. 2008; 118, 2733-2746非專利文獻(xiàn)4 Clin. Chem. 2009; 55, 1801-1808

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供對(duì)惡性腫瘤的存在、嚴(yán)重程度、治療方法的選擇或者效果判定、復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性或者是否復(fù)發(fā)進(jìn)行判定的方法以及診斷用試劑或試劑盒。于是，本發(fā)明人為了找到新型的惡性腫瘤標(biāo)記進(jìn)行了各種研究，結(jié)果也是完全意外地發(fā)現(xiàn)了在惡性腫瘤患者的體液樣品中以遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于健康的正常人的濃度存在著可溶性LRll0然后，獲得了該可溶性LRll濃度由于治療而正常化、在復(fù)發(fā)時(shí)會(huì)再次升高等的見解，發(fā)現(xiàn)了作為用于對(duì)惡性腫瘤的存在、嚴(yán)重程度、治療方法的選擇或者效果判定、復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性或者是否復(fù)發(fā)進(jìn)行判定的腫瘤標(biāo)記是有用的。本發(fā)明是基于該見解而完成的技術(shù)方案。即，本發(fā)明提供一種對(duì)惡性腫瘤的存在、嚴(yán)重程度、治療方法的選擇或者效果判定、復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性或者是否復(fù)發(fā)進(jìn)行判定的方法，其特征在于，包括下述工序，I)對(duì)來自被檢驗(yàn)體試樣中的可溶性LRll濃度和/或量進(jìn)行測(cè)定，2)將該測(cè)定值與健康人群的可溶性LRll測(cè)定值進(jìn)行比較。另外，本發(fā)明還提供一種試劑或者試劑盒，含有能夠?qū)碜员粰z驗(yàn)體試樣中的可溶性LRll濃度和/或量進(jìn)行測(cè)定的試劑，用于通過將該測(cè)定值與健康人群的可溶性LRll測(cè)定值進(jìn)行比較來對(duì)惡性腫瘤的存在、嚴(yán)重程度、治療方法的選擇或者效果判定、復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性或者是否復(fù)發(fā)進(jìn)行判定。另外，本發(fā)明還提供一種惡性腫瘤的存在、嚴(yán)重程度、治療方法的選擇或者效果判定、復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性或者是否復(fù)發(fā)的診斷用試劑盒，其特征在于，含有能夠?qū)扇苄訪Rll濃度和/或量進(jìn)行測(cè)定的試劑。根據(jù)本發(fā)明的方法，對(duì)來自懷疑存在惡性腫瘤的患者的試樣中的可溶性LRll濃度進(jìn)行測(cè)定，與健康的正常人的LRll濃度進(jìn)行比較，由此能夠提供在對(duì)惡性腫瘤的存在、嚴(yán)重程度、治療方法的選擇或者效果判定進(jìn)行評(píng)價(jià)上有用的信息。另外，即使在治療了惡性腫瘤之后，也能夠通過繼續(xù)測(cè)定可溶性LRll來預(yù)知復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性或者是否復(fù)發(fā)。


[圖I]表示對(duì)急性骨髓性白血病患者緩解治療前后血清中的可溶性LRll的濃度變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)的結(jié)果。[圖2]是表示可溶性LRll蛋白質(zhì)濃度低(<20ng/mL)的急性骨髓性白血病患者與可溶性LRll蛋白質(zhì)濃度高(> 20ng/mL)的急性骨髓性白血病患者的緩解率的圖。[圖3]是表示可溶性LRll蛋白質(zhì)濃度低(<20ng/mL)的急性骨髓性白血病患者與可溶性LRll蛋白質(zhì)濃度高(> 20ng/mL)的急性骨髓性白血病患者的總生存率的圖。
具體實(shí)施例方式下面，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。本發(fā)明以使用可溶性LRll作為惡性腫瘤標(biāo)記為特征。在本發(fā)明中作為對(duì)象的惡性腫瘤被劃分為上皮性惡性腫瘤、以及屬于非上皮性惡性腫瘤的一種的造血器官腫瘤。進(jìn)一步詳細(xì)而言，上皮性惡性腫瘤包括胃癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、食道癌、乳腺癌、子宮頸癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、大腸癌、膽囊癌等，造血器官腫瘤包括急性白血病、慢性白血病、以非霍奇金淋巴瘤為代表的惡性淋巴瘤,但不限定于此。本發(fā)明的判定方法包括下述工序(I )對(duì)來自被檢驗(yàn)體試樣中的可溶性LRl I濃度和/或量進(jìn)行測(cè)定，(2)將該測(cè)定值與健康人群的可溶性LRll測(cè)定值進(jìn)行比較。作為本發(fā)明中的被檢驗(yàn)體，只要是能出現(xiàn)惡性腫瘤癥狀的被檢驗(yàn)體，則沒有特別限定，例如可以舉出人、小鼠、大鼠、兔子、豬、狗、貓等哺乳動(dòng)物。另外，作為來自被檢驗(yàn)體的試樣，可以舉出血液(血清、血漿)、腦脊髓液、淋巴液、尿、組織、細(xì)胞等，但從試樣制備的容易性考慮，優(yōu)選血液，特別優(yōu)選血清。另外，對(duì)于來自被檢驗(yàn)體的試樣而言，優(yōu)選來自懷疑有惡性腫瘤的動(dòng)物(尤其是人)的試樣，特別優(yōu)選來自利用其它腫瘤標(biāo)記懷疑有惡性腫瘤的人的試樣。來自被檢驗(yàn)體的試樣中可溶性LRll的濃度或量的測(cè)定可采用對(duì)可溶性LRll有親和性的物質(zhì)進(jìn)行。該親和性物質(zhì)只要是對(duì)可溶性LRll具有結(jié)合能力的物質(zhì)，則沒有特別限制，可以舉出對(duì)可溶性LRll特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，例如可以舉出脫輔基脂蛋白E (apo E)、apo E 富集的 VLDL( 0 _VLDL)、RAP(The 39_40kDa receptor-associated protein,受體相關(guān)蛋白)、uPA(urokinase-type plasminogen activator,尿激酶型纖溶酶原激活物)、PAI_1(type-1 plasminogen activator inhibitor,纖溶酶原激活物抑制因子-I)、uPA_PAI_l 復(fù)合體等蛋白質(zhì)、以及抗可溶性LRll抗體等。其中，更優(yōu)選RAP和抗可溶性LRll抗體，特別優(yōu)選抗可溶性LRll抗體。作為抗可溶性LRll抗體，只要是與從血清精制而得的可溶性LRll進(jìn)行反應(yīng)的抗體，則單克隆抗體、多克隆抗體均可，但優(yōu)選使用單克隆抗體。該抗體的制作能夠采用眾所周知的方法進(jìn)行制作。例如，在多克隆抗體的制作中，使用小鼠、大鼠、金黃地鼠、兔子、山羊、綿羊、雞等作為免疫的動(dòng)物?？寡迨菍⒖乖瓕?duì)動(dòng)物的皮下、皮內(nèi)、腹腔等一次或者多次給藥后從血清中獲得的。使用蛋白質(zhì)、肽作為 抗原時(shí)，更優(yōu)選與具有免疫激活效果的補(bǔ)液的混合物的免疫。另外，在單克隆抗體的制作中，能夠按照公知的單克隆抗體制作方法來制作，例如長(zhǎng)宗香明、寺田弘共著，“單克隆抗體”廣川書店(1990年)；Jame ff. Golding, “MonoclonalAntibody”，3rd edition, Academic Press, 1996 年。另外，也能米用 DNA 免疫法來制作單克隆抗體，可以將 Nature 1992 Mar 12 ；356 152-154、J. Immunol Mehtods Mar I;249147-154作為參考進(jìn)行制作。作為用于抗體制作的抗原，可以使用LRll蛋白質(zhì)、或其部分片段(肽)、或者組合了編碼LRll蛋白質(zhì)的cDNA的載體。為了獲得識(shí)別LRll的高級(jí)結(jié)構(gòu)的單克隆抗體，作為載有人類LRll全長(zhǎng)基因的構(gòu)建物的全長(zhǎng)LRll載體成為最適合的免疫用抗原基因，除此之外，插入了 LRll序列的部分區(qū)域的構(gòu)建物也能作為免疫用抗原基因使用。DNA免疫法可以通過對(duì)免疫動(dòng)物采用各種基因?qū)敕?例如肌肉注射、電穿孔、基因槍等)中的任一種方法將上述基因構(gòu)建物單獨(dú)或者混合地注射到動(dòng)物(小鼠或者大鼠等)的皮下并使其攝入至細(xì)胞內(nèi)來實(shí)施。該單克隆抗體可以采用對(duì)依照常法制成的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并從培養(yǎng)上清中分離的方法、將該雜交瘤細(xì)胞投與到與其具有適合性的哺乳類動(dòng)物并作為腹水回收的方法來制造?？贵w可以根據(jù)需要地將其更加精制地使用。作為精制 分離抗體的方法，有以往公知的方法，例如硫酸銨沉淀法等鹽析、利用Sephadex等的凝膠過濾法、離子交換色譜法、利用蛋白A色譜柱等的親和性精制法等。來自被檢驗(yàn)體的試樣中的可溶性LRll的測(cè)定方法沒有特別限定，但優(yōu)選通過使用了抗可溶性LRll抗體的免疫學(xué)方法、利用了 RAP等的親和性的方法、以及將它們組合的方法進(jìn)行測(cè)定。作為免疫學(xué)方法，例如可采用免疫染色(蛋白免疫印跡，Western blot)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、免疫比濁法(TIA、LTIA)、酶免疫測(cè)定法、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法、熒光免疫測(cè)定法等，除此以外，還能采用使用了抗體和RAP等對(duì)LRll具有親和性的物質(zhì)的夾心ELISA。另外，如果將使試樣中的可溶性LRll吸附在預(yù)先載帶有RAP等親和性物質(zhì)的不溶性擔(dān)載體后用合適的緩沖液進(jìn)行洗滌、以及將該可溶性LRll洗脫這樣的前處理進(jìn)行組合，則能夠除去試樣中含有的混雜蛋白質(zhì)，能夠高精度地測(cè)定可溶性LR11，因此優(yōu)選。另外，本發(fā)明人等建立的、采用了介由表面活性劑進(jìn)行的前處理的ELISA法(Clin. Chem. 2009; 55, 1801-1808)非常簡(jiǎn)便并且能夠高精度地測(cè)定，因此特別優(yōu)選。應(yīng)予說明，在可溶性LRl I的測(cè)定中，為了獲得定量值、或者半定量值，優(yōu)選與成為基準(zhǔn)的LRll量/濃度進(jìn)行比較。這種情況下，作為成為基準(zhǔn)的LRll量/濃度，優(yōu)選使用已知濃度的血清可溶性LR11，由平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的培養(yǎng)細(xì)胞或培養(yǎng)上清中回收而得的LRl I，重組LRl I，或者在抗體制作時(shí)用作免疫原的合成肽等。接著，將所得的測(cè)定值與健康人群的可溶性LRll測(cè)定值進(jìn)行比較。健康人群的可溶性LRll測(cè)定值優(yōu)選采用與上述來自被檢驗(yàn)體的試樣的情況相同的方法預(yù)先進(jìn)行測(cè)定。比較來說，優(yōu)選使用將健康人群的可溶性LRll測(cè)定值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理而求出的基準(zhǔn)值。該基準(zhǔn)值優(yōu)選對(duì)每個(gè)對(duì)象疾病都以統(tǒng)計(jì)學(xué)的方式求出。如同在后述實(shí)施例中的記載，可判定在存在惡性腫瘤時(shí)、在嚴(yán)重化時(shí)、在具有復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性時(shí)，來自被檢驗(yàn)體的試樣的可溶性LRll的濃度或者量比健康人群的上述基準(zhǔn)值有意義地高。因此，通過來自被檢驗(yàn)體的試樣的可溶性LRll的濃度或量與該 基準(zhǔn)值的對(duì)t匕，能夠?qū)盒阅[瘤的存在、嚴(yán)重程度、治療方法的選擇或者效果判定、復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性或者是否復(fù)發(fā)進(jìn)行判定。所謂惡性腫瘤的嚴(yán)重程度是指癌發(fā)展到何種程度的指標(biāo)。在本發(fā)明中，所謂“對(duì)惡性腫瘤的存在、嚴(yán)重程度進(jìn)行判定”是指，例如對(duì)于造血器官腫瘤的情況而言，由于在WHO分類中被詳細(xì)地劃分成白血病、惡性淋巴瘤，也評(píng)價(jià)了惡性程度，所以包括劃分成這些分類。另外，對(duì)于非霍奇金淋巴瘤的情況而言，在WHO分類中根據(jù)細(xì)胞增殖的速度劃分為“高惡性程度”、“中惡性程度”及“低惡性程度”，包括劃分成這些分類。應(yīng)予說明，作為各自代表性的腫瘤，可以舉出濾泡性淋巴瘤、彌漫性大B細(xì)胞性淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴母細(xì)胞性淋巴瘤。另外，關(guān)于上皮性惡性腫瘤，可使用根據(jù)腫瘤的大小與發(fā)展程度、向所屬淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況、以及是否遠(yuǎn)程轉(zhuǎn)移進(jìn)行的 m分類這種國(guó)際性疾病階段分類有關(guān)的指標(biāo)，進(jìn)一步以該分類為基礎(chǔ)可使用能夠一次地表現(xiàn)癌的發(fā)展程度和擴(kuò)散程度的階段分類，包括劃分成這些分類。采用例如緩解期導(dǎo)入療法進(jìn)入緩解期時(shí)，實(shí)現(xiàn)了希望的治療目的。在此，所謂緩解，例如對(duì)于造血器官腫瘤的情況而言，是指從血液、骨髓中未檢測(cè)出白血病細(xì)胞、惡性淋巴瘤的狀態(tài)。治療方法的選擇或者效果判定能夠通過對(duì)出現(xiàn)了癥狀的腫瘤的大小變化進(jìn)行觀察來評(píng)價(jià)。另外，對(duì)于復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性，經(jīng)過治療沒有將LRll的濃度降低到正常區(qū)域時(shí)可判斷為復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性高，進(jìn)而對(duì)于是否復(fù)發(fā)，在間歇期、由治療帶來的緩解之后，可溶性LRll的濃度開始升高時(shí)，可評(píng)價(jià)為腫瘤再次復(fù)發(fā)的可能性高。進(jìn)而，利用本發(fā)明方法，能夠進(jìn)行以后的預(yù)測(cè)，例如能夠預(yù)測(cè)2 3年生存率。另外，在判定上述的惡性腫瘤的存在等時(shí)，不僅是可溶性LRll的測(cè)定值，還優(yōu)選與其它公知的腫瘤標(biāo)記進(jìn)行組合來判斷。作為公知的腫瘤標(biāo)記，可以舉出a-胎球蛋白、CEA、CA19-9、CA125、PIVKAII、SCC、SLX、彈性蛋白酶 I、細(xì)胞角質(zhì)蛋白 19 片段、DUPAN2 等。本發(fā)明的試劑盒以含有能夠?qū)扇苄訪Rll進(jìn)行測(cè)定的試劑為特征。作為能夠?qū)扇苄訪Rl I進(jìn)行測(cè)定的試劑，可優(yōu)選地舉出含有對(duì)可溶性LRl I具有親和性的物質(zhì)的試劑，例如含有抗可溶性LRll抗體、RAP等上述蛋白質(zhì)的試劑，但不限定于此，該試劑盒可以包含可溶性LRll的檢測(cè)所必需的其它構(gòu)成要素，例如反應(yīng)緩沖液、反應(yīng)容器。在本發(fā)明的試劑盒中，可進(jìn)一步包含上述健康人群的可溶性LRll測(cè)定值數(shù)據(jù)、用于與該數(shù)據(jù)進(jìn)行比較的協(xié)議。實(shí)施例
下面，通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明具體地進(jìn)行說明。但是，本發(fā)明不限定于這些實(shí)施例。參考例I基于DNA免疫法的抗可溶性LRll單克隆抗體的制作( 1)表達(dá)載體的構(gòu)建將構(gòu)成LRll的全長(zhǎng)基因(Q92673)的部分氨基序列(1000-1550)(序列號(hào)碼I)的基因片段插入到帶有FLAG標(biāo)簽的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(pcDNA3. 1，Invitrogen公司)。表達(dá)載體含有對(duì)由來自人類堿性磷酸酶的GPI錨定序列形成的肽進(jìn)行編碼的DNA。將其作為L(zhǎng)Rll [1000-1550]載體。(2) CHO表達(dá)物的確認(rèn)對(duì)于目標(biāo)基因產(chǎn)物是否如設(shè)計(jì)地利用構(gòu)建的LRll [1000-1550]載體在細(xì)胞膜表面表達(dá)，在免疫前通過使用了 CHO細(xì)胞(來自中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)的瞬間導(dǎo)入表達(dá)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了確認(rèn)。即，在前一天對(duì)6孔板的每個(gè)孔鋪入IXlO6個(gè)細(xì)胞。在5%C02、37°C的條件下培養(yǎng)一晚。轉(zhuǎn)染當(dāng)日，在聚苯乙烯圓管內(nèi)將質(zhì)粒稀釋液(3 ii g plasmid DNA+500 u L D-MEM)與lipofectamine2000 稀釋液(9 y L 的 lipofectamine2000+500 y L 的 D-MEM)充分混合，在室溫孵育20分鐘后，除去在前一天鋪板形成的培養(yǎng)上清，以不剝離細(xì)胞的方式輕輕地添加到細(xì)胞中。在5%C02、37°C的條件下孵育5小時(shí)后，取出上清，添加含有5%FCS的D-MEM培養(yǎng)基后在5%C02、37°C的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。第二天,通過解離緩沖液(Invitrogen公司)從板上剝離細(xì)胞，并用于流式細(xì)胞儀(FCM)解析。FCM解析以如下方式實(shí)施。即，在第一抗體反應(yīng)中，在含有3%FCS的磷酸緩沖液、pH7. 2 (PBS)中使得ANTI-FLAG (注冊(cè)商標(biāo))M2抗體(SIGMA)于4°C與細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)30分鐘。在第二抗體中，用含有3%FCS的磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞后，在含有3%FCS的PBS中使得PE標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體(Beckman)于4°C進(jìn)行30分鐘反應(yīng)。用含有3%FCS的PBS洗滌細(xì)胞后，懸浮于適量的含有3%FCS的PBS中，提供給流式細(xì)胞儀。其結(jié)果，確認(rèn)了目標(biāo)基因產(chǎn)物通過構(gòu)建的LRll [1000-1550]載體在細(xì)胞表面表達(dá)。(3)基于DNA免疫法的抗體的制作DNA免疫法是將上述(I)的LRll [1000-1550]載體單獨(dú)或者混合地對(duì)金粒子敏化的載體通過基因槍對(duì)免疫動(dòng)物的皮下進(jìn)行，導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。具體而言,用Helios (注冊(cè)商標(biāo))Gene Gun Optimization Kit (Bio-Rad,美國(guó)),依照該試劑盒的使用說明書每25mg的金粒子給予200 u g的上述LRll [1000-1550]載體。免疫每隔2周實(shí)施4次。在第4次免疫時(shí)，對(duì)少量的抗血清取樣，將用含有3%FCS的PBS稀釋1000倍而得的抗血清作為第一抗體進(jìn)行FCM解析。此時(shí)，使用使上述(2)的目的基因產(chǎn)物瞬間表達(dá)的CHO細(xì)胞(以下，也稱為強(qiáng)制表達(dá)細(xì)胞)進(jìn)行FCM解析，確認(rèn)了抗體價(jià)升高。另外，單克隆抗體的制作采用一般的細(xì)胞融合法實(shí)施。即，進(jìn)行2次末次加強(qiáng)免疫(final boost)后，對(duì)已免疫的動(dòng)物進(jìn)行解剖，依照規(guī)定方法分離產(chǎn)生抗體的細(xì)胞并與小鼠骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合，從而制成產(chǎn)生抗體的雜交瘤株。培養(yǎng)這些雜交瘤株后，取培養(yǎng)上清的一部分，通過利用了強(qiáng)制表達(dá)細(xì)胞的酶免疫測(cè)定法和FCM，選擇出與抗原蛋白質(zhì)反應(yīng)、與非抗原蛋白質(zhì)不反應(yīng)的試樣。應(yīng)予說明，利用了強(qiáng)制表達(dá)細(xì)胞的酶免疫測(cè)定法以如下的方式進(jìn)行。將強(qiáng)制表達(dá)細(xì)胞涂在96孔板上，使雜交瘤培養(yǎng)上清作為第一抗體進(jìn)行反應(yīng)，第一抗體反應(yīng)后，洗滌板并添加第二抗體。在此，所謂第二抗體是能夠識(shí)別小鼠免疫球蛋白或者大鼠免疫球蛋白的抗體，是用辣根過氧化物酶(HRP)進(jìn)行了標(biāo)記的抗體。反應(yīng)后，添加與標(biāo)記了第二抗體的酶相對(duì)應(yīng)的熒光基質(zhì)，用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行解析。
接著，采用有限稀釋法進(jìn)行克隆，選擇穩(wěn)定且發(fā)現(xiàn)高抗體價(jià)的雜交瘤株作為產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤株。接著，以如下的方式實(shí)施來自腹水的單克隆抗體的大量制備。對(duì)用0.5mL姥鮫烷(Pristane)進(jìn)行了前處理的裸鼠腹腔注射0. 5mL的磷酸緩沖生理鹽水、pH7. 4中的IXlO6 3X IO6克隆化雜交瘤細(xì)胞。在大約2周后，收集腹水，用蛋白A親和精制單克隆抗體?？纱_認(rèn)2種這樣利用DNA免疫法而得的代表性的抗可溶性LRlI單克隆抗體(來自小鼠M3，來自大鼠R14)與來自人類和兔子的血清的可溶性LRlI進(jìn)行反應(yīng)。參考例2來自兔子血清的可溶性LRll的制備對(duì)利用插入了人類RAP基因的pGEX2T (GE Healthcare Bioscience公司制造)載體轉(zhuǎn)化了的大腸桿菌DH5 a進(jìn)行培養(yǎng)，通過離心分離回收菌體。將從3L的培養(yǎng)液中回 收到的菌體懸浮于含有0. 2%溶菌酶和0. 5%TritonX-100的PBS (pH7. 2)中，通過超聲波處理來破碎菌體。使該破碎液的離心上清中的RAP/GST融合蛋白質(zhì)通過IOmL的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathione Sepharose) 4FF (GE Healthcare Bioscience 公司制造)并使其吸附后，用PBS (pH7. 2，以下無特別記載時(shí)為相同pH)洗滌，制成RAP-瓊脂糖凝膠樹脂。將IOmL的該RAP-瓊脂糖凝膠樹脂與IL的兔子血清進(jìn)行混合，邊于4°C緩慢地?cái)嚢柽吺蛊浞磻?yīng)一夜后，回收RAP-瓊脂糖凝膠樹脂并用PBS洗滌。然后用檸檬酸緩沖液(pH5. 0)洗脫兔子可溶性LRll并濃縮后，用PBS透析。進(jìn)一步將該液體與化學(xué)鍵合了抗可溶性LRll單克隆抗體(M3)的瓊脂糖凝膠樹脂混合，邊于4°C緩慢地?cái)嚢柽吺蛊浞磻?yīng)一夜后，用檸檬酸緩沖液(PH3.0)中洗脫兔子可溶性LR11。將該洗脫液進(jìn)行濃縮后，通過凝膠過濾色譜(Supedex200 ；GE Healthcare Bioscience公司制造)用PBS進(jìn)行分離精制。將收集了可溶性LRll的溶出流份并濃縮而得的濃縮物作為精制兔子可溶性LR11。對(duì)于該蛋白質(zhì)含量，利用SDS聚丙烯酰胺電泳進(jìn)行分離后，通過銀染色檢測(cè)可溶性LRll的蛋白質(zhì)。同時(shí)基于含量已知的牛血清白蛋白(BSA)的染色帶的發(fā)色強(qiáng)度，計(jì)算出精制兔子可溶性LRll的濃度，作為在下面的參考例3中記載的ELISA法中的校準(zhǔn)值使用。參考例3基于ELISA法的血清中的可溶性LRll的檢測(cè)將抗可溶性LRll單克隆抗體(M3)用PBS稀釋成10 ii g/mL，在微孔板(NUNC公司制造)中每I孔添加IOOiI L，在室溫固化2小時(shí)。用含有0. 05%Tween20的PBS (PBST)洗滌后，每I孔添加200 u L含有1%BSA的PBST (BSA-PBST),在室溫封閉I小時(shí)。用以3:1的比例混合了 7%MEGA_9 (同仁化學(xué)公司制造)和HBR (Scantibodies Laboratory公司制造)的樣品處理液將人血清稀釋成11倍。另外，參考例2中精制的來自兔子的可溶性LRll也用上述樣品處理液梯度稀釋，作為校準(zhǔn)值。每I孔添加IOOy L的這些稀釋樣品，在室溫使其反應(yīng)一夜后，將標(biāo)記了生物素的抗可溶性LRll單克隆抗體(R14)用BSA-PBST稀釋為
0.4 u g/mL，每I孔添加100 u L，在室溫使其反應(yīng)4小時(shí)。用PBST洗滌后，將過氧化物酶標(biāo)記鏈霉抗生素蛋白(PIERCE公司制造)用BSA-PBST稀釋為0. 2 y g/mL,每I孔添加100 u L，在室溫使其反應(yīng)I小時(shí)。用PBST洗滌后，接著每I孔添加100 ii L的TMB基質(zhì)液，在室溫使其發(fā)色30分鐘，每I孔添加IOOii L的I. 5N硫酸使發(fā)色停止后，用酶標(biāo)儀(Abs. 450nm)進(jìn)行測(cè)定。利用由校準(zhǔn)值作出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出試樣中的可溶性LRll濃度，乘以稀釋倍率，即為人血清中的可溶性LRll濃度。
實(shí)施例I作為造血器官腫瘤疾病的標(biāo)記的可溶性LRll對(duì)于從經(jīng)初次診斷被診斷為造血器官腫瘤的81名個(gè)體中采取的血清，求出可溶性LRll濃度，與從87名并無脂質(zhì)異常的健康的正常人另采取的血清中的可溶性LRll濃度進(jìn)行比較。81名被診斷為造血器官腫瘤的疾病分類的詳細(xì)內(nèi)容是急性淋巴性白血病6名、急性骨髓性白血病11名、慢性淋巴性白血病5名、慢性骨髓性白血病7名、霍奇金淋巴瘤5名、非霍奇金淋巴瘤26名、骨髓增生異常綜合癥4名、多發(fā)性骨髓瘤8名、以及POEMS綜合癥9名。血清中的可溶性LRll濃度采用參考例2所示的ELISA法進(jìn)行測(cè)定。對(duì)于各個(gè)的疾病分類，考慮健康的正常人的濃度水平，將暫定的臨界值設(shè)定為20ng/mL時(shí)的病例數(shù)以及其平均值不于表I。由表I，可判斷出與健康的正常人相比，尤其在白血病、非霍奇金淋巴瘤中高頻率地確認(rèn)了遠(yuǎn)超過臨界值的病例。[表 I]
權(quán)利要求
1.一種對(duì)惡性腫瘤的存在、嚴(yán)重程度、治療方法的選擇或者效果判定、復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性或者是否復(fù)發(fā)進(jìn)行判定的方法，其特征在于，包括下述工序 1)測(cè)定來自被檢驗(yàn)體的試樣中的可溶性LRll濃度和/或量， 2)將該測(cè)定值與健康人群的可溶性LRll測(cè)定值進(jìn)行比較。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，惡性腫瘤是造血器官腫瘤或者上皮性惡性腫瘤。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，造血器官腫瘤是白血病或者惡性淋巴瘤。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，白血病是急性白血病或者慢性白血病。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，惡性淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，上皮性惡性腫瘤選自胃癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、食道癌、乳腺癌、子宮頸癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、大腸癌及膽囊癌。
7.根據(jù)權(quán)利要求I 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，來自被檢驗(yàn)體的試樣是血液、血清、血漿、腦脊髓液及尿中的任一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求I 7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，測(cè)定采用與可溶性LRll特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，蛋白質(zhì)選自抗可溶性LRll抗體、apoE、P-VLDL、RAP、uPA、PAI-I、uPA-PAI-l 復(fù)合體。
10.一種試劑或者試劑盒，含有能夠?qū)碜员粰z驗(yàn)體的試樣中的可溶性LRll濃度和/或量進(jìn)行測(cè)定的試劑，用于通過將該測(cè)定值與健康人群的可溶性LRll測(cè)定值進(jìn)行比較來對(duì)惡性腫瘤的存在、嚴(yán)重程度、治療方法的選擇或者效果判定、復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性或者是否復(fù)發(fā)進(jìn)行判定。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑或者試劑盒，其中，惡性腫瘤是造血器官腫瘤或者上皮性惡性腫瘤。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的試劑或者試劑盒，其中，造血器官腫瘤是白血病或者惡性淋巴瘤。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的試劑或者試劑盒，其中，白血病是急性白血病或者慢性白血病。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的試劑或者試劑盒，其中，惡性淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的試劑或者試劑盒，其中，上皮性惡性腫瘤選自胃癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、食道癌、乳腺癌、子宮頸癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、大腸癌及膽囊癌。
16.根據(jù)權(quán)利要求10 15中任一項(xiàng)所述的試劑或者試劑盒，其中，來自被檢驗(yàn)體的試樣是血液、血清、血漿、腦脊髓液及尿中的任一種。
17.根據(jù)權(quán)利要求10 16中任一項(xiàng)所述的試劑或者試劑盒，其中，測(cè)定采用與可溶性LRll特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)進(jìn)行。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑或者試劑盒，其中，蛋白質(zhì)選自抗可溶性LRll抗體、apo E、P-VLDL、RAP、uPA、PAI-l、uPA-PAI-l 復(fù)合體。
19.一種惡性腫瘤的存在、嚴(yán)重程度、治療方法的選擇或者效果判定、復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性或者是否復(fù)發(fā)的診斷用試劑盒，其特征在于，含有能夠?qū)扇苄訪Rll濃度和/或量進(jìn)行測(cè)定的試劑。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中，能夠?qū)扇苄訪Rll濃度和/或量進(jìn)行測(cè)定的試劑是含有選自抗可溶性LRll抗體、apo E、^ -VLDL, RAP、uPA、PAI-I、uPA-PAI-1復(fù)合體中的物質(zhì)的試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種對(duì)惡性腫瘤的存在、嚴(yán)重程度、治療方法的選擇或者效果判定、復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性或者是否復(fù)發(fā)進(jìn)行判定的方法及診斷用試劑盒。對(duì)惡性腫瘤的存在、嚴(yán)重程度、治療方法的選擇或者效果判定、復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性或者是否復(fù)發(fā)進(jìn)行判定的方法包括下述工序，1)對(duì)來自被檢驗(yàn)體試樣中的可溶性LR11濃度和/或量進(jìn)行測(cè)定、2)將該測(cè)定值與健康人群的可溶性LR11測(cè)定值進(jìn)行比較。
文檔編號(hào)G01N33/574GK102656456SQ20108005685
公開日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月16日
發(fā)明者中世古知昭, 齋藤康, 松尾正直, 武城英明, 海老沼宏幸, 深町勇, 田久保耕平 申請(qǐng)人:積水醫(yī)療株式會(huì)社