專利名稱：測定液體中的熒光的方法和裝置的制作方法
測定液體中的熒光的方法和裝置本發(fā)明涉及熒光的測定，特別是對液體中存在的熒光化合物的識別。使用熒光染料作為液體和固體本體材料的標(biāo)記或標(biāo)簽是公知的技術(shù)。典型的應(yīng)用是標(biāo)記液體如碳?xì)淙剂弦栽诠?yīng)鏈中的后續(xù)點(diǎn)鑒定液體。做這些工作通常出于操作原因， 例如幫助區(qū)分燃料間的等級，或由于其它原因，特別是保證燃料的品質(zhì)，阻止和檢測摻假并提供檢查是否正確納稅的方式。除了燃料，還可以標(biāo)記其它產(chǎn)品，如植物油以確認(rèn)產(chǎn)品由某特定來源生產(chǎn)，或證明達(dá)到特定的標(biāo)準(zhǔn)。對于檢測用作標(biāo)記物的熒光化合物的方法，當(dāng)被標(biāo)記的材料通過吸收激發(fā)光或發(fā)射光、通過顯示其自身的背景熒光或者通過改變標(biāo)記物的熒光特征而與標(biāo)記物的熒光發(fā)生相互作用時(shí)，則會出現(xiàn)問題。在用熒光染料標(biāo)記有色液體，如石油衍生產(chǎn)品時(shí)，這尤其成為問題。烴基液體，例如燃料，顯示寬的熒光發(fā)射。熒光背景傾向于增強(qiáng)染料的任何熒光信號，但液體固有的吸收會減少染料的熒光。標(biāo)記這些燃料，特別是汽油和柴油，是標(biāo)記化合物的重要應(yīng)用，且對于在這些有價(jià)值和廣泛的產(chǎn)品中使用這些標(biāo)記物，高精度地檢測單一或多種標(biāo)記化合物的能力是至關(guān)重要的。該問題已通過多種方式解決，多數(shù)涉及通過萃取到極性液體中或固體吸附劑上的方式從液體中分離標(biāo)記化合物。例如，US5，358，873說明并要求保護(hù)檢測汽油摻假的方法，該方法通過用若丹明染料標(biāo)記，然后在含有少量無粘結(jié)快速色譜級二氧化硅的小瓶中搖動少量可疑燃料?？梢蓸悠分写嬖诘娜舻っ鳂?biāo)記染料使二氧化硅變紅。US 4，659，676描述了通過溶解到卟啉中制備的熒光標(biāo)記的絡(luò)合疏水性液體。 通過觀測照射時(shí)的特征熒光來鑒定熒光標(biāo)記的絡(luò)合疏水性液體。為達(dá)到鑒定目的，首先將卟啉萃取到酸性水溶液中以檢測熒光。US 2，392，620描述了使用傘形酮或衍生物作為石油的熒光標(biāo)記物，并通過測定萃取到堿性水溶液后的特征熒光來進(jìn)行檢測。US4，735，631中， 用某些取代的蒽醌標(biāo)記燃料，隨后通過萃取到不混溶的堿性試劑中來檢測標(biāo)記的燃料樣品中的蒽醌。本發(fā)明的目的是提供檢測存在的熒光材料的方法，該方法克服了這些現(xiàn)有方法的至少一些缺陷。根據(jù)本發(fā)明，我們提供測定溶解或分散在本體材料中的熒光標(biāo)記化合物的熒光的方法，包括步驟(a)測定所述本體材料和所述熒光標(biāo)記化合物的混合物的熒光特征；(b)猝滅熒光標(biāo)記化合物的熒光以得到猝滅混合物；(c)測定所述猝滅混合物的熒光特征；(d)比較所述混合物的熒光特征和所述猝滅混合物的熒光特征；和(e)針對本體材料的吸收的影響來校正測定的熒光發(fā)射特征。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，我們提供適于在實(shí)施任一前面要求的方法中使用的裝置，所述裝置包括(a)至少一個(gè)激發(fā)光源，其能夠發(fā)射選定波長的光，該選定波長的光激發(fā)至少一種熒光標(biāo)記化合物的可檢測熒光；(b)至少一個(gè)檢測所述至少一種熒光標(biāo)記化合物發(fā)射的熒光的光檢測設(shè)備；
(c)至少一個(gè)吸收光源，其能夠發(fā)射選定波長的光，該選定波長的光不激發(fā)任何熒光標(biāo)記化合物的可檢測熒光，但能被本體材料吸收；(d)至少一個(gè)用于檢測所述吸收光源發(fā)射的穿過樣品的光的光檢測設(shè)備；(e)計(jì)算用戶需要的關(guān)于校正的樣品熒光信息的數(shù)據(jù)處理設(shè)備；和(f)控制所述裝置的至少部分操作的控制設(shè)備。通過比較所述混合物所測定的熒光和所述猝滅混合物所測定的熒光，將它們的差別歸因于標(biāo)記化合物的熒光，從而能夠在本體材料存在下估計(jì)混合物中標(biāo)記化合物的性質(zhì)或濃度的指示，而無需依賴分離步驟。雖然在測定其熒光前分離熒光化合物對于通過其特征熒光確定化合物的存在和身份是有用的，但分離步驟可能對確定本體材料中原本存在的化合物的量的任何嘗試引入不確定性。相應(yīng)地，鑒別本體材料的方法包括將含有至少一種熒光化合物的標(biāo)記物加入所述本體材料以形成所述本體材料和所述熒光標(biāo)記化合物的混合物的步驟，然后，使用本發(fā)明的熒光測定方法測定所述至少一種熒光化合物的熒光。本體材料可以是固體或液體，但優(yōu)選為液體。液體可以為有機(jī)物或水溶液，且可以含有一種或多種溶解的成分或分散的成分。該材料通常為商業(yè)化產(chǎn)品，向其中加入標(biāo)記化合物以在供應(yīng)鏈或工業(yè)過程中的后續(xù)點(diǎn)確認(rèn)該商業(yè)化產(chǎn)品。這些產(chǎn)品包括燃料，如石油和石油衍生產(chǎn)品，尤其是汽油、柴油、煤油、潤滑油乙醇、酒精汽油、油脂和溶劑，還包括生物衍生燃料，如衍生自棕櫚油、麻風(fēng)樹、黃豆等的油。該方法也可用于確認(rèn)產(chǎn)品，如香水、墨水、清漆和涂料產(chǎn)品中的標(biāo)記化合物。熒光化合物選自可獲得的具有已知熒光特征(即在用不同的、更短的激發(fā)波長的光照射時(shí)發(fā)射發(fā)射波長的熒光)的化合物。為獲得由熒光化合物引起的熒光和本體材料引起的熒光之間最清晰的解析，化合物的激發(fā)波長和發(fā)射波長的差別應(yīng)當(dāng)與本體材料中的任何物質(zhì)盡量不同。現(xiàn)實(shí)中，獲得這一區(qū)別的最好的方式是使用在用于激發(fā)它的輻射的波長和任何發(fā)射的輻射的波長之間顯示最大可能區(qū)別的化合物。優(yōu)選，但不是必須的，是使用產(chǎn)生最大的熒光發(fā)射的激發(fā)波長，并檢測相應(yīng)于最強(qiáng)發(fā)射的波長。激發(fā)波長和發(fā)射波長之間的差距與化合物的最大吸收波長和最大熒光發(fā)射波長之間的差距相類似，但不必相同，這進(jìn)而通常稱為斯托克斯位移(Stokes shift)。在后面的解釋中，參考了任何躍遷并非嚴(yán)格與斯托克斯位移相對應(yīng)的化合物的斯托克斯位移，如涉及其它振動能級的躍遷，也隱含了熒光譜中的子帶，或者造成熒光發(fā)射的任何躍遷。典型地，有用的標(biāo)記化合物的斯托克斯位移為至少lOnm，更普遍為至少20nm，通常至少50nm。當(dāng)本體材料為固有熒光特性(例如汽油和柴油)或含有一種或多種處于未標(biāo)記狀態(tài)的熒光化合物時(shí)，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中優(yōu)選使用具有比本體材料自身的斯托克斯位移更大的斯托克斯位移的熒光標(biāo)記化合物。熒光標(biāo)記化合物的激發(fā)波長通常處于從紫外到紅外的范圍內(nèi)，即約200-1200nm。優(yōu)選的熒光化合物包括激發(fā)和發(fā)射波長為約 350-850nm的熒光染料。這些染料可以吸收可見光區(qū)的光，即其可以具有可見的顏色，但用于有色本體材料中或者濃度非常低時(shí)，當(dāng)與本體材料混合時(shí)它們是不可見的。合適的熒光材料包括任何現(xiàn)有技術(shù)說明的作為熒光標(biāo)記物使用的材料和發(fā)現(xiàn)的適于這種用途的其它化合物。特別地我們要提到酞菁、萘酞菁、鎳連二硫烯、胺鐺化合物、次甲基染料、奧四元酸染料、熒光素及其衍生物、取代蒽醌、偶氮染料、嚇啉、香豆素、取代香豆素(包括傘形酮)、苯并吡喃及其衍生物，咕噸染料(包括若丹明)、噁嗪、克酮酸染料、萘二甲酰亞胺、萘并熒光酮(naphthofluorones)、半萘并熒光酮、三碳菁、雙吲哚基馬來酰亞胺、 1，3_ 二芳基-和1，3，5_三芳基-2-吡唑啉、吖啶、菲啶、二吡咯甲烷。

圖1顯示了一類基于取代的苯并吡喃的合適染料，其中R1為烷基取代基，其能夠稠合到與氨基取代基毗鄰的芳環(huán)上出2可以為亞氨基或羰基；這類優(yōu)選的實(shí)例中，R1為丁基取代基，R2為亞氨基。以上所列出的，僅描述了可以用于本發(fā)明方法的寬泛種類的熒光化合物，只要存在能夠猝滅出現(xiàn)于本體材料的化合物的熒光即可，而不意味對本發(fā)明的限制。還應(yīng)選擇與本體材料相容的熒光化合物，從而能夠以標(biāo)記所述材料所需的濃度溶解或分散在本體材料中。所以這些化合物可以離子形式使用，在能夠獲得時(shí)，用于極性液體或進(jìn)行衍生以提高在各類有機(jī)液體中的相容性和溶解性?？梢赃x擇使這些化合物在本體材料中可見，例如顯示出材料被標(biāo)記，或者可選地，選擇在本體材料中肉眼不可見，即為“沉默”標(biāo)記物。選擇合適的熒光化合物的其它標(biāo)準(zhǔn)包括它的毒性、價(jià)格、可獲得性和在本體材料中的穩(wěn)定性。一種或多種作為熒光標(biāo)記化合物使用的熒光染料存在于本體材料中的濃度以所述染料不影響所檢測的與本體材料相關(guān)的吸收是有益的。優(yōu)選的是，不管媒介的顏色如何，低濃度的染料的熒光反應(yīng)與濃度成比例。通過對混合物的物理處理，例如加熱，或者通過對混合物的化學(xué)處理，例如改變混合物的PH、改變?nèi)軇┑臉O性、加入“漂白劑”例如氧化劑或還原劑或者化學(xué)猝滅化合物，可完成熒光的猝滅。猝滅熒光化合物的熒光改變了它的熒光特征。我們使用的“改變”包括激發(fā)或發(fā)射波長的改變，和/或發(fā)射的熒光量的改變。通常，猝滅減少了由熒光譜中的發(fā)射峰高測定的熒光量，經(jīng)常該峰減少到低于未猝滅混合物中其峰高的20%。當(dāng)使用其激發(fā)波長 +/-5nm波長的光激發(fā)時(shí)，其熒光發(fā)射峰高與測定沒有熒光化合物的本體材料時(shí)儀器響應(yīng)典型的變化無法區(qū)分時(shí)，可認(rèn)為熒光化合物被完全猝滅。來自熒光化合物的熒光被完全猝滅不是必須的，但優(yōu)選基本上完全的猝滅。應(yīng)當(dāng)根據(jù)使用的熒光標(biāo)記物來選擇猝滅方式。猝滅化合物與熒光化合物反應(yīng)以改變其熒光特征。反應(yīng)可通過離子對締合、絡(luò)合、分子構(gòu)型的改變例如可通過改變?nèi)軇┮穑?發(fā)色團(tuán)的氧化、不溶性的產(chǎn)生、非熒光物的使用或通過其它方式實(shí)現(xiàn)。合適的猝滅化合物取決于熒光化合物的性質(zhì)。一些公知的熒光染料，例如咕噸、噻噸、二萘嵌苯和苯并吡喃衍生物的已知猝滅劑包括但不限于多金屬氧酸鹽(例如磷鉬酸、磷鎢酸、鎢硅酸、鎢鉬酸)；硫氰酸鉀(可選地與離子轉(zhuǎn)移試劑配合使用)，N-氯代琥珀酰亞胺，胺例如反-2-氨基乙胺和二氮雜二環(huán)辛烷，氫氧化四丁基銨溶液，三氯氰尿酸，過乙酸，過氧化物例如過氧化氫和過氧化苯甲酰，苯胺例如N-甲基苯胺和N，N-二甲基苯胺，硝基苯如1，3_ 二硝基苯，可溶的過渡金屬絡(luò)合物、氯和次氯酸鹽物質(zhì)。優(yōu)選的用于非極性介質(zhì)例如烴燃料的猝滅劑，為多金屬氧酸鹽的極性溶液，特別是基于醇的溶液。當(dāng)以高PPm的量加入時(shí)，這些猝滅劑立即充分猝滅染料的熒光，而不改變本體液體的熒光響應(yīng)。WO 2005/052560描述了通過將染料吸附到吸附性材料上來從液體混合物中去除熒光染料，從而可以檢測液體樣品的光密度，以根據(jù)沒有染料存在時(shí)的液體介質(zhì)的光密度修正檢測到的含有染料的液體樣品的發(fā)射熒光。利用吸附劑從本體材料中去除染料比原位猝滅染料勞動密集程度更高，因?yàn)樗蕾囉谙疵摗⑷缓筮M(jìn)入分離室，隨后將其精確稀釋到已知的體積。因此，WO 2005/052560的方法不包括于本發(fā)明中。
通過比校未猝滅的混合物的熒光發(fā)射和猝滅混合物的熒光發(fā)射來校正未猝滅的混合物的熒光發(fā)射。這決定了熒光量僅由溶液中一種或多種熒光標(biāo)記物產(chǎn)生。在優(yōu)選的實(shí)例中，從未猝滅混合物的發(fā)射光譜中扣除猝滅混合物的發(fā)射光譜。更優(yōu)選的是校正由本體材料的光吸收造成的影響。校正后的發(fā)射光譜用于確定檢測樣品的熒光特征。然后可以將一種或多種這類特征(例如熒光發(fā)射的波長和/或強(qiáng)度)與在已知顏色和背景熒光的介質(zhì)中含有已知量的熒光標(biāo)記物的標(biāo)準(zhǔn)混合物樣品的類似特征相比較。從檢測的樣品得到的發(fā)射和標(biāo)準(zhǔn)樣品得到的發(fā)射之間的差異說明從中采集樣品的本體材料已經(jīng)改變，例如稀釋或其它方式的改變?？梢杂涗洏?biāo)準(zhǔn)樣品的特征，并用作與檢測樣品的簡單的數(shù)值比較。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一旦考慮到介質(zhì)的熒光背景的作用，染料的熒光響應(yīng)的變化通常與染料溶解至其中的介質(zhì)的顏色呈近似的線性關(guān)系。這是因?yàn)榻橘|(zhì)對激發(fā)光和/或發(fā)射熒光的吸收。當(dāng)標(biāo)記的材料為在同樣的產(chǎn)品中可顯示明顯的顏色變化且隨著時(shí)間的推移顏色也自然地發(fā)生變化的有色液體例如烴燃料時(shí)，這尤為相關(guān)。在優(yōu)選的形式中，本發(fā)明的方法能夠?qū)πＵ私橘|(zhì)(即本體材料)的背景熒光并考慮其顏色后的熒光響應(yīng)(熒光量、激發(fā)或發(fā)射波長)進(jìn)行合適的校正。然后采用校準(zhǔn)將已校正的熒光響應(yīng)轉(zhuǎn)換成染料的難度。我們還證實(shí)了遵循Lippert-Mataga方程的觀測結(jié)果，即熒光程度取決于溶解到其中的介質(zhì)的極性。這說明使用吸收來校正熒光只有應(yīng)用于具有相似極性的液體才是理想的。如果使用的熒光標(biāo)記物受溶劑的極性影響較小，則基于汽油和柴油的燃料的數(shù)據(jù)能夠在同一圖中進(jìn)行比較。因此優(yōu)選使用對其分散在其中的介質(zhì)的極性變化不敏感的熒光標(biāo)記物。如果使用的熒光標(biāo)記物受溶劑的極性影響較強(qiáng)，則優(yōu)選將基于汽油的燃料的結(jié)果與其它基于汽油的燃料進(jìn)行比較，即與基于柴油的燃料分開來。如果使用的熒光標(biāo)記物具有強(qiáng)烈依賴于溶劑的熒光，則在任何分析前應(yīng)當(dāng)通過加入另一種溶劑使得介質(zhì)的極性被標(biāo)準(zhǔn)化。通過使用能夠激發(fā)熒光標(biāo)記化合物的熒光發(fā)射的波長的光照射混合物樣品，來檢測猝滅和未猝滅混合物的熒光。這通過使用標(biāo)準(zhǔn)熒光計(jì)來完成，其中用已知波長的光(激發(fā)射線)照射通常包含在透明池或比色皿中的樣品。透明的，我們指樣品池或至少樣品池的一部分對激發(fā)射線和發(fā)射熒光是基本透明的。然后使用光檢測設(shè)備收集樣品發(fā)射的光， 并測定發(fā)射光的波長和強(qiáng)度。激發(fā)射線通常具有預(yù)先確定的波長，其被選擇為能夠被樣品中的熒光材料之一吸收并產(chǎn)生熒光發(fā)射的波長。選擇的激發(fā)射線的波長取決于使用的具體熒光標(biāo)記化合物的吸收峰的形狀。激發(fā)波長一定的波長范圍，在該范圍內(nèi)染料能夠被激發(fā)出熒光。激發(fā)波長優(yōu)選小于或約等于最大吸收波長，以避免檢測到激發(fā)射線及激發(fā)射線和熒光發(fā)射光譜之間相互作用。選擇的激發(fā)射線的波長可取決于使用的具體熒光化合物的吸收峰的形狀。激發(fā)射線可通過任何已知的源產(chǎn)生，例如具有合適的帶通濾波器或衍射光柵的全譜光源，或者單一或窄帶光源如激光?？色@得具有很多不同波長的激光光源，并且可以選擇或調(diào)諧以提供正確波長的光來激發(fā)至少一種熒光材料的熒光。特別合適的光源包括選擇來發(fā)射期望強(qiáng)度和光譜的光的LED。優(yōu)選對樣品中存在的每一種熒光標(biāo)記材料提供獨(dú)立的光源，對每個(gè)光源進(jìn)行選擇和調(diào)諧或?yàn)V光以發(fā)射在各自的熒光標(biāo)記物的最大吸收頻率處或附近的射線。當(dāng)存在多個(gè)光源時(shí)，提供用于指示數(shù)據(jù)處理器使用了哪一個(gè)射線源的部件。理想的情況是光源發(fā)射的射線具有的中心峰波長在檢測樣品的時(shí)間內(nèi)的變化不超過士2nm，以保證吸收光譜不發(fā)生變化。當(dāng)使用的產(chǎn)生輸出射線的光源的波長例如隨溫度變化時(shí)，則應(yīng)選擇穩(wěn)定的光源，并且應(yīng)提供溫度穩(wěn)定部件，如帕爾貼模塊或可選的散熱器。如果需要的話，溫度穩(wěn)定部件也能用于加熱光源以使光源達(dá)到其最佳工作溫度。將激發(fā)射線的一部分直接轉(zhuǎn)移到射線檢測設(shè)備中以檢測發(fā)射光的特定波長的中心峰波長和/或強(qiáng)度以及其變化是可能的。當(dāng)樣品間的激發(fā)射線的特定波長的中心峰波長或強(qiáng)度變化時(shí)，也可能計(jì)算樣品熒光光譜的增強(qiáng)或縮減因子，以補(bǔ)償引起樣品吸收更多或更少能量的激發(fā)射線的變化。為區(qū)分透過樣品的光和樣品發(fā)射的熒光，通常在透射光的路徑外設(shè)置光檢測器。 光檢測器可為光電管或光電二極管，包括電荷耦合設(shè)備。使用一個(gè)或多個(gè)棱鏡或鏡子或其組合能夠?qū)碜詷悠返陌l(fā)射射線定向到射線檢測器的路徑上，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。優(yōu)選的是在整個(gè)樣品路徑長度上收集發(fā)射的射線，以獲得樣品間發(fā)射變化的最大靈敏度。射線可通過狹縫或小孔以減少到達(dá)控測器的光的發(fā)散，從而增加光譜的解析度。小孔相對于路徑長度優(yōu)選具有相似的尺寸。檢測器可以是標(biāo)準(zhǔn)光譜裝置中使用的任何檢測器， 包括例如光電管、電荷耦合裝置等。通常樣品發(fā)射的射線被分成不同的波長，例如通過衍射光柵、棱鏡或凹面全息鏡，然后使用檢測器測定每一種波長下的光的強(qiáng)度。包含鏡子、棱鏡、 衍射光柵和檢測器的光學(xué)系統(tǒng)優(yōu)選設(shè)計(jì)為緊密耦合光學(xué)系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的裝置除了具有測定上述樣品的熒光的光學(xué)器件外，還具有測定介質(zhì)吸收的部件。對介質(zhì)吸收的測定需要使用光源，以下將其稱為“吸收光源”，它不會引起染料發(fā)出熒光。現(xiàn)實(shí)中，這種光源應(yīng)當(dāng)很弱以不能引起存在的任何染料發(fā)出能被光檢測器檢測的熒光，或者該光源產(chǎn)生的光的波長不會引起任何存在的染料發(fā)出可檢測的熒光。吸收光源包括一種或多種濾波器以產(chǎn)生期望的用于測定介質(zhì)吸收的特征。優(yōu)選的是，通過參考透過樣品的光的量與透過無色的標(biāo)準(zhǔn)參照物的光的量來計(jì)算樣品的吸收，這種吸收在儀器的校準(zhǔn)過程中測定，被稱為“零吸收”。樣品對吸收光源的發(fā)射光的吸收通過與用于測定樣品發(fā)射的熒光的相同的光檢測器測定?；蛘撸墒褂脝为?dú)的檢測器來測量吸收。優(yōu)選的裝置包括用于測定熒光和吸收的具有兩種或更多種光源和一種或多種檢測器的儀器。所有光源中除一個(gè)光源外為“激發(fā)”光源，適于發(fā)射其波長能夠激發(fā)一種或多種熒光化合物發(fā)出熒光的光。在優(yōu)選的實(shí)例中，每一這類光源包括布置為與合適的帶通濾波器結(jié)合使用的LED。用一種或多種置于透過光路徑外，優(yōu)選與透過光路徑成約90°的檢測器來檢測樣品發(fā)出的熒光(如果有的話)。另外，選擇“吸收光源”，其不會引起熒光但設(shè)置以朝向用于檢測透過樣品的光的光檢測器直接發(fā)射光，該檢測器可以為任何一個(gè)用于測定熒光發(fā)射的光檢測器。吸收光源發(fā)出的光應(yīng)該不能引起染料的激發(fā)，但能夠被介質(zhì)吸收。 在裝置的優(yōu)選實(shí)施例中，吸收光源為LED，選擇其發(fā)射白光，但與用于激發(fā)熒光的光源相比強(qiáng)度相對較低。該吸收光源及其檢測器共同使用以測定介質(zhì)的吸收。通過適當(dāng)?shù)脑O(shè)置與儀器相關(guān)的電子件，能夠操作共用檢測器，即用于檢測吸收或發(fā)射以及熒光的檢測器，以確定檢測器是在檢測來自吸收光源的透過光還是熒光發(fā)射的光。這樣的設(shè)置包括使檢測器和激活“熒光激發(fā)”光源和“吸收”光源的時(shí)間同步。可選的設(shè)置可能依賴于通過透射光的波長和熒光波長之間的差距來區(qū)分用于吸收檢測的透射光和用于熒光檢測的熒光。因此，該共用檢測器能夠用于收集適于吸收和熒光測定的數(shù)據(jù)。使用數(shù)據(jù)處理器對來自檢測器的數(shù)據(jù)進(jìn)行收集并分析以產(chǎn)生用戶需要的與樣品的校正后的熒光相關(guān)的信息。優(yōu)選對數(shù)據(jù)處理器程序化以比較猝滅混合物的熒光和未猝滅混合物的熒光，并優(yōu)選補(bǔ)償介質(zhì)的吸收，還能夠進(jìn)行適當(dāng)?shù)挠?jì)算以產(chǎn)生差譜、微分譜或綜合譜?？梢詢H對一個(gè)或少數(shù)數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行計(jì)算，例如在特定波長處的峰高而不是整個(gè)譜圖。當(dāng)用戶需要有關(guān)每個(gè)波長處的發(fā)射光的信息時(shí)，數(shù)據(jù)處理設(shè)備則以圖表或圖形等的形式產(chǎn)生這一信息。也可將數(shù)據(jù)處理器連接數(shù)據(jù)存儲設(shè)備，以便重新檢索以前的圖表信息并進(jìn)行比較?？刂破?，至少部分地控制裝置的操作?？刂破鞔_保在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間并根據(jù)使用的檢測方法在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間段內(nèi)啟動合適的光源。通過響應(yīng)用戶界面，控制器還提供對裝置的自動或半自動操作。例如，半自動操作包括產(chǎn)生信息和指令消息以提示用戶操作或操縱部分裝置，或者更換或注射樣品?？刂破骱蛿?shù)據(jù)處理器可通過合適的程序化的電子微處理器方便地提供。檢測裝置優(yōu)選為便攜式，其具有的所有部件處于單一的殼體中。優(yōu)選提供合適的設(shè)備以輔助其便攜性，如需要的一個(gè)或多個(gè)把手、背帶或其它攜帶設(shè)備。提供控制器以打開或關(guān)閉樣品箱，并操作儀器以允許來自選定的射線源的光進(jìn)入樣品。殼體優(yōu)選還包括電源如電池組或電源適配器。然而電源可通過在獨(dú)立的殼中提供，從而電源產(chǎn)生的熱量可被耗散而不會影響裝置的溫度。殼體可裝配顯示器以顯示樣品的結(jié)果、設(shè)備的狀態(tài)或有關(guān)使用方法的說明和信息。顯示方式包括屏幕顯示、信息顯示或其它指示器如光。使用本發(fā)明的裝置的方法包括校準(zhǔn)步驟。在校準(zhǔn)步驟中，含有無色液體例如水或無色有機(jī)溶劑的比色皿或樣品池置于樣品架中，測定來自“吸收光源”的光的透射以確定該液體的吸收。然后記錄得到的數(shù)值作為“零吸收”用于校準(zhǔn)。作為進(jìn)一步的校準(zhǔn)，將類似于待測樣品淺色和深色液體的樣品，各自不合有標(biāo)記物(或猝滅標(biāo)記物)或不含有標(biāo)準(zhǔn)量的未猝滅標(biāo)記物，依次引入樣品架，并測定熒光。然后將測定的熒光用于校準(zhǔn)儀器，從而關(guān)于淺色液體和深色液體，對于特定裝置而言，標(biāo)記的樣品與未標(biāo)記(或猝滅的)樣品之間的熒光測定的差異是已知的。我們已發(fā)現(xiàn)，零吸收校準(zhǔn)(使用無色液體)優(yōu)選每天或每周重復(fù)進(jìn)行，這取決于裝置的使用，或者在進(jìn)行每一未知的樣品檢測或進(jìn)行批次的這種檢測前校準(zhǔn)。當(dāng)待測樣品的性質(zhì)發(fā)生明顯變化時(shí)，例如當(dāng)汽油和柴油樣品間發(fā)生更換，或者樣品的顏色或極性與校準(zhǔn)液體明顯不同時(shí)，每次都要使用淺色和深色液體進(jìn)行校準(zhǔn)。校準(zhǔn)使得數(shù)據(jù)處理器計(jì)算校準(zhǔn)樣品的吸收和校準(zhǔn)樣品中標(biāo)準(zhǔn)的已知標(biāo)記物的熒光之間的關(guān)系。然后利用該校準(zhǔn)調(diào)整后續(xù)樣品所測定的熒光以校正樣品顏色對所測標(biāo)記物的熒光的影響。計(jì)算校正的方法示于實(shí)施例中。該方法中，校準(zhǔn)表示通過外推法計(jì)算零吸收樣品中的校準(zhǔn)樣品的熒光。使用校準(zhǔn)，能將每種樣品測定的熒光調(diào)整至在零吸收的計(jì)算值，從而在由有色樣品發(fā)射的熒光計(jì)算標(biāo)記物的存在量時(shí)能夠忽略顏色的影響。校準(zhǔn)后，使用裝置的方法優(yōu)選包括以下步驟。將含有未知量標(biāo)記物的液體樣品 (“未知”樣品)置于樣品架上。通過使一種或多種熒光激發(fā)光源照射樣品，然后用一個(gè)或多個(gè)光檢測器檢測由樣品發(fā)射的熒光，所述儀器測定樣品的熒光。記錄該熒光光譜(或光譜的一部分)，例如作為“譜圖A”。該儀器也能測定樣品的吸收，其通過用“吸收光源”的光照射樣品，并用設(shè)置用于測定透射光的檢測器來測定透射過樣品的光的量來完成。該裝置然后測定已被處理來猝滅標(biāo)記物熒光的未知液體樣品的熒光。這種樣品可以是與在進(jìn)行了后續(xù)處理以猝滅熒光的前述檢測相同的樣品，或者另一種已進(jìn)行處理來猝滅標(biāo)記物的熒光的相同未知液體的樣品。記錄該熒光光譜(或光譜的一部分)，例如作為“譜圖B”。然后裝置計(jì)算熒光，即在標(biāo)記物的一種或多種熒光波長下發(fā)射光的量，其僅歸因于標(biāo)記物，這通過從所記錄的譜圖A (或部分光譜)中扣除所記錄的光譜B (或部分光譜)，或者通過任何其它合適的能夠確定熒光差異的方式來實(shí)現(xiàn)。我們提及“光譜的一部分”時(shí)，我們指不需要測定或記錄全譜，因?yàn)樵诤芏嗲闆r下只需要測定和/或記錄落入預(yù)先確定波長的光譜的一部分，因?yàn)闃?biāo)記物的熒光特征將被獲知。部分光譜可包括其間出現(xiàn)熒光特征峰的波長或其可以遠(yuǎn)比整個(gè)峰的光譜更窄?？赡芤笥脩粼诿看螜z測前將每種樣品置于樣品架上?？蛇x的是，用戶可將未猝滅樣品和猝滅樣品置于能夠夾持一種樣品以上的樣品架上。這種樣品架也能夠夾持進(jìn)行 “零吸收”校正的標(biāo)準(zhǔn)無色液體樣品。根據(jù)要求將適當(dāng)?shù)臉悠芬频交蛞瞥鰜碜悦糠N光源的光的路徑上。作為進(jìn)一步的選擇，通過操作鏡子或其它方式能夠?qū)晒饧ぐl(fā)光源和/或吸收光源的光轉(zhuǎn)向通過每種樣品。該裝置可選擇地包括合適數(shù)量的光源或設(shè)備以將來自光源的光分成適當(dāng)數(shù)量的能夠同時(shí)照射一種以上樣品的光束。該裝置能夠全手動、自動或半自動操作。在半自動操作中，操作者進(jìn)行需要的人工操作，例如更換照射的樣品，響應(yīng)由裝置的操作系統(tǒng)給出的提示。標(biāo)記物組合物可包括一種或多于一種的熒光材料。優(yōu)選存在多于一種以上的熒光材料，例如1-4種熒光材料，每一種均以與組合物中的各種其它材料量不同的已知量存在于標(biāo)記組合物中。還可以存在其它材料，如溶劑、其它種類的標(biāo)記化合物、非熒光染料等。以預(yù)先確定的量將標(biāo)記組合物加入液體中，所述預(yù)先確定的量包括組合物中含有的每一種熒光材料的已知數(shù)量。可將標(biāo)記組合物應(yīng)用于含有測定量的組合物的容器中，并進(jìn)行計(jì)算以在使溶解在測定量的液體中時(shí)每種熒光材料具有選定的濃度。在以下的實(shí)施例中將對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，其中使用Jobin Yvon Fluoromax-3熒光分光光度計(jì)記錄發(fā)射光譜，其中激發(fā)波長為510nm，所采用的帶寬為 2. Onm，記錄610nm處的發(fā)射。用具有325nm的燈和2. Onm帶寬的Thermo Spectronic UVl UV-可見光分光光度計(jì)記錄紫外和可見光譜。所有測定均使用IOmm比色皿。以下實(shí)施例中使用的染料1為圖1所示的化合物，其中隊(duì)為丁基取代基，R2為亞氨基。附圖中圖1顯示了合適種類的熒光化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖2和圖3分別顯示了實(shí)施例1和2所述的未標(biāo)記的、標(biāo)記的和猝滅的煤油和汽油的熒光發(fā)射光譜。圖4是熒光與四種燃料A-D中的染料1的濃度的關(guān)系圖。圖5是以ΙΟΟμ g/Ι溶解在8種不同燃料中的染料1的熒光發(fā)射與610nm處的燃料吸收之間的關(guān)系圖。圖6是以25、50、75μ g/Ι溶解在燃料A-D中的染料1的熒光發(fā)射與610nm處的燃料吸收之間的關(guān)系圖。圖7是實(shí)施例5、6和7的染料1的發(fā)射熒光與610nm處的吸收之間的關(guān)系圖。實(shí)施例1記錄500-700nm范圍的未標(biāo)記煤油樣品的熒光發(fā)射光譜。用異-辛烷作為參比溶劑記錄煤油在400-900nm的UV-Vis光譜。在IOml煤油中制備100微克/升(μ g/Ι)的染料1的溶液，以形成標(biāo)記的煤油。記錄500-700nm的熒光光譜。將250微升12-磷鉬酸 (5g/l，在乙基己醇中)加至IOml標(biāo)記的煤油樣品以猝滅染料1的熒光。顛倒小瓶以確保完全混合后，再次記錄500-700nm的熒光光譜。圖2顯示了未標(biāo)記的、標(biāo)記的和猝滅的煤油的熒光發(fā)射光譜。非常有效地猝滅了由染料引起的熒光信號，得到的譜圖非常類似于未標(biāo)記的燃料的譜圖，特別是在用于測定染料的熒光發(fā)射的波長附近?？蓪⒚河椭械娜玖?的“校正的”焚光發(fā)射視為染料的熒光發(fā)射加上燃料的背景熒光，再減去燃料中猝滅的染料的熒光發(fā)射。此后，使用“校正的熒光”指未猝滅的含有染料1的樣品在eiOnm的熒光強(qiáng)度與猝滅的樣品(即加入磷鉬酸猝滅劑后) 在eiOnm處的熒光強(qiáng)度的差。實(shí)施例2使用汽油重復(fù)實(shí)施例1中所述的實(shí)驗(yàn)。未標(biāo)記的、標(biāo)記的和猝滅的汽油的熒光發(fā)射光譜顯示于圖3中。通過比校圖2中不合標(biāo)記物或猝滅的標(biāo)記物的燃料與圖3中的相應(yīng)曲線，可以清楚地看出，與煤油相關(guān)的背景熒光遠(yuǎn)低于與汽油相關(guān)的背景熒光。實(shí)施例3 熒光與濃度的相關(guān)性在附圖4中標(biāo)示為A、B、C和D的四種不同的有色燃料中，測定染料1的熒光發(fā)射。 圖4顯示了這些燃料響應(yīng)于濃度的熒光變化。在所有的燃料中，在考慮的染料的濃度范圍內(nèi)，染料的熒光響應(yīng)與染料的濃度呈線性比例。圖4中可以看出該結(jié)果，即不論介質(zhì)的顏色如何，在低濃度下染料的熒光響應(yīng)與濃度成比例，這普遍適用。實(shí)施例4 熒光與吸收的相關(guān)性使用實(shí)施例1中所述的方法在8種不同的有色燃料中對染料1校正的熒光發(fā)射進(jìn)行了測定。通過測定其在eiOnm的吸收測定了每一種燃料的顏色。圖5是顯示了 8種不同燃料中的染料1的校正熒光與吸收之間的變化的圖。在現(xiàn)實(shí)中，一些顏色最淺的燃料相對于異-辛烷顯示出負(fù)吸收，可能是由于燃料和異-辛烷之間折射率的不匹配。為了簡化圖 5，最淺顏色的燃料已經(jīng)被設(shè)定為零吸收，其它燃料的吸收值相應(yīng)增大。可以看出，假定不同介質(zhì)的極性基本上相同時(shí)，熒光隨著介質(zhì)的吸收呈線性變化。知道熒光變化與吸收的關(guān)系提供了計(jì)算任意顏色和任意背景熒光的介質(zhì)中染料量的方法。最佳擬合圖5中八個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的直線方程為方程1)吸收=-2. OOX 10" X 熒光 +0. 0554該方程僅適用于含有ΙΟΟμ g/Ι染料的燃料。然而，從圖4我們知道在低于ΙΟΟμ g/ 1處染料的熒光響應(yīng)與其濃度成正比，而不管介質(zhì)的顏色如何。圖6顯示了染料1在實(shí)施例 3中使用的四種不同燃料中在25、50和75ppb下的數(shù)據(jù)，可以看出，所有熒光響應(yīng)與吸收的關(guān)系線均通過y軸上相應(yīng)于方程1的截距的相同點(diǎn)。為計(jì)算未知樣品中染料的濃度，我們僅能測定其熒光和吸收。需要的其它信息是方程1的y軸上的截距。這能夠生成新的直線，其在y軸上的截距由方程1給出，且對于未知樣品其通過該數(shù)據(jù)點(diǎn)。新的直線在χ軸上的截距對應(yīng)于無色介質(zhì)，即吸收為零的情況的未知樣品的熒光響應(yīng)。方程1在χ軸上的截距對應(yīng)于無色介質(zhì)中100yg/l的染料的熒光。 因此，通過比校由未知樣品計(jì)算得到的新的直線的χ軸截距和方程1的χ軸截距，其通過含有100μ g/Ι的樣品給出，我們能夠計(jì)算未知樣品中染料的濃度。實(shí)施例5未知燃料的吸收和熒光數(shù)據(jù)分別為0.001和沈3，000。已知吸收和熒光的關(guān)系的截距為恒量，其由方程1給出，則使用這一數(shù)據(jù)的曲線的斜率將為-2. 00X 10_7，這顯示于圖7中。這就意味著無色介質(zhì)中的熒光響應(yīng)為沈8，000。由方程1的χ軸截距，我們能夠計(jì)算出染料的濃度為0.097mg/l。染料的實(shí)際濃度為100 μ g/Ι，因此計(jì)算值的誤差僅為3%。實(shí)施例6第二未知燃料的吸收和熒光數(shù)據(jù)分別為0. 03和136，000。使用方程1的y軸截距，我們能夠計(jì)算使用該數(shù)據(jù)的曲線的斜率為-1.87X10_7，如圖7所示。這就意味著無色介質(zhì)的熒光響應(yīng)為四6，500，或者參考方程1的χ軸截距，染料的濃度為0. 107mg/l。染料的實(shí)際濃度為100yg/l，且燃料為汽油。其誤差為7%。簡單地比較汽油中的染料的熒光和零吸收介質(zhì)中染料的熒光將會預(yù)測實(shí)施例2的濃度僅為0. 050mg/l，誤差達(dá)50%。實(shí)施例7第三種已知含有染料1的未知燃料的吸收和熒光數(shù)據(jù)分別為0. 019和68，500。已知吸收和熒光的所有關(guān)系的截距為恒量，其由方程1給出，則使用這一數(shù)據(jù)的曲線的斜率將為-5. 39X10_7，如圖7所示。這就意味著無色介質(zhì)中的熒光響應(yīng)為102，500，或者參考方程1的χ軸截距，染料的濃度為0.037mg/l。染料的實(shí)際濃度為37. 5 μ g/1，且燃料是汽油和UK95辛烷汽油的混合物。簡單地比較染料的熒光和零吸收介質(zhì)中染料的熒光將會預(yù)測的濃度為0. 025mg/l。因此，通過在選擇性地猝滅后用其中溶有標(biāo)記物的介質(zhì)的吸收校正標(biāo)記物的熒光響應(yīng)，我們能夠顯著改進(jìn)定量熒光標(biāo)記物的方法，尤其是在其中溶有標(biāo)記物的介質(zhì)具有未知熒光和吸收的情況下。
權(quán)利要求
1.測定溶解或分散在本體材料中的熒光標(biāo)記化合物的熒光的方法，包括步驟(a)測定所述本體材料和所述熒光標(biāo)記化合物的混合物的熒光特征；(b)猝滅熒光標(biāo)記化合物的熒光得到猝滅混合物；(c)測定猝滅混合物的熒光特征；(d)比較所述混合物的熒光特征和所述猝滅混合物的熒光特征；和(e)針對本體材料的吸收的影響來校正測定的熒光發(fā)射特征。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中本體材料是液體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述熒光標(biāo)記化合物屬于選自由以下物質(zhì)組成的組的化學(xué)類物質(zhì)酞菁、萘酞菁、鎳連二硫烯、胺鐺化合物、次甲基染料、奧四元酸染料、 熒光素及其衍生物、取代蒽醌、偶氮染料、嚇啉、香豆素、取代香豆素(包括傘形酮)、苯并吡喃及其衍生物，咕噸染料(包括若丹明)、噁嗪、克酮酸染料、萘二甲酰亞胺、萘并熒光酮、半萘并熒光酮、三碳菁、雙吲哚基馬來酰亞胺、1，3- 二芳基-和1，3，5-三芳基-2-吡唑啉、吖啶、菲啶、二吡咯甲烷。
4.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中通過加熱、改變混合物的pH、改變混合物的極性、加入氧化劑或還原劑或加入化學(xué)猝滅化合物來實(shí)施所述猝滅。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中通過加入化學(xué)猝滅化合物來對熒光化合物進(jìn)行猝滅。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述猝滅化合物選自由多金屬氧酸鹽、硫氰酸鉀、 N-氯代琥珀酰亞胺、胺、氫氧化季銨、二氮雜二環(huán)辛烷、三氯氰尿酸，過乙酸，過氧化物，取代苯胺、取代硝基苯、可溶的過渡金屬絡(luò)合物、氯和次氯酸鹽組成的組。
7.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中從未猝滅混合物的熒光發(fā)射中減去至少一個(gè)波長處的猝滅混合物的熒光發(fā)射，以校正來自本體材料的熒光發(fā)射。
8.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中通過測定不同地著色的材料中相同濃度下的相同熒光化合物的熒光發(fā)射特征作所獲得的校準(zhǔn)，來針對本體材料的吸收的影響對測定的熒光發(fā)射特征進(jìn)行校正。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中將校正過的發(fā)射與類似標(biāo)記混合物的標(biāo)準(zhǔn)樣品的發(fā)射相比較。
10.鑒別本體材料的方法，包括步驟將含有至少一種熒光化合物的標(biāo)記物加入所述本體材料以形成所述本體材料和所述熒光標(biāo)記化合物的混合物，然后，使用前面任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的測定熒光的方法測定所述本體材料樣品中的所述至少一種熒光化合物的熒光。
11.適用于實(shí)施前面任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法的裝置，所述裝置包括(a)至少一個(gè)激發(fā)光源，其能夠發(fā)射選定波長的光，該選定波長激發(fā)至少一種熒光標(biāo)記化合物的可檢測熒光；(b)至少一個(gè)檢測由所述至少一種熒光標(biāo)記化合物發(fā)射的熒光的光檢測設(shè)備；(c)至少一個(gè)吸收光源，該光源能夠發(fā)射選定波長的光，該選定波長不激發(fā)任何熒光標(biāo)記化合物的可檢測熒光，但該光源能被本體材料吸收；(d)至少一個(gè)用于檢測所述吸收光源發(fā)射的穿過樣品的光的光檢測設(shè)備；(e)計(jì)算用戶需要的關(guān)于校正的樣品熒光信息的數(shù)據(jù)處理設(shè)備；和(f)控制所述裝置的至少部分操作的控制設(shè)備。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的裝置，其中至少一個(gè)光檢測設(shè)備是共用檢測器，其適于檢測由至少一種熒光標(biāo)記化合物發(fā)射的熒光，且適于檢測由所述吸收光源發(fā)射的穿透過樣品的光。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的裝置，其中操作共用檢測器以確定它所檢測的是透射光還是熒光。
14.根據(jù)權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)所述的裝置，其中數(shù)據(jù)處理器用于計(jì)算校準(zhǔn)樣品的吸收和校準(zhǔn)樣品中的標(biāo)準(zhǔn)已知標(biāo)記物的熒光之間的關(guān)系，從而可以利用所述計(jì)算的關(guān)系調(diào)整測得的樣品的熒光以校正樣品顏色對測定的標(biāo)記物熒光的影響。
15.根據(jù)權(quán)利要求11-14任一項(xiàng)所述的裝置，其適于便攜，且包括含有所述裝置的全部部件的單一殼體。
全文摘要
本發(fā)明涉及用熒光標(biāo)記化合物標(biāo)記本體材料并隨后通過測定其熒光發(fā)射來鑒別熒光化合物的方法，其中在猝滅熒光化合物前后測定標(biāo)記樣品的熒光以修正由于本體材料自身固有的熒光性質(zhì)對所測定熒光的影響。該測定可進(jìn)一步修正以解決已知的材料吸收對所測定熒光的影響。還描述了實(shí)施以上方法的裝置。
文檔編號G01N33/28GK102308210SQ201080006575
公開日2012年1月4日 申請日期2010年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月3日
發(fā)明者B·V·克羅德, D·W·J·麥卡里恩, I·S·艾德沃賽 申請人:約翰森·馬瑟公開有限公司