專利名稱：一種土壤環(huán)境中痕量天然及合成雌激素含量的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種土壤中痕量雌激素的檢測技術，特別是涉及一種采用液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用技術對土壤樣品中痕量天然和合成雌激素含量的檢測方法。
背景技術：
由人與動物卵巢分泌的天然雌激素雌酮Estrone，El)、17 β -雌二醇 (17 β-Estradiol, Ε2)和雌三醇 striol，E3)，以及作為口服避孕藥主要成分的合成雌激素17 α -乙炔基雌二醇(17 α -Ethinyl Estradiol，EE2)，會隨著糞尿排放進入污水處理系統(tǒng)或農田土壤中。雌激素的排放是不可避免的，近十年來雌激素作為典型的內分泌干擾物受到廣泛關注。歐美等國對多家污水處理廠雌激素濃度及去除效率的調查結果顯示，在污水處理廠出水及受納水體中殘留著ng/L濃度水平的雌激素，表明污水處理廠不能有效去除進水中的雌激素。畜禽養(yǎng)殖業(yè)排放的雌激素會通過堆肥施用或地表徑流進入土壤及水體中。有關魚類生殖異?，F(xiàn)象的研究結果表明，污水處理廠受納水體中所含ng/L濃度水平的雌激素是導致魚類雌性化生殖異常現(xiàn)象的主要原因物質。近年來，食品安全問題受到人們的廣泛關注，在有機糧食和有機蔬菜種植中，農家肥得到廣泛應用。土壤施肥是雌激素在土壤環(huán)境中殘留與增加的主要原因。研究結果表明， 當牧場施用雞糞肥后，其地表徑流中17 β -雌二醇的濃度為20 2530ng/L，而其土壤中的含量由0. 055ng/g增至0. 675ng/g，且取決于糞肥施用率及已施用時間。測定土壤中雌激素的含量，對于食品安全風險控制與評價具有重要意義。土壤中雌激素的含量與土壤的性質、 深度、有機質含量等因素有關，不同土壤的雌激素含量可能相差很大。近年來，雌激素的儀器檢測技術有了很大的提高，如氣相色譜-質譜聯(lián)用(GC/ MS)、氣相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用(GC/MS/MS)、液相色譜-質譜聯(lián)用(LC/MS)、液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用(LC/MS/MQ等，具有較高的靈敏度和精確度。由于土壤樣品基體復雜，樣品前處理技術在雌激素檢測中起著重要的作用，如何高效地從土壤樣品中提取雌激素，建立回收率高、重現(xiàn)性好、精確度及精密度高的土壤中痕量天然和合成雌激素分析方法，成為研究的關鍵。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對土壤樣品基體復雜，土壤中雌激素痕量存在，前處理技術難度大等問題，擬開發(fā)一種回收率高、靈敏度高、準確、快速的分析技術，實現(xiàn)對土壤樣品中痕量天然和合成雌激素的定量測定。本發(fā)明的技術方案如下—種土壤中痕量雌激素含量的檢測方法，該方法包括如下步驟(1) 土壤樣品預處理取5g經冷凍干燥后土壤樣品，采用快速溶劑萃取儀進行萃取，萃取劑為丙酮，其溶劑量為120-140mL，所采用的快速溶劑萃取條件為溫度60°C，壓力1500pis，靜態(tài)提取2次，各8min。Waters公司的HLB固相萃取柱的活化順序為5mL色譜純乙酸乙酯、5mL色譜純甲醇及IOmL超純水，流速為lmL/min ；取上述快速溶劑萃取儀的萃取液30mL，加入600mL 蒸餾水后混勻，采用已活化的固相萃取柱對該混合液進行固相萃取富集，控制流速為3mL/ min ；萃取結束后真空抽干HLB柱5min，以去除水分；利用2X3mL乙酸乙酯洗脫HLB柱，控制流速為lmL/min，洗脫液收集于IOmL玻璃離心管中；洗脫液在氮氣流下緩慢吹干，加入 200 μ L乙腈/水(v/v) = 1 1，漩渦混合；冷藏等待濃度測定。(2)利用液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用分析雌激素濃度色譜柱Nova-Pak C18,3. 9mmX 150mmX 4 μ m ；梯度洗脫采用甲醇和pH = 10的氨水為流動相，甲醇的比例在0-1. 2min內由 15 % 升到 70 %, 1. 2-2. Omin 內升到 90%, 2. 0-3. Omin 內升到 98 %,3. 0-6. Imin 維持在 98%,6. 1-6. 2min內降至15%,6. 2-lOmin內維持在15%，以上百分比均為體積百分比；(3)標準曲線的繪制，以外標法進行定量測定(4)樣品的測定采集待測土壤樣品，按步驟⑴對土壤樣品進行預處理，再按步驟⑵進行液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用檢測，并與步驟C3)得到的標準曲線比較，通過換算最終得到待測土壤樣品中天然和合成雌激素的含量。本發(fā)明所述的方法還包括采用同樣的土壤樣品，采用浸泡加標方式按0.5ng/g 的添加量加入標準溶液，進行上述預處理并測定天然和合成雌激含量，進行回收率計算；本發(fā)明中所述的天然雌激素為雌酮、17 β-雌二醇和雌三醇，合成雌激素為 17 α-乙炔基雌二醇。本發(fā)明的有益效果是采用快速溶劑萃取儀進行提取，操作簡單，萃取速度快，安全可靠；采用固相萃取柱進行富集，有機溶劑用量少，富集倍數高，操作簡單；采用液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用進行檢測，檢測限低，具有較高的靈敏度和精確度。本發(fā)明提供一種檢測限低、重現(xiàn)性好、靈敏度高、回收率較好、操作簡單易行的分析方法，能夠快速分析土壤中痕量天然和合成雌激素的含量。


圖1為200ng/L標準品溶液的色譜圖，出峰順序為El :5. 48min ；E2 :5. 45min ；E3 4. 75min ；EE2 5.37min。圖2為采用本發(fā)明的方法測定回收率的色譜圖。
具體實施例方式
下面結合實施例及附圖對本發(fā)明的技術方案作進一步的描述。(1) 土壤樣品預處理采集好的土壤樣品先進行冷凍干燥處理。取5g冷凍干燥后的樣品，以丙酮為萃取劑進行快速溶劑萃取，其溶劑量為120-140mL，得到丙酮萃取液并測量其體積。所采用的快速溶劑萃取條件為溫度60°C，壓力1500pis，靜態(tài)提取2次，各8min。Waters公司的HLB固相萃取柱的活化順序為5mL色譜純乙酸乙酯、5mL色譜純甲醇及IOmL超純水，流速為ImL/ min。取30M1上述丙酮提取液加入600mL蒸餾水后混勻，采用已活化的固相萃取柱對該混合液進行固相萃取富集，控制流速為3mL/min。萃取結束后真空抽干5min，以去除水分，利用2X3mL乙酸乙酯洗脫HLB柱，洗脫液收集于IOmL玻璃離心管中，控制流速為lmL/min。 洗脫液在氮氣流下緩慢吹干，加入200 μ L乙腈/水(ν/ν) = 1 1，漩渦混合后，待測。(2)利用液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用分析雌激素濃度液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用選擇的條件3200Qtrap 型液相色譜-串聯(lián)質譜儀，配有電噴霧離子化源(ESI)以及Analyst 1. 4. 1數據處理軟件，美國AppliedBiosystem公司；Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)，包括四元輸液泵，自動進樣器，美國Agilent公司。色譜柱Nova_PakC18 (3. 9mmX 150mmX4 μ m) ,Waters 公司。離子源電噴霧離子化源(ESI)，負離子方式檢測；離子噴射電壓:-4500V ；溫度4500C ；源內氣體1 (GSl，N2)壓力45psi ；氣體2(GS2，N2)壓力45psi ；氣簾氣體(N2)壓力20psi ；掃描方式為多重反應監(jiān)測(MRM)；碰撞氣(N2)壓力Medium。采用甲醇和PH= 10的氨水為流動相，梯度洗脫條件詳見表1。表1流動相梯度條件
權利要求
1.一種土壤環(huán)境中痕量天然及合成雌激素含量的檢測方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)土壤樣品預處理取5g經冷凍干燥后土壤樣品，采用快速溶劑萃取儀進行萃取，萃取劑為丙酮，其溶劑量為120-140mL，所采用的快速溶劑萃取條件為溫度60°C，壓力1500pis，靜態(tài)提取2次， 各8min。Waters公司的HLB固相萃取柱活化的順序為5mL色譜純乙酸乙酯、5mL色譜純甲醇及IOmL超純水，流速為lmL/min ；取上述快速溶劑萃取儀的萃取液30mL，加入600mL蒸餾水后混勻，采用已活化的固相萃取柱對該混合液進行固相萃取富集，控制流速為3mL/min ； 萃取結束后真空抽干HLB柱5min，以去除水分；利用2X3mL乙酸乙酯洗脫HLB柱，控制流速為lmL/min，洗脫液收集于IOmL玻璃離心管中；洗脫液在氮氣流下緩慢吹干，加入200 μ L 乙腈/水(ν/ν)=1 1，漩渦混合；冷藏等待濃度測定。(2)利用液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用分析雌激素濃度色譜柱Nova-Pak C18,3. 9mmX 150mmX 4 μ m ；梯度洗脫采用甲醇和PH= 10的氨水為流動相，甲醇的比例在0-1. aiiin內由15% 升到 70%, 1. 2-2. Omin 內升到 90%, 2. 0-3. Omin 內升到 98%, 3. 0-6. Imin 維持在 98%, 6. 1-6. 2min內降至15%，6. 2-10min內維持在15%，以上百分比均為體積百分比。(3)標準曲線的繪制，以外標法進行定量測定。(4)樣品的測定采集待測土壤樣品，按步驟(1)對土壤樣品進行預處理，再按步驟( 進行液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用檢測，并與步驟C3)得到的標準曲線比較，通過換算最終得到待測土壤樣品中天然和合成雌激素的含量。
2.根據權利要求1所述土壤環(huán)境中痕量雌激素含量的檢測方法，其特征在于，還包括采用浸泡加標方式測定回收率的步驟，添加量為0. 5ng/g。
3.根據權利要求1所述土壤環(huán)境中痕量雌激素含量的檢測方法，其中所述的天然雌激素為雌酮、17 β -雌二醇和雌三醇，合成雌激素為17 α -乙炔基雌二醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種土壤中痕量天然及合成雌激素的檢測技術，特別是涉及一種采用液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用技術對土壤樣品中痕量天然和合成雌激素含量的檢測方法。本方法將采集好的土壤品進行冷凍干燥，采用丙酮進行快速溶劑萃取，得到萃取液，采用固相萃取柱濃縮富集其中的雌激素，采用乙酸乙酯將雌激素從固相萃取柱上洗脫下來，利用液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用分析雌激素濃度。該方法環(huán)境友好、易于操作、且回收率較高，能夠快速分析土壤樣品中痕量天然和合成雌激素的含量。
文檔編號G01N30/72GK102236001SQ201010154070
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月23日 優(yōu)先權日2010年4月23日
發(fā)明者史江紅, 曹金玲, 楊志峰, 陳慶彩, 韓蕊 申請人:北京師范大學