專利名稱：一種快速的稚幼魚甾類激素提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及魚類留類激素的提取技術(shù)。
背景技術(shù)：
留類激素是化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的親脂性小分子，主要包括雌性激素、雄性激素、皮質(zhì)甾類激素等。它們相對不溶于水，很容易穿過靶細胞的質(zhì)膜進入細胞內(nèi)，與細胞質(zhì)和細胞核中的受體結(jié)合形成激素_受體復(fù)合物，調(diào)節(jié) 基因表達，并影響特殊組織的生長與分化。在魚類中，通過檢測其各組留類激素的水平能研究魚類的生長發(fā)育及其調(diào)控機制，同時還能研究外界環(huán)境對魚類自身生長發(fā)育的影響。目前，對于成魚來說，由于其能取得的血清量較多，因而是留類激素測定的主要對象。而個體較小的魚類以及稚幼魚中血清含量少，很難進行留類激素的研究與分析。有關(guān)魚類稚幼魚中留類激素水平的測定和調(diào)控機制研究國內(nèi)尚未見到報道，而國外也僅見到通過乙醚抽提的方法測定夏牙鲆和蝦虎魚幼魚中雌二醇含量的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問題是提供了一種簡單快捷的稚幼魚留類激素提取方法。本發(fā)明的技術(shù)方案將稚幼魚組織破碎，再利用乙醇和二氯甲烷將其溶解，具體步驟如下步驟1、取新鮮的或_20°C凍存的稚幼魚，稱量后剪碎置于研缽中；步驟2、按照每克魚重對應(yīng)Iml 50%乙醇的比例向研缽中加入50%乙醇，充分研磨后將勻漿液轉(zhuǎn)入離心管中；再用上述50%乙醇體積2倍的無水乙醇沖洗研缽中殘留的魚組織，并一同轉(zhuǎn)入離心管中；步驟3、勻漿采用超聲波粉碎15 25秒；并在4°C下，6000 8000轉(zhuǎn)/分鐘離心 10分鐘，收集上清液；步驟4、將固相殘余物與50%乙醇混勻洗滌一次，50%乙醇洗滌用量為每克魚重應(yīng)用1ml，再于4°C下，6000 8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集上清液；步驟5、將上述兩步驟中的上清液匯集，加入上清液5倍體積的二氯甲烷，反復(fù)混勻，然后靜止分層；步驟6、用注射器吸除上層的水相，將含有機相的離心管置于通風(fēng)櫥中，45°C水浴， 充分揮發(fā)有機相；用含有1 % BSA的PBS緩沖液充分溶解，并放置于-20°C保持待用。本發(fā)明根據(jù)留類激素的理化性質(zhì)，設(shè)計出快捷的留類激素提取方法，經(jīng)反復(fù)實驗證明，本發(fā)明可獲得高質(zhì)量的留類激素用于研究分析，并經(jīng)過放射性免疫法(RIA)、化學(xué)發(fā)光法和免疫酶聯(lián)法(ELISA)等測定出多種魚類稚幼魚中的留類激素含量。本發(fā)明流程簡單，操作簡單，整個操作過程費時少，結(jié)果穩(wěn)定可靠，無須特殊或昂貴的儀器，成本低，所需試劑少，并且均為無毒或低毒試劑，對操作人員傷害少。本發(fā)明可以用于魚類中稚幼魚甾類激素的提取，也適用于其它水產(chǎn)生物生長發(fā)育及神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控研究，具有廣泛的適用性。
具體實施例方式實施例11)取新鮮的大菱鲆稚魚(全長1. Icm, 0. IOg)，稱量后置于研缽中剪碎；2)向研缽中加入0.1ml 50 %乙醇，充分研磨后將 勻漿液轉(zhuǎn)入離心管中；再用 0. 2ml無水乙醇沖洗研缽中殘留的魚組織，并一同轉(zhuǎn)入離心管中；3)勻漿采用超聲波粉碎15秒；并在4°C下，6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集上清液；4)將固相殘余物用0. Iml的50%乙醇混勻洗滌一次，再于4°C下，6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集上清液；5)將上述兩步中的上清液匯集，加入2ml 二氯甲烷，反復(fù)混勻，然后靜止分層；6)用注射器吸除上層的水相，將含有機相的離心管置于通風(fēng)櫥中，45°C水浴，充分揮發(fā)有機相；用含有1 % BSA的PBS (pH 7. 4)緩沖液0. 5ml充分溶解，并放置于_20°C保持待用。本方法提取的樣品采用北方生物技術(shù)研究所的睪酮放免試劑盒，經(jīng)放免法測定其睪酮含量為0. 301ng/g。實施例21)取冷凍保存的牙鲆幼魚(全長5. 8cm, 2. IOg)，稱量后置于研缽中剪碎；2)向研缽中加入2.1ml 50 %乙醇，充分研磨后將勻漿液轉(zhuǎn)入離心管中；再用 4. 2ml無水乙醇沖洗研缽中殘留的魚組織，并一同轉(zhuǎn)入離心管中；3)勻漿采用超聲波粉碎25秒；并在4°C下，6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集上清液；4)將固相殘余物用2. Iml的50%乙醇混勻洗滌一次，再于4°C下，6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集上清液；5)將上述兩步中的上清液匯集，加入42ml 二氯甲烷，反復(fù)混勻，然后靜止分層；6)用注射器吸除上層的水相，將含有機相的離心管置于通風(fēng)櫥中，45°C水浴，充分揮發(fā)有機相；用含有BSA的PBS (pH 7.4)緩沖液1. Oml充分溶解，并放置于_20°C保持待用。本方法提取的樣品采用山東濰坊三維診斷技術(shù)有限公司的睪酮與雌二醇放免試劑盒，經(jīng)放免法測定其睪酮含量為0. 037ng/g，其雌二醇含量為25. 12μ g/g。實施例31)取新鮮的銀鯧幼魚(全長2. 5cm, 0. 1 lg)，稱量后置于研缽中剪碎；2)向研缽中加入0.11ml 50 %乙醇，充分研磨后將勻漿液轉(zhuǎn)入離心管中；再用 0. 22ml無水乙醇沖洗研缽中殘留的魚組織，并一同轉(zhuǎn)入離心管中；3)勻漿采用超聲波粉碎25秒；并在4°C下，6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集上清液；4)將固相殘余物用0. Ilml的50%乙醇混勻洗滌一次，再于4°C下，6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集上清液；5)將上述兩步中的上清液匯集，加入2. 2ml 二氯甲烷，反復(fù)混勻，然后靜止分層；
6)用注射器吸除上層的水相，將含有機相的離心管置于通風(fēng)櫥中，45°C水浴，充分揮發(fā)有機相；用含有1 % BSA的PBS (pH 7. 4)緩沖液0. 5ml充分溶解，并放置于_20°C保持待用。本方法提取的樣品采用北 方生物技術(shù)研究所的雌二醇放免試劑盒，經(jīng)放免法測定其雌二醇含量為47. 17yg/g。
權(quán)利要求
1. 一種快速的稚幼魚留類激素提取方法，將稚幼魚組織破碎，再利用乙醇和二氯甲烷將其溶解，其特征在于具體步驟如下步驟1、取新鮮的或-20°C凍存的稚幼魚，稱量后剪碎置于研缽中； 步驟2、按照每克魚重對應(yīng)Iml 50%乙醇的比例向研缽中加入50%乙醇，充分研磨后將勻漿液轉(zhuǎn)入離心管中；再用上述50%乙醇體積2倍的無水乙醇沖洗研缽中殘留的魚組織，并一同轉(zhuǎn)入離心管中；步驟3、勻漿采用超聲波粉碎15 25秒；并在4°C下，6000 8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集上清液；步驟4、將固相殘余物與50%乙醇混勻洗滌一次，50%乙醇洗滌用量為每克魚重應(yīng)用 lml，再于4°C下，6000 8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集上清液；步驟5、將上述兩步驟中的上清液匯集，加入上清液5倍體積的二氯甲烷，反復(fù)混勻，然后靜止分層；步驟6、用注射器吸除上層的水相，將含有機相的離心管置于通風(fēng)櫥中，45°C水浴，充分揮發(fā)有機相；用含有1 % BSA的PBS緩沖液充分溶解，并放置于-20°C保持待用。
全文摘要
一種快速的稚幼魚甾類激素提取方法，本發(fā)明的技術(shù)方案首先將稱量后的稚幼魚剪碎，然后置于含有無水乙醇的研缽中研磨，再采用超聲波粉碎；勻漿經(jīng)離心后取得上清液，并加入5倍體積的二氯甲烷，經(jīng)反復(fù)混勻后靜置分層；去除上層的水相，將下層有機相置于45℃水浴揮發(fā)干凈；最后用含有1％BSA的PBS緩沖液溶解，并于-20℃保存待用。本發(fā)明可用于稚幼魚的各種甾類激素的提取，適用于多種魚類神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控研究。
文檔編號G01N1/28GK102156055SQ20101011032
公開日2011年8月17日 申請日期2010年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月11日
發(fā)明者孫鵬, 尹飛, 彭士明, 施兆鴻 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所