專利名稱：先兆子癇檢測和治療的方法和組合物的制作方法
先兆子癇檢測和治療的方法和組合物相關(guān)專利這個(gè)專利申請要求以下兩個(gè)優(yōu)先權(quán)2008年10月31日遞交的題為“先兆子癇是一種以錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的特定超分子聚合為特征的疾病”的美國臨時(shí)專利號61/197，914; 2009年1月四日遞交的題為“先兆子癇是一種以錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的特定超分子聚合為特征的疾病，可以利用識別特定蛋白質(zhì)低聚物構(gòu)象的抗體進(jìn)行檢測”的美國臨時(shí)專利號 61/206，534，兩者的全部內(nèi)容通過引用的方式結(jié)合到本文中。
背景技術(shù)：
在美國，有6-8 %的孕婦被先兆子癇困擾著(Hauth，J. C. et al.，Obstet Gynecol. 95(1) :24_8，2000)，發(fā)病率為每 1000 個(gè)分娩中有 23. 6 例(Samadi，A. R. et al.， Obstet Gynecol. 87 (4) =557-63,1996.) 0先兆子癇被認(rèn)為應(yīng)當(dāng)為20 %的孕婦相關(guān)女性死亡負(fù)責(zé)(MacKay，A. P. et al. ,Paediatr Perinat Epidemiol. 19(3) :206_14，2005)，是治療性早產(chǎn)(medically indicated preterm delivery) (MIPTD)的主要原因(Fronterhouse, W. et al. , J Matern Fetal Med. 10 (3) 162-5，2001.)，應(yīng)當(dāng)為所有早產(chǎn)的 10 % 負(fù)責(zé) (Fronterhouse, W. et al.，J Matern Fetal Med. 10(3) 162—5，2001.)。先兆子癇(PE) 是以懷孕后20周開始出現(xiàn)血壓升高和蛋白尿?yàn)樘卣鞯?AC0G Committee on Practice Bulletins. Obstet Gynecol. 99(1) :159-67, 2002.)。如果血壓和蛋白尿持續(xù)增加或者出現(xiàn)末端器官損壞(包括胎兒生長限制)的癥狀，就會被認(rèn)為是嚴(yán)重先兆子癇(sPE)。嚴(yán)重先兆子癇的過程伴隨著女性身體狀況的漸行性惡化，醫(yī)源性分娩依然是唯一明確的治療方法。護(hù)理醫(yī)師可采取的措施包括權(quán)衡對未成熟胎兒立即分娩的風(fēng)險(xiǎn)和母子都受到先兆子癇困擾的風(fēng)險(xiǎn)。對此，現(xiàn)在的手段是緊密監(jiān)控母親和胎兒的狀態(tài)，并且以人工生產(chǎn)作為最終的處理方法。(Zamorski，Μ·Α·& Green，L. A. Am Fam Physician 64 :263-70,216,2001.)現(xiàn)今，還沒有能夠預(yù)測或者診斷先兆子癇或者預(yù)計(jì)一個(gè)特定病人體內(nèi)會發(fā)展到怎樣嚴(yán)重程度的臨床檢測。早期癥狀包括持續(xù)頭痛、視線模糊或者對光的敏感性以及腹部疼痛。然而，先兆子癇通常在直到發(fā)現(xiàn)血壓升高和尿液中的蛋白質(zhì)(蛋白尿)之前不會被診斷出來，而這些一般是在懷孕二十周后的常規(guī)護(hù)理檢查中發(fā)現(xiàn)的(Roberts JM, Cooper Dff. Pathogenesis and genetics of pre-eclampsia. Lancet. 2001 ;357 (9249) :53-56)。在這種診斷后先兆子癇的嚴(yán)重癥狀包括癲癇、大腦出血、消耗性血管內(nèi)凝血和腎衰竭可能很快就會出現(xiàn)。這些方法是不準(zhǔn)確的，而且對大部分嚴(yán)重癥狀發(fā)展的可能性只提供了很少的信息。而且，目前的診斷方法需要醫(yī)生的監(jiān)督和有損傷性的方法，進(jìn)一步拖延早期和快速的診斷，并使之復(fù)雜化。因此急需開發(fā)一個(gè)更早期更準(zhǔn)確的不需要醫(yī)師進(jìn)行監(jiān)督的檢測和診斷先兆子癇及伴隨著的蛋白尿高血壓紊亂的方法。
發(fā)明摘要如以下所述，專利申請人證明了先兆子癇(PE)是一個(gè)以蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊(形成異?；蛘咤e(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)聚集物)為特點(diǎn)的局限于孕婦的病癥。此外，他們還證明了頗具特征的異常蛋白質(zhì)聚集物(我們也稱之為錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)聚集物或中間體)在尿液中出現(xiàn)并積累于得了先兆子癇的孕婦(病人)的胎盤中并且是嗜剛果紅的。這些異常蛋白質(zhì)聚集物是伴隨著先兆子癇的出現(xiàn)，并且他們在尿液和/或胎盤組織中的出現(xiàn)也表明先兆子癇的存在。在本說明書中，“錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的超分子聚集物”(supramolecular aggregates of misfolded proteins) 一詞(簡稱為“超分子聚集物”)的意思包含可溶蛋白質(zhì)聚集物和不可溶蛋白質(zhì)聚集物。這里所描述的伴隨著先兆子癇出現(xiàn)的錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的超分子聚集物可用于判斷孕婦先兆子癇的出現(xiàn)，也可以判斷一個(gè)孕婦患先兆子癇的可能性或者風(fēng)險(xiǎn)。最近蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)現(xiàn)使得尋找生物標(biāo)記分子和將先兆子癇看做是一種錯(cuò)誤折疊紊亂的新視角成為可能。正如這里所述的，申請人已經(jīng)確定了 PE中的蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊的出現(xiàn)以及性質(zhì)和水平。他們已經(jīng)證明PE是以錯(cuò)誤折疊蛋白的排泄量增加為特征的，這個(gè)現(xiàn)象可以使用錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物對于特定染料例如自組裝偶氮染料剛果紅 (self-assembling azo dye Congo Red(CR))的親和力而被檢測到。蛋白質(zhì)構(gòu)象紊亂疾病如老年癡呆癥、輕鏈淀粉樣變性和阮病毒疾病是通過由于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的防御性折疊為異常3D結(jié)構(gòu)而造成的含淀粉纖維的形成和聚集形成的。專利申請人發(fā)現(xiàn)可溶性前淀粉蛋白低聚物(soluble pre-amyloid oligomers)(纖維組裝中的中間體，也就是錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)中間體)有可以導(dǎo)致內(nèi)皮損傷和氧化性壓力的蛋白質(zhì)毒性作用，而這些正是在嚴(yán)重先兆子癇(sPE)中起到致病性作用的過程。申請人發(fā)現(xiàn)檢測到可溶性前淀粉蛋白低聚物的出現(xiàn)可以顯示或者預(yù)示嚴(yán)重PE(severe ΡΕ)和前嚴(yán)重 PE(pre-severe ΡΕ)(前先兆子癇，也就是可以發(fā)展成為臨床顯性的sPE之前的亞臨床狀態(tài))。所以，申請人發(fā)現(xiàn)和鑒定了這種孕婦特有的病癥中尿里的可溶性前淀粉蛋白低聚物的性質(zhì)。他們的成果是在世界上最先發(fā)現(xiàn)PE是以蛋白質(zhì)的類淀粉蛋白組裝為特征的構(gòu)象紊亂疾病。這里描述的使用可以識別具有獨(dú)特的折疊構(gòu)象的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)低聚物的抗體進(jìn)行的進(jìn)一步工作支持了錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)中間體傾向于組裝為可能在臨床性疾病的表現(xiàn)上發(fā)揮作用的孔狀結(jié)構(gòu)(淀粉蛋白通道)的發(fā)現(xiàn)。已經(jīng)被診斷PE或者注定會得PE的病人的尿液和/或胎盤中積累著異常和/或過度錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)聚集物，顯示著這些異常蛋白質(zhì)聚集物是這個(gè)疾病病理中的致病性因素。這項(xiàng)新發(fā)現(xiàn)為新的治療(部分或全部降低疾病的發(fā)作或者發(fā)展、逆轉(zhuǎn))先兆子癇的診斷和治療策略提供了基礎(chǔ)。例如，使用免疫學(xué)或者藥理學(xué)手段阻止這樣結(jié)構(gòu)的形成、逆轉(zhuǎn)(干擾、拆散)已經(jīng)存在的超分子聚集物提供了治療先兆子癇的治療性干涉的新途徑。這樣的異常蛋白聚集物(蛋白質(zhì)的超分子類淀粉蛋白組裝)除了對剛果紅的親和力之外的特征也在這里敘述了。在先兆子癇病人的尿液和胎盤組織中發(fā)現(xiàn)的超分子聚集物的一個(gè)組分是krpinAKalpha-l抗胰蛋白酶)或krpinAl的多肽片段。所以，先兆子癇與其他疾病(如alpha-Ι抗胰蛋白酶缺乏癥)有一個(gè)相似的特征在alpha-Ι抗胰蛋白酶缺乏癥里，錯(cuò)誤折疊的alpha-Ι抗胰蛋白酶的積累導(dǎo)致了肝細(xì)胞的損傷和肝硬化 (n. Engl. 1 ed. 346 :45-53 (2002) ;J. Clin. Inv. 110 1585-1590 (2002)) 此外，血漿銅藍(lán)蛋白(ceruloplasmin)、重鏈 IgG(heavy-chain IgG)禾口輕鏈 IgG(light-chain IgG)、干擾素誘導(dǎo)蛋白 6-16 (interferon-inducible protein 6-16) (IFI6-16，G1P3)及他們的片段在 PE的嗜剛果紅性蛋白尿中都被鑒定為錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)聚集物的組分。這里描述的以及在后面描述的特定實(shí)施方案中，是伴隨著先兆子癇出現(xiàn)并出現(xiàn)在尿液和胎盤組織中的分離出的異常蛋白聚集物，這些分離出的異常蛋白質(zhì)聚集物中至少含有以下成份中的一個(gè)(一個(gè)或者更多)SerpinAl、血漿銅藍(lán)蛋白、重鏈IgG、輕鏈IgG、干擾素誘導(dǎo)蛋白6_16以及每個(gè)的片段。這里描述的本發(fā)明的實(shí)施方案之一是一個(gè)非創(chuàng)性的尿液診斷和預(yù)后的檢測或者檢驗(yàn)，它是基于在妊娠過程中檢測伴隨著先兆子癇的上述對剛果紅顯現(xiàn)親和性(嗜剛果紅性)的異常蛋白聚集物的出現(xiàn)與否(定性)或其數(shù)量(定量)，并且是對蛋白錯(cuò)誤折疊的一個(gè)整體性的衡量。利用剛果紅保留率(Congo Red Retention) (CRR)來評估整體蛋白錯(cuò)誤折疊負(fù)荷(global protein misfolding load)是診斷PE和有指征分娩(indicated delivery) (IND)(有指征分娩是早產(chǎn)的一大因素)的一種簡單的診斷測試。這里描述了診斷和預(yù)后檢驗(yàn)，在一些實(shí)施方案中，具體地說，根據(jù)評估或分析從一個(gè)孕婦處獲得的樣品 (例如尿液或者胎盤組織)以檢測樣品中是否含有與先兆子癇相關(guān)的嗜剛果紅性的異常蛋白聚集物。然而，應(yīng)該讀者要明白這種診斷或預(yù)后檢驗(yàn)可以使用多種多樣的能夠檢測或者分析出一個(gè)樣品中是否含有與先兆子癇相關(guān)的異常蛋白聚集物或者其含量的試劑，嗜剛果紅性只是錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物的一個(gè)描述性特征之一。其他特征包括例如異常蛋白聚集物的組成和構(gòu)象，它反過來定義了錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物的其他性質(zhì)，如他們的大小、與其他染料的相互作用、以及與抗體的結(jié)合，這些都可以用于上述的診斷和預(yù)后方法中。這里描述的是一種通過在孕婦尿液或者胎盤組織中檢測伴隨著先兆子癇出現(xiàn)的一個(gè)(一個(gè)或更多)錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的超分子聚集物(異常蛋白聚集物、錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物、錯(cuò)誤折疊蛋白中間體、蛋白質(zhì)的超分子類淀粉蛋白組裝)來診斷或者輔助診斷孕婦體內(nèi)先兆子癇的方法。應(yīng)當(dāng)理解的是這里描述的檢測試驗(yàn)可以在妊娠過程中的任何時(shí)間進(jìn)行。在一些特定的實(shí)施方案中，這里描述的診斷測試可以對計(jì)劃要懷孕的女性進(jìn)行。這樣的超分子聚集物可以利用利用本領(lǐng)域內(nèi)所知的一系列的現(xiàn)有技術(shù)和方法在尿液或胎盤組織中來檢測出來。一種合適的技術(shù)就是當(dāng)尿液或胎盤組織中的異常蛋白聚集物達(dá)到和先兆子癇相關(guān)的水平就能檢測到。這樣的技術(shù)可以利用染料、小分子、熒光化合物或者其它與異常蛋白聚集物結(jié)合或者相互作用的試劑(如一種抗體、抗體片段、抗體擬肽)，來標(biāo)記、顯示或者改變聚集物使其能被檢測得到。在這里和其他實(shí)施方案中，一個(gè)結(jié)果就是超分子聚集物/異常蛋白聚集物以及尿液或胎盤組織樣品與最初獲得的尿液或胎盤組織及其組分有所不同(也就是樣品被修飾過了，如加入分析它們中要用的試劑、 改變溫度或者稀釋度或濃度；異常蛋白聚集物被標(biāo)記、顯示了或改變，這樣他們就能被檢測到了)。應(yīng)當(dāng)理解的是當(dāng)使用一種染料的時(shí)候，可用于檢測這里所描述的超分子聚集的染料可能具有以下特征中的一個(gè)或多個(gè)一種自組裝染料、一種非自組裝染料、一種雜芳香族染料、一種偶氮染料、一種纖維特異性染料和/或其它染料。這些染料可以包括但不僅限于剛果紅、姜黃素類似物；X-34(l，4-二(3-羧基-4-羥基苯基乙烯基)苯)(1， 4-bis (3-carboxy-4-hydroxyphenylethenyl) -benzene)；硫石黃素 S (Thioflavin S)；硫石黃素 T(Thioflavin T)；尼羅紅(Nile Red)；吖啶橙(acridine orange)；氨基 _8_ 磺酸萘 (ANS) ；Bis-ANS ;4-( 二氰基乙烯基)久洛尼定 (dicyanovinyl)-julolidine) (DCVJ)； A01987(惡嗪染料)；熒光苯乙烯基染料(fluorescent styryl dyes) ；BF-168 (6_2_ 氟乙氧基)-2-[2-(4_甲氨基苯酚)乙烯基]苯并嗯唑((6-2-Fluoroethoxy)-2-[2-(4-methylaminopheni 1) ethenyl]benzoxazole) ；BSB :(反，反)溴 _2, 5_ 二- (3_ 輕基幾基 _4_|圣基)苯乙 j；?；?(trans, trans) -l-bromo-2, 5-bis- (3-hydroxycarbonyl-4-h ydroxy) styrylbenzene)；喧琳蹤(quinilinehydrazone)化合物(如，4—甲基一7-甲氧基-2-(4- Rf 琳基亞甲基聯(lián)氛)Rftt木)(艮口 4-methyl-7-methoxy-2-(4-quinolylmethylene hydrazino) quinoline)，金黃胺 G (艮口 Chrysamine—G)；禾福平(rifampicin)；極黑素；黃萃素(baicalein)；鯊肌醇(scyllitol)(如青蟹肌醇(Cocositol), Quercinitol, 1,3, 5/2, 4，6_六羥基環(huán)己烷)及其衍生物；成像探針，如[11C]-PIB =N-甲基[11C]244 ’-甲基氨基苯酷-6-輕基苯并三唾)(N-methyl [11C] 2- (4 ‘ -methylaminophenyl-6-hydroxybenzathi azole))；均二苯乙烯基苯并三唑(stilbenylbenzothiazole)和其衍生物。自組裝染料包括例如，剛果紅、伊文思藍(lán)(Evans Blue), bis-azo ANS，非自組裝染料包括例如ANS和錐蟲藍(lán)(Trypan Blue)。如這里所描述的，這些異常蛋白聚集物顯示了對自組裝偶氮染料剛果紅的親和力，所以，它們在尿液或胎盤組織中的出現(xiàn)可通過檢測來自于有待檢測(試驗(yàn))先兆子癇的孕婦的尿液或胎盤組織中的嗜剛果紅性來確定(定性和/或定量)。這里所描述的是一種診斷或者輔助診斷一個(gè)孕婦體內(nèi)先兆子癇的方法，檢測出尿液的嗜剛果紅性，比如通過斑點(diǎn)印跡附著和光譜位移分析，顯示著一個(gè)孕婦患有先兆子癇(顯示著這個(gè)孕婦患有先兆子癇)或者將會患先兆子癇(如果需要的話可以使用已知的方法進(jìn)行進(jìn)一步的檢測以確定)。如這里所描述的，雖然我們稱這些異常蛋白質(zhì)是嗜剛果紅性的，這只是一個(gè)描述性術(shù)語，讀者應(yīng)該明白這些異常蛋白質(zhì)可以通過許多其它的手段檢測，包括其它試劑，例如其它染料(如其他自組裝染料)，硫磺素(硫磺素S，硫磺素T)和抗體(例如多克隆，如All抗體，Officer抗體，OC抗體，和單克隆，如Ml 18，M204, M205，M89 (如M89-17)和M09)或通過利用例如極化光顯微鏡、熒光顯微鏡或電子顯微鏡觀察聚集物。通過檢測嗜剛果紅性檢測的異常蛋白質(zhì)聚集物或片段就是這里描述的異常蛋白聚集物，他們含有以下成分中的至少一種(一種或更多)SerpinAl、血漿銅藍(lán)蛋白、重鏈 IgG、輕鏈IgG、干擾素誘導(dǎo)蛋白6-16以及每個(gè)的片段。不難理解，這里所有描述的例子中，各種抗體(多克隆或者單克隆)可以被使用。 在特定例子中，可以使用至少一個(gè)(一個(gè)或多個(gè))下面的抗體或者其等價(jià)物(幾乎以相同的方式識別(結(jié)合)的抗體)，如對相同的表位或構(gòu)象A11抗體，Officer抗體，OC抗體， Ml 18抗體，M204抗體，M205抗體，M89抗體(如M89-17)和M09抗體。在某些具體實(shí)施方案中，診斷或輔助診斷孕婦患先兆子癇的方法包括(a)從孕婦處獲得尿液樣本或者胎盤組織樣本；(b)將(a)中獲得的樣本與一種可以與PE相關(guān)的異常蛋白聚集物或其中組分結(jié)合或者標(biāo)記伴隨著PE出現(xiàn)的異常蛋白聚集物或其組分的試劑 (例如一種染料，如剛果紅，或者一種抗體)在能夠讓這種試劑與異常蛋白聚集物結(jié)合或發(fā)生相互作用的條件下混合(接觸)，從而產(chǎn)生可以檢測得到的(被標(biāo)記的)異常蛋白聚集物或其組分(如可檢測的serpina-2或者其他組分)并且(c)確定(a)中是否發(fā)生結(jié)合或者其他相互作用，如通過確定可檢測的異常蛋白聚集物或組分是否存在于樣品中，結(jié)合即顯示女性患有先兆子癇，可以將這名女性診斷為患有或者即將患先兆子癇。她的狀態(tài)(是否患有先兆子癇)可以通過已知手段(如這里所述的方法)進(jìn)行進(jìn)一步檢驗(yàn)以確認(rèn)現(xiàn)在方法得到的結(jié)果。結(jié)合或者顯示或者標(biāo)記異常蛋白的試劑可以有多種種類，如一種染料(如
9剛果紅，硫磺素S，硫磺素T，伊文思藍(lán)，錐蟲藍(lán)，ANS, bis-azo ANS)，一種放射性追蹤物(如 (Il)C匹茲堡化合物B(PIB))或者一種抗(結(jié)合)異常蛋白聚集物得抗體，如與異常蛋白聚集物的一個(gè)特征區(qū)域或者構(gòu)象特征結(jié)合的抗體，或與其中一個(gè)或多個(gè)組分(一個(gè)或多個(gè) SerpinAl、血漿銅藍(lán)蛋白、重鏈IgG、輕鏈IgG、干擾素誘導(dǎo)蛋白6-16或者每個(gè)的片段)的一個(gè)特征區(qū)域或者特征結(jié)合的抗體。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，診斷或輔助診斷孕婦患先兆子癇的方法包括(a)從懷孕女性處獲得尿液樣本或者胎盤組織樣本；(b)將(a)中獲得的樣本與一種可以將至少一種出現(xiàn)在異常蛋白聚集物中的蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)片段染色的染料(如剛果紅)混合，在染料將樣本中的蛋白質(zhì)染色的條件下進(jìn)行，這樣就產(chǎn)生了一個(gè)含有染料的尿液樣本或者胎盤組織樣本；并且(c)分析(b)中獲得的尿液樣本或者胎盤組織樣本以確定(確認(rèn)樣本是否含有)伴隨著先兆子癇出現(xiàn)的超分子聚集物(異常蛋白質(zhì)聚集物)的存在和被染料染色，如果樣本含有被染料染色的伴隨著先兆子癇產(chǎn)生的超分子聚集物，這個(gè)染色顯示著女性患有先兆子癇，這名女性就被診斷為患有或者很可能患先兆子癇。如果樣本含有這樣被染色的錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物，那么她比如果樣本中不含有伴隨著先兆子癇出現(xiàn)的被染料染色的異常蛋白聚集物更可能患有先兆子癇。伴隨著先兆子癇出現(xiàn)的被染料染色的異常蛋白聚集物的出現(xiàn)預(yù)示著這位女性已經(jīng)患有或者很可能患有先兆子癇。她的狀態(tài)(是否患有先兆子癇)可以通過已知手段(如這里所述的方法)進(jìn)行進(jìn)一步檢驗(yàn)以確認(rèn)現(xiàn)在方法得到的結(jié)果。檢測到的異常蛋白聚集物就是這里敘述的異常蛋白聚集物，它們至少含有以下成分中的一個(gè)或多fkrpinAl、血漿銅藍(lán)蛋白、重鏈IgG、輕鏈IgG、干擾素誘導(dǎo)蛋白6-16以及每個(gè)的片段。染色的異常蛋白聚集物的檢測可以通過已知的方法實(shí)現(xiàn)，如斑點(diǎn)印跡分析或者僅僅肉限觀察一個(gè)經(jīng)過染色的支持表面(如濾紙)上的一個(gè)區(qū)域，此經(jīng)過染色的支持表面包含尿液樣品(或者胎盤組織樣本)和染料混合后的組合物(例如尿液樣品和剛果紅的混合物)。一個(gè)用這里描述的實(shí)施方案確定已患、可能患有或者有患先兆子癇風(fēng)險(xiǎn)的孕婦可以通過進(jìn)行一項(xiàng)附加檢驗(yàn)，如之前描述的方法或?yàn)轭I(lǐng)域里面的人所熟知的一種或多種方法 (也就是，血壓測量、水腫評估、腹部疼痛、頭痛的發(fā)生及視覺問題)進(jìn)一步評估這種情況或者確認(rèn)先兆子癇的出現(xiàn)/風(fēng)險(xiǎn)。這里描述的檢測尿液中嗜剛果紅性異常蛋白聚集物不僅可用于診斷已經(jīng)存在的先兆子癇，而且可以預(yù)測孕婦將來發(fā)生先兆子癇的情況，也可被看做是預(yù)測一個(gè)孕婦將會患先兆子癇幾率增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)測或者輔助預(yù)測一個(gè)孕婦將會患(將發(fā)展為) 先兆子癇的方法包括從孕婦處獲得一個(gè)尿液或者胎盤組織樣本及分析尿液或者胎盤組織樣本中與先兆子癇相關(guān)的異常蛋白聚集物的存在(確認(rèn)樣本中是否含有)，此女性樣本含有伴隨先兆子癇出現(xiàn)的異常蛋白聚集物比不含有的更可能得(得的可能性比正常人高)先兆子癇。讀者應(yīng)該明白這里描述的PE的發(fā)生和/或發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的方法包括檢測伴隨先兆子癇出現(xiàn)的異常蛋白聚集物的存在/缺乏的方法(對于快速定性分析)和量化樣本中檢測到的超分子聚集物的數(shù)量和/或其準(zhǔn)確性質(zhì)(也就是，鑒定聚集物中的蛋白質(zhì)，鑒定聚集物的構(gòu)象等)的方法。檢測到的異常蛋白聚集物可以是這里描述的一種(一種或多種)超分子聚集物， 它含有以下成分中的至少一種(一個(gè)或多個(gè))SerpinAl、血漿銅藍(lán)蛋白、重鏈IgG、輕鏈IgG、干擾素誘導(dǎo)蛋白6-16或者這些蛋白每個(gè)的片段。預(yù)測孕婦是否會發(fā)展出先兆子癇的方法可以通過以下實(shí)現(xiàn)，例如(a)從孕婦處獲得一個(gè)尿液樣本或者胎盤組織樣本；(b)將尿液樣本或胎盤組織樣本與一種可以與伴隨著先兆子癇出現(xiàn)的錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物結(jié)合或者相互作用的試劑在能夠讓這種試劑與這樣的錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物或其組分結(jié)合或者相互作用的條件下混合，這樣產(chǎn)生了含有可以檢測得到的(帶標(biāo)記的)異常蛋白聚集物的組合物或其組分(如可檢測到WkrpinAl或其它組分)；及(c)確定(b)中的結(jié)合或其它相互作用是否發(fā)生，如可以通過確定是否有可以檢測到的錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物或其組分在樣本中存在，如果存在的話，這名孕婦比樣本中不存在可檢測蛋白聚集物的個(gè)體在妊娠過程中更可能發(fā)展成先兆子癇(將要得先兆子癇的可能性更高)。結(jié)合或顯示或標(biāo)記異常蛋白的試劑可以是以下幾種類型之一，如一種染料(如剛果紅、硫磺素S、硫磺素T、伊文思藍(lán)、錐蟲藍(lán)、ANS、bis-azo ANS)，一種放射性示蹤劑(如(11) C匹茲堡復(fù)合物B (PIB))或者一種抗(結(jié)合)異常蛋白聚集物的抗體，如可以結(jié)合一個(gè)特征區(qū)域或者特定構(gòu)象或者一個(gè)或多個(gè)聚集物組分的抗體，如一個(gè)或多個(gè)krpinAl、血漿銅藍(lán)蛋白、重鏈IgG、輕鏈IgG、干擾素誘導(dǎo)蛋白6-16以及這些蛋白的一個(gè)或多個(gè)片段。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，預(yù)測或輔助預(yù)測一個(gè)孕婦將會患(將會發(fā)展)先兆子癇的可能性的方法包括(a)從孕婦處獲得尿液樣本或者胎盤組織樣本；(b)將樣本與一種可以把伴隨著先兆子癇出現(xiàn)的超分子聚集物中的蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)片段染色的染料(如剛果紅)在能夠讓染料將樣本中的蛋白質(zhì)染色的條件下混合，從而產(chǎn)生了一個(gè)含有染料的樣本；并且(c)分析(b)中獲得的尿液樣本或者胎盤組織樣本以確定(確認(rèn)樣本是否含有) 伴隨著先兆子癇出現(xiàn)的被染料染色的超分子聚集物的存在，如果樣本含有伴隨著先兆子癇產(chǎn)生的被染料染色的超分子聚集物，那么她比如果樣本中不含有伴隨著先兆子癇出現(xiàn)的被染料染色的異常蛋白聚集物更可能發(fā)展先兆子癇(將會得的可能性更高)。被染色的聚集物的檢測可以通過使用已知的方法，如斑點(diǎn)印跡分析或者僅僅肉眼觀察一個(gè)經(jīng)過染色的支持表面(如濾紙)上的一個(gè)區(qū)域，此經(jīng)過染色的支持表面包含尿液樣品(或者胎盤組織樣本)和染料混合后的組合物(例如尿液樣品和剛果紅的混合物)。相似的，一個(gè)孕婦將會發(fā)展為先兆子癇的風(fēng)險(xiǎn)可通過這里描述的方法進(jìn)行評估。 在一個(gè)實(shí)施方案中，確定一個(gè)孕婦會患有(將會發(fā)展為)先兆子癇的風(fēng)險(xiǎn)的方法包括從孕婦處獲得一個(gè)尿液或者胎盤組織樣本及分析尿液或者胎盤組織樣本中伴隨先兆子癇出現(xiàn)的錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物的存在(確認(rèn)樣本中是否含有)，如果樣本含有隨先兆子癇出現(xiàn)的錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物，此女性比樣本中不含隨先兆子癇出現(xiàn)的錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物有更大的風(fēng)險(xiǎn)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，評估和確定一個(gè)孕婦將會發(fā)展為先兆子癇的風(fēng)險(xiǎn)的方法包括(a)從孕婦處獲得一個(gè)尿液樣本或者胎盤組織樣本；(b)將尿液樣本或胎盤組織樣本與一種可以與伴隨著先兆子癇出現(xiàn)的錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物結(jié)合或者相互作用的試劑在可以讓試劑與這樣的錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物或其組分結(jié)合或者相互作用的條件下混合，這樣產(chǎn)生了可以檢測到的(標(biāo)記的)蛋白聚集物或其組分(如可檢測到或其它組分)；及(c)確定(b)中的結(jié)合或其它相互作用是否發(fā)生，如可以通過確定是否有可以檢測到的錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物或其組分在樣本中存在，如果存在的話，這名孕婦比樣本中不存在可檢測蛋白聚集物的個(gè)體有更大的風(fēng)險(xiǎn)會發(fā)展為先兆子癇。結(jié)合或顯示或標(biāo)記異常蛋白的試劑可以是以下幾種類型之一，如一種染料(如剛果紅、硫磺素S、硫磺素T、伊文思藍(lán)、錐蟲藍(lán)、ANS、bis-azo ANS)，一種放射性示蹤劑(如(11) C匹茲堡復(fù)合物B (PIB))或者一種抗(結(jié)合)異常蛋白聚集物的抗體，如可以結(jié)合一個(gè)特征區(qū)域或者特定構(gòu)象或者一個(gè)或多個(gè)聚集物組分的抗體，如一個(gè)或多個(gè)krpinAl、血漿銅藍(lán)蛋白、重鏈IgG、輕鏈IgG、干擾素誘導(dǎo)蛋白6-16以及這些蛋白的一個(gè)或多個(gè)片段。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，評估或估計(jì)一個(gè)孕婦將會患有(將會發(fā)展為)先兆子癇的方法包括(a)從孕婦處獲得尿液樣本或者胎盤組織樣本；(b)將樣本與一種可以使隨先兆子癇出現(xiàn)的錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物中的至少一種蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)片段染色的染料 (如剛果紅)在可以讓染料將樣本中的蛋白質(zhì)染色的條件下混合，這樣就產(chǎn)生了一個(gè)含有染料的樣本；并且(c)分析(b)中獲得的尿液樣本或者胎盤組織樣本以確定(確認(rèn)樣本是否含有)伴隨著先兆子癇出現(xiàn)的被染料染色的錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)聚集物的存在，如果樣本含有伴隨著先兆子癇產(chǎn)生的被染料染色的錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)聚集物，那么這名孕婦比如果樣本中不含有伴隨著先兆子癇出現(xiàn)的被染料染色的錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物有更大的風(fēng)險(xiǎn)發(fā)展為先兆子癇(發(fā)展的可能性更高)。被染色的聚集物的檢測可以通過使用已知的方法，如斑點(diǎn)印跡分析或僅僅觀察含有與染料結(jié)合的尿液或者胎盤組織樣本(如尿液與剛果紅混合液) 的染色表面的區(qū)域(在表面上，如濾紙)實(shí)現(xiàn)。用剛果紅染色的胎盤組織樣本也顯示了這樣的蛋白質(zhì)聚集物和可檢測的染色 (如剛果紅染色)的特征性質(zhì)。胎盤中超分子聚集物的其他標(biāo)記也可用于診斷或輔助診斷孕婦體內(nèi)的先兆子癇；預(yù)測或輔助預(yù)測一個(gè)孕婦將會患有(將會發(fā)展為)先兆子癇的可能性；評估和估計(jì)一個(gè)孕婦將會患有(將會發(fā)展為)先兆子癇的風(fēng)險(xiǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這項(xiàng)方法是診斷或輔助診斷孕婦體內(nèi)的先兆子癇的方法， 也就是對從孕婦處獲得的尿液或胎盤組織中的伴隨先兆子癇出現(xiàn)的超分子聚集物的檢測 (確定存在與否)，這個(gè)檢測是通過使用可以識別(結(jié)合)這里描述的隨著先兆子癇已經(jīng)形成了獨(dú)特折疊構(gòu)象的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)低聚物的抗體或者可以識別(結(jié)合)隨著先兆子癇出現(xiàn)的超分子聚集物和/或這樣聚集物的一個(gè)蛋白質(zhì)或多肽組分(作為這樣的一個(gè)聚集物的組分)的抗體而實(shí)現(xiàn)的。這樣超分子聚集物的存在預(yù)示著(預(yù)示著這個(gè)孕婦患有)先兆子癇。這里也描述了一種診斷受試者(一個(gè)孕婦)是否患先兆子癇或預(yù)測將來是否可能得先兆子癇的體外方法，包括檢測一個(gè)來自于受試者的尿液或胎盤樣本中異常/錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物(超分子聚集物)的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，在一個(gè)尿液樣本中檢測到了超分子聚集物(異常/錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在一個(gè)胎盤樣本中檢測到了異常/錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物。在上述任何一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過剛果紅染色檢測異常蛋白聚集物，如通過斑點(diǎn)印跡附著和/或光譜位移分析，或者通過硫磺素S染色。在任何一個(gè)實(shí)施方案中，異常/錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物可以含有krpinAl (alpha-Ι抗胰蛋白酶) 和/或多肽片段和/或血漿銅藍(lán)蛋白片段和/或重鏈IgG和/或輕鏈IgG。這里還描述了一種用于治療和/或防止孕婦患先兆子癇的方法的蛋白質(zhì)聚合抑制劑。用于治療和/或防止孕婦患先兆子癇的方法的蛋白質(zhì)聚合抑制劑包括1)抑制超分子聚集物重新形成的蛋白質(zhì)聚集抑制劑；幻逆轉(zhuǎn)之前就存在的超分子聚集物的蛋白質(zhì)抑制劑；；3)抑制超分子蛋白聚集物的重新形成并逆轉(zhuǎn)或者拆散之前就存在的超分子蛋白聚集物的蛋白抑制劑；4)穩(wěn)定蛋白質(zhì)原有構(gòu)象的蛋白聚集物抑制劑，這樣也就降低了異常
12折疊和后續(xù)聚合的速率；5)1)到4)的蛋白聚集抑制劑中可以抑抗胰蛋白酶)和/或多肽片段的聚集的；1)到4)中任何一種的蛋白聚集抑制劑，可以抑制 SerpinAKalpha-I抗胰蛋白酶)和/或多肽片段的聚集，并從以下選出(a)三甲胺N-氧化物(trimethylamine N-oxide) ； (b)三甲胺N-氧化物相關(guān)化合物；(c)FLEAIG肽；以及 (d)與FLEAIG肽相關(guān)的多肽和衍生物；6)1)到5)中任何一種的多肽抑制劑，并從以下選出(a)三甲胺N-氧化物；(b)三甲胺N-氧化物相關(guān)化合物；(c)FLEAIG肽；以及(d)與 FLEAIG肽相關(guān)的多肽和衍生物；7)1)到5)中任何一種的多肽抑制劑，并且是一種反_ β 淀粉蛋白試劑；8) —種7)的多肽抑制劑，而且反淀粉蛋白試劑是從以下選取的ρ-氨基苯酚，2-氨基-4-氯苯酚五肽 iA β 5 (LPFFD) (2-Amino-4-Chlorophenol pentap印tide iAP5) (LPFFD) (Axonyx 公司)；A β 聚集抑制劑 PPI-1019 (Praecis)；氨基多糖(GAG)擬肽 NC-531(Neurochem)；抗生素氯碘羥喹(Clioquinol) O^rana生物科技有限公司)，小分子環(huán)糊精，來自銀杏提取液Ε(Λ761的天然產(chǎn)物((Dr. Willman Schwabe GmbH & Co)；聚苯酚； SP-233, 一種22R-羥基膽固醇衍生物(Samaritan藥業(yè))，阿撲嗎啡(Apomorphine)，和A β 免疫(Elan 制藥公司，Acumen’ s ADDL 禾斗技)。參見 Drug Discovery Today :Therapeutic Strategies 2004 Elsevier Ltd 1(1) :7_12。這里描述的是一種研究和測試可用于治療先兆子癇的療法(即藥物)的方法。例如，藥物，包括那些已知的或后續(xù)發(fā)現(xiàn)的可以降低其他錯(cuò)誤折疊紊亂的嚴(yán)重性，都可以被檢測。例如，那些已經(jīng)評估過對治療如老年癡呆癥、輕鏈淀粉樣變性和阮病毒疾病有效性的藥物可用于評估治療先兆子癇時(shí)的有效性，包括阻止其開始、降低先兆子癇發(fā)生的程度或者逆轉(zhuǎn)已經(jīng)存在的先兆子癇(即通過阻斷、降解或打斷隨著先兆子癇出現(xiàn)的錯(cuò)誤折疊的蛋白聚集物，降低已經(jīng)存在的錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物的負(fù)擔(dān))。對這些試劑以及那些還沒被評估他們在治療異常蛋白聚集物類疾病時(shí)作用的試劑可以進(jìn)行檢測，以確定其在治療先兆子癇時(shí)的作用。這里還描述了治療患先兆子癇的孕婦的方法。一種治療先兆子癇的方法是給予一個(gè)孕婦治療有效量的藥物，例如，可以抑制(部分地或全部地)蛋白聚集物重新形成的藥物；可以逆轉(zhuǎn)(部分地或全部地)已經(jīng)存在的蛋白聚集物的壓力或存在的藥物；可以穩(wěn)定這些蛋白質(zhì)原始構(gòu)象進(jìn)而降低異常折疊和后續(xù)聚集速率的藥物；或者藥物的組合(多于一種藥物，相同類型的行為，如兩種抑制蛋白質(zhì)聚集物重新形成的藥物；多于一種藥物，不是相同類型的行為，如一種抑制蛋白聚集物重新形成的藥物和一種降低已經(jīng)存在的蛋白聚集物壓力的藥物)。根據(jù)進(jìn)一步的描述，申請人要求以下
權(quán)利要求
1.對懷孕女性是否患有先兆子癇的診斷以及輔助診斷的方法包括(a)從一名女性身上得到樣本；并且(b)檢測樣品中存在隨著先兆子癇產(chǎn)生(在病理學(xué)上是發(fā)病因素)的錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)超分子聚集物，超分子聚集物出現(xiàn)在樣品里的女性患先兆子癇或者將患先兆子癇的幾率比樣品中沒有出現(xiàn)這種超分子聚集物的女性更高。2.對懷孕女性是否患有先兆子癇的診斷以及輔助診斷的方法包括(a)從一名女性身上得到樣本；(b)將樣品與可以標(biāo)記錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)超分子聚集物的試劑在合適的標(biāo)記超分子聚集物可以發(fā)生的條件下混合，這種蛋白質(zhì)(i)含有serpina-Kalpha-l抗胰蛋白酶)或一個(gè)serpina-Ι的片段并且(ii)伴隨著先兆子癇出現(xiàn)(在病理學(xué)上是其發(fā)病因素)；并且(c)確定樣品中是否含有超分子聚集物，如果它存在，這名女性患先兆子癇或者將患先兆子癇的幾率比樣品中沒有出現(xiàn)這種超分子聚集物更高。3.權(quán)利要求1的方法中超分子聚集物含有serpina-1 (alpha-1抗胰蛋白酶)或者一個(gè)serpina-Ι的片段。4.權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的方法中超分子聚集物進(jìn)一步含有至少以下蛋白之一血漿銅藍(lán)蛋白，IgG的重鏈，IgG的輕鏈和干擾素誘導(dǎo)蛋白6-16 (IFI6)。5.權(quán)利要求1、3或者4中任意一個(gè)的方法中超分子聚集物的存在是通過混合樣本和一種可以以可檢測的方式標(biāo)記超分子聚集物的試劑進(jìn)行檢測的。6.權(quán)利要求1-5的方法中的樣本是尿液樣本或者胎盤組織樣本。7.權(quán)利要求1-6中的任何一個(gè)方法中的試劑是一種染料、一種抗體或者一種熒光劑標(biāo)簽。8.權(quán)利要求7的方法中的染料是一種雜芳香環(huán)染料。9.權(quán)利要求8的方法中的染料是剛果紅或者一種硫磺素。10.權(quán)利要求7-9中任何一個(gè)的方法中的超分子聚集物被染料染色而且超分子聚集物的染色是通過斑點(diǎn)印跡修正和/或光譜位移分析檢測的。11.孕婦是否患有先兆子癇的診斷性檢測中的檢測就是確定女性是否存在嗜剛果紅性蛋白尿以及一種含有serpina-1 (alpha-1抗胰蛋白酶)或一個(gè)serpna-Ι的片段的嗜剛果紅性蛋白聚集物能否在從孕婦處獲得的尿液樣本中檢測到。12.權(quán)利要求7的方法中的抗體是一種構(gòu)象依賴型而氨基酸序列非依賴型抗體。13.權(quán)利要求12的方法中的構(gòu)象依賴型抗體識別一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)誤折疊蛋白的超分子聚集物上的一個(gè)或多個(gè)表位，這些錯(cuò)誤蛋白是從下面分子群中選出的前纖維低聚物、 纖維低聚物、原纖維和淀粉蛋白纖維。14.權(quán)利要求13的方法中的構(gòu)象依賴型抗體識別纖維低聚物和/或淀粉蛋白纖維上的一個(gè)或多個(gè)表位。15.權(quán)利要求13的方法中的構(gòu)象依賴型抗體結(jié)合一種原纖維(圓形的)上面的一個(gè)或多個(gè)表位。16.權(quán)利要求13的方法中的構(gòu)象依賴型抗體結(jié)合一種前纖維低聚物上面的一個(gè)或多個(gè)表位。17.權(quán)利要求14的方法中的構(gòu)象特異性抗體是OC抗體。18.權(quán)利要求15的方法中的構(gòu)象特異性抗體是Officer抗體。19.權(quán)利要求16的方法中的構(gòu)象特異性抗體是All抗體。20.權(quán)利要求15或18的方法中如果原纖維特異性抗體與樣本是有免疫反應(yīng)性的， 那么這名女性已經(jīng)患有或者即將患細(xì)胞溶血癥。21. 一種診斷或者輔助診斷孕婦是否患有先兆子癇的方法包含(a)從孕婦處獲得一個(gè)尿液樣本或者一個(gè)胎盤組織樣本；(b)將樣本接觸一種可以結(jié)合伴隨先兆子癇出現(xiàn)的錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的超分子聚集物的構(gòu)象依賴型抗體，如果抗體結(jié)合樣本中的一個(gè)組分，女性已患先兆子癇或者很可能患先兆子癇的可能性比如果抗體不結(jié)合樣本組分的情況要高。22.權(quán)利要求21的方法中樣本的組分是以下幾種高分子聚集物之一一種前纖維低聚物、一種纖維低聚物、一種原纖維或者一種淀粉蛋白纖維。23.權(quán)利要求22的方法中的構(gòu)象依賴型抗體識別纖維低聚物和/或淀粉蛋白纖維上的一個(gè)或多個(gè)表位。24.權(quán)利要求22的方法中的構(gòu)象依賴型抗體識別原纖維(圓形的)上的一個(gè)或多個(gè)表位。25.權(quán)利要求22的方法中的構(gòu)象依賴型抗體識別前纖維低聚物上的一個(gè)或多個(gè)表位。26.權(quán)利要求23的方法中的構(gòu)象特異性抗體是OC抗體。27.權(quán)利要求M的方法中的構(gòu)象特異性抗體是Officer抗體。28.權(quán)利要求25的方法中的構(gòu)象特異性抗體是All抗體。29.權(quán)利要求對或27的方法中如果原纖維特異性抗體對樣本是有免疫反應(yīng)性的， 那么這名女性已經(jīng)患有或者即將患細(xì)胞溶血癥。30. 一種確定一個(gè)孕婦是否有患先兆子癇風(fēng)險(xiǎn)的方法包含(a)從女性處獲得一個(gè)樣本；(b)檢測樣本中是否存在伴隨先兆子癇(病理學(xué)上來說是其致病因素)出現(xiàn)的錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的超分子聚集物，如果超分子聚集物存在于樣本中，那么這名女性相對于樣本中沒有蛋白質(zhì)聚集物存在有更大的風(fēng)險(xiǎn)會患先兆子癇。31. 一種確定一個(gè)孕婦是否有患先兆子癇風(fēng)險(xiǎn)的方法包含(a)從女性處獲得一個(gè)樣本；(b)將樣本與一種可以標(biāo)記錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)超分子聚集物的試劑在適合標(biāo)記超分子聚集物的條件下混合，這種聚集物(i)含有serpina-Kalpha-l抗胰蛋白酶)或一個(gè) serpina-Ι的片段并且(ii)伴隨著先兆子癇出現(xiàn)(在病理學(xué)上是其發(fā)病因素)；并且(c)確定樣品中是否含有超分子聚集物，如果它存在，這名女性將患先兆子癇的風(fēng)險(xiǎn)比樣品中沒有出現(xiàn)蛋白聚集物更高。32.權(quán)利要求30的方法中的超分子聚集物含有serpina-1 (alpha-1抗胰蛋白酶) 或者serpina-Ι的一段片段。33.權(quán)利要求31或權(quán)利要求32的方法中超分子聚集物進(jìn)一步含有至少以下蛋白之一血漿銅藍(lán)蛋白，IgG的重鏈，IgG的輕鏈和干擾素誘導(dǎo)蛋白6-16 (IFI6)。34.權(quán)利要求30、32或者33中任意一個(gè)的方法中超分子聚集物的存在是通過混合樣本和一種可以以可檢測的方式標(biāo)記超分子聚集物的試劑進(jìn)行檢測的。35.權(quán)利要求30-34的方法中的樣本是尿液樣本或者胎盤組織樣本。36.權(quán)利要求34或35中的任何一個(gè)方法中的試劑是一種染料、一種抗體或者一種熒光劑標(biāo)簽。37.權(quán)利要求36的方法中的染料是剛果紅或者一種硫磺素。38.權(quán)利要求35-37中任何一個(gè)的方法中的超分子聚集物被剛果紅染色而且超分子聚集物的染色是通過斑點(diǎn)印跡固定和/或光譜位移分析檢測的。39. 一種降低孕婦發(fā)生先兆子癇程度的方法包括給予女性治療用有效劑量的對女性體內(nèi)發(fā)生[形成]蛋白聚集物的一種抑制劑，這種聚集物含有serpina-1 (alpha-1抗胰蛋白酶)或serpina-Ι的一個(gè)片斷并伴隨著先兆子癇(是其的一個(gè)致病因素)出現(xiàn)的，這里的治療用有效劑量就是足以抑制(部分地或者全部地)超分子聚集物的形成、打散(部分地或者全部地)已存在的超分子聚集物或者二者兼有的劑量。40.權(quán)利要求39的方法中的抑制劑穩(wěn)定了超分子聚集物至少一個(gè)組分的原有構(gòu)象，從而降低了異常折疊發(fā)生的程度，這樣女性體內(nèi)超分子聚集物形成的程度比抑制劑不存在時(shí)降低了。41.權(quán)利要求39或40的方法中的抑制劑是一種可以結(jié)合蛋白質(zhì)聚集物的一個(gè)組分的抗體或抗體片段、一種三甲胺N-氧化物、一種抗-beta淀粉蛋白試劑(即ρ-氨基苯酚，2-氨基-4-氯苯酚及其衍生物)、一個(gè)纖維形成的小分子抑制劑、原纖維形成或低聚物形成；或一種纖維形成、原纖維形成或低聚物形成的多肽抑制劑。42. 一種診斷先兆子癇或者預(yù)測受試者先兆子癇的未來發(fā)展的體外方法包含檢測取自所說的受試者的尿液或胎盤樣本中異常蛋白聚集物(錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的超分子聚集物)。43.權(quán)利要求1的方法中的異常蛋白聚集物是在一份尿液樣本中檢測到的。44.權(quán)利要求42的方法中的異常蛋白聚集物是在一份胎盤樣本中檢測到的。45.權(quán)利要求42-44任何一個(gè)的方法中的異常蛋白聚集物都是通過剛果紅染色檢測的。46.權(quán)利要求45的方法中的剛果紅染色包括斑點(diǎn)印跡固定和光譜位移分析。47.權(quán)利要求42-44任何一個(gè)的方法中的異常蛋白聚集物都是通過硫磺素S或者硫磺素T染色檢測的。48.權(quán)利要求42-47任何一個(gè)的方法中的異常蛋白聚集物包括 serpina-1 (alpha-1抗胰蛋白酶)和/或其多肽片段。49.權(quán)利要求42-48任何一個(gè)的方法中的異常蛋白聚集物包括血漿銅藍(lán)蛋白片段和IgG的重鏈和輕鏈。50. 一種蛋白聚集抑制劑用于治療和/或預(yù)防先兆子癇。51.權(quán)利要求50的抑制劑可抑制蛋白聚集物的重新形成。52.權(quán)利要求50或51的抑制劑可以逆轉(zhuǎn)或者拆散已經(jīng)存在的蛋白聚集物的形成。53.權(quán)利要求50的抑制劑可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)原有的構(gòu)象，從而降低異常折疊和后續(xù)聚合的速率。54.權(quán)利要求50-53任何一個(gè)的抑制劑可抑制serpina-1 (alpha-1抗胰蛋白酶) 和/或其多肽碎片的聚合，是從以下選出的(a)三甲胺N-氧化物；(b)三甲胺N-氧化物相關(guān)復(fù)合物；(c)FLEAIG多肽；以及(d)與FLEAIG多肽相關(guān)的多肽及其衍生物。55.權(quán)利要求50巧4任何一個(gè)的抑制劑，是從以下選出的(a)三甲胺N-氧化物； (b)三甲胺N-氧化物相關(guān)復(fù)合物；(c)FLEAIG多肽；以及(d)與FLEAIG多肽相關(guān)的多肽及其衍生物。56.權(quán)利要求50-M任何一個(gè)的抑制劑都是抗-beta淀粉蛋白試劑。57.權(quán)利要求56的抑制劑中，抗-beta淀粉蛋白是從ρ-氨基苯酚和2_氨基_4_氯苯酚中選出的。
58.權(quán)利要求7的方法中的抗體至少是以下之一(一個(gè)或多個(gè))A11抗體、OC抗體、Officer抗體、Ml 18抗體、M204抗體、M205抗體、M89抗體(即89-17)及M09抗體。附圖簡述

圖1展示了對尿液樣品(5 μ L/點(diǎn)加到硝酸纖維素膜(nitrocellulose membrane) 上)進(jìn)行剛果紅點(diǎn)測試后一個(gè)硝酸纖維素膜在洗之前(左邊)和洗之后(右邊)的情況的一張照片。圖2展示對一組橫向比較的尿液樣品(33 μ L/點(diǎn)加到硝酸纖維素膜上)進(jìn)行了剛果紅點(diǎn)測試后洗之前和洗之后的情況的一張照片。被方框圈住數(shù)字的樣本來自于患明顯嚴(yán)重先兆子癇的女性。圖3對一組縱向比較的尿液樣品(33 μ L/點(diǎn)加到硝酸纖維素膜上)進(jìn)行了剛果紅點(diǎn)測試后洗之前和洗之后的情況的一張照片。在整個(gè)妊娠過程中全程跟蹤了六個(gè)孕婦，多次抽取尿液進(jìn)行分析。被方框圈住的樣本來自于臨床顯示發(fā)病時(shí)期。對應(yīng)于樣本U348i和 U348J的方框是在由于先兆子癇而進(jìn)行有醫(yī)學(xué)指征分娩(緊急剖腹產(chǎn))后取得的樣品。圖4展示剛果紅保留率(CRR)的柱狀圖，根據(jù)患有嚴(yán)重先兆子癇(sPE)、慢性高血壓(cHTN)和正常懷孕對照(CRL)的女性的蛋白總量標(biāo)準(zhǔn)化。圖5展示了剛果紅保留率(CRR)和剛果紅整合(CRI)分別與(A)診斷先兆子癇和 (B)預(yù)測因先兆子癇而進(jìn)行強(qiáng)制性分娩的協(xié)同系數(shù)的ROC曲線(來自于114個(gè)不同孕婦的 233個(gè)尿液樣本)。圖6展示了尿蛋白的剛果紅保留率(CRR)和根據(jù)異常蛋白質(zhì)組學(xué)資料(UPSr)確定的先兆子癇的存在和嚴(yán)重性的相關(guān)性圖表。圖7展示了尿蛋白的剛果紅保留率(CRR)和比率指標(biāo)uFP :log[sFlt-l/ PIGFX 100]相關(guān)性的圖表。圖8展示了通過(A)斑點(diǎn)印跡檢測的剛果紅親和性，(B)凝膠過濾或(C)離心來分離先兆子癇中錯(cuò)誤折疊的尿蛋白的方法?？蜃〉臉颖緛碜曰加信R床顯性嚴(yán)重先兆子癇 (sPE)的女性。圖9展示的圖表說明了㈧招募的不同病狀組(CRL:對照；cHTN:慢性高血壓； gHTN 妊娠期高血壓；mPE 溫和先兆子癇；sPE 嚴(yán)重先兆子癇；spPE 重疊先兆子癇)的尿蛋白的％剛果紅保留率(CRR) ； (B)不同分娩組的尿蛋白的％剛果紅保留(CRR) (IND 有指征分娩)；(C) 一個(gè)準(zhǔn)確性圖譜，對比(1)尿蛋白的％剛果紅保留率(CRR)、(2)尿液中sFLT/ PIGF的比值及(3)P/C比例即尿蛋白/肌酸比例的預(yù)測準(zhǔn)確性(敏感性/100-特異性)。圖10展示了一張用尿液樣本(如圖所示尿液、血液、腦脊髓液(CSF)和胎盤裂解液；PE 先兆子癇；CRL 對照組)點(diǎn)在硝酸纖維素膜上進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)的照片，用三種多克隆抗體All、OC和Officer探測。圖11展示了一張用尿液樣本(PE 先兆子癇；CRL 對照組；cHTN 慢性高血壓)點(diǎn)在硝酸纖維素膜上進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)的照片，用多克隆抗體All進(jìn)行探測。紅色箭頭標(biāo)出了樣品點(diǎn)在膜上的不同行的位置。薄膜與樣本格子狀列陣及每個(gè)被黑圈圈出的樣本位置進(jìn)行對比。圖12展示了一張用尿液樣本(PE 先兆子癇；CRL:對照組)點(diǎn)在硝酸纖維素膜上進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)的照片，用多克隆抗體A11(A11，列1)進(jìn)行探測，在陰性對照(neg.，列2)中舍去了一級All抗體，以觀察是否有二級抗體非特異性結(jié)合。圖13展示了一張用尿液樣本(PE 先兆子癇；CRL 對照組)點(diǎn)在硝酸纖維素膜上進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)的照片，用單克隆抗體(M204，M205，M118，M89-17，M09，M55)和多克隆抗體All(All)進(jìn)行探測，在陰性對照(neg.，列2)中舍去了一級All抗體，以觀察是否有二級抗體非特異性結(jié)合。圖14展示了一張圖，顯示在縱向跟蹤的一組病人中預(yù)測由于先兆子癇導(dǎo)致有指征分娩。圖15A展示了來自三位女性的胎盤切片，其中兩個(gè)因?yàn)閲?yán)重先兆子癇進(jìn)行早產(chǎn) (A-F)，另一個(gè)是原發(fā)性早產(chǎn)(對照，G-H)，切片都用剛果紅染色并用白光(A，D，G)或者極化光(B，C，E，F(xiàn)，H和I)在顯微鏡下觀察。圖C和F是圖B&E中方框區(qū)域的放大(640x)。圖 I 使用剛果紅以相同條件染色的來自于一個(gè)患老年癡呆癥病人的大腦切片的極化光圖像。圖15B展示了先兆子癇患者尿液中剛果紅陽性沉淀物質(zhì)的圖像。圖16顯示了來自兩個(gè)患嚴(yán)重先兆子癇女性的尿液樣本的雙重還原性SDS PAGE電泳。左圖顯示了使用考馬斯亮蘭將所有蛋白染色后的凝膠(列1-4)。右圖顯示了轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)的^rpinAl的免疫反應(yīng)性。分子量標(biāo)簽(MW)呈現(xiàn)在每幅圖中。圖17顯示了對于抗-APF單克隆抗體09和89的二級篩選結(jié)果。圖18顯示了對抗alpha溶血素和ABeta的單克隆抗體09和89分析的結(jié)果。發(fā)明詳述先兆子癇在妊賑的后半期產(chǎn)生，與大量孕婦和胎兒患病或死亡相關(guān)。目前尚無有效的篩選方法，來診斷或者評估患此病以及與之相連的高血壓的風(fēng)險(xiǎn)。因此，懷孕女性無法得到有效的監(jiān)控或者治療，直到疾病引起其他并發(fā)癥，包括血壓升高、尿液出現(xiàn)蛋白等等。 另外，沒有患此類疾病風(fēng)險(xiǎn)的女性又要在懷孕全程做不必要的癥狀檢查，因?yàn)闆]有有效的方法使她們在懷孕早期就從有風(fēng)險(xiǎn)群體中被區(qū)分出來。而且，目前的測試方法需要醫(yī)生的監(jiān)督。此處描述的方法和組合物用于檢測和/或監(jiān)測先兆子癇相關(guān)的嗜剛果紅性以及與先兆子癇相關(guān)或引起先兆子癇的錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物的特異性構(gòu)型，這對于診斷和治療先兆子癇有很大的作用。同時(shí)，此處還描述了可以獨(dú)立用于診斷、治療先兆子癇的額外生物標(biāo)記，與此處描述的方法和用品相關(guān)聯(lián)，這些標(biāo)記還可以用于進(jìn)一步確認(rèn)和評估孕婦先兆子癇的狀態(tài)。例如，通過檢測錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物，一名女性被上述方法評判為患有先兆子癇或可能有高患病風(fēng)險(xiǎn)，她可以通過以先兆子癇相關(guān)(有指示作用)的額外生物標(biāo)記或指示物為基礎(chǔ)的方法被進(jìn)一步評估。這包括，例如，在孕婦尿液中檢測某一特定先兆子癇相關(guān)(有指示作用)生物標(biāo)記的存在或缺失(例如，絲氨酸蛋白酶抑制劑Al (SerpinAl)和白蛋白)，和/或在尿液中測量某一特定先兆子癇相關(guān)(有指示作用)生物標(biāo)記的比例(如 sFlt和PIGF)。對這些生物標(biāo)記的評估可以確認(rèn)或者輔助確認(rèn)(推翻或輔助推翻)上述方法的評估結(jié)果，即一名懷孕女性是否患有先兆子癇或有患病風(fēng)險(xiǎn)?？梢赃M(jìn)行此類評估的方法在此處有所描述，并且參考了如下專利內(nèi)容(例如，美國專利申請?zhí)?2/084004 ；PCT/ US2006/042585 和美國專利申請公開號US-2006_0183175 ；PCT/US2005/047010，它們的全部內(nèi)容通過引用的方式結(jié)合到本文中)。上面提到的方法可以用于診斷或輔助診斷孕婦是否患有、或有高風(fēng)險(xiǎn)患有下列高血壓異常癥先兆子癇、子癇、輕度先兆子癇、慢性高血壓、EPH妊娠中毒癥、妊娠高血壓、疊加型先兆子癇(包括與慢性高血壓、慢性腎病或狼瘡疊加的先兆子癇)、HELLP綜合征(溶血、肝臟酶升高、血小板含量下降)和腎病。此處所述方法同樣可以用于評判孕婦患有一個(gè)特定的高血壓并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，包括先兆子癇。這些并發(fā)癥可能包括剖腹產(chǎn)、血漿尿酸升高、收縮壓和舒張壓升高、驗(yàn)?zāi)虬粲械鞍追磻?yīng)、懷孕次數(shù)、生產(chǎn)時(shí)胎兒體重異常、胎盤破裂、IUGR、溶血、血小板減少癥、肝臟酶升高和HELLP綜合征(溶血、肝臟酶升高、血小板含量下降)。1、剛果紅測試/嗜剛果紅性以診斷先兆子癇蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定、錯(cuò)誤折疊和聚集成對自組裝染料剛果紅具有親和性(嗜剛果紅性)的超分子結(jié)構(gòu)，這是數(shù)目正在增加的一系列逐步發(fā)展的人類疾病的共同特征，比如阿爾茨海默病、帕金森癥和阮病毒病。對偶氮染料剛果紅(CR)的親和性被用于檢測這類蛋白錯(cuò)誤折疊引起的疾病中異常類淀粉蛋白聚集。申請人做出了新的出人意料的發(fā)現(xiàn)先兆子癇是與蛋白錯(cuò)誤折疊和蛋白聚集相關(guān)的孕婦特有的疾病。他們證明，先兆子癇帶有超分子類淀粉蛋白聚集和嗜剛果紅性尿蛋白的特征，說明錯(cuò)誤折疊蛋白的分泌增加。申請人推測， 尿液中先兆子癇相關(guān)的嗜剛果紅性提供了一種先兆子癇的診斷和/或預(yù)后診斷測試，其方法為測量中球蛋白錯(cuò)誤折疊的程度。與先兆子癇相關(guān)的錯(cuò)誤折疊蛋白可以在“超分子錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物”中發(fā)現(xiàn)。在本文中，“超分子錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物”這一術(shù)語(此處也指“超分子聚集物”、“異常蛋白聚集物”、“超分子類淀粉蛋白聚集”和“剛果紅蛋白聚集物”)指可溶的蛋白聚集物和不可溶的蛋白聚集物。這些包括(1)纖維前體寡聚物(同時(shí)只“類淀粉蛋白前體寡聚物”和“非纖維錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物”)，可溶并且具有“淀粉樣”性質(zhì)；( 原纖維；C3)纖維寡聚物， 可溶；以及(4)類淀粉蛋白纖維，不可溶。從先兆子癇患者、可能患有先兆子癇的患者和有患先兆子癇風(fēng)險(xiǎn)的孕婦處獲得的樣本，例如尿樣，可能含有相對少量或沒有不可溶類淀粉纖維，但是可能含有一種或幾種可溶超分子蛋白聚集物的混合物，例如纖維前體寡聚物、纖維寡聚物，和/或原纖維。在一些實(shí)施方案中，用于診斷先兆子癇的方法包括檢測樣本中的超分子蛋白聚集物。超分子聚集物可以利用，例如，雜芳香環(huán)和/或纖維特異性染料來檢測。在一些實(shí)施方案中，檢測樣本中(例如尿樣中)超分子聚集物，可以通過利用這些超分子聚集物與普通蛋白相比，能夠增加/增強(qiáng)芳香雜環(huán)染料的熒光(或?qū)е鹿庾V移動)的性質(zhì)來檢測，這些染料包括例如硫磺素(讓10打￡1“11)(硫磺素1\11111或硫磺素5，11^)和剛果紅(CR)。在一些實(shí)施方案中，診斷先兆子癇的方法包括檢測可溶超分子聚集物，例如使用雜芳香環(huán)和/或纖維特異性染料檢測樣本中纖維前體寡聚物。我們不希望被某一種特定理論限制，但是我們認(rèn)為在向可溶超分子聚集物加入雜芳香環(huán)和/或纖維特異性染料可以促進(jìn)不可溶超分子聚集物的形成和沉淀，例如纖維前體聚集物和/或纖維聚集物，使得這些聚集物變得容易檢測得到。這里提供的是診斷或輔助診斷先兆子癇的方法。在一些實(shí)施方案中，檢測尿液嗜剛果紅性(如利用斑點(diǎn)印跡固定法或者光譜移動分析)對于孕婦是否患先兆子癇有指示作用。在一些實(shí)施方案中，用上述方法檢測出尿液中的嗜剛果紅性蛋白聚集物，不只是對已經(jīng)患有的先兆子癇的診斷證據(jù)，同時(shí)也可以預(yù)測孕婦未來是否可能得先兆子癇。在一些實(shí)施方案中，胎盤組織中被剛果紅染色的嗜剛果紅性蛋白聚集物可以用于診斷先兆子癇。需要明白的是，蛋白聚集物可以用很多種其他方法和試劑檢測。這些都是普通技術(shù)范疇之內(nèi)，并且需要過度的實(shí)驗(yàn)，這些是本發(fā)明的一部分，并且包含在此。除了諸如剛果紅和硫磺素等染料以外，其它試劑(包括剛果紅和硫磺素的衍生物)也可以用于檢測此處描述的超分子蛋白聚集物。這些檢測試劑包括，但不局限于姜黃素類似物(J.Am· Chem Soc. 131 :15257(2009) ； X-34 (1,4-bis (3-carboxy-4-hy droxyphenylethenyl)-benzene), 一種高焚光的剛果紅(Ikonomovic 等人，Methods in Enzymology 412(2006), "Amyloid,Prions and other protein aggregates",Part B pp 123-144)和 J. Histochem and Cytochem 48 :1223(2000)；硫磺素 S ；硫磺素 T ；尼羅紅；吖啶橙；氨基-8-萘磺酸鹽(ANS)和Bis-ANS ；4- 二氰乙烯久洛尼定(DCVJ) (Biophysical Journal 94(12) :4867_4879，2008) ;A01987(惡嗪染料)(Nature Biotechnology 23(5)577(2005))；熒光苯乙烯染料(Angewandte Chemie, Internnational Edition 43(46)6331-6335(2004)) ；BF-168 (6_2_ 氟乙氧基)-2-[2-(4_ 甲基氨基苯酚)乙烯基] 苯并惡唑(J. Neuroscience 24 (10), 2535 (2004)) ；BSB (反，反)-1-溴-2，5-二 - (3-羥基羰基-4-羥基)苯乙烯基苯(Lab. Investigation 83(12) 1751 (2003))；喹啉腙化合物 (如,4-甲基-7-甲氧基-2-(4-喹啉基亞甲基聯(lián)氨)喹啉)(W02002/0M652，Thomas Raub et. al. , Chrisamin G et al. Chrysamine-G, a lipophilic analogue of Congo red, inhibits A beta-induced toxicity in PC12 cells.Life Sci. 1998 ；63 (20) :1807-14)； 利福平 CTomiyama T et al. J Biol Chem. 1996 ；271 :6839-6844)；褪黑素(Pappolla Met al. J Biol Chem. 1998 ；273 :7185-7188)；黃芩素(Zhu M et al. The flavoid baicalein inhibits fibrillation of alpha-synuclein and disaggregates existing fibrils. J Biol Chem. 2004 Jun 25 ；279 (26) :26846-57)；鯊肌醇(青蟹肌醇，1，3，5/2，4，6-六羥基環(huán)己燒(Cocositol, Quercinitol, 1,3, 5/2,4,6-Hexahydroxycyclohexane))及其衍生物(Sun et al. Synthesis of scyllo-inositol derivatives and their effects on amyloid beta peptide aggregation. Bioorg Med Chem. 2008 Aug 1 ；16 (15) :7177-84)； 成像探針，如[11C]-PIB :N-甲基[11C]2_(4，-甲基氨基苯酚-6-羥基苯并三唑)(Brain 130 :2607(2007))；均二苯乙烯基苯并三唑和其衍生物(Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 18 :1534(2008))以及其它例如 FEBS letters 583 :2593(2009)中描述的例子的試劑。在一些實(shí)施方案中，提供了非侵入性和快速尿液診斷方法。在一些實(shí)施方案中，這些診斷方法以剛果紅親和性為基礎(chǔ)。在一些實(shí)施方案中，先兆子癇患者蛋白錯(cuò)誤折疊總程度可以通過簡單的診斷測試判斷(尿液剛果紅保留值(CRR))。CRR測試也可以被用于預(yù)測 IND，一個(gè)重要的早產(chǎn)原因。此處描述的方法和組合物使得人們可以通過檢測和/或監(jiān)控嗜剛果紅性來評判和/或監(jiān)控孕婦患有高血壓癥的風(fēng)險(xiǎn)，例如剛果紅保留值。需要明白的是，其他可以與蛋白聚集物反應(yīng)/結(jié)合的染料，以及/或具有剛果紅類似化學(xué)性質(zhì)的染料也可以被用于上述方法。本發(fā)明不局限于使用剛果紅。在一些實(shí)施方案中，診斷方法包括從懷孕女性處得到蛋白樣本，并且測試蛋白樣本的嗜剛果紅性。在一些實(shí)施方案中，嗜剛果紅性的檢測是通過將尿樣與剛果紅染料接觸
20充足的時(shí)間，使剛果紅結(jié)合(CRI)，隨后使用洗滌溶液洗滌樣本。洗滌后，樣本剛果紅保留值 (CRR)顯示該孕婦是否患有先兆子癇或有患先兆子癇的風(fēng)險(xiǎn)。作為剛果紅結(jié)合值的參考，可以引入陽性和陰性對照，例如，從已經(jīng)確診先兆子癇患者處獲得的樣本，和正常血壓人群處獲得的樣本。結(jié)合步驟和/或洗滌步驟可以通過加入陽性和陰性對照得到對比。陽性樣本在洗滌后仍保留剛果紅染色(CRR陽性)則說明染色充分，陰性樣本在洗滌后不含剛果紅表明洗滌充分(CRR陰性)。在一些實(shí)施方案中，CRR可以不用可視儀器即可觀察，例如，通過諸如剛果紅親和斑點(diǎn)印跡、凝膠過濾、和離心以及水洗沉淀了的結(jié)合剛果紅的蛋白等分離方法(見圖8)。在一些實(shí)施方案中，分離步驟可以在一個(gè)容器或試管中進(jìn)行，例如hlcon 或Eppendorf 管，染料結(jié)合和洗滌可以在這個(gè)容器或試管中進(jìn)行，隨后進(jìn)行離心以將結(jié)合了蛋白的染料和未結(jié)合蛋白染料分離(例如，沉淀)，隨后可以選做額外的洗滌步驟。在一些實(shí)施方案中，樣本可以被點(diǎn)在具有蛋白親和性的膜上，例如硝酸纖維素膜，染色和洗滌步驟可以在膜上進(jìn)行(例如，斑點(diǎn)印跡)。此類測試只需要有限或者不需要經(jīng)過訓(xùn)練的醫(yī)生的監(jiān)督，例如由訓(xùn)練過的技術(shù)員，或者在一些情況下由病人完成，不需要指導(dǎo)和/或?qū)嶒?yàn)儀器 (例如使用一個(gè)含有必要試劑和說明書的試劑盒)。申請人:發(fā)現(xiàn)，盡管一組懷孕女性尿樣里的蛋白濃度相差很遠(yuǎn)，尿液中蛋白水平通常足以測量嗜好剛果紅性，而不需要將樣本濃縮。這使得人們可以設(shè)計(jì)對實(shí)驗(yàn)室儀器沒有特殊要求、或只要求基本儀器的簡單分析檢測。在一些實(shí)施方案中，剛果紅結(jié)合值百分比(％ CRI)可以通過比如使用光密度測量 (0D，光密度測量儀)，與陰性對照相比較，再乘以100，來測定。洗滌后的剛果紅保留值百分比(％ CRR)也可以使用光密度測量(0D)，將結(jié)果與陰性對照相比較，再乘以100。樣本的 CRR值即可通過與相應(yīng)陰性對照值相比得到。洗滌充分的標(biāo)志是陰性對照中沒有可見的殘余剛果紅，OD的平均值應(yīng)該為0(如果使用了多個(gè)對照)。在一些實(shí)施方案中，剛果紅保留值(CRR)和剛果紅結(jié)合值(CRI)系數(shù)可以被計(jì)算出來，CRR > 20%的樣本可以被“稱作”紅斑點(diǎn)試驗(yàn)陽性，而CRR < 15%者為陰性。在一些實(shí)施方案中，使用此處所述的診斷方法在尿液中檢測出嗜剛果紅性尿蛋白，可以在臨床表征出現(xiàn)前8至10周檢測出孕婦患有重度先兆子癇。在一些實(shí)施方案中， 尿嗜剛果紅性的鑒定(通過斑點(diǎn)雜交固定和/或光譜漂移實(shí)驗(yàn))對于患者是否患有先兆子癇有指示作用，并且提供了一種先兆子癇的診斷方法。在一些實(shí)施方案中，由上述方法檢測到的尿液嗜剛果紅性蛋白聚集物不只可以用于診斷現(xiàn)存的先兆子癇癥，還可以預(yù)測未來發(fā)展為先兆子病癥的可能性。在一些實(shí)施方案中，尿樣在收集后(例如，在斑點(diǎn)印跡、驗(yàn)?zāi)虬羯匣蛘咂渌愃莆锲飞?可以立即被分析，或等待一段時(shí)間。例如，尿樣可以在-70攝氏度下冰凍，和/或收集在管中或容器中，干燥后在-20攝氏度或者4攝氏度保存。樣本的干燥可以使用真空離心(例如，SpeedVac)，干燥后的樣本可以儲存更久，并且降低0攝氏度以上分析時(shí)變質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)(例如，蛋白變性)。需要注意的是，通過干燥來濃縮樣本通常是不必要的，但是樣本可以由于上述或其他原因被干燥。2.用構(gòu)象特異性的蛋白質(zhì)聚集物抗體診斷先兆子癇申請人:意外地發(fā)現(xiàn)先兆子癇是一種蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病，這種疾病與蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和聚集有關(guān)，它的一個(gè)很重要的特點(diǎn)是淀粉樣蛋白的聚集。
這里我們詳細(xì)列出診斷先兆子癇的一些方法，這些方法利用特異性的抗體，識別懷孕期女性尿液中某種先兆子癇特征性的蛋白質(zhì)聚集物，從而診斷出這種疾病。這里描述的方法是用多克隆或單克隆抗體檢測與蛋白質(zhì)聚集類疾病如先兆子癇有關(guān)的蛋白質(zhì)構(gòu)象，其中主要有(i)檢測一種前纖維狀的可溶性寡聚體構(gòu)象，例如本專利用到的“All”抗體等；(ii)檢測一種環(huán)狀的原纖維構(gòu)象，例如本專利用到的“Officer”抗體等；(iii)檢測一種細(xì)纖維狀構(gòu)象，例如本專利用到的“0C”抗體等。在本說明書中，“錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)超分子聚集物”(也被稱為“超分子聚集物”、“異常蛋白質(zhì)聚集物”、“超分子淀粉樣聚集物”或者“親剛果紅蛋白質(zhì)聚集物”)指的是可溶性的和非可溶性的蛋白質(zhì)聚集物。這些聚集物包括(1)前纖維狀寡聚體(也稱為“前淀粉樣寡聚體”或者“非纖維錯(cuò)誤蛋白聚集物”)，這種聚集物可溶并且具有“淀粉樣”的特征；O) 原纖維狀聚集物；C3)纖維狀寡聚體，這種聚集物也是可溶的；(4)淀粉樣纖維，這種聚集物不可溶。這些超分子聚集物中，每一種都能夠被特異性的抗體識別，例如本說明書中提到的構(gòu)象依賴性-序列非依賴性抗體。本說明書中提到的具有“淀粉樣”特征的蛋白質(zhì)聚集物具有某些共同的化學(xué)、物理、生物學(xué)特征，都含有淀粉樣纖維，但是在其他化學(xué)、物理、生物學(xué)特征上可能有所不同， 例如對于某些淀粉樣蛋白質(zhì)聚集物，它們的結(jié)構(gòu)可能有所不同。在某些實(shí)施方案中，前纖維狀寡聚體會出現(xiàn)在先兆子癇病人的尿液中。在某些實(shí)施方案中，這種前纖維狀寡聚體在樣本中的出現(xiàn)，例如在尿液中，能夠被構(gòu)象依賴性-氨基酸序列非依賴性的抗體所識別。在某些實(shí)施方案中，All抗體可以起到這種作用。在某些實(shí)施方案中，原纖維會出現(xiàn)在樣品中，例如先兆子癇病人的尿液中。在某些情況下，這些原纖維在樣本的出現(xiàn)，例如在尿液中，能夠被構(gòu)象依賴性-氨基酸序列非依賴性抗體所識別。在某些實(shí)施方案中，Officer抗體可以起到這種作用。在某些實(shí)施方案中，纖維狀寡聚體或者淀粉樣纖維會出現(xiàn)在樣品中，例如先兆子癇病人的尿液中。在某些情況下，這些纖維狀寡聚體或者淀粉樣纖維在樣本的出現(xiàn)，例如在尿液中，能夠被構(gòu)象依賴性-氨基酸序列非依賴性抗體所識別。在某些情況下，OC抗體可以起到這種作用。這種構(gòu)象依賴性-氨基酸序列非依賴性識別超分子聚集物的抗體可以利用動物， 例如用小鼠或者兔子，采用含有前纖維聚集物(寡聚體)、纖維狀聚集物(寡聚體)、具有 “淀粉樣”性質(zhì)并且可能形成這種前纖維聚集物的多肽原纖維或者纖維、纖維狀聚集物、原纖維或者淀粉樣纖維等來制備?，F(xiàn)在已知一些具有“淀粉樣”特征的多肽，例如Αβ (1-40)、 A β (1-42)、多聚谷氨酰胺(PolyGln)分子 ΝΗ2-KKQ42KK-COOh 等，這些例子在 Example 4， Kayed etal. Mol Neurodegener. 2007 ；2 18 ；Hrncic et al. Am J Pathol. 2000 ； 157 1239-1246 ;0，Nuallain B et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2002 ;99 1485-1490 中有詳細(xì)的描述。制備抗體用的動物可以用一群形態(tài)單純的纖維來免疫，例如產(chǎn)生構(gòu)象依賴性-氨基酸序列非依賴性的特異性識別纖維或纖維狀聚集物的抗體。這樣產(chǎn)生的抗體中，一些可能專門識別纖維或纖維狀聚集物，而并不識別(不交叉反應(yīng))隨機(jī)的螺旋狀單體、前纖維寡聚體或者正常折疊的前體蛋白。
另一種方法是用無定形的前纖維聚集物來免疫動物制備抗體，例如產(chǎn)生構(gòu)象依賴性-氨基酸序列非依賴性的特異性識別前纖維聚集物的抗體。這樣產(chǎn)生的抗體中，一些可能專門識別前纖維狀聚集物，而并不識別(不交叉反應(yīng))纖維狀寡聚體、淀粉樣纖維、單體或者正常折疊的前體蛋白。另一種方法是用原纖維來免疫動物制備抗體，例如產(chǎn)生構(gòu)象依賴性-氨基酸序列非依賴性的特異性識別環(huán)形原纖維的抗體。這樣產(chǎn)生的抗體中，一些可能專門識別原纖維， 而并不識別(不交叉反應(yīng))前纖維寡聚體、纖維狀寡聚體、淀粉樣纖維、單體或者正常折疊的前體蛋白。申請人:已經(jīng)說明，檢測與先兆子癇相關(guān)的異常蛋白質(zhì)構(gòu)象(超分子聚集物)的特異性能夠隨著二級抗體被人IgG預(yù)先吸附以減少非特異性結(jié)合而顯著增加。這一結(jié)論的部分根據(jù)是申請人發(fā)現(xiàn)與先兆子癇相關(guān)的蛋白質(zhì)超分子聚集物中包含人類免疫球蛋白或其片段。未提前吸附的二級抗體的交聯(lián)反應(yīng)會導(dǎo)致二級抗體的非特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，提供檢測尿液中與先兆子癇相關(guān)的異常蛋白質(zhì)構(gòu)象的方法，這些方法包括獲取已經(jīng)患有、被懷疑患有、或者有高風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)生先兆子癇的懷孕期女性的尿液樣本，將尿液樣本與特異性識別蛋白質(zhì)聚集類疾病相關(guān)構(gòu)象的一級抗體(單克隆或者多克隆)在適合結(jié)合的條件下接觸，使錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)與抗體結(jié)合，成為一個(gè)組合物，再將這個(gè)結(jié)合體與預(yù)先吸附過人IgG以降低非特異性結(jié)合的二級抗體接觸，并檢測尿液中是否存在錯(cuò)誤折疊蛋白與抗體的復(fù)合體，這種復(fù)合體的出現(xiàn)即代表了先兆子癇可能發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)聚集物按照上文的方法與All —級抗體接觸，并接著與預(yù)先吸附過的二級抗體接觸。這樣，檢測的All陽性程度即代表了先兆子癇綜合癥的嚴(yán)重性。應(yīng)當(dāng)明白的是，只要能夠足夠地與人IgG預(yù)先吸附以防止非特異性結(jié)合，任何能夠檢測一級抗體的二級抗體都可以被采用。從這個(gè)層面上講，這一發(fā)明并不局限二級抗體。 二級抗體可以連接任何用于檢測的標(biāo)記，其中包括但不限于放射性同位素標(biāo)記、酶標(biāo)記、非放射性同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記、毒素標(biāo)記、親和標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記或者核磁共振對比度試劑等。另外需要注意的是，隨著目的的不同，檢測系統(tǒng)可以很方便地變化，例如采用多種標(biāo)簽的高通量/自動化篩選或者其他檢測方法，從這個(gè)層面上講，這一發(fā)明并沒有局限性。也應(yīng)當(dāng)明白的是，這里提到的抗體只是作為例子，也可以用這里提到的或者其他已知的方法產(chǎn)生更多的抗體。除了這里提到的之外的其他抗體，包括但不限于全抗體、單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人抗體、靈長類動物抗體、多特異性抗體、單鏈抗體、表位結(jié)合抗體、含有VL或VH結(jié)構(gòu)域的抗體等，例如識別蛋白質(zhì)聚集物的、識別錯(cuò)誤折疊或異常蛋白質(zhì)構(gòu)象的、識別特定蛋白質(zhì)(那些本專利提到的生物標(biāo)記蛋白)片段的抗體等，也構(gòu)成了這一發(fā)明的一部分。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了識別蛋白質(zhì)聚集體、錯(cuò)誤折疊或者異常的蛋白質(zhì)構(gòu)象的單克隆抗體。在某些實(shí)施方案中，提供與All抗體使用相同抗原制備的抗體 (Science 300 :486_489，2003)，這些抗體優(yōu)先識別不同種類的前纖維蛋白寡聚體構(gòu)象。在某些實(shí)施方案中，提供#204、#205和#89單克隆抗體，這些抗體表現(xiàn)出能夠免疫識別蛋白質(zhì)聚集體，能夠識別先兆子癇病人尿液中這些蛋白質(zhì)聚集體，并且在對照組尿液中檢測不出此類蛋白質(zhì)聚集體的存在。在某些實(shí)施方案中，能夠識別前纖維蛋白寡聚體的不同的構(gòu)象的單克隆抗體例如#204、#205和#89單克隆抗體，可以用來診斷先兆子癇。這里提到的尿液中的蛋白質(zhì)聚集物不僅僅可以用于診斷已經(jīng)發(fā)生的先兆子癇，也可以預(yù)測這種疾病未來的發(fā)生。除了檢測尿液中出現(xiàn)的蛋白質(zhì)聚集物之外，胎盤組織樣本也可以出現(xiàn)這種蛋白質(zhì)聚集物的特征。用選擇性抗體檢測胎盤中異常折疊的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)聚集體的方法同樣也可以用于診斷先兆子癇。在某些實(shí)施方案中，與蛋白質(zhì)寡聚體結(jié)合的抗體可能具有治療的作用，如(i)破壞蛋白質(zhì)寡聚體/聚集物；(ii)阻止蛋白質(zhì)寡聚體/ 聚集物的進(jìn)一步生長；(iii)穩(wěn)定已有的蛋白質(zhì)寡聚體/聚集物，防止其轉(zhuǎn)化為更易致病的構(gòu)象；(iv)將蛋白質(zhì)寡聚體/聚集物從致病構(gòu)象轉(zhuǎn)化為非致病構(gòu)象。這樣的治療方法已經(jīng)用于治療老年癡呆癥，例如使用抗淀粉樣蛋白的抗體等。申請人發(fā)現(xiàn)，先兆子癇是一種與異常蛋白質(zhì)寡聚體積累有關(guān)的疾病。在一些實(shí)施方案中，對異常折疊的蛋白質(zhì)的獨(dú)特構(gòu)象具有親和性的抗體，如本專利提到的#204、#205和 #89-17單克隆抗體或類似的抗體，可以用于治療先兆子癇。申請人:發(fā)現(xiàn)，先兆子癇病人尿液中出現(xiàn)的蛋白質(zhì)聚集物，其中包括一種或多種免疫球蛋白的重鏈和輕鏈、血菜銅藍(lán)蛋白和interferon-inducible protein 6-16(IFI_6)蛋白，也同樣對于檢測、預(yù)防、治療這種疾病有意義。在一些實(shí)施方案中，提供了對于先兆子癇的診斷和預(yù)后方法，這些方法包括對于先兆子癇癇人胎盤或者尿液中的蛋白質(zhì)聚集體中蛋白質(zhì)的定量分析，相應(yīng)的蛋白質(zhì)包括免疫球蛋白重鏈和輕鏈、血漿銅藍(lán)蛋白和IFI-6蛋白。 在一些實(shí)施方案中，對于蛋白質(zhì)的定量分析包括測量相對于某個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)濃度，例如某個(gè)血壓正常的個(gè)體的樣本。在一些實(shí)施方案中，使用特異性識別免疫球蛋白重鏈和輕鏈、 血漿銅藍(lán)蛋白或者IFI-6的抗體。在一些實(shí)施方案中，提供特異性識別存在于先兆子癇癇人或者高危個(gè)體尿液樣本中的錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)聚集體的構(gòu)象表位的抗體，用于檢測先兆子癇的發(fā)生。這里提供的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體，也包括抗體片段以及包含相關(guān)抗原識別結(jié)構(gòu)域的抗體衍生物。“抗體”這個(gè)詞是指含有至少一個(gè)抗原結(jié)合域的免疫球蛋白分子或其他分子。這里用到的“抗體”一詞包括全抗體(如IgG，IgA, IgE, IgM或IgD)，單克隆抗體，多克隆抗體，嵌合抗體，人性化抗體，靈長類動物抗體，多特異性抗體，單鏈抗體，表位結(jié)合片段如Fab、Fab’ 和F (ab，) 2, Fd, Fvs,單鏈Fvs (scFv)，硫交聯(lián)Fvs (sdFv)，含有VL或VH結(jié)構(gòu)域的片段，以及完全合成或者重組的抗體。本發(fā)明中的免疫球蛋白或者抗體分子可以是任何種類(如IgG，IgE, IgM, IgD, IgA 和IgY)，類型(如IgGl, IgG2，IgG3，IgG4，IgAl和IgA2)或者亞型的免疫球蛋白分子。在一些實(shí)施方案中，提供多克隆抗體，例如“Office”，“0C”和“All”多克隆抗體。 單克隆抗體和多克隆抗體可以通過用免疫原的不同表位來免疫的方法從活體中取得，例如用寡聚蛋白聚集物(前纖維狀和纖維狀)、原纖維聚集物或者含有淀粉樣纖維的聚集物進(jìn)行免疫。這些聚集物在構(gòu)象上可以是均一的，也可以是不均一的/無定形的?？寡獫{可以從一系列動物中通過一次或多次注射一種抗原得到，也可以選擇性加入非特異性免疫增強(qiáng)劑，例如佐劑等。對于許多小分子或者半抗原來說，可能需要與一種載體蛋白通過某種偶聯(lián)試劑相連，這種載體蛋白可能會被輔助性T細(xì)胞識別來起到幫助的作用。均一或者不均一 /無定形的寡聚蛋白質(zhì)聚集體(前纖維狀或者纖維狀)、原纖維聚集體或者含有淀粉樣纖維的聚集物可以與某種佐劑共同使用，例如不完全福氏佐劑。
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在一次或多次免疫之后，產(chǎn)生的抗體中主要可能為對表位有親和性的IgG。多克隆抗體能夠提供多種特異性。多克隆抗體的特異性可以通過用純化的抗原進(jìn)行親和層析的方法來提高。在一些實(shí)施方案中，提供單克隆抗體，例如“M204” “M205”和“M89”單克隆抗體。 這些和其他識別類似抗原的單克隆抗體能夠用于本專利中描述的方法，如診斷或者協(xié)助診斷先兆子癇；預(yù)測或者協(xié)助預(yù)測懷孕女性患先兆子癇的可能性；以及確定或者協(xié)助確定一名懷孕期女性是否有發(fā)展為先兆子癇的危險(xiǎn)。例如，單克隆抗體89對于懷孕期女性的尿液的免疫反應(yīng)程度能夠表明HELLP綜合癥的風(fēng)險(xiǎn)和嚴(yán)重程度，HELLP是嚴(yán)重先兆子癇的一種非典型形式，其特征有溶血、肝臟酶類水平升高和血小板水平偏低。在HELLP綜合癥中，早期的診斷非常重要，因?yàn)檫@種病癥的致死率高達(dá)25%。已經(jīng)制備了抗α原纖維(alpha protofibrils)的單克隆抗體，這種抗體能夠與溶血素形成的原纖維反應(yīng)，這些聚集物是由細(xì)菌產(chǎn)生的外毒素形成的，在體外實(shí)驗(yàn)中能夠引起紅細(xì)胞裂解。本專利申請中提供的結(jié)果(例如圖13)支持了使用單克隆抗體89 對單克隆抗體204，205或者多克隆抗體Al 1的相對免疫反應(yīng)強(qiáng)度來確定HELLP綜合癥的風(fēng)險(xiǎn)和急需治療的程度。同時(shí)，也描述了確定或者協(xié)助確定懷孕期女性患HELLP綜合癥的風(fēng)險(xiǎn)和急需治療的程度的方法。這種方法包括評估一個(gè)樣本中(例如尿液或胎盤組織)單克隆抗體89的免疫反應(yīng)強(qiáng)度與單克隆抗體204、205以及多克隆抗體All中至少一個(gè)的反應(yīng)強(qiáng)度之比。這種反應(yīng)強(qiáng)度之比與未患先兆子癇的對照組懷孕期女性的不同能夠判斷或者協(xié)助判斷懷孕期女性患HELLP綜合癥的可能性。單克隆抗體可以通過免疫動物，如小鼠和大鼠來取得?？梢詮谋幻庖叩膭游锷砩戏蛛x出B細(xì)胞，例如從胰腺中取得。分離出來的B細(xì)胞能夠和其他細(xì)胞融合，例如與骨髓癌細(xì)胞系融合，來產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，這種細(xì)胞能夠無限地培養(yǎng)在離體環(huán)境中。這些雜交瘤細(xì)胞能夠通過稀釋來分離(單細(xì)胞克隆)并培養(yǎng)成不同的集落。這些集落可以被用來篩選產(chǎn)生某種特殊親和性和特異性的抗體的單個(gè)集落。篩選出的雜交瘤細(xì)胞能夠培養(yǎng)在培養(yǎng)液中， 產(chǎn)生的抗體能夠從培養(yǎng)液中分離出來。雜交瘤細(xì)胞也能夠被注射入動物體內(nèi)，例如小鼠，來產(chǎn)生活體腫瘤(例如腹膜瘤)，從而產(chǎn)生抗體，這些抗體能夠從腹水中收集。血漿的促使細(xì)胞裂解的作用能夠被選擇性地失活，例如用加熱的方法。能夠用于制備抗體的包括某些特定的蛋白、多肽、半抗原、化學(xué)性化合物和蛋白質(zhì)聚集體，例如均一性和不均一性/無定形的寡聚聚集體(前纖維狀和纖維狀)，原纖維聚集物或者含有淀粉樣纖維的聚集物。了解這一方法的人士會發(fā)現(xiàn)，用于免疫的多肽的量會隨著許多因素的不同而變化，例如用于免疫的動物、所選擇的多肽的抗原性以及注射的部位。 作為免疫原的多肽(如聚集物)可以經(jīng)過適當(dāng)?shù)男揎棧蛘吲c佐劑共同使用以增加多肽的抗原性。在某些情況下，多肽(聚集物)，肽鏈，半抗原和小分子可以與載體蛋白共軛連接以激發(fā)免疫反應(yīng)。均一性或者非均一性/無定形寡聚聚集物(前纖維，纖維)，原纖維聚集物或者含有淀粉樣纖維的聚集物可以與佐劑共同使用，例如不完全福氏佐劑。能夠用于提高抗原性的方法已經(jīng)很清楚，包括例如將抗原與某異源性蛋白(如球蛋白或者半乳糖苷酶)相連接，或者在免疫時(shí)加入一種佐劑。滴定確定抗體用量時(shí)可以采用例如抗原特異性ELISA，蛋白質(zhì)印跡分析，或者放射免疫反應(yīng)等方法來測定。一般采用一只或多只動物產(chǎn)生抗體。這里提供的抗體或者免疫特異性片段可能來自以下任何一種動物包括兔，綿羊，山羊，雞，小鼠，大鼠，倉鼠，天竺鼠， 驢，駱駝，或者馬。在一次或多次注射抗原之后，每次注射后7-10天以后，可以取動物血漿來確定特定抗體的產(chǎn)生量(滴定)。這種測試可以是對于抗原本身，例如用ELISA方法檢測?？贵w可以儲存在許多不同的緩沖溶液中，例如在中性PH值的0. 01M、pH7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS) 中，還可以選擇性地加入0. 疊氮化鈉以抑制微生物生長。對于長期儲存，抗體可以保存在低溫下，例如4 V、-20 V或者-70 V?？贵w可以保存在大于0. 5mg/mL的濃度下，也可以加入一種載體蛋白(如牛血漿白蛋白)，或者在需要冷凍時(shí)加入50%甘油。制備抗體的方法，包括準(zhǔn)備抗原，免疫動物和收集抗血漿的方法可以在以下參考文獻(xiàn)中找到Antibodies :A Laboratory Manual，Ε. Harlow and D. Lane，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor，NY，1988)pp. 55-120 禾口 A. M. Campbell， Monoclonal Antibody Technology ；Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，The Netherlands(1984).這里采用的名詞“抗體片段”包括任何含有一個(gè)表現(xiàn)出抗原結(jié)合功能的抗原結(jié)合域的抗體?？贵w可以用傳統(tǒng)技術(shù)變成片段。例如，用胃蛋白酶處理抗體可以產(chǎn)生F(ab’)2 片段。產(chǎn)生的F(ab’)2片段能夠處理使二硫鍵減少，來產(chǎn)生Fab’片段。木瓜蛋白酶消化可以形成Fab片段。重組技術(shù)或者化學(xué)合成可以用來產(chǎn)生Fab，F(xiàn)ab，，F(xiàn)(ab，)2, scFv, Fv, dsFv, Fd, dAbs, TandAbs, ds-scFv, dimers, minibodies, diabodies,雙特異性抗體片段禾口其他抗體片段。這種產(chǎn)生抗體片段的方法已經(jīng)有了詳細(xì)的描述?？贵w片段，包括單鏈抗體，可能僅包含可變區(qū)域，也可以含有以下幾個(gè)區(qū)域全體或部分組合鉸鏈區(qū)域，CHI, CH2和CH3 結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，抗體或抗體片段含有一個(gè)抗體輕鏈可變區(qū)域(VL)和一個(gè)通常包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體重鏈可變區(qū)域(VH)。在某些情況下，抗體或抗體片段含有全部或部分重鏈恒定區(qū)，如IgGl, IgG2，IgG3，IgG4，IgAl, IgA2，IgE, IgM或者IgD恒定區(qū)。在某些情況下，重鏈恒定區(qū)是IgGl重鏈恒定區(qū)的全部或部分?？贵w或者抗體片段也可能含有全部或部分kappa輕鏈恒定區(qū)，或者lambda輕鏈恒定區(qū)。在某些情況下，輕鏈恒定區(qū)是一個(gè)lambda輕鏈恒定區(qū)，或者是它的一部分。這些恒定區(qū)的全部或部分可以自然產(chǎn)生，也可以部分或者全部合成。這些恒定區(qū)的序列已經(jīng)有了詳細(xì)的報(bào)道。這里用到的名詞“重鏈部分”包括來自免疫球蛋白重鏈的氨基酸序列。含有重鏈部分的多肽至少含有以下部分之一 CH1結(jié)構(gòu)域，鉸鏈結(jié)構(gòu)域(高級、中級或者低級鉸鏈結(jié)構(gòu)域)，CH2結(jié)構(gòu)域，CH3結(jié)構(gòu)域，或者它們的片段及衍生物。例如，在本專利中用到結(jié)合用的多肽鏈可能含有一個(gè)CHl結(jié)構(gòu)域；或者含有一個(gè)CHl結(jié)構(gòu)域，至少部分鉸鏈結(jié)構(gòu)域，和一個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域；或者含有一個(gè)CHl結(jié)構(gòu)域和一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域；或者含有一個(gè)CHl結(jié)構(gòu)域，至少一部分鉸鏈結(jié)構(gòu)域，一個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域。在其它一些實(shí)施方案中，本專利中的多肽鏈含有一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步地，這里用到的多肽鏈可能缺少至少一部分的CH2結(jié)構(gòu)域(如全部或部分的CH2結(jié)構(gòu)域)。根據(jù)基本的知識可以理解，這些結(jié)構(gòu)域(如重鏈部分)可以經(jīng)過修飾，使其與天然的免疫球蛋白的氨基酸序列不同。這里用到的名詞“輕鏈部分”包含天然免疫球蛋白輕鏈衍生出的氨基酸序列。一般，輕鏈部分含有至少一個(gè)VL或者CL結(jié)構(gòu)域。
在一些實(shí)施方案中，抗體或者抗原結(jié)合片段是哺乳動物抗體或者抗原結(jié)合片段， 例如小鼠、大鼠、兔、人的抗體或者抗原結(jié)合片段。在一些實(shí)施方案中，所用的抗體為人抗體。這里用于描述抗體的“人”是指抗體或片段含有來源于或者與人一致的(例如來源于人的生殖細(xì)胞或者體細(xì)胞)可變(如VH，VL， CDR或FR區(qū)域)或恒定區(qū)域或兩者兼具。在一些實(shí)施方案中，人性化抗體或人抗體可以用于人類治療中，例如治療或者防止先兆子癇。在這些抗體中，效應(yīng)部分可能是來自于人，所以抗體可以更好的與人體免疫系統(tǒng)的其他部分相互作用，即抗體不會被機(jī)體識別為異源物質(zhì)。在某些情況下，這些抗體與天熱存在的人類抗體有同樣的半衰期。在一些實(shí)施方案中，人抗體可能含有一個(gè)或者多個(gè)并非天然存在的人類核苷酸編碼的序列，這些序列是人工改造過或者加入的，以修飾抗體的序列。重組技術(shù)在產(chǎn)生大量抗體、抗體片段和單鏈抗體時(shí)被優(yōu)先采用。一般地，重組產(chǎn)生抗體、抗體片段或者衍生物采用雜交瘤細(xì)胞中分離出來的編碼所需抗體的mRNA。這個(gè)mRNA 被用于產(chǎn)生編碼抗體或者一個(gè)片段的cDNA分子。一旦得到，這個(gè)cDNA可以依據(jù)方法的不同在真核和原核宿主中被擴(kuò)增和表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，提供抗體的衍生物。這里用到的“抗體衍生物” 一詞包含抗體本身或者一個(gè)片段，也可能包含多余的結(jié)構(gòu)部分。這些部分可能會增加抗體的水溶性、吸收性、生物半衰期等等，在活體或者試管中降低抗體毒性，去除或者減弱抗體在活體中不良的副作用，或者作為一個(gè)可以檢測抗體存在的標(biāo)記物。能夠調(diào)節(jié)這些作用的結(jié)構(gòu)已經(jīng)有了詳細(xì)的報(bào)道。在某些情況下，提供標(biāo)記過的、可監(jiān)測的抗體。如果一種抗體與一個(gè)能用已知方法鑒別、可視化或者定位的分子結(jié)合，那么這種抗體就稱為“標(biāo)記過、可監(jiān)測的”。合適的可監(jiān)測的標(biāo)記包括放射性同位素標(biāo)記、酶標(biāo)記、非放射性同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記、毒素標(biāo)記、親和標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記和核磁共振對比試劑。在一些實(shí)施方案中，提供能夠分泌選擇性識別特定超分子聚集物構(gòu)象的單克隆抗體，例如識別特定的在前纖維寡聚體、纖維狀寡聚體、環(huán)形原纖維或者淀粉樣纖維的抗體。在一些實(shí)施方案中，這些單克隆抗體可以被用于治療或者防止先兆子癇。這些抗體也可以用于定性或者定量的監(jiān)測先兆子癇相關(guān)的錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)聚集物，如在尿液樣品中。這些先兆子癇相關(guān)的錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)聚集物表現(xiàn)出特定的寡聚體構(gòu)象，這些構(gòu)象能夠用單克隆抗體來識別，并且這些構(gòu)象的出現(xiàn)能夠說明患者已經(jīng)發(fā)生先兆子癇，或者預(yù)測即將發(fā)生先兆子癇綜合癥的風(fēng)險(xiǎn)。3. SerpinAl和白蛋白作為先兆子癇的生物學(xué)標(biāo)記申請人:之前已經(jīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)(SELDI-T0F質(zhì)譜)與標(biāo)準(zhǔn)的分子和生物化學(xué)識別檢測相結(jié)合的方法證明，患有先兆子癇的女性的尿液和其他體液和組織中所含的SerpinAl多肽或白蛋白多肽的量比未患這種疾病的女性高(U. S. Appl. No. 12/084004(PCT/US2006/042585)，其內(nèi)容以引用得形式結(jié)合到本文中)。在某些方面，這個(gè)發(fā)明與檢測來自受試者樣品(如尿液)中SerpinAl多肽或白蛋白多肽的方法來確定先兆子癇的狀態(tài)有關(guān)。在某些情況下，以SELDI為基礎(chǔ)的測量方法可以用于對受試者的先兆子癇發(fā)病情況的檢測。這些方法可能包含一個(gè)檢測最多13個(gè) SerpinAl和白蛋白多肽片段生物標(biāo)記的水平的步驟。這個(gè)方法部分基于krpinAl和白蛋
27白多肽生物標(biāo)記的出現(xiàn)與先兆子癇發(fā)病的關(guān)聯(lián)。13種SerpinAl和白蛋白多肽生物標(biāo)記物已經(jīng)被鑒別出來(U. S. Appl. No. 12/084004 (PCT/US2006/042585))，其中部分的 SEQ 號碼在這里列出[MIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK(SEQ ID NO 1)；M0XIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK (SEQ ID NO :2)；M0XIEQNTKSPLFM0XGKVVNPTQK (SEQ ID NO :3)；EDPQ⑶AAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFS(SEQ ID NO :4)；DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVL(SEQ ID NO :5)；DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIA(SEQ ID NO :6)]這里用到的名詞“白蛋白”是指全長的白蛋白多肽，也指它的一個(gè)片段多肽。白蛋白多肽生物標(biāo)記的例子在這里以SEQ號碼列出[DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVL(SEQ ID NO :5)；DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIA(SEQ ID NO :6)]野生型白蛋白的全長氨基酸序列為Genbank Accession No. P02768.已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，來自懷孕女性的樣品如果上面的13種生物標(biāo)記物的含量超過一定的標(biāo)準(zhǔn)，就能夠指示先兆子癇的發(fā)生。在這些情況下，有兩種尿液中蛋白質(zhì)的評分標(biāo)準(zhǔn) (UPS)一種Boolean評分(UPSb)，代表指派給13種生物標(biāo)記的每一種Boolean指示劑的總和，另一種與之互補(bǔ)的是一種排序的評分(UPSr)，它能夠?qū)?3種生物標(biāo)記的Boolean指示劑結(jié)果用數(shù)值1(即客觀存在)保留下來，其計(jì)算方法為UPSr = [S/N/10]+l，其中S/N =SELDI分析中的信噪比。所以，理論上說，UPSb的評分范圍為0到13 (每一種krpinAl 和白蛋白多肽生物標(biāo)記物)，而UPSr能夠從0取到無窮。每種評分都有最合適的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)， 用于區(qū)分對照組和患有嚴(yán)重先兆子癇的患者。UPSb水平高于6以及UPSr水平高于8表示受試者患有嚴(yán)重的先兆子癇。UPSb水平低于6和UPSr水平低于8表示受試者未患有嚴(yán)重的先兆子癇。如果一個(gè)樣本含有其它UPSb和UPSr的評分組合，那么在1，2，3，4，5，6，或者更多天后應(yīng)該獲取第二份樣品，這份樣品可以用本專利中的方法檢測，來確定受試者是否患有先兆子癇。測試樣品的準(zhǔn)備，生物標(biāo)記物的探測和測量，以及診斷的方法都在本文和引文(U. S. Appl. No. 12/084004 (PCT/US2006/042585))中有所描述。4.用VEGF，PIGF和sFlt_l作為先兆子癇的生物標(biāo)記研究表明，患有先兆子癇的女性體內(nèi)血漿中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、胎盤生長因子(PIGF)和可溶性fms樣酪氨酸激酶-l(sFlt-l)的濃度會發(fā)生變化(Levine RJ et al.N Engl J Med 2004 12 ；350 :672-83 ；Maynard SE et al. J Clin Invest 2003 ； 111 :649-58 ；Levine RJ et al.N Engl J Med 2004 12 ；350 672-83)。申請人過去曾經(jīng)證明VEGF，PIGF和sFlt-Ι可以作為早期診斷先兆子癇的生物標(biāo)記(U. S. Publ. No US-2006-0183175 ；PCT/US2005/047010，其內(nèi)容以引用得形式結(jié)合到本文中)。申請人已經(jīng)說明，患有高血壓的懷孕女性尿液中sFlt-Ι的濃度顯著上升，PIGF濃度顯著降低。在某些情況下，本專利采用測量尿液樣本中的PIGF和sFlt-Ι的方法，并且采用這兩種作用相反的生長因子的比值來將患有嚴(yán)重先兆子癇的懷孕女性與其他懷孕女性區(qū)分開，其他懷孕女性包括可能表現(xiàn)出伴有或者不伴有慢性高血壓的輕微先兆子癇的個(gè)體，以及血壓正常的對照組。專利中描述的方法也可以用來評估懷孕女性發(fā)展出某一種高血壓并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，其中包括先兆子癇。這些并發(fā)癥可能包括剖腹產(chǎn)帶來的血液中尿酸含量升高，血管收縮壓和舒張壓上升，蛋白尿，妊娠，生產(chǎn)時(shí)胎兒的重量，胎盤破壞，宮內(nèi)胎兒生長遲緩，溶血，血小板減少癥，肝臟酶類升高和HELLP綜合癥等。在某些情況下，采用一個(gè)方程式來分析獲得的生物標(biāo)記物的濃度或者水平。得到的數(shù)值能夠提供一名懷孕女性發(fā)展出高血壓癥狀的可能性，例如先兆子癇。這里用到的名詞“方程式”代表任何數(shù)學(xué)表達(dá)式，算法或者其他能用來評估某個(gè)生物標(biāo)記物的水平是否說明一名懷孕女性已經(jīng)或者可能患有高血壓或者并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)的方法。在某些情況下，這種方程式可以用來計(jì)算懷孕女性的UFP值。在本專利中，UFP指的是log[sFlt-l/PireX100]。一方面，uFP值大于1.4是一個(gè)預(yù)后指標(biāo)，代表這名懷孕女性需要治療或者防止高血壓相關(guān)綜合征的危險(xiǎn)升高。另一方面，uFP值大于2. 1說明這名懷孕女性有患嚴(yán)重先兆子癇的風(fēng)險(xiǎn)。另外，uFP值大于2. 1還說明這名懷孕女性可能需要剖腹產(chǎn)。測試樣本的制備，檢測，生物標(biāo)記物測量和診斷的方法在本文和引文(U. S. Publ. No :US-2006-0183175)中都有描述。5.測試樣本的準(zhǔn)備(為本專利中描述的某些方法)樣本可以是來自懷孕的受試者，如一個(gè)需要檢測先兆子癇情況的孕婦。受試的懷孕個(gè)體可以是先前根據(jù)其個(gè)人病史或家族史確定有很高的患先兆子癇風(fēng)險(xiǎn)的女性。懷孕的受試者也可以是先前被診斷為患有慢性高血壓。其他受試者可以是已知患有先兆子癇的懷孕女性。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明描述的方法可以用來監(jiān)測已經(jīng)診斷出患有先兆子癇的個(gè)體，例如確定某種治療方法對于一個(gè)患先兆子癇的女性的作用。另外，受試者也可能是用于常規(guī)檢測是否患有先兆子癇的健康女性，或者是建立受試者自身或者為其它受試者建立生物標(biāo)志物的基準(zhǔn)水平。在其它情況下，樣本可能來自其它非人類的雌性懷孕個(gè)體，或者未懷孕的個(gè)體，例如用于鑒別治療先兆子癇的化合物的方法等。尿液樣本可以在取樣后立即檢測，或者經(jīng)過一段時(shí)間后再檢測，只要在測量時(shí)樣本中還含有可以測量的生物標(biāo)記物。例如，尿液樣本可以保存在-70°C，或者混合后儲存在用能夠穩(wěn)定或保存生物標(biāo)記物的試劑預(yù)先處理過的容器中。比較好的情況是，尿液樣本采自早晨空腹的第一次尿液。本專利中涉及的生物標(biāo)記可以在不同的生物樣本中測量，最好是來自液體樣本， 如尿液。生物標(biāo)記也可以在組織或者其它生物液體樣本中測量。能夠用本專利的方法和試劑盒測量其它生物樣本的例子包括但不限于血液、血漿、血漿、陰道分泌液、腦脊液、眼淚和唾液等。如果需要，可以將樣品經(jīng)過處理以提高生物標(biāo)記的可檢測性。例如，來自受試者的尿液樣品可以分成多個(gè)組分。任何能夠富集所需的生物標(biāo)記多肽的方法都可以被采用。根據(jù)檢測方法的不同，樣品處理，例如預(yù)先分離的步驟，可以是選擇性的，并且不是提高生物標(biāo)記的可檢測性所必需的。例如，如果采用特異性與生物標(biāo)記物結(jié)合的抗體來檢測生物標(biāo)記在尿液中是否存在，那么樣品處理就不是必需的。樣品處理可以包括對樣品的分離，以及收集確定含有生物標(biāo)記物的組分。分餾的方法包括例如體積排阻色譜、離子交換色譜、肝素色譜、親和色譜、分級提取、凝膠電泳和液相色譜等。分離的方法示例在引文(PCT/ US03/00531)中有描述。作為示例，樣品可以用陰離子交換色譜預(yù)先分離。陰離子交換色譜能夠?qū)悠分械牡鞍踪|(zhì)依據(jù)電荷特征分離。例如，可以采用Q陰離子交換樹脂，樣品可以接下來用不同PH 的洗脫劑洗脫下來。陰離子交換色譜可以分離樣品中比其他生物分子帶更多負(fù)電荷的生物分子。用更高PH洗脫的蛋白質(zhì)可能帶有比較弱的負(fù)電荷，用低pH洗脫的蛋白質(zhì)可能帶有比較強(qiáng)的負(fù)電荷。因此，除了可以降低樣品的復(fù)雜性外，陰離子交換色譜還可以將依據(jù)結(jié)合特性分離蛋白質(zhì)。作為另外一個(gè)例子，生物分子也可以用高分辨率電泳來分離，例如一維或者二維凝膠電泳。含有生物標(biāo)記的組分可以被分離出來，并且進(jìn)一步用氣相離子光譜測定。比較好的方法是采用二維凝膠電泳產(chǎn)生二維的生物分子點(diǎn)的陣列，其中包括一種或多種生物標(biāo)記物。例子見 Jungblut and Thiede, Mass Spectr. Rev. 16 145-162 (1997)。二維凝膠電泳可以用普遍采用的方法進(jìn)行，參考Deutscher ed.，Mechods in Enzyniology vol.182。 在某些情況下，樣品中的生物分子可以采用例如等電聚焦的方法分離，這時(shí)生物分子在一個(gè)PH梯度中被分離，達(dá)到各自凈電荷為O的點(diǎn)(等電點(diǎn))。這種第一步分離的方法會得到一個(gè)一維的生物分子陣列，這個(gè)陣列中的生物分子接下來會被用另一種通常和第一步不同的方法分離。典型的方法中，二維凝膠電泳可以用化學(xué)的方法分離分子量1000-200000Da 的復(fù)雜生物分子混合物。這些凝膠的PH值通常為3-10 (大范圍凝膠)。作為另外一個(gè)例子，高效液相色譜(HPLC)也可以用于依據(jù)物理性質(zhì)分離樣品中的生物分子混合物，例如依據(jù)極性、電荷和大小。HPLC設(shè)備一般含有一個(gè)固定相，一個(gè)泵，一個(gè)注射器，一個(gè)分離柱，和一個(gè)檢測器。一部分樣品中被注射進(jìn)入柱子中，樣品中的生物分子通過柱子分離?；旌衔镏胁煌纳锓肿右罁?jù)在固定相和流動相中不同的分配行為，以不同的速率通過柱子。與所需的生物標(biāo)記物的分子量或者其他物理性質(zhì)相同的組分可以被采集。這一組分可以接下來用氣相離子光譜來檢測生物標(biāo)記物。例如，可以用MALDI或者 SELDI的方法檢測。分析前，生物標(biāo)記可以被選擇性地修飾以提高分辨率，或者鑒別其特征。例如，生物標(biāo)記可以經(jīng)過蛋白質(zhì)裂解處理。可以采用任何合適的蛋白酶處理。蛋白酶，例如胰蛋白酶，常常將蛋白質(zhì)切割為特定數(shù)目的碎片，這些碎片非常有用，可以作為生物標(biāo)記的指紋， 用來間接測定這些生物標(biāo)記。這對于區(qū)分分子量接近的生物標(biāo)記非常有用。另外，裂解后的片段更適用于大分子量生物標(biāo)記的分析，因?yàn)樾》肿恿康纳飿?biāo)記更容易用質(zhì)譜分析。接下來，生物標(biāo)記的特性可以進(jìn)一步用物理、化學(xué)特征的匹配在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中分析(例如 SwissProt)ο在一些實(shí)施方案中，在檢測標(biāo)志物前，可以將來自懷孕女性的尿液樣本用一種或多種穩(wěn)定試劑處理，或者在收集樣本前將用于收集樣本的容器用一種或多種穩(wěn)定試劑處理。這里的名詞“穩(wěn)定劑”是指一種或多種分子，例如多肽或核苷酸，可以用來防止標(biāo)志物的分解。在一些情況下，穩(wěn)定劑可以是一種蛋白酶抑制劑，包括AEBSF，Pefabl0C SC，抗蛋白酶，抗蛋白酶的二鹽酸化物，抑蛋白酶肽，苯甲醚和苯甲醚的鹽酸化物，苯丁抑制素，胰凝乳蛋白酶抑制劑，E-64，EDTA及其鈉鹽，亮抑酶肽，乙基馬來酰亞胺，胃酶抑素和胃酶抑素A， 膦酰二肽，疊氮化鈉，胰蛋白酶抑制劑或者ε -氨基己酸。5.探測和測量生物標(biāo)記物(為本專利描述的一些實(shí)施方案)本發(fā)明中用到的先兆子癇的生物標(biāo)記物可以用任何已經(jīng)廣泛使用的方法檢測。這些方法的例子包括但不限于免疫學(xué)方法檢測分泌蛋白，蛋白質(zhì)純化方法，蛋白質(zhì)功能和活性測試，核酸雜交方法，核酸反轉(zhuǎn)錄方法，和核酸擴(kuò)增方法。在某些情況下，生物標(biāo)記物的水平可以用ELISA來測定。這里提供的方法和組合物使通過檢測或者監(jiān)控來自懷孕女性的樣品中的先兆子癇相關(guān)的生物標(biāo)記(例如krpinAl多肽，白蛋白多肽，VEGF多肽，sFlt-Ι多肽和PIGF多肽)的水平來評估或者監(jiān)控一名懷孕女性患先兆子癇的風(fēng)險(xiǎn)。這可以通過在懷孕后的各個(gè)時(shí)期用本發(fā)明描述的方法獲取尿液樣品和檢測生物標(biāo)記的水平來實(shí)現(xiàn)。得到的數(shù)值可以與對照的數(shù)值比較，也可以與已知的(預(yù)先確定好的)標(biāo)準(zhǔn)比較。這里用到的名詞“合適的標(biāo)準(zhǔn)”或者“對照”是指從對照個(gè)體取得的尿液中測得的生物標(biāo)記水平。合適的標(biāo)準(zhǔn)可以通過正常懷孕女性和確定有高血壓癥狀如先兆子癇的懷孕女性的尿液樣本來確定。在某些情況下，本發(fā)明中提供的標(biāo)準(zhǔn)來自于與測試樣本取樣時(shí)相同懷孕周數(shù)的個(gè)體。來自受試者的樣本可以同時(shí)獲取和分析?；蛘撸日鬃影B相關(guān)的生物標(biāo)記(例如^rpinAl多肽，白蛋白多肽，VEGF多肽，sFlt-Ι多肽和PIGF多肽)也可以在受試者的樣本用作其他常規(guī)檢測之前或之后測定。標(biāo)準(zhǔn)的先兆子癇相關(guān)的生物標(biāo)記水平可以由掌握基本技能的人員用已經(jīng)廣泛采用的方法獲得。諸如SerpinAl多肽和白蛋白多肽的生物標(biāo)記最好可以用固定在固相載體的捕捉劑來捕捉，例如這里描述的任意一種生物芯片、多孔微量滴定板、樹脂或者其他合適的載體。比較好的質(zhì)譜技術(shù)是表面增強(qiáng)激光解吸/離子化(SELDI)質(zhì)譜，例如用U. S. Patent No. 5,719,060 and No. 6，225，047中描述的方法。在這些方法中，表面上的探針將待分析的組分呈遞給能量來源的步驟在解吸/例子化的過程中起到了重要的作用。在這種情況下，名詞“探針”是指一種能夠連接含有探針的表面，并且將待分析的物質(zhì)呈遞給離子化能量源，進(jìn)行離子化并且注入液相離子光譜(例如質(zhì)譜)的設(shè)備。一個(gè)探針一般含有一個(gè)固定底物，可以是活動的或者固定的，這個(gè)底物含有一個(gè)樣品呈遞表面，在這個(gè)表面上，待分析物被呈遞給離子化能量源。在一種稱為“表面增強(qiáng)親和捕捉”的SELDI中，探針包含一個(gè)化學(xué)選擇性表面 (“SELDI探針”)?！盎瘜W(xué)選擇性表面”結(jié)合一種吸附劑，也稱為“結(jié)合基團(tuán)”或者“捕捉試劑”，或者一種能夠結(jié)合捕捉試劑的反應(yīng)基團(tuán)，例如通過一個(gè)能夠形成化學(xué)鍵或配位鍵的反應(yīng)。這里的“反應(yīng)基團(tuán)”代表一個(gè)能夠結(jié)合捕捉試劑的化學(xué)基團(tuán)。環(huán)氧化合物和 carbodiimidizole是很好的能夠共價(jià)結(jié)合多肽捕捉試劑如抗體或者細(xì)胞受體的反應(yīng)性區(qū)域。次氮基乙酸和亞氨基二乙酸是很好的能夠與金屬離子配位的反應(yīng)區(qū)域，這些金屬離子可以與含組氨酸多肽非共價(jià)相互作用?！胺磻?yīng)性表面”是指結(jié)合了反應(yīng)基團(tuán)的表面?！拔烬RU”或者“捕捉試劑”是指任何能夠結(jié)合所需的生物標(biāo)記物的物質(zhì)。本發(fā)明中，適用于SELDI 的吸附劑在U. S. Patent No. 6，225，047中有描述。一種類型的吸附劑是“色譜吸附劑”，這種吸附劑是色譜中常用的材料。色譜吸附劑包括例如離子交換材料，金屬螯合劑，固定的金屬螯合劑，疏水性相互作用吸附劑，親水性相互作用吸附劑，染料，混合吸附劑(如疏水吸引/靜電排斥性吸附劑)?！吧锾禺愋晕絼笔橇硪粋€(gè)范疇，指含有生物分子的吸附劑，例如核苷酸、核酸分子、氨基酸、多肽、單糖、多糖、脂肪酸、脂質(zhì)、類固醇或者它們的共價(jià)結(jié)合物(如糖蛋白，脂蛋白，糖脂)。在某些情況下，生物特異性吸附劑可以是大分子結(jié)構(gòu)，例如蛋白質(zhì)復(fù)合物，生物膜或者病毒。具體的生物特異性吸附劑有抗體，受體蛋白和核酸。通常，生物特異性吸附劑比色譜性吸附劑對于所分析的物質(zhì)具有更高的特異性。另一種SELDI稱作SEND，利用了將能量吸收分子結(jié)合在表面的探針(“SEND探針”)。這里的“能量吸收分子”(EAM)是指能夠從激光解吸離子化源吸收能量，并且?guī)椭环治龅奈镔|(zhì)解吸和離子化的分子。EAM包括用于MALDI的分子，其中的代表性物質(zhì)為肉桂酸衍生物，芥子酸(SPA)，氰基氫氧化肉桂酸(CHCA)和二羥基苯甲酸，阿魏酸，和羥基苯乙酮衍生物。這一類別也包含在SELDI中使用的EAM，這些物質(zhì)在U. S. Patent No. 5，719，060 中有列舉。另一種形式的SELDI稱為SEPAR，這種方法涉及使用一種探針，這種探針含有與表面結(jié)合的區(qū)域，能夠共價(jià)結(jié)合被分析的物質(zhì)，并且在受光照射后通過一個(gè)光敏鍵的斷裂釋放被分析的分子，光照可以是激光。例子見U. S. Intent No. 5，719，060。SEPAR和其他種類的SELDI可以依據(jù)本專利中的要求進(jìn)行調(diào)整，用于檢測生物標(biāo)記或者生物標(biāo)記物的總體情況。本發(fā)明中對于生物標(biāo)記物的檢測可以用某些選擇性條件進(jìn)行增強(qiáng)，例如某些吸附劑和洗滌液。這里“洗滌液”是指一種試劑，通常是溶液，它可以用來影響或者修飾某種待分析物質(zhì)在吸收表面的吸附，或者去除表面上未結(jié)合的物質(zhì)。洗滌液的洗脫特性可以由例如PH值，離子強(qiáng)度，疏水性，促溶性，去垢劑強(qiáng)度和溫度決定。在本發(fā)明中的一些實(shí)施方案中，樣品采用“生物芯片”的方法分析。“生物芯片”是指一個(gè)一般為平面的固體底物，上面連接著一種捕捉試劑(吸附劑)。經(jīng)常地，生物芯片的表面包含許多能夠分清楚的位置，每一個(gè)位置上固定著一種捕捉試劑。生物芯片可以用于在中間結(jié)合一種探針，接著這種探針可以用于氣相離子光譜，如比較好的采用質(zhì)譜分析。或者，生物芯片也可以與另一種底物結(jié)合，形成一種可以用光譜分析的探針。本發(fā)明中，有許多生物芯片都能用于捕捉生物標(biāo)記物，這些芯片有來自商業(yè)來源的如 Ciphergen Biosystems (Fremont, CA), Packard BioScience Company (Meriden, CT)，Zyomyx (Hayward, CA)，Phylos (Lexington, ΜΑ)。這些生物芯片的離子在 U. S. Patent Nos. 6，225，047，6，329，209 和 PCT Publication Nos. WO 99/51773 和 WO 00/56934 中都有描述。更具體一點(diǎn)說，Ciphergen Biosystems生產(chǎn)的生物芯片含有鋁制底物上的條狀表面，表面上在可以定位的位置有色譜型或生物特異性吸附劑。條狀結(jié)構(gòu)的表面上包被有二
氧化硅。Ciphergen ProteinChip 陣列中具有代表性的是 H4，SAX-2，WCX-2 禾Π IMAC-3 生物芯片，這些芯片包含功能化的交聯(lián)高分子。這些分子以水凝化的方式，通過物理方法與生物芯片表面連接，或者通過硅烷與生物芯片表面共價(jià)連接。Η4生物芯片具有異丙基特性，用于疏水性連接。SAX-2生物芯片具有四級銨特性，用于陰離子交換。WCX-2生物芯片具有羧酸特性，用于陽離子交換。IMAC-3生物芯片具有次氮基乙酸特性，用于以配位形式吸收過度金屬離子，例如Cu++和Ni++，這些固定的金屬離子又可以用于配位吸附生物標(biāo)記物分子。含有吸附劑的底物與尿液樣本接觸一段足夠的時(shí)間，使可能存在的生物標(biāo)記物與吸附劑結(jié)合。孵育一段時(shí)間后，洗滌底物表面以去除未結(jié)合的物質(zhì)。任何合適的洗滌劑都可以被采用，最好是采用液體溶劑。接下來，用能量吸收分子與結(jié)合了生物標(biāo)記物的底物相互作用。能量吸附分子是指能夠從氣相離子光譜的能量源中吸收能量的分子，這種分子能夠幫助生物標(biāo)記物從底物上解吸下來。示例的能量吸收分子包括肉桂酸衍生物，芥子酸和二羥基苯甲酸。比較好的能量吸收分子是芥子酸。一旦吸附到底物上，例如生物芯片或者抗體上，任何合適的方法都可以用來測量樣品中的生物標(biāo)記物。例如，生物標(biāo)記物可以用許多檢測和測量的方法測定，如氣相離子光譜類方法，光學(xué)方法，電化學(xué)方法，原子力顯微鏡和放射性頻率方法。這些方法可以用來檢測一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)記物。在某些情況下，探測和測量生物標(biāo)記使用的是質(zhì)譜的方法，尤其是SELDI方法。 SELDI是指一種解吸/離子化氣相離子光譜的方法(例如質(zhì)譜)，被檢測的物質(zhì)被捕捉到一個(gè)含有SELDI探針的表面上，在“SELDI MS”中，所用的氣相離子光譜是質(zhì)譜。SELDI技術(shù)在上文有更詳細(xì)的描述。在其他情況下，可以用免疫檢測的方法來檢測樣品中的生物標(biāo)記物。免疫檢測方法采用抗體來特異性結(jié)合抗原(如生物標(biāo)記物)。免疫檢測的特點(diǎn)是采用抗體特異性結(jié)合抗原的特點(diǎn)來分離、結(jié)合和定量測量某種抗原。因此，在某種指定的免疫檢測條件下，抗體與某種特定的抗原的結(jié)合能力是與背景結(jié)合能力的2倍以上，并且與樣品中其他的蛋白質(zhì)沒有明顯的結(jié)合。這種特異性的結(jié)合可能要求抗體經(jīng)過對某種特定蛋白質(zhì)的特異性篩選。 例如，用某種動物例如大鼠、小鼠或人類的生物標(biāo)記分子制備的多克隆抗體可以通過篩選， 獲得僅與這個(gè)物種的這個(gè)生物標(biāo)記物反應(yīng)而不與其他蛋白質(zhì)反應(yīng)的多克隆抗體，“其他蛋白質(zhì)”不包括基因多態(tài)性產(chǎn)物和這種生物標(biāo)記物的不同等位基因的產(chǎn)物。這種篩選可以通過將抗體中與其他物種的這個(gè)蛋白交叉反應(yīng)的部分去除的方法來實(shí)現(xiàn)。利用純化的生物標(biāo)記物或者它們的核苷酸序列，可以用已知的方法制備特異性結(jié)合某種生物標(biāo)記的抗體(例如SerpinAl多肽或者白蛋白多肽)。方法可以參考Coligan， Current Protocols in Immunology(1991) ；Harlow & Lane, Antibodies :A Laboratory Manual (1988) ；Goding, Monoclonal antibodies :Principles and Practice (2d ed. 1986) ；Kohler & Milstein, Nature 256 :495-497(1975) ；Huse et al.，Science 246 1275-1281(1989) ；Ward et al. Nature 341 :544-546(1989).通常，來自受試者的樣品可以與特異結(jié)合某種生物標(biāo)記的抗體反應(yīng)?？贵w也可以選擇性地與一種固相載體結(jié)合，用來在抗體與樣本結(jié)合前幫助洗滌和復(fù)合物的分離。固相載體有玻璃或者塑料質(zhì)地，形式為微量滴定板、桿狀、珠子或者微球等?？贵w也可以連接在一個(gè)探針底物上，或者蛋白質(zhì)芯片上。在樣品和抗體共同孵育之后，洗滌混合物，并且檢測生成的抗體-生物標(biāo)記復(fù)合物。這個(gè)可以通過將洗滌后的混合物與檢測試劑共同孵育來實(shí)現(xiàn)。這種檢測試劑可以是例如連接有可檢測標(biāo)簽的二級抗體等。典型的可檢測標(biāo)簽包括磁性小球，熒光染料，放射性標(biāo)簽，酶(如辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶等常用于ELISA的酶)，和有色的標(biāo)記如膠體金或者有色玻璃或者塑料小球?；蛘撸瑯悠分械纳飿?biāo)記也可以用間接的方法檢測，例如用一個(gè)加入標(biāo)簽的二級抗體來檢測與生物標(biāo)記特異結(jié)合的抗體，或者使用競爭性或抑制性的檢測方法，例如用一種與待檢測的生物標(biāo)記物的一個(gè)特定的表位結(jié)合的單克隆抗體與之前的混合物共同孵育的方法。檢測抗體-生物標(biāo)記復(fù)合物的存在和含量的方法包括例如檢測熒光、冷光、化學(xué)發(fā)光、吸收、反射、發(fā)射、二次折射、折射率(例如表面等離子共振，橢圓光度法，共振鏡方法，門控波導(dǎo)耦合器方法或者干涉測量法)等。光學(xué)方法包括顯微鏡(共聚焦和非共聚焦)， 成像方法，和非成像方法。放射頻率方法包括多極共振光譜。許多實(shí)用的方法都已經(jīng)廣泛采用，包括例如酶聯(lián)免疫檢測(EIA)例如酶聯(lián)免疫吸附測試，放射免疫檢測，蛋白質(zhì)印跡檢測或者槽印跡檢測。免疫檢測的方法既可以測定一種生物標(biāo)記在樣品中是否存在，也可以確定存在的量?？贵w-標(biāo)記復(fù)合物的量可以通過與標(biāo)準(zhǔn)比較來確定。標(biāo)準(zhǔn)可以是例如已知的化合物或樣品中其他蛋白質(zhì)的量?？梢岳斫獾氖巧飿?biāo)記的量并不能測出絕對值，而是以與標(biāo)準(zhǔn)物的比值形式出現(xiàn)。當(dāng)樣品測量后產(chǎn)生數(shù)據(jù)時(shí)，例如用質(zhì)譜方法測量后，數(shù)據(jù)可以用計(jì)算機(jī)軟件分析。 在某些情況下，與底物結(jié)合的生物標(biāo)記能夠在氣相例子光譜中被檢測出來，這些生物標(biāo)記被一種離子源例如激光離子化，產(chǎn)生的離子被離子光學(xué)裝置收集起來，然后在質(zhì)量分析器中分離并分析經(jīng)過的離子。檢測器隨后將檢測到的離子的信息翻譯為質(zhì)量-電荷比的形式。因此，生物標(biāo)記物的含量和質(zhì)量都能被檢測。通常，由解吸和檢測得到的生物標(biāo)記的數(shù)據(jù)可以用電子計(jì)算機(jī)分析。計(jì)算機(jī)程序分析所得的數(shù)據(jù)，指示出被檢測到的生物標(biāo)記的數(shù)目，并且選擇性地顯示每個(gè)生物標(biāo)記的信號強(qiáng)度和分子量。數(shù)據(jù)分析也可以包含確定生物標(biāo)記的信號強(qiáng)度，并且去除與預(yù)先設(shè)定的數(shù)據(jù)分布偏離的數(shù)據(jù)。例如，可以通過計(jì)算每一個(gè)峰值相對于某個(gè)參考值的強(qiáng)度來歸一化觀察到的峰值。參考值可以是機(jī)器或者化學(xué)試劑如能量吸收分子本身產(chǎn)生的背景噪音， 這個(gè)信號在分析時(shí)被設(shè)為零值。電腦可以把所得的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成不同的顯示格式。標(biāo)準(zhǔn)的光譜可以用于顯示，但是一種更實(shí)用的方法是只顯示峰高和質(zhì)量信息，這樣可以得到一個(gè)比較干凈的圖像，并且使得分子量接近的生物標(biāo)記更容易區(qū)分；另一種實(shí)用的方法是比較一個(gè)或者更多的光譜，并且標(biāo)記出不同樣品間上調(diào)或者下調(diào)的生物標(biāo)記分子。使用這些方法，就可以確定某種特定的生物標(biāo)記是否在樣品中存在。用于分析數(shù)據(jù)的軟件可以包括一種算法，來分析一個(gè)信號峰值是否代表一種生物標(biāo)記。軟件也可以用來將觀察到的生物標(biāo)記峰的數(shù)據(jù)用于分類樹或者人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析， 來確定一種生物標(biāo)記的峰值或者多個(gè)峰值的組合是否代表一種羊膜內(nèi)炎癥的診斷。7.對于先兆子癇的多種或綜合分析在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了檢測或者預(yù)測先兆子癇的方法，這些方法可以采用一種或者多種方法來測量一個(gè)或者多個(gè)先兆子癇的生物標(biāo)記，如用多種方法，那么后面的測量結(jié)果可以用于確認(rèn)前面的測試結(jié)果，或者得到更多的定性和定量結(jié)果，這樣能夠提高結(jié)果的預(yù)測價(jià)值，并且為診斷帶來更高的可信度。例如，最開始可以采用剛果紅保留值 (Congo Red Retention)測試的方法(例如斑點(diǎn)印跡)來得到關(guān)于受試者是否患有或可能發(fā)展為先兆子癇的第一個(gè)指標(biāo)。這個(gè)第一步測試可以由受試者自己在不需要監(jiān)視或者實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的情況下完成，或者只需要很少的技術(shù)和實(shí)驗(yàn)設(shè)備。如果剛果紅保留測試的結(jié)果是陽性的，那么可以進(jìn)一步進(jìn)行定量，這個(gè)指標(biāo)也可以用作檢測或者預(yù)測先兆子癇的嚴(yán)重程度。除了剛果紅保留測試和類似的基于染料的測試，樣品也可以用于基于抗體的測試，例如使用檢測錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物的特定構(gòu)象的抗體。這些測試可以采用與剛果紅保留測試所用的相同的樣品，或者采用來自同一受試者的第二個(gè)樣品；測試可以在剛果紅保留測試之后進(jìn)行，也可以同時(shí)進(jìn)行。這些使用識別錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)聚集物特定構(gòu)象的抗體的測試可以在一些實(shí)施方案中用于證實(shí)剛果紅保留測試的結(jié)果，或者可以用來獲得更多的定性信息，例如將某種特定的蛋白質(zhì)寡聚體構(gòu)象的存在與否與發(fā)展為先兆子癇的可能性聯(lián)系起來，或者指示先兆子癇的嚴(yán)重性。除了這些基于先兆子癇樣本中蛋白質(zhì)聚集物的測試外(如親剛果性/剛果紅保留測試和基于抗體的蛋白質(zhì)聚集物分析)，也可以采用其它測試方法來證實(shí)這些測試的結(jié)果，或者獲取更多定量和定性的數(shù)據(jù)。例如，可以用更多的測試來檢測更多的生物標(biāo)記物是否存在，包括檢測先兆子癇生物標(biāo)記物白蛋白、SerpinAl、sFlt_l、PIGF, VEGF，采用的方法可以是ELISA或者用SELDI-T0F方法分析蛋白質(zhì)片段。另外，可以計(jì)算預(yù)測性的生物標(biāo)記水平的比值，例如 sFlt/PIGF[uFP]。進(jìn)一步，其他蛋白質(zhì)的存在或者相對水平也可以用于先兆子癇的診斷，例如尿液蛋白質(zhì)聚集物中的免疫球蛋白，血漿銅藍(lán)蛋白等。應(yīng)該注意的是，這里描述的測試方法可以用任何順序進(jìn)行，可以單獨(dú)進(jìn)行或者以任何組合方式進(jìn)行。在這個(gè)方面，本發(fā)明沒有限制。申請人之前也曾經(jīng)說明和描述過，這些測試方法中的任何一個(gè)都足以檢測先兆子癇，幫助診斷和預(yù)后。8.治療蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病，例如老年癡呆癥，輕鏈淀粉樣變性病和朊蛋白疾病，都是隨淀粉樣纖維的增多和聚集加劇的，原因是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊為異常的3D結(jié)構(gòu)。最近的觀察結(jié)果顯示可溶性前淀粉樣寡聚體(纖維組織的中間體)具有蛋白毒性，能夠?qū)е卤砥て茐暮脱趸瘔毫ΑＩ暾埲嗽?jīng)證明，表皮破壞和氧化壓力在嚴(yán)重先兆子癇中起到了致病作用。 申請人:意外發(fā)現(xiàn)先兆子癇是一種構(gòu)象疾病，并與蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和聚集有關(guān)，其特點(diǎn)是淀粉樣蛋白的聚集。申請人又進(jìn)一步用構(gòu)象特異性多克隆或單克隆抗體染色的方法說明，患有先兆子癇的受試者尿液中的錯(cuò)誤折疊中間體具有組裝成為孔狀結(jié)構(gòu)(淀粉樣通道)的傾向，這可能在臨床發(fā)病的過程中起到重要作用，例如表皮破壞和氧化壓力。申請人推斷，在診斷出先兆子癇的病人胎盤中積累的異常蛋白質(zhì)聚集物說明這種蛋白質(zhì)聚集是這種疾病的致病因素之一。在一些實(shí)施方案中，提供了治療先兆子癇的方法，這些方法包括免疫學(xué)和藥理學(xué)的策略，并基于阻斷可能組裝成淀粉樣通道的錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)寡聚體的產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，提供了治療先兆子癇的方法。在一些實(shí)施方案中，這些治療方法是基于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的能夠減輕其他蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊疾病(例如老年癡呆癥)的嚴(yán)重程度的方法。在研究類似蛋白質(zhì)異常聚集疾病，例如老年癡呆癥和其他淀粉樣變性疾病的新的治療方法過程中，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了新的能夠抑制新的蛋白質(zhì)聚集物生成、或者減少已有蛋白質(zhì)聚集物負(fù)擔(dān)的藥物。我們的有關(guān)先兆子癇與蛋白質(zhì)異常聚集相關(guān)的發(fā)現(xiàn)顯示可以用這些藥物治療先兆子癇。多種方法和藥物已經(jīng)被發(fā)展出來并用于抑制或者減少老年癡呆癥中的β淀粉樣聚集來治療老年癡呆癥，例如針對于纖維或者寡聚體生成的小分子抑制劑、肽抑制劑，對于一種或多種蛋白質(zhì)聚集物組分的免疫，用針對一種或多種蛋白質(zhì)聚集物組份的抗體或抗體片段進(jìn)行被動抗體免疫。這些試劑中的一些已經(jīng)被證明可以抑制除淀粉樣蛋白外其他蛋白質(zhì)的聚集。例如，對氨基苯酚和2-氮基-4-氯苯酚以及它們的衍生物(Cell Biochemistry and Biophysics 44 :549-553(2006))能夠抑制其他蛋白質(zhì)的聚集。
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在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用蛋白質(zhì)聚集抑制劑來抑制蛋白質(zhì)聚集物的形成，或者逆轉(zhuǎn)已經(jīng)形成的蛋白質(zhì)聚集來治療先兆子癇的方法。在一些實(shí)施方案中，提供能夠使易聚集的蛋白質(zhì)原來的構(gòu)象更穩(wěn)定的試劑來降低異常折疊以及接下來的聚集的速率。在一些實(shí)施方案中，提供針對于纖維或者寡聚體生成的小分子抑制劑、肽抑制劑，對于一種或多種蛋白質(zhì)聚集物組分的免疫，用針對一種或多種蛋白質(zhì)聚集物組份的抗體或抗體片段進(jìn)行被動抗體免疫，作為治療或者預(yù)防先兆子癇的方法。在一些實(shí)施方案中，提供抗β淀粉樣蛋白試齊[J (如在Drug Discovery Today =TherapeuticStrategies 1 :7-12(2004)中和本專利中總結(jié)的)來治療或者預(yù)防先兆子癇。申請人:還發(fā)現(xiàn)krpinAl或者它的多肽片斷是先兆子癇蛋白質(zhì)聚集物的成分之一。過去曾有報(bào)道可以作為早期診斷先兆子癇的生物標(biāo)記(U. S Appl. No. 12/084004(PCT/US2006/042585))。這里用到的“SerpinAl多肽”一詞是指全長的krpinAl多肽，也指全長krpinAl 多肽的一個(gè)片段多肽。SerpinAl過去已經(jīng)被鑒定為一個(gè)絲氨酸蛋白酶抑制劑，和一個(gè) alpha 1抗胰蛋白酶。SerpinAl多肽的Genbank序列為No. P01009。可以理解的是另一個(gè) SerpinAl等位基因編碼的krpinAl多肽也可以用于檢測受試者是否患有先兆子癇。例如， 由M1A，M2，或M3等位基因編碼的krpinAl多肽都可以用作診斷或者評估受試者的先兆子癇。SerpinAl多肽在肝臟和胚胎滋養(yǎng)層合成，并且以多種與krpinAl的抗蛋白質(zhì)裂解作用無關(guān)的形式存在。SerpinAl多肽極易被氧化，強(qiáng)氧化壓力會引的氧化。在試管實(shí)驗(yàn)中，來自全長SerpinAl多肽C端的一個(gè)片段多肽能夠引起氧化反應(yīng)和嗜中性趨化行為。在先兆子癇患者尿液中鑒別出SerpinAl表明先兆子癇與其他疾病如alpha-1 抗胰蛋白酶缺乏癥有著類似的病源，后者是由于錯(cuò)誤折疊的alpha-1抗胰蛋白酶的積累導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和肝硬化(N. Engl. J. Med. 346 :45-53 (2002) ;J. Clin. Inv. 110 1585-1590 (2002) )0在某些情況下，提供能夠防止krpinAl蛋白或者其片段異常聚集的治療試劑。在其他情況下，提供能夠解聚已有的SerpinAl或者其片段聚集物的試劑。例如，一種這樣的試劑是三甲基胺氮氧化物和相關(guān)化合物(Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 24 727-732(2001)) 0另一個(gè)例子是FLEAIG多肽(SEQ ID NO :7)和相關(guān)多肽及衍生物(Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35 =540-548 (2006)) 在某些情況下，三甲基胺氮氧化物和相關(guān)化合物，或者FLEAIG多肽(SEQ ID NO 7)和相關(guān)多肽及衍生物被提供作為一種有用的治療方法，來治療或預(yù)防先兆子癇。正如具有一般的相關(guān)技能的人士所認(rèn)為的，對于一個(gè)治療方法的評估也可以基于對于先兆子癇的綜合癥和最終結(jié)果的評估。因此，本發(fā)明也可以用于確定由一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)記(如krpinAl，白蛋白，sFlt_l，PIGF，VEGF，錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物/親剛果紅物質(zhì)) 代表的受試者的發(fā)病，發(fā)展或者好轉(zhuǎn)情況。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以用于檢測已經(jīng)診斷為先兆子癇的受試者的一種或多種生物標(biāo)記的水平。在其它一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以用于獲得用于診斷個(gè)體先兆子癇的測量結(jié)果。在一些實(shí)施方案中，受試者可能已經(jīng)處于先兆子癇的藥物治療中，而在其它一些實(shí)施方案中受試個(gè)體可能沒有接受先兆子癇的治療。選擇治療先兆子癇的方法可以部分基于懷孕女性中有異常高水平的先兆子癇生物標(biāo)記物(如SerpinAl,白蛋白，sFlt-1, PIGF，VEGF)，或者有與先兆子癇相關(guān)的錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物并表現(xiàn)出親剛果紅特性。治療方法可以包括采用某種特定種類的藥物，活動方式的變化，或者飲食的變化，這些至少部分基于某種先兆子癇指示物的出現(xiàn)(例如檢測出一種或多種生物標(biāo)記，親剛果紅/錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)聚集物或者是特定的蛋白質(zhì)寡聚體構(gòu)象)。這些個(gè)體可能已經(jīng)在接受先兆子癇的藥物治療。根據(jù)本發(fā)明，可以基于檢測出的一種或多種生物標(biāo)記、親剛果紅/錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)聚集物或者是特定的蛋白質(zhì)寡聚體構(gòu)象，調(diào)整個(gè)體的治療方案。一個(gè)個(gè)體可能先前并沒有接受任何先兆子癇的治療，那么接受監(jiān)測一種或多種生物標(biāo)記、親剛果紅/錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)聚集物或者是特定的蛋白質(zhì)寡聚體構(gòu)象， 這樣可以幫助選擇最有效的治療方案。9.試劑盒在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供可以在所描述方法中使用的試劑盒。試劑盒所含的試劑可以包括帶標(biāo)記的化合物或者能夠檢測出尿液中嗜剛果紅性或者錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物的試劑。在一些實(shí)施方案中，試劑盒還可以包含對蛋白質(zhì)具有親和性的支持表面，可以與樣品(如尿液樣品)相接觸；試劑盒還可以進(jìn)一步含有一種能夠和與先兆子癇相關(guān)的錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物結(jié)合的染料(如剛果紅)，這種染料可以用于與樣品接觸；試劑盒中也可以含有器皿、試管或者容器，用來將樣品和染料混合，或者用來孵育結(jié)合了樣品中蛋白質(zhì)的具有蛋白親和性的支持表面。試劑盒也可以包括一種或多種洗滌液，用來去除未結(jié)合錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物的染料。試劑盒可以還包含陽性對照品和陰性對照品來幫助控制染料結(jié)合和洗滌條件和時(shí)間，以保證在，例如上述對蛋白質(zhì)具有親和性的支持表面(“測試條”)上進(jìn)行足夠的結(jié)合和洗滌。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了適用于本發(fā)明檢測方法的試劑盒，試劑盒所含的試劑可以是標(biāo)記的化合物或者能夠檢測出尿液中錯(cuò)誤折疊蛋白聚集物及其含量的方法 (例如提供能與聚集物結(jié)合的抗體)，合適的能夠與生物標(biāo)記物結(jié)合的試劑包括抗體、抗體衍生物、抗體片段等。對于基于抗體的試劑盒，此試劑盒可以包含例如(1)第一個(gè)抗體一個(gè)用于和生物標(biāo)記物結(jié)合的抗體(例如結(jié)合在固相載體上)，(2)第二個(gè)抗體一個(gè)不同于第一個(gè)抗體的、可以與第一個(gè)抗體或者上述生物標(biāo)記物結(jié)合的抗體，并帶有可供檢測的標(biāo)記。可以用這種試劑盒檢測的先兆子癇相關(guān)生物標(biāo)記包括sFlt-1，PIGF, VEGF,白蛋白，SerpinAl，IFI6和血漿銅藍(lán)蛋白。在一些實(shí)施方案中，試劑盒含有特異性識別某些錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)構(gòu)象(例如纖維構(gòu)象)等的抗體?？贵w可以與該試劑盒可檢測的類型的樣品中特定的蛋白質(zhì)聚集物構(gòu)象結(jié)合。在某些情況下，樣品是含有先兆子癇相關(guān)的蛋白質(zhì)聚集物的尿液樣本，其中含有免疫球蛋白，二級抗體可以預(yù)先吸附Ig，以降低或者防止二級抗體與含有免疫球蛋白的蛋白質(zhì)聚集物的非特異性結(jié)合。這些試劑盒，在一些實(shí)施方案中，也可以含有其他組成部分，例如一種緩沖劑，一種防腐劑，或者一種蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。試劑盒還可以包含另一種組分用于檢測可檢測的標(biāo)記的(例如一種酶或者一種底物)。試劑盒的每一個(gè)組成部分都可以用一個(gè)獨(dú)立的容器盛裝，并且所有不同的容器都可以放在一個(gè)包裝中，其中包括用于解釋檢測結(jié)果的使用指南。容器可以預(yù)先用穩(wěn)定劑處理，穩(wěn)定劑也可以作為試劑盒的一個(gè)組成部分。實(shí)施例實(shí)施例1方法口口口艦亦糖制聚(細(xì)·式)1.將收集的尿樣離心。1500g，15分鐘，4°C2.使用 Pierce BCA 試劑盒(Thermo Scientific Cat#23225)測量離心后尿樣中蛋白濃度。為了測量蛋白，尿液樣本可能需要稀釋12倍。從潛在具有先兆子癇風(fēng)險(xiǎn)的女性處得到的尿樣的蛋白質(zhì)濃度變化很大，根據(jù)體內(nèi)含水情況，健康人尿液中蛋白水平也有很大變化。因此，最好能夠使總蛋白濃度一致化。在超過680個(gè)女性尿樣中，只有約5% (37/681)的總蛋白不足ang/mL。約60%的尿樣中含有超過6. 6mg/mL的總蛋白?？傮w來說，在大多數(shù)情況下沒有干燥樣本的必要，例如使用SpeedVac。干燥方法已經(jīng)得到檢驗(yàn)，其結(jié)果證明，干燥不能改變樣品的紅色斑點(diǎn)印跡結(jié)果。為了保持一致性，在所有測試中均使用了 SpeedVac 干燥。3.錐形離心管中加入一定體積的樣品，使其中含有200 μ g蛋白。使用SpeedVac 離心至干燥。4.準(zhǔn)備剛果紅儲備液(5mg/ml)。剛果紅(Sigma, Cat#C6277)溶于水。14，OOOg 離心10分鐘，分離未溶解的粉末。儲備液應(yīng)當(dāng)是新鮮制備的，而且應(yīng)當(dāng)在制備后一小時(shí)內(nèi)使用(例如，加入尿樣)。也可以選擇通過稀釋儲備液50倍制備剛果紅工作溶液(0. Img/ ml) ο5.在0. ImL PBS中加入2μ 1剛果紅儲備液，作為空白樣本。6.將干燥后的尿液樣本從SpeedVac上取下，加入30 μ 1剛果紅工作濃度溶液，震蕩混勻。7.使用震蕩器將樣本劇烈震蕩1小時(shí)，使剛果紅與樣本結(jié)合。8. 一小時(shí)后，在硝酸纖維素膜(0.2微米孔徑)上用5μ1混有剛果紅的樣品點(diǎn)雙點(diǎn)。每一點(diǎn)應(yīng)當(dāng)含有33. 3yg蛋白。同時(shí)點(diǎn)空白樣本。如果使用超過一張膜，則每一張膜上都需要有空白樣本點(diǎn)。最好每一次測試都加入陽性對照。在透照儀前加上格子，再將硝酸纖維素膜放在透照儀上進(jìn)行點(diǎn)點(diǎn)，可以使每個(gè)點(diǎn)分布整齊，從而能夠跟蹤每一個(gè)樣品的位點(diǎn)。9.讓膜干燥15分鐘。10.在水中洗滌3分鐘11.拍照(所有點(diǎn)此時(shí)應(yīng)當(dāng)具有相似的染色強(qiáng)度)12.在50%的甲醇中洗滌3分鐘，在70%的甲醇中洗滌1分鐘，最后在90%甲醇中洗滌，直到空白樣本中的紅色消失(通常7到10分鐘)。13.拍照(各點(diǎn)染色強(qiáng)度，例如陽性對照和空白樣本，應(yīng)當(dāng)看起來有所不同)。14.在甲醇洗滌前后分別掃描圖像，并且計(jì)算每一點(diǎn)的光密度(OD)。使用任何一種密度測量軟件均可，例如NIH Image J015.計(jì)算所有樣本的剛果紅結(jié)合百分比(CRI)，計(jì)算方法為(同一樣本甲醇洗滌之前的平均OD值/同一片膜上空白樣本的平均OD值)X100。
16.計(jì)算所有樣本的剛果紅保留百分比(CRR)，包括空白樣本。計(jì)算方法為(同一樣本甲醇洗滌之后的平均OD值/同一樣本甲醇洗滌之前的平均OD值)X100 ；隨后，從所有尿樣斑點(diǎn)值中減去空白樣本的CRR。如果甲醇洗滌徹底，空白樣本的斑點(diǎn)不應(yīng)有任何殘留的紅色，其OD平均值應(yīng)當(dāng)為0。17.將CRR > 20%的紅色斑點(diǎn)定為測試陽性，CRR < 15%的稱為陰性。18.如果CRR在15%到20%之間，則重復(fù)測試。根據(jù)測試結(jié)果，被分析的223個(gè)樣本的診斷和預(yù)后診斷分界線在大約16. 1%。應(yīng)當(dāng)注意使所有孵育和準(zhǔn)備(例如離心)的時(shí)間、體積、濃度都接近最佳值。不過，不同的時(shí)間、體積和濃度也可以得到可靠的測試結(jié)果，而且可以通過不是太多的試驗(yàn)就可摸索出來，因此上述孵育和準(zhǔn)備的時(shí)間、體積、濃度并不是限制性的，更進(jìn)一步，所有這里描述的可能用到化學(xué)物質(zhì)和/或儀器都沒有特殊限制，其它等價(jià)化合物和/或儀器也可以使用。另外，請注意某些步驟具有選擇性，步驟之間的順序可以改變，某些步驟可以刪除或者合并。這些改變對于具有常規(guī)技術(shù)的人都將是顯而易見的。例如，孵育時(shí)間不足1小時(shí) (步驟7)，在尿樣中加入非變性溶劑(例如Tween20)，或者用乙醇、異丙醇替代甲醇進(jìn)行洗滌，都可以得到可靠的測試結(jié)果。研究設(shè)計(jì)將招募到的110名女性按照預(yù)先設(shè)定分為3組血壓正常對照組(CRL η = 49,GA 2821-34周)；慢性高血壓組(cHTN η = 12,GA :29 [24-34IM )和嚴(yán)重先兆子癇組(sPE η = 49, GA 30對_34周)。另外，34名屬于先兆子癇高危人群、但無癥狀的孕期女性被長期追蹤觀察。尿樣剛果紅染色情況通過使用等量蛋白進(jìn)行斑點(diǎn)印跡固定和光譜漂移測試 (spectral shift assay)被量化。被染色的蛋白通過串聯(lián)質(zhì)譜被鑒定，并且通過flfestern 雜交被驗(yàn)證。使用SELDI-T0F生成了尿液蛋白組指紋。胎盤蛋白剛果紅染色通過極化顯微鏡檢測。結(jié)果圖1展示了剛果紅斑點(diǎn)檢測的硝酸纖維素膜在洗滌前(左)和洗滌后(右)的照片(硝酸纖維素膜上點(diǎn)樣量為5μ 1/點(diǎn))。正如圖中所示，在洗滌前剛果紅對各個(gè)樣品的染色情況一致，但是洗滌后染色只針對患有嚴(yán)重先兆子癇的女性尿液樣本(此時(shí)空白樣本為陰性對照)。圖2展示了對一組橫向比較的尿液樣品(Μ個(gè)樣本)進(jìn)行了剛果紅點(diǎn)測試后 (33 μ L/點(diǎn)加到硝酸纖維素膜上)洗之前和洗之后的情況的一張照片。被帶方框數(shù)字標(biāo)注的樣本來自于被確診患有嚴(yán)重先兆子癇的女性(SPE)。如圖中所示，在洗滌前，剛果紅對各個(gè)樣本的染色情況相似，但是洗滌后只針對患有嚴(yán)重先兆子癇的女性尿液樣本。圖3展示了對一組縱向比較的尿液樣品( 個(gè)樣本)進(jìn)行了剛果紅點(diǎn)測試后(33yL/點(diǎn)加到硝酸纖維素膜上)洗之前和洗之后的情況的一張照片。在整個(gè)妊娠過程中全程跟蹤了六個(gè)孕婦， 多次抽取尿液進(jìn)行分析。2號患者和5號患者之后患上先兆子癇。5號患者帶有方框的樣本采自臨床確診發(fā)病時(shí)期。樣品U348i和U348j是在由于先兆子癇而進(jìn)行有醫(yī)學(xué)指征分娩 (緊急剖腹產(chǎn))后取得的樣品。如此處所示，早在她們被確診患有先兆子癇之前，二位患者就已經(jīng)具有異常的剛果紅斑點(diǎn)尿樣檢測陽性結(jié)果(紅點(diǎn)為陽性)。圖14展示了在縱向跟蹤組病人中預(yù)測因先兆子癇而進(jìn)行有醫(yī)學(xué)指征分娩的曲線。通過剛果紅測試對36名處于高危(n = 30)或低危(n = 6)的女性進(jìn)行測試。其中，這一組的四人患上嚴(yán)重先兆子癇，進(jìn)行了有醫(yī)學(xué)指征分娩。這里的數(shù)據(jù)顯示，之后患上先兆子癇的女性的第一次測試樣本中即具有高尿液嗜剛果紅性。我們無法取得更早的樣本，以確認(rèn)這些女性是否在孕前就具有這樣的陽性結(jié)果。圖4為柱狀圖，展示了患有重度先兆子癇(sPE)、慢性高血壓(cHTN)和正常懷孕(CRL)的孕婦的剛果紅保留值(CRI )。其中剛果紅保留值經(jīng)過針對總蛋白質(zhì)濃度的均一化處理。如圖所示，CRR明顯與重度先兆子癇有關(guān)，并且具有很好的指示作用。尿樣在患者確診患有重度先兆子癇后入院時(shí)被測試。圖5顯示了以下幾組的剛果紅保留值和剛果紅結(jié)合值系數(shù)的ROC曲線A)確診先兆子癇，B)預(yù)測到因先兆子癇而進(jìn)行有醫(yī)學(xué)指征分娩023個(gè)尿樣，從114名不同孕婦處獲取)，一些女性在懷孕期間做了連續(xù)的尿樣分析。圖 6顯示，尿液蛋白的剛果紅保留值與先兆子癇的存在和嚴(yán)重程度緊密相關(guān)，正如使用異常蛋白組學(xué)圖(UPSr)分析的結(jié)果。圖7顯示，尿液蛋白的剛果紅保留值與比率值UFP相關(guān)聯(lián)，uFP:log[sFIt-l/ PIGFxlOO]，正如此處和 U. S. Publ. No :US-2006_0183175 ；PCT/US2005/047010 所描述。圖 8 顯示，與其他疾病中錯(cuò)誤折疊的蛋白類似(例如阿爾茨海默病和阮病毒癇)，先兆子癇癥尿液中的錯(cuò)誤折疊蛋白也可以用相同方法分離出來比如㈧利用剛果紅親和性進(jìn)行斑點(diǎn)印跡(方框中的樣本來自被臨床診斷患有重度先兆子癇的女性，如前所述)(B)凝膠過濾，或者(C)離心，并將沉淀下來的剛果紅結(jié)合蛋白用水洗滌(例如，針對(B)和(C))。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，胎盤組織切片被剛果紅染色。在有先兆子癇的切片中出現(xiàn)云狀雙折射物質(zhì)積聚在syncytiotrophoblasts，而對照組合體中沒有。圖15A顯示來自三名女性的胎盤組織切片，其中兩人因重度先兆子癇而早產(chǎn)(A-F)，另外一人為突發(fā)性早產(chǎn)(對照，G-H)。這些切片使用剛果紅染色，然后在顯微鏡下使用白光(A、D、G)或者極化光(B、C、 E、F、H和I)觀察，C組和F組分別是B組和E組中方形部分的進(jìn)一步放大(640x)。如B和 E中所示，患有先兆子癇的女性胎盤顯示出云狀灰藍(lán)色(B和C)或者灰綠色(E和F)雙折射物質(zhì)積聚在合體(syncytiotrophoblast)層(紅色箭頭)。組I 阿爾茨海默病患者腦部切片的極化光圖像，在相同條件下使用剛果紅染色。圖15B顯示先兆子癇患者尿樣中對剛果紅有陽性反應(yīng)的沉淀物圖像。在與剛果紅結(jié)合并離心之后，沉淀物(A)被水洗滌三次(洗滌之間重復(fù)離心)，用一滴水重懸，然后放在載玻片上使用顯微鏡極化光觀察(B)，或者在用醋酸鈾(uranyl acetate)染色后放置在電子顯微鏡的網(wǎng)格上，染色可以為(C)陽性或者(D)陰性。箭頭指向一種非細(xì)胞結(jié)構(gòu)，很可能是原纖維。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，剛果紅染色的物質(zhì)，同那些對構(gòu)象抗體有免疫活性的條帶一起走SDS凝膠電泳，并且用質(zhì)譜分析。在先兆子癇患者的尿蛋白和對構(gòu)象抗體有免疫活性的條帶中都檢測到了抗胰蛋白酶、血漿銅藍(lán)蛋白、IgG的重鏈和輕鏈的片段。對嗜剛果紅性物質(zhì)進(jìn)行針對SERPINA1的Wfestern印跡試驗(yàn)，觀察到許多能與抗體反應(yīng)結(jié)合的梯度分布的片斷。Western印跡或斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)也顯示先兆子癇患者尿液中含有血漿銅藍(lán)蛋白和 IFI6-16。ELISA驗(yàn)證了輕鏈的存在。圖16展示了從兩名重度先兆子癇患者處取到的尿液樣本⑴647和TO48)，它們被加載在雙重4-20%還原性SDS PAGE膠上，部分通過剛果紅親和沉淀富集錯(cuò)誤折疊蛋白(3、4道和7、8道，紅色星號)，部分沒有富集(1、2道和5、6道)。左圖為膠經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)染色后總蛋白的情況(1-4道)。在剛果紅沉淀后的樣本中，很多新的條帶變得可見。右圖為轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上蛋白對絲氨酸蛋白酶抑制劑Al (SERPINA1)的免疫活性。在7、8兩道可以見到額外的梯狀片段圖形，但是5、6中不可見。每一組都有分子量標(biāo)記物。這同時(shí)暗示，剛果紅可以被用來有效濃縮生物樣本(此處為先兆子癇患者尿樣) 中的錯(cuò)誤折疊蛋白和聚集蛋白，從而做進(jìn)一步研究?？傊瑪?shù)據(jù)顯示先兆子癇的特征是尿樣中，與CRL和cHTN相比嗜剛果紅性蛋白顯著增加，而與GA無關(guān)(P<0. 001)。在縱向長期觀察組中，那些因患上重癥先兆子癇而早產(chǎn)的女性(η = 4)的尿液中，嗜剛果紅性蛋白在臨床癥狀出現(xiàn)前8-10周就已經(jīng)出現(xiàn)。剛果紅與先兆子癇尿樣中蛋白結(jié)合后，產(chǎn)生光吸收中的紅移現(xiàn)象，與其他淀粉樣超分子蛋白結(jié)構(gòu)中觀察到的現(xiàn)象類似。尿液剛果紅親和性結(jié)果與先兆子癇的蛋白質(zhì)組文庫特征相關(guān)(r = 0. 89，P < 0. 001)。上述數(shù)據(jù)證明，先兆子癇是一種以淀粉樣超分子蛋白質(zhì)聚集物和尿液中的嗜剛果紅性蛋白為標(biāo)志的妊娠期疾病。通過斑點(diǎn)印跡和光譜漂移測試鑒定尿液中的嗜剛果紅性蛋白，可以查出患有先兆子癇的病人，并且提供了一種診斷方法。通過上述方法檢測出的尿液嗜剛果紅性蛋白聚集物，不僅可以診斷已經(jīng)存在的先兆子癇，同時(shí)也可以預(yù)測未來是否會發(fā)展為先兆子癇(臨床結(jié)果)。作為檢測尿液中嗜剛果紅性蛋白聚集物的補(bǔ)充，胎盤組織樣本的剛果紅染色結(jié)果也顯示出此類蛋白聚集物的標(biāo)志性特點(diǎn)。在胎盤組織中使用剛果紅染色的方法同樣可以應(yīng)用在先兆子癇的診斷中。應(yīng)該明白的是，除了剛果紅，也可以使用這一領(lǐng)域中多種其它化學(xué)試劑和方法來檢測分析蛋白聚集物(例如，硫代核黃素)。實(shí)施例2方法研究設(shè)計(jì)將預(yù)先招募到的347名女性按照預(yù)先設(shè)定分組血壓正常對照組(CRL η = 98,GA 27-42周)；慢性高血壓組(cHTN η = 40，GA :11-41周)；妊娠期高血壓組(gHTN η = 8 GA 3洸-39周)；輕度先兆子癇組(mPE η = 36, GA 324-41周)；嚴(yán)重先兆子癇組(sPE η = 117，GA :22-42周)和疊加型先兆子癇(spPE η = 33 GA :318-40 周！)。另外，35名無癥狀的孕期女性在全部妊娠期被長期追蹤觀察，并進(jìn)行一系列測試。剛果紅斑點(diǎn)測試通過等量化尿蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，在幾分鐘內(nèi)通過剛果紅保留值百分比進(jìn)行客觀量化。CRR通過與蛋白-肌酐比例(P/C)相比對因?yàn)橄日鬃影B而進(jìn)行有指征分娩(IND) 的預(yù)測能力進(jìn)行評判，如此處以及(U. S. Publ. No :US-2006-0183175 ；PCT/US2005/047010) 所述。結(jié)果先兆子癇的特征是，對偶氮染料剛果紅(CR)親和的錯(cuò)誤折疊蛋白的分泌增加。剛果紅染料也被用于檢測阿爾茨海默病和阮病毒病中異常的淀粉樣蛋白聚集物。剛果紅斑點(diǎn)測試CRR被設(shè)計(jì)并證實(shí)為一種以尿液嗜剛果紅性蛋白為基礎(chǔ)的先兆子癇診斷和預(yù)后診斷方法，它的原理為檢測妊娠期間某一尿液樣品中錯(cuò)誤折疊蛋白整體情況或總量。圖9A顯示不同實(shí)驗(yàn)組尿液蛋白的CRR值(CRL 對照；cHTN 慢性高血壓；gHTN 妊娠期高血壓；mPE 輕度先兆子癇；sPE 重度先兆子癇；spPE 疊加性先兆子癇)。61% (211/347)的女性具有 IND =CRL :4%;crHTN 40%；gHTN :75%;mPE :69%;sPE :99%;spPE :100%。77% (162/211)。在mPE中，CRR有所上升，在sPE和spPE中上升更加明顯，與GA值無關(guān)。有指征分娩的女性在加入本研究時(shí)即有CRR升高(圖9B，P < 0. 001)。圖9C顯示，在被長期跟蹤觀察的女性中，11% (4/35)進(jìn)行有指征早產(chǎn)(IND)。在這一組中，CRR在臨床診斷出先兆子癇癥狀之前14士4周就開始升高。與尿樣sFltl/PlGF(P =0. 014)和尿蛋白/肌酐比例(P/C)相比，CRR對于IND的預(yù)測準(zhǔn)確性更高(圖9C)?？傊ㄟ^CRR判斷總體蛋白錯(cuò)誤折疊情況是一種簡單的先兆子癇診斷和IND預(yù)測方法，IND是對早產(chǎn)的重要原因之一。實(shí)施例3方法研究設(shè)計(jì)將招募到的111名女性的尿樣分為3組嚴(yán)重先兆子癇組(n = 49，GA:28士1周)； 慢性高血壓組(cHTN η = 12，GA : 士1周)和血壓正常對照組(CRL η = 50，GA :28士 1 周)。等量的尿蛋白被用于斑點(diǎn)印跡檢測。這里用到三種構(gòu)象特異性抗體，分別識別前體纖維可溶寡聚鏈(AlLInvitrogen)，環(huán)形原纖維(Officer)或者纖維(OC)。通過刪除主要抗體的方法可以驗(yàn)證特異性。聚集物蛋白的組分通過質(zhì)譜鑒定，并且使用Western雜交和序列特異性抗體驗(yàn)證。結(jié)果蛋白構(gòu)象異常引起的疾病，例如阿爾茨海默病、輕鏈淀粉樣變性和阮病毒病，會因淀粉樣纖維的形成和聚集物而惡化。這種聚集物由細(xì)胞蛋白錯(cuò)誤折疊為異常3D結(jié)果導(dǎo)致。 可溶前淀粉樣寡聚鏈(纖維聚集的中間體)具有蛋白毒性效果，導(dǎo)致內(nèi)皮損傷和氧化壓力。先兆子癇癇理學(xué)中的一些重要特征是心血管內(nèi)皮的活化，以及隨后的血管痙攣。 關(guān)于其起因的理論包括胎盤的異常植入和發(fā)育、氧化壓力、內(nèi)皮前列腺素和一氧化氮平衡異常、基因多樣性、自體抗體循環(huán)異常和母體系統(tǒng)化炎癥反應(yīng)的異常(Buhimschi IA等人， Hum Reprod Update 1998 ；4 :25-42 ；Ward K 等人；Nat Genet 1993 ；4 59 ；Wallukat G 等人，J Clin Invest 1999 ；103 :945-952 ；Fass MM 等人，Am J Obstet Gynecol 1994 ；171 158-64 ；Roberts JM等人，Lancet 1993;341:1447-51)。鑒于內(nèi)皮損傷和氧化壓力在重度先兆子癇中扮演致病角色，尿液中可溶前體淀粉樣寡聚蛋白與先兆子癇之間的關(guān)系特性被鑒定并分類。被用于檢測尿液可溶前體淀粉樣寡聚蛋白的抗體可以檢測包括如下幾種構(gòu)象的蛋白i)前體纖維可溶寡聚構(gòu)象，例如“All”抗體等。ii)環(huán)形原纖維構(gòu)象，例如“Officer” 抗體等，以及iii)纖維構(gòu)象，例如“0C”抗體等。包括尿蛋白聚集物在內(nèi)的尿液斑點(diǎn)雜交顯示出一個(gè)問題，S卩非特異性All抗體結(jié)合。隨后發(fā)現(xiàn)(借助尿蛋白樣本的質(zhì)譜分析)，樣本中尿蛋白聚集物同時(shí)包括錯(cuò)誤折疊的人類免疫球蛋白(IgG)的重鏈和輕鏈，正是它們被大多數(shù)二級抗體非特異性識別(例如與之發(fā)生交叉反應(yīng))。在篩選了大批二級抗體的特異性之后，人們發(fā)現(xiàn)，使用被IgG預(yù)先吸附過的二級抗體是保證特異性的關(guān)鍵。當(dāng)使用All多克隆抗體檢測尿蛋白聚集物實(shí)驗(yàn)中的二級抗體被人IgG預(yù)先吸附過后，由于二級抗體與尿蛋白聚集物中錯(cuò)誤折疊蛋白和免疫球蛋白(IgG)輕重鏈的非特異性結(jié)合減少，檢測的敏感性大幅度上升。使用這種檢測方法，All測試是否為陽性將與癥狀的
42嚴(yán)重程度相關(guān)。圖10為使用All、OC和Officer三種多克隆抗體對尿樣斑點(diǎn)探測后進(jìn)行 Western印跡的硝酸纖維素膜的照片。這三種多克隆抗體(All針對廣泛的構(gòu)象，OC針對纖維型，Officer針對一些環(huán)形結(jié)構(gòu)annular)表現(xiàn)出針對先兆子癇患者樣本的免疫活性(圖中所示為，尿液、血液、腦脊液(CSF)和胎盤破碎液；PE 先兆子癇；CRL 對照組)。Officer 抗體被認(rèn)為對于在RBC類似物中可能與類淀粉樣蛋白通道一起形成通道或空洞的蛋白構(gòu)象有特異性，從而可能解釋先兆子癇病人的溶血現(xiàn)象。尿液、血液、腦脊液和胎盤破碎液也經(jīng)過了測試。數(shù)據(jù)顯示，先兆子癇是一種構(gòu)象異常，其特征是淀粉樣蛋白的沉寂。同步進(jìn)行 All和Officer染色表明，錯(cuò)誤折疊的蛋白中間體具有聚集成為空洞樣結(jié)構(gòu)的傾向(類淀粉蛋白通道)，這可能與臨床疾病表現(xiàn)有關(guān)。圖11展示了 3組女性尿液斑點(diǎn)測試的代表性結(jié)聚。這3組分別是先兆子癇組 (PE)、cHTN和對照。每一個(gè)斑點(diǎn)包含40mg尿蛋白。箭頭標(biāo)出樣本點(diǎn)的位置。將膜與樣本使用框架對比，樣本的位置被黑色圈標(biāo)注。結(jié)果表明，許多患有先兆子癇并具有剛果紅染色陽性結(jié)果的女性，其尿樣具有All免疫活性，雖然并非所有剛果紅陽性的女性都具有。這一數(shù)據(jù)表示，All陽性與癥狀的嚴(yán)重程度相關(guān)?；加兄囟认日鬃影B的女性尿液表現(xiàn)出All和Officer免疫活性的上升(sPE 42士8，cHTN :9±6，CRL :3士 lU/μ g，P < 0. 001)，但是不包括0C，上述結(jié)果與GA值相獨(dú)立。 尿液All和Officer斑點(diǎn)測試結(jié)果的強(qiáng)度與高血壓(P = 0. 007)和蛋白尿(P = 0. 005)的
嚴(yán)重程度相關(guān)。在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中，檢測了 PE尿液中哪種蛋白質(zhì)參與形成了被All識別的聚集物。 兩個(gè)高分子量、且為All陽性的條帶被從非還原性SDS PAGE膠上切下。使用胰蛋白酶消化，隨后將樣本送入Keck儀器進(jìn)行sPE尿液中蛋白質(zhì)可溶寡聚鏈的鑒定。下述鑒定結(jié)果得到了質(zhì)譜的驗(yàn)證免疫球蛋白的重鏈和輕鏈、銅藍(lán)蛋白和干擾素誘導(dǎo)蛋白6-16蛋白(GIP3， IFI6-16)，其中干擾素誘導(dǎo)蛋白被發(fā)現(xiàn)與阿爾茨海默病presenilin-2蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。先兆子癇尿液斑點(diǎn)測試中，IFI6-16的出現(xiàn)被其抗體驗(yàn)證。這一抗體是小鼠多克隆抗體，來自 Novus Biologicals Inc, Littleton, CO.，編號為 H00002537-A01。上述研究結(jié)果，S卩，先兆子癇患者尿液中蛋白具有All抗體免疫活性，這些蛋白包括免疫球蛋白的重鏈和輕鏈、銅藍(lán)蛋白和干擾素誘導(dǎo)蛋白6-16蛋白(GIP1，IFI6-16)，證明了胎盤和/或尿液中的一種或多種此類蛋白聚集物的量化同樣可以應(yīng)用在先兆子癇的診斷與預(yù)后診斷。實(shí)施例4樣本評估抗原和抗體的準(zhǔn)備方法根據(jù)Kayed等人的文章“Fibril specific conformation dependent antibodies recognize a generic epitope common to amyloid fibrils and fibrillar oligomers that is absent in prefibrillar oligomers"Molecular Nuerodegeneration 2007,2 :18 中，文中描述為纖維抗原制備方法為在50% HFIP/H20、0. 02%疊氮化鈉中攪拌2mg/ml的Αβ 42 肽7天。隨后，將HFIP在氮?dú)鈿饬髦姓舭l(fā)凈，再將樣本攪拌7天，使用PBS透析(分子量分界線為10，000Da)。所得的纖維通過EM檢查，其純度通過使用抗寡聚蛋白的抗體檢測，以不含寡聚蛋白為準(zhǔn)。抗原被用在給兩只新西蘭白兔(Pacific Immunology Corp. ,Ramona, CA, 92065)免疫，采用經(jīng)過IA⑶C認(rèn)證的方法。每一只兔子被500 μ 1完全弗氏佐劑(CFA)中的抗原免疫，隨后每隔4周使用500μ1不完全弗氏佐劑(IFA)中的抗原進(jìn)行加強(qiáng)免疫， 一共加強(qiáng)兩次。纖維和寡聚鏈的準(zhǔn)備在室溫下，將0. 3mg凍干的A β 42溶解在150 μ 1六氯異丙醇(HFIP)中10-20分鐘，制備Αβ纖維和纖維寡聚物。將所得的Αβ溶液加入DD水中， 配制成80 μ M的濃度，置于有機(jī)硅離心管中。經(jīng)過室溫10-20分鐘的溫育之后，將樣品離心15分鐘，使用14000XG的轉(zhuǎn)速，上清部分(ρΗ 2.8-3.5)被轉(zhuǎn)移到新的有機(jī)硅管中，并且置于氮?dú)馊鯕饬髦?0分鐘，以蒸發(fā)HFIP。之后，在500RPM條件下使用Teflon包被的微小攪拌棒攪拌樣本M小時(shí)，溫度為22°C。這一方法初始是為制備All陽性纖維前體寡聚物，但是近期的更多研究表明，這個(gè)方法同樣可以制備OC陽性的纖維寡聚物(Kayed等人，“Common structure of soluble amyloid oligomers implies common mechanism of pathogenesis”，Science 2003,300(5618) :486-489)。通過 4°C 以 100000XG 的轉(zhuǎn)速離心一小時(shí)，分離纖維和纖維A β 42寡聚物。含有纖維狀寡聚物的上清和含有纖維的沉淀被分離并收集。用等量的水將沉淀重懸?；蛘撸褂肐mg凍干的A β 42，溶解在200μ1的DMSO 中，室溫放置10-15分鐘，使之形成纖維寡聚物。DMSO中的纖維寡聚物根據(jù)其大小，使用ρΗ 為 7. 4 的 IOmM 的磷酸，通過 TSK-GEL SuperSW2000 柱進(jìn)行分離 CTosoh Bioscience LLC)， 設(shè)定流速為0. :3ml/分鐘。結(jié)果因?yàn)锳ll抗體對寡聚形態(tài)的蛋白沒有特異性，使用單克隆抗體再做進(jìn)一步確認(rèn)將提供更多的有用信息。因此，All陽性和陰性的尿樣都使用一組單克隆抗體進(jìn)行檢測，它們和All抗體由同樣的抗原誘生(Science 300 :486_489，2003)，但是相比與All，這些單克隆抗體對于不同類型的纖維前體蛋白寡聚物構(gòu)象具有不同的親和力和傾向性。我們得到了 10個(gè)尿樣的測試條帶，這些樣本來自患有先兆子癇(PE)的女性或者對照組(CRL)女性。 圖12顯示耶魯實(shí)驗(yàn)室得到的All免疫活性結(jié)果(條帶1)。條帶2使用了同樣的試劑和方法，不同的是，All抗體被刪去，并作為對二級抗體非特異結(jié)合的對照。其余條帶被送到UC Irvine的實(shí)驗(yàn)室。圖13的照片為經(jīng)過Western印跡之后的硝酸纖維素膜上的尿樣斑點(diǎn)(PE 先兆子癇；CRL對照)。這些樣本分別使用了單克隆抗體(M204，M205，M118，M09，M55)和多克隆抗體All (All)，以及不含一級抗體的陰性對照(Neg.)，以對比二級抗體的非特異性結(jié)合。這一實(shí)驗(yàn)提供了獨(dú)立的確證，證實(shí)All抗體對于先兆子癇尿液具有免疫活性，并且表明某些更具有選擇性的單克隆抗體同樣表現(xiàn)出免疫活性。這些發(fā)現(xiàn)表明，識別不同纖維前體蛋白寡聚物構(gòu)象的單克隆抗體，例如單克隆測204，測205和#M89，都可以用于先兆子癇的診斷。從患有先兆子癇的女性處取得的尿樣，可以被單克隆抗體M204強(qiáng)烈染色，被M205 輕微染色，但對照組不具備這一特點(diǎn)。其中一部分先兆子癇樣本也會被識別環(huán)形原纖維的 M89抗體染色。圖13顯示的樣本中，被M89染色最深的PE病理同時(shí)也是具有與HELLP (#4 病例)相符合的早期臨床退化情況。相反的是，#6病例(對M89染色為陰性，但是對M204、 M205和All為陽性)患有重度先兆子癇的診斷僅僅基于肺部積水這一單一標(biāo)準(zhǔn)，而其他PE 女性多是通過血壓或者尿蛋白被確診。#6病例隨后發(fā)展成圍產(chǎn)期心肌病，并因此需要重癥監(jiān)護(hù)病房的強(qiáng)力循環(huán)系統(tǒng)支持。對M89染色的差異提示，#6病例可能具有獨(dú)特的病因，并且也許能夠通過構(gòu)象單克隆抗體，例如抗環(huán)形原纖維的單克隆抗體09和89，的不同免疫活性區(qū)分這些疾病。實(shí)施例5抗體的制備兩只新西蘭白兔被注射了抗原，其中含有通過羧基末端巰酯將末端巰基連接到金顆粒膠體的Αβ 1-40。一百微克的多肽聚合抗原與不完全弗氏佐劑一同注射，并且使用相同的抗原每隔3周進(jìn)行加強(qiáng)注射，持續(xù)約5個(gè)月。待免疫響應(yīng)被確認(rèn)與All抗體的響應(yīng)等值后，一只動物被處死，其脾臟被收集并且其中的淋巴細(xì)胞通過標(biāo)準(zhǔn)方法被用于制備雜交瘤細(xì)胞。培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞足夠長時(shí)間之后，多克隆井中的上清液被取出，并從中篩選構(gòu)象依賴型纖維前體寡聚物特異性的抗體，此處使用Aβ纖維前體寡聚物作為初始篩選試劑。 Αβ單體、纖維前體寡聚物和纖維被用于第二輪篩選，以去除不具備構(gòu)象依賴性，與各種 Αβ構(gòu)象都相互作用的抗體。大約118個(gè)多克隆井因具有超過標(biāo)準(zhǔn)值0.5AU的免疫活性而被選出。這些多克隆被進(jìn)一步分類，所得的單克隆通過Aβ單體、纖維前體寡聚物和纖維進(jìn)行進(jìn)一步篩選和鑒定。在第二輪篩選之后，對纖維前體寡聚物或者纖維具有獨(dú)特傾向性的克隆被篩選出來。具有代表性的克隆通過與All多克隆抗體以及6E10，一種序列特異性鼠單克隆抗體對比被挑選出來。通過斑點(diǎn)印跡測試抗體的構(gòu)象特異性和序列特異性。斑點(diǎn)印跡測試包括 Iyg Αβ單體、纖維前體寡聚物和纖維，以及1 μ g α synuclein纖維前體寡聚物、免疫球蛋白輕鏈、朊病毒106-1 多肽段、KKOHO)KK和降鈣素。All多克隆抗體與所有類型的纖維前體寡聚物作用，但是不與Aβ單體和纖維作用。6Ε10只識別含有Αβ的樣本?？寺?18、 201、204、205和206對纖維前體寡聚物有特異性，但是不識別單體或者纖維。這一組克隆表現(xiàn)出針對其他被識別的纖維前體寡聚物的獨(dú)有特異性。克隆121特異性識別Αβ纖維，但是不識別任何一種纖維前體寡聚物或者Aβ單體。很多克隆分泌具有相同特異性的抗體。其中最多的類型是與克隆201相似，即只識別Αβ纖維前體寡聚物，不識別其他類型的寡聚物。所有這些克隆同時(shí)也是IgM?？寺?118同克隆48和55也無法區(qū)分(數(shù)據(jù)未給出)以下列出了兩種單克隆IgGjP 118和204的序列信息。多變區(qū)的氨基酸序列是不同的，與它們不同的特異性相符。#118 kappa VI+C1AQAAEL VMTQTPASVSAA VGGTVTINCQSSESVYNSRLSWFQQKPGQPPKLLIYFASTLASGVSSRF SGSGSGTEFTLTISGVQCDDAA TYYCAGHFSNSVYTFGGGTEVWTGDPV APTVLIFPPSADLVATGTVTIVCV AN KYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC*(S EQ ID NO. 7)#118 Vh+ClhAAQP AMAQSVEESGGRL VTPGTPLTLTCTVSGFSLSA YEVSffVRQAPGKGLEffIGIIY ANGNTVY ASff AKGRFTISKTSTKVDLRIPSPTTEDTATYFCARDIYTTTTNLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGD THSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKV DKTVAPSTCSKTSC(SEQ ID NO. 8)#204 kappa VI+C11AQAAELDMTQTPASVSEPVGGTVTIKCQASQSISSYLA WYQQKPGQRPRLLIYETSTLASGVPSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAA TYYCQSTYENPTYVSFGGGTEVGVKGDPV APTVLIFPPSADLV ATGTVTIVCV A NKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC*( SEQ ID NO. 9)#204 Vh+ClhAAQPAMAQSVKESGGRLVTPGTPLTLACTVSGFSLNTYSMFWVRQAPGKGLQWIGIISNFGVIY Y ATff AKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTA TYFCVRKYGSEffGGDLffGPGTL VTVSSGQPKAPSVFPL APCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTL TNGVRTFPSVRQSSGL YSLSSVVSVTSSSQPVTCNV AHPATNTKVDKTVAPSTCSKTSC(SEQ ID NO. 10)#205 kappa VI+C11AQAAEL VMTQTPSSVSAA VGGTVTISCQSSESVYNNNYLSWYQQKPGQPPKRLI30 DSASTLDSGVP SRFKGSGSGAQFTLTISDLECDDAA TYYCAGA YVNWMRIFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPSADLVATGTVTIV CVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGD C* (SEQ ID NO. 11)#205 Vh+ClhMAQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLINYYMNWVRQAPGKGLEWIGLITGW ADTYY AN SAKGRFTISKTSSTTVDLKITSPTTDDTATYFCVRGGHTNIISLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLPPCCG DTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRIFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPAT NTKVDKTVAPSTCSKTSC(SEQ ID NO. 12)針對A β寡聚物和纖維的單克降抗體:雖然多克隆對于不同聚集形式的類淀粉蛋白的免疫應(yīng)答具有很強(qiáng)的特異性，但是單克隆抗體在確定類淀粉蛋白聚集物精細(xì)結(jié)構(gòu)變化、鑒定聚集物的結(jié)構(gòu)和病理重要性上具有獨(dú)特的優(yōu)勢。我們在初期關(guān)注的是針對纖維前體類淀粉蛋白抗原簇的抗體，但是使用金膠體偶連的Αβ免疫小鼠，如同我們制備All。我們嘗試通過使用4個(gè)不同品系的小鼠，在兩個(gè)不同供應(yīng)商處制備小鼠單克隆抗體。雖然我們在小鼠多克隆血漿中得到了構(gòu)象依賴型 IgG的良好滴度，我們?nèi)匀恢荒軓男∈笃⑴K細(xì)胞融合產(chǎn)物中克隆分泌IgM的雜交瘤細(xì)胞。我們嘗試了不同的免疫途徑，進(jìn)行6個(gè)月的免疫注射，并使用不用來源的淋巴細(xì)胞(外周和淋巴結(jié))，但是我們一直未能得到IgM以外的克隆。無法從小鼠雜交瘤細(xì)胞中得到分泌IgG的克隆的原因仍然未知。雖然這些IgM克隆具有一定的用途，但是在很多應(yīng)用條件下并不適合，所以我們與Epit0mics，lnc簽約，制備兔單克隆IgG。盡管我們使用了和獲得小鼠單克隆抗體時(shí)相同的抗原和篩選方法，我們得到了更多的陽性獨(dú)立克隆(> 200)，其中的許多個(gè)都是IgG克隆(數(shù)據(jù)未給出)。這中間的許多克隆具有相似的表型，并且被歸入我們目前鑒定了的6個(gè)不同的組中。(圖1)我們得到的單克隆抗體的特異性值得關(guān)注，主要由于以下幾個(gè)原因(圖1)。盡管我們都是用Αβ單體、寡聚物和纖維來篩選與之作用的抗體，所有通過注射All Ai3C端巰酯連接金膠體而得到的單克隆抗體，都具有構(gòu)象特異性。沒有一種克隆識別類似6E10單體。這表明，針對固態(tài)抗原的免疫應(yīng)答具有高度構(gòu)象特異性。沒有任何抗體可以同時(shí)識別純纖維和純寡聚物樣品，表明這些抗原決定簇的分布相互排斥。第二，大部分抗體(M118， M204，M205, M206)識別“通用抗原決定簇”，它們分布于從其他蛋白和肽鏈序列得到的纖維前體寡聚物。但是，在這一組識別“通用，，纖維前體寡聚物抗原決定簇的抗體中，抗體識別的寡聚物類型有相當(dāng)大的差異。所有的通用單克隆抗體識別Αβ寡聚物，因?yàn)樗鼈儽挥糜诘谝淮魏Y選，但是每一個(gè)抗體都具有比All多克隆免疫應(yīng)答更加嚴(yán)格的特異性。例如，M204 可以強(qiáng)烈識別大多數(shù)的寡聚物，但是與免疫球蛋白輕鏈寡聚物的反應(yīng)明顯較弱。M205與 α synuclein和輕鏈寡聚物反應(yīng)強(qiáng)烈，但是與阮病毒106-126、聚合Q以及降鈣素寡聚物不反應(yīng)。M118傾向于輕鏈和聚合Q，但是對synuclein、阮癇毒或者降鈣素寡聚物沒有作用。 這些結(jié)果顯示，在這一類群中廣泛分布的纖維前體寡聚物中帶有多種不同的抗原決定簇， 而單克隆抗體可以識別這些獨(dú)特的抗原決定簇。笛S，一些單克隆抗體同時(shí)具有構(gòu)象依賴性和序列特異性。皿201只識別八3寡聚物，而M121只識別Αβ纖維。Μ118、Μ204和Μ205 是IgG，其他抗體是IgM。實(shí)施例6單克隆抗體由EpitomiCS，InC在兔子中制備。新西蘭白兔被注射了 A β環(huán)形原纖維，使用Kayed等人在J.Biol. Chem. 2009(1)中描述的方法制備。純凈的Αβ環(huán)形原纖維以Αβ纖維前體寡聚物為起始材料制備，寡聚物的制備方法如前所述O)。APF通過在纖維前體寡聚物溶液中加入5% (體積比體積)正己烷制備，每隔5分鐘樣本被渦旋震蕩混合器混合1分鐘，總共用時(shí)50分鐘。隨后，樣本在水中被透析，使用麗分界為IOkDa的透析膜。 兔子共被注射了 7次，每次注射500yg的Αβ環(huán)形原纖維，相隔3周。篩選其血漿中的環(huán)形原纖維特異性滴度，具有最高滴度的兔子被選用制備單克隆抗體。所得雜交瘤細(xì)胞的上清液首先通過ELISA篩選A β環(huán)形原纖維、A β纖維和A β單體。對于A β環(huán)形原纖維具有超過1.0光密度，且對于Aβ纖維和Αβ單體的活性是背景級別的井被選作二級篩選。大約100個(gè)井被選入二級篩選，篩選對象為0. 1 %的SDS溶液中的A β環(huán)形原纖維(APFs)、α 溶血素孔、Αβ纖維、Αβ纖維前體寡聚物、Αβ單體和Αβ，使用斑點(diǎn)雜交。結(jié)果如下所示。在二級篩選中，單克隆09和89只對于α溶血素孔有免疫反應(yīng)。我們同時(shí)鑒定了它們對溶解在IOmM的NaOH中的α溶血素和A β的免疫反應(yīng)，其western印跡結(jié)果如下所
7J\ ο單克隆抗體09和87都被發(fā)現(xiàn)能夠與Wfestern印跡中大約65kDa的條帶反應(yīng)。M87 同樣與大約40kDa的條帶反應(yīng)。65kDa處的α溶血素條帶與用于制備單克隆抗體的兔子的多克隆血漿也有明顯反應(yīng)。1. Kayed, R.，A. Pensalfmi, L Margol, Y. Sokolov, F. Sarsoza, E. Head，J. Hall，and C. Glabe. 2009. Annular proto fibrils are a structurally and functionally distinct type of amyloid oligomer. J Bioi Chern 284 :4230-4237.2. Kayed，R.，and C. G. Glabe. 2006. Conformation-dependent anti-amyloid oligomer antibodies. Methods EnzyrnoI413 :326-344.這一發(fā)明的使用需要這一領(lǐng)域中常規(guī)的傳統(tǒng)的細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、DNA雜交和免疫學(xué)技術(shù)，除非另行說明。這些技術(shù)都在文獻(xiàn)中有所描述。這一發(fā)明的應(yīng)用并不局限于之前文本或者圖畫中描述的各組分的構(gòu)建和安排。這一發(fā)明同樣可以用于其它情況，而且通過各種方法被應(yīng)用。此處使用的用語和術(shù)語是以描述為目的，不應(yīng)被看作限制。對于“包括”、“含有”或者“具有”、“包含”、“涉及”等詞以及其變化，是為了包括其下列出的多個(gè)項(xiàng)目，或者與之等價(jià)以及額外的項(xiàng)目。
權(quán)利要求
1.一種在懷孕女性中診斷或者輔助診斷先兆子癇的方法，包括(a)從該名女性處得到樣品，并且(b)在樣本中檢測錯(cuò)誤折疊蛋白的超分子聚集物，該聚集物與先兆子癇有關(guān)(是病理學(xué)上的一種誘因)，如果樣本中出現(xiàn)超分子聚集物，則這名女性患有先兆子癇，或者比沒有聚集物的女性更可能患上先兆子癇。
2.一種在懷孕女性中診斷或者輔助診斷先兆子癇的方法，包括(a)從該名女性處得到樣品；(b)將樣本與能夠標(biāo)記錯(cuò)誤折疊蛋白超分子聚集物的試劑相結(jié)合，這種蛋白(i)包含 SERPINA-1( α-1抗胰蛋白酶)或者SERPINA-1的一個(gè)片段，而且(ii)與先兆子癇相關(guān)(一種病理上的致病因素)，實(shí)驗(yàn)條件適宜試劑與超分子聚集物結(jié)合，并且(c)確定樣本中是否含有超分子聚集物，如果有蛋白質(zhì)聚集物，則這名女性患有先兆子癇，或者比沒有聚集物的女性更可能患上先兆子癇。
3.權(quán)利要求1中的方法，超分子聚集體包含SERPINA-l(a-l抗胰蛋白酶)或者 SERPINA-1的一個(gè)片段。
4.權(quán)利要求3中的方法，超分子聚集物還包括銅藍(lán)蛋白、IgG重鏈、IgG輕鏈和干擾素誘導(dǎo)蛋白6-16(IFI6)的至少一種。
5.權(quán)利要求1、3或4中的任何一種方法，超分子聚集物的出現(xiàn)是通過將樣本與可以標(biāo)記超分子聚集物的試劑結(jié)合來檢測的。
6.權(quán)利要求1至5中的任何一種方法，樣本都是尿液樣本或者胎盤組織樣本。
7.權(quán)利要求1至6中的任何一種方法，其試劑是一種染料、抗體或者熒光標(biāo)記。
8.權(quán)利要求7中的方法，其染料是雜環(huán)染料。
9.權(quán)利要求8中的方法，其染料是剛果紅或者一種硫磺素。
10.權(quán)利要求7到9中的方法，其染料染色對象為超分子聚集體，而染色結(jié)果通過斑點(diǎn)印跡固定和/或光譜漂移實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測。
11.一種懷孕女性先兆子癇癥的診斷方法。這一方法是對女性尿液中嗜剛果紅性蛋白的出現(xiàn)的檢測。在從懷孕女性處得到的尿樣中檢測嗜剛果紅性蛋白聚集物的存在，其中包含SERPINA-1 ( α -1抗胰蛋白酶)或者SERPINA-1的一個(gè)片段。
12.權(quán)利要求7中的方法。其抗體是構(gòu)象依賴型、氨基酸序列獨(dú)立型的抗體。
13.權(quán)利要求12中的方法，其構(gòu)象依賴型抗體識別錯(cuò)誤折疊蛋白超分子聚集物中的一種或更多抗原決定簇，這些聚集物從包含纖維前體寡聚物、纖維寡聚物、原纖維和類淀粉蛋白纖維的族群中挑選而得。
14.權(quán)利要求13中的方法，其構(gòu)象依賴型抗體識別纖維寡聚物和/或類淀粉蛋白纖維上的一種或多種抗原決定簇。
15.權(quán)利要求13中的方法，其構(gòu)象依賴型抗體與(環(huán)形)原纖維上的一種或多種抗原決定簇結(jié)合。
16.權(quán)利要求13中的方法，其構(gòu)象依賴型抗體與纖維前體寡聚物的一種或多種抗原決定簇結(jié)合。
17.權(quán)利要求14中的方法，其構(gòu)象特異性抗體是OC抗體。
18.權(quán)利要求15中的方法，其構(gòu)象特異性抗體是Officer抗體。
19.權(quán)利要求16中的方法，其構(gòu)象特異性抗體是All抗體。
20.權(quán)利要求15到18的方法，如果原纖維特異性抗體對樣本有免疫活性，則該女性已經(jīng)患有或者可能發(fā)展為溶血癥。
21.一種在懷孕女性中診斷或者輔助診斷先兆子癇的方法，包括(a)從女性處得到尿液樣本或胎盤組織樣本；(b)將樣本與構(gòu)象依賴型抗體接觸，抗體將與錯(cuò)誤折疊蛋白的超分子聚集體結(jié)合，而這種聚集體與先兆子癇相關(guān)。如果抗體結(jié)合了樣本的某一成分，則與未結(jié)合樣本對應(yīng)的個(gè)體相比，該名女性已經(jīng)患有或更易患有先兆子癇。
22.權(quán)利要求21中的方法，其樣本中的成分指超分子聚集體，包括纖維前體寡聚物、纖維寡聚物、原纖維或類淀粉蛋白纖維。
23.權(quán)利要求22中的方法，構(gòu)象依賴型抗體識別纖維寡聚物和/或類淀粉蛋白纖維中的一種或多種抗原決定簇。
24.權(quán)利要求22中的方法，其構(gòu)象依賴型抗體識別(環(huán)形)原纖維上的一種或多種抗原決定簇。
25.權(quán)利要求22中的方法，其構(gòu)象依賴型抗體識別纖維前體寡聚物上的一種或多種抗原決定簇。
26.權(quán)利要求23中的方法，其構(gòu)象特異性抗體是OC抗體。
27.權(quán)利要求M中的方法，其構(gòu)象特異性抗體是Officer抗體。
28.權(quán)利要求25中的方法，其構(gòu)象特異性抗體是All抗體。
29.權(quán)利要求M或27的方法，如果原纖維特異性抗體對樣本有免疫活性，則該名女性已經(jīng)患有或可能會發(fā)展為溶血癥。
30.一種確定懷孕女性是否具有患上先兆子癇風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括(a)從該女性處得到樣本；(b)從樣本中檢測與先兆子癇有關(guān)的錯(cuò)誤折疊蛋白超分子聚集物(是病理上的一種致病因素)，如果樣本中出現(xiàn)聚集物，則該名女性發(fā)展為先兆子癇的風(fēng)險(xiǎn)要大于樣本中沒有聚集物的女性。
31.一種確定懷孕女性是否具有患上先兆子癇風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括(a)從該女性處得到樣本；(b)將樣本與能夠標(biāo)記錯(cuò)誤折疊蛋白超分子聚集體的試劑相結(jié)合。其中的蛋白聚集體 (i)包含SERPINA-1( α-1抗胰蛋白酶)或者SERPINA-1的一個(gè)片段，而且(ii)與先兆子癇相關(guān)(一種病理上的致病因素)，實(shí)驗(yàn)條件適宜試劑與超分子聚集體結(jié)合，并且(c)確定樣本中是否含有超分子聚集體。如果有蛋白質(zhì)聚集體，則這名女性患有先兆子癇，或者比沒有聚集物的女性更可能發(fā)展為先兆子癇患者。
32.權(quán)利要求30中的方法，其超分子聚集體包含SERPINA-l(a-l抗胰蛋白酶)或者 SERPINA-1的一個(gè)片段。
33.權(quán)利要求31或32中的方法，超分子聚集體還包括銅藍(lán)蛋白、IgG重鏈、IgG輕鏈和干擾素誘導(dǎo)蛋白6-16(IFI6)的至少一種。
34.權(quán)利要求30、32或33中的任何一種方法，超分子聚集體的出現(xiàn)是通過將樣本與可以標(biāo)記超分子聚集體的試劑結(jié)合來檢測的。
35.權(quán)利要求30至34中的任何一種方法，其樣本是尿液樣本或者胎盤組織樣本。
36.權(quán)利要求34或35中的方法，其試劑是一種染料、抗體或者熒光標(biāo)記。
37.權(quán)利要求36中的方法，其染料是剛果紅或者一種硫磺素。
38.權(quán)利要求35到37中的任何一種方法，剛果紅染色對象為超分子聚集體，而染色結(jié)果通過斑點(diǎn)雜交固定和/或光譜漂移實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測。
39.一種減弱懷孕女性患上先兆子癇癥的癥狀的方法，包括向該名女性提供有效量的抑制劑，可以抑制蛋白聚集物的發(fā)生形成，其中蛋白聚集物含有SERPINA-l(a-l抗胰蛋白酶)或者SERPINA-1的一個(gè)片段，而且與先兆子癇相關(guān)(一種病理上的致病因素)。這一有效量是足以抑制超分子蛋白聚集體發(fā)生的劑量，或者可以破壞(部分或全部)現(xiàn)存的超分子聚集體，或者二者皆符合。
40.權(quán)利要求39中的方法，其抑制劑可以穩(wěn)定超分子聚集體中至少一種成分的原始構(gòu)象，并且減少異常折疊發(fā)生的程度，因此使用抑制劑的女性，其超分子蛋白聚集物發(fā)生的程度要輕于不使用抑制劑的女性。
41.權(quán)利要求39或40中的方法，其抑制劑是一種抗體或者可以和蛋白聚集物的某一組分相結(jié)合抗體片段、一種氧化三甲基胺、一種抗β類淀粉蛋白試劑(例如，P-氨基酚、 2-氨-4-氯酚以及衍生物)、一個(gè)抑制纖維、原纖維或寡聚物形成的小分子抑制劑，或者抑制纖維、原纖維或寡聚物形成的多肽抑制劑。
42.一個(gè)體外診斷個(gè)體先兆子癇，或者預(yù)測其未來發(fā)展為先兆子癇可能性的方法，其步驟包括在上述個(gè)體的尿液或胎盤樣本中檢測異常蛋白聚集物(錯(cuò)誤折疊蛋白的超分子聚集物)。
43.權(quán)利要求1中的方法，其異常蛋白聚集物在尿樣中檢測。
44.權(quán)利要求42中的方法，其異常蛋白聚集物在胎盤樣本中檢測。
45.權(quán)利要求42至44中的任何一種方法，其中所說的異常蛋白聚集體通過剛果紅染色檢測。
46.權(quán)利要求45中的方法，剛果紅染色包括斑點(diǎn)雜交固定和光譜漂移實(shí)驗(yàn)。
47.權(quán)利要求42至44中的任何一種方法，其中所說的異常蛋白聚集物通過硫磺素S或者硫磺素A染色檢測。
48.權(quán)利要求42至47中的任何一種方法，其異常蛋白聚集體包括SERPINA-1( α -1抗胰蛋白酶)和/或者其多肽片段。
49.權(quán)利要求42至48中任何一種方法，其異常蛋白聚集體包括銅藍(lán)蛋白和IgG輕重鏈的片段。
50.一種用于治療和/或預(yù)防先兆子癇的蛋白聚集物抑制劑。
51.權(quán)利要求50中的抑制劑，抑制蛋白聚集物的重新合成。
52.權(quán)利要求50或51中的抑制劑，逆轉(zhuǎn)或者破壞已經(jīng)存在的蛋白質(zhì)聚集物。
53.權(quán)利要求50的中的抑制劑，可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)的原始構(gòu)象，從而減少異常折疊以及隨后的聚集物發(fā)生的概率。
54.權(quán)利要求50至53中的任何一種抑制劑，可以抑制SERPINA-1(α-1抗胰蛋白酶) 和/或者其多肽片段的聚集物。抑制劑從以下物質(zhì)中選擇(a)氧化三甲基胺；(b)氧化三甲基胺相關(guān)化合物；(c)FLEAIG多肽；和(d)和FLEAIG多肽相關(guān)的多肽及其衍生物。
55.權(quán)利要求50至討中的任何一種抑制劑，是從以下物質(zhì)中選擇(a)氧化三甲基胺； (b)氧化三甲基胺相關(guān)化合物；(c) FLEAIG多肽；和(d)和FLEAIG多肽相關(guān)的多肽及其衍生物。
56.權(quán)利要求50至M中的任何一種抑制劑，是抗β類淀粉蛋白試劑。
57.權(quán)利要求56中的抑制劑，其抗β類淀粉蛋白試劑是從ρ-氨基酚和2-氨-4-氯酚中挑選的。
全文摘要
提供了診斷、治療和/或預(yù)防先兆子癇相關(guān)的方法、試劑盒和化合物。
文檔編號G01N33/573GK102483418SQ200980153533
公開日2012年5月30日 申請日期2009年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月31日
發(fā)明者C·G·格萊柏, C·S·布希姆斯基, I·布希姆斯基 申請人:加利福尼亞大學(xué)歐文分校, 加利福尼亞大學(xué)董事會, 耶魯大學(xué)