專(zhuān)利名稱(chēng)：診斷和治療先兆子癇或子癇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
概括地說(shuō)，本發(fā)明涉及患有先兆子癇或子癇的被試者的檢測(cè)和治療。
背景技術(shù)：
先兆子癇是高血壓、水腫和蛋白尿的綜合征，可影響5-10％的孕婦并導(dǎo)致很多產(chǎn)婦和胎兒發(fā)病及死亡。先兆子癇造成全世界每年至少200,000名產(chǎn)婦死亡。先兆子癇的癥狀通常在懷孕第20周后出現(xiàn)且通常是通過(guò)常規(guī)監(jiān)測(cè)婦女的血壓和尿液而檢測(cè)出來(lái)的。然而，這些監(jiān)測(cè)方法不能有效診斷早期綜合征，如果采取有效的治療，就可減少被試者或發(fā)育中胎兒的危險(xiǎn)。
目前還沒(méi)有已知的先兆子癇療法。先兆子癇的嚴(yán)重程度可從輕度直至威脅生命。輕度的先兆子癇可通過(guò)臥床休息和經(jīng)常監(jiān)測(cè)來(lái)治療。對(duì)于中度至重度的病例，建議住院并接受血壓藥物治療或抗驚厥藥物治療以防止癲癇發(fā)生。如果情況威脅到母親或嬰兒的生命，則要終止懷孕并在足月前分娩出嬰兒。
胎兒和胎盤(pán)的適當(dāng)發(fā)育是由若干生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的。這些生長(zhǎng)因子中的其中一個(gè)是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞-特異性促分裂原、血管生長(zhǎng)誘導(dǎo)劑、和血管滲透性的介質(zhì)。VEGF已經(jīng)表現(xiàn)出對(duì)于腎小球毛細(xì)血管修復(fù)很重要。VEGF以同型二聚體與兩個(gè)同源跨膜酪氨酸激酶受體-fms-樣酪氨酸激酶(Flt-1)和激酶結(jié)構(gòu)域受體(KDR)中的一個(gè)結(jié)合，它們?cè)趶暮芏嗖煌M織獲得的內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)有所不同。Flt-1，而不是KDR由形成胎盤(pán)的滋養(yǎng)層細(xì)胞高水平表達(dá)。胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(P1GF)是VEGF家族的成員，也涉及胎盤(pán)的發(fā)育。P1GF由細(xì)胞滋養(yǎng)層及合胞體滋養(yǎng)層表達(dá)且能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及活化。P1GF以同型二聚體與Flt-1受體結(jié)合，但不與KDR受體結(jié)合。P1GF和VEGF均可對(duì)促分裂原活性和血管生成作出貢獻(xiàn)，而這對(duì)于胎盤(pán)發(fā)育是至關(guān)重要的。
近來(lái)已經(jīng)在人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)基中鑒定了可溶性形式的Flt-1受體(sFlt-1)，且隨后在胎盤(pán)組織中證實(shí)了體內(nèi)表達(dá)。sFlt-1是Flt-1受體的剪接變體，其缺少跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。sFlt-1以高親和性與VEGF結(jié)合，但不會(huì)刺激內(nèi)皮細(xì)胞分裂。據(jù)信sFlt-1可作為“生理庫(kù)”發(fā)揮作用而負(fù)調(diào)節(jié)VEGF信號(hào)途徑。因此調(diào)節(jié)sFlt-1水平可調(diào)節(jié)VEGF和VEGF信號(hào)途徑。通過(guò)正在發(fā)育胎盤(pán)中的滋養(yǎng)層細(xì)胞小心調(diào)節(jié)VEGF和PlGF信號(hào)途徑對(duì)于維持適宜的增殖、遷移和血管生成是至關(guān)重要的。因此需要一種方法能夠準(zhǔn)確診斷可能患有或患有先兆子癇的被試者，特別是在最嚴(yán)重的癥狀發(fā)生之前診斷。還需要進(jìn)行治療。
發(fā)明概述我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種在癥狀發(fā)展前，診斷和有效治療先兆子癇和子癇的方法。
利用基因表達(dá)分析，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在患有先兆子癇孕婦的胎盤(pán)組織樣品中，sFlt-1水平顯著提高。已知sFlt-1通過(guò)起“生理庫(kù)”的作用而拮抗VEGF和PlGF且，在先兆子癇或子癇婦女中，在含有必需量的這些重要的血管生成和促分裂原因子的胎盤(pán)中可能缺少sFlt-1。過(guò)量的sFlt-1還可通過(guò)破壞維持血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞和/或排列于腦脈絡(luò)叢的內(nèi)皮細(xì)胞而導(dǎo)致腦水腫和在子癇中見(jiàn)到的癲癇發(fā)生而導(dǎo)致子癇。在本發(fā)明中，將提高VEGF和PlGF水平的化合物給予被試者，從而通過(guò)拮抗提高的sFlt-1的作用而治療或預(yù)防先兆子癇或子癇。此外，針對(duì)sFlt-1的抗體可用于競(jìng)爭(zhēng)性抑制VEGF或PlGF與sFlt-1的結(jié)合，由此提高游離VEGF和PlGF的水平。RNA干擾和反義核酸堿基(nucleobase)寡聚物也可用于降低sFlt-1水平。最終，本發(fā)明提供sFlt-1、VEGF、和PlGF作為先兆子癇或子癇、或其傾向的早期診斷和治療的檢測(cè)工具的用途和監(jiān)測(cè)。
因此，一方面，本發(fā)明提供一種通過(guò)給予被試者能夠結(jié)合sFlt-1的化合物而治療或預(yù)防被試者先兆子癇或子癇的方法，其中所述給藥時(shí)間和用量足以治療或預(yù)防被試者的先兆子癇或子癇。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種通過(guò)給予被試者提高能夠結(jié)合sFlt-1的生長(zhǎng)因子水平的化合物(例如，煙堿、茶堿、腺苷、硝苯地平、米諾地爾、或硫酸鎂)而治療或預(yù)防被試者先兆子癇或子癇的方法，其中所述給藥時(shí)間和用量足以治療或預(yù)防被試者的先兆子癇或子癇。
另一方面，本發(fā)明提供一種通過(guò)給予被試者純化的sFlt-1抗體或其抗原結(jié)合片段而治療或預(yù)防被試者先兆子癇或子癇的方法，其中所述給藥時(shí)間和用量足以治療或預(yù)防被試者的先兆子癇或子癇。
在另一相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種通過(guò)給予被試者與至少一部分sFlt-1核酸序列互補(bǔ)的反義核酸堿基寡聚物而治療或預(yù)防被試者先兆子癇或子癇的方法，其中所述給藥足以治療或預(yù)防被試者的先兆子癇或子癇。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，反義核酸堿基寡聚物的長(zhǎng)度為8-30個(gè)核苷酸。
在另一相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種治療或預(yù)防被試者先兆子癇或子癇的方法。該方法包括給予被試者含有至少一部分sFlt-1核酸序列的雙鏈RNA(dsRNA)的步驟，其中所述給藥足以治療或預(yù)防被試者的先兆子癇或子癇。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，將雙鏈RNA加工成19-25個(gè)核苷酸長(zhǎng)的小分子干擾RNA(siRNA)。
在上述方面的各實(shí)施方案中，所述候選化合物是生長(zhǎng)因子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，包括所有同種型如VEGF189、VEGF121、或VEGF165；胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(P1GF)，包括所有同種型；或其片段。在優(yōu)選實(shí)施方案中，候選化合物是結(jié)合sFlt-1的抗體。在上述方面的其它實(shí)施方案中，該方法還包括給予被試者抗-高血壓的化合物。在上述方面的其它實(shí)施方案中，所述被試者是懷孕的人、產(chǎn)后的人、或非-人類(lèi)(例如，牛、馬、綿羊、豬、山羊、狗、或貓)。
另一方面，本發(fā)明提供一種治療或預(yù)防先兆子癇或子癇的方法。該方法包括給予需要這種治療的被試者有效量的含VEGF或PlGF多肽的藥物組合物。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物含有VEGF多肽。在另一實(shí)施方案中，所述組合物含有PlGF多肽。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種治療或預(yù)防先兆子癇或子癇的方法。該方法包括給予需要這種治療的被試者有效量的含編碼VEGF或PlGF的核酸分子的藥物組合物。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物含有VEGF核酸分子。在另一實(shí)施方案中，所述組合物含有PlGF核酸分子。
在另一相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種治療或預(yù)防被試者先兆子癇或子癇的方法。該方法包括給予被試者抑制sFlt-1多肽結(jié)合生長(zhǎng)因子的化合物(例如，化學(xué)化合物、多肽、肽、抗體或其片段)的步驟，其中所述給藥足以治療或預(yù)防被試者的先兆子癇或子癇。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物結(jié)合sFlt-1并阻斷生長(zhǎng)因子的結(jié)合。
在上述方面的各實(shí)施方案中，該方法還包括給予被試者抗-高血壓化合物(例如，腺苷、硝苯地平、米諾地爾、和硫酸鎂)的步驟。在上述方面的其它實(shí)施方案中，被試者是懷孕的人、產(chǎn)后的人、或非-人類(lèi)(例如，牛、馬、綿羊、豬、山羊、狗、或貓)。
另一方面，本發(fā)明提供一種診斷被試者患有先兆子癇或子癇，或具有發(fā)展先兆子癇或子癇傾向的方法，該方法包括測(cè)量被試者樣品中的sFlt-1、VEGF、或P1GF多肽水平。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種診斷被試者患有先兆子癇或子癇，或具有發(fā)展先兆子癇或子癇傾向的方法，通過(guò)測(cè)定被試者樣品中sFlt-1、VEGF或P1GF多肽中至少兩個(gè)的水平，并使用度量計(jì)算sFlt-1、VEGF、或P1GF水平之間的關(guān)系，其中被試者樣品相對(duì)于對(duì)照的改變可診斷被試者的先兆子癇或子癇。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，度量是先兆子癇抗-血管生成指數(shù)(PAAI)[sFlt-1/VEGF+P1GF]，其中PAAI可用作抗-血管生成活性的指標(biāo)。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，大于20的PAAI表示先兆子癇或子癇。在另一實(shí)施方案中，sFlt-1、VEGF或P1GF多肽的水平是通過(guò)免疫學(xué)測(cè)定法，如ELISA測(cè)定的。
在上述方面的各實(shí)施方案中，樣品是體液，如血清或尿液。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，大于2ng/ml的sFlt-1水平可表示先兆子癇或子癇。在上述方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，所測(cè)量的sFlt-1多肽水平是游離的、結(jié)合的或總的sFlt-1多肽水平。在上述方面的其它優(yōu)選實(shí)施方案中，VEGF或P1GF的水平是游離的VEGF或PlGF的水平。
另一方面，本發(fā)明提供一種診斷被試者患有先兆子癇或子癇，或具有發(fā)展先兆子癇或子癇傾向的方法。該方法包括測(cè)量被試者樣品中的sFlt-1、VEGF或P1GF核酸分子水平，并把它與參照樣品進(jìn)行比較，其中該水平的改變可診斷被試者的先兆子癇或子癇，或診斷發(fā)展先兆子癇或子癇的傾向。
另一方面，本發(fā)明提供一種診斷被試者患有先兆子癇或子癇，或具有發(fā)展先兆子癇或子癇傾向的方法。該方法包括測(cè)定被試者中sFlt-1、VEGF或P1GF基因的核酸序列，并把它與參照序列進(jìn)行比較，其中被試者核酸序列的改變是被試者中基因產(chǎn)物水平的改變，可診斷患有先兆子癇或子癇的被試者，或發(fā)展先兆子癇或子癇的傾向。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，所述改變是核酸序列多態(tài)性。
在上述方面的各實(shí)施方案中，所述樣品是被試者的體液(例如，尿液、羊水、血清、血漿或腦脊液)，其中sFlt-1、VEGR或P1GF可正常檢測(cè)。在其它實(shí)施方案中，所述樣品是組織或細(xì)胞。非限制性例子包括胎盤(pán)組織或胎盤(pán)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞(例如，單核細(xì)胞)。在上述方面的其它實(shí)施方案中，被試者是未懷孕的人、懷孕的人、或產(chǎn)后的人。在上述方面的其它實(shí)施方案中，被試者是非-人類(lèi)(例如，牛、馬、綿羊、豬、山羊、狗、或貓)。在上述方面的其它實(shí)施方案中，至少一種所測(cè)量水平是sFlt-1(游離的、結(jié)合的或總的)的水平。在上述方面的其它實(shí)施方案中，在測(cè)量VEGF水平時(shí)，還測(cè)量了sFlt-1或PlGF的水平。在上述方面的各實(shí)施方案中，sFlt-1核酸或多肽水平相對(duì)于對(duì)照的提高是先兆子癇或子癇的診斷指標(biāo)。在上述方面的其它實(shí)施方案中，游離VEGF多肽或VEGF核酸水平相對(duì)于對(duì)照的降低是先兆子癇或子癇的診斷指標(biāo)。在上述方面的其它實(shí)施方案中，游離PlGF多肽或PlGF核酸水平相對(duì)于對(duì)照的降低是先兆子癇或子癇的診斷指標(biāo)。
在上述方面的其它實(shí)施方案中，兩次或多次測(cè)量所述水平，而測(cè)量之間水平的改變是先兆子癇或子癇的診斷指標(biāo)。在其中一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，從第一次測(cè)量到下一次測(cè)量，sFlt-1的水平提高了。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，從第一次測(cè)量到下一次測(cè)量，VEGF或PlGF的水平降低了。
另一方面，本發(fā)明提供一種用于診斷被試者先兆子癇或子癇的診斷試劑盒，其中包含選自sFlt-1、VEGF及PlGF核酸分子的核酸序列或其片段，或與其互補(bǔ)的序列，或其任意組合。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑盒包含用于檢測(cè)sFlt-1、VEGF、或PlGF核酸分子的至少兩個(gè)探針。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種用于診斷被試者先兆子癇或子癇的試劑盒，它包含檢測(cè)sFlt-1、VEGF或PlGF多肽及其任意組合的工具。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)方法選自免疫學(xué)測(cè)定、酶測(cè)定以及比色測(cè)定。在上述方面的其它實(shí)施方案中，該試劑盒可診斷出懷孕或未懷孕的被試者發(fā)展先兆子癇或子癇的傾向。在上述方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑盒檢測(cè)sFlt-1或P1GF。在上述方面的其它優(yōu)選實(shí)施方案中，在試劑盒檢測(cè)VEGF時(shí)，還可檢測(cè)sFlt-1或PlGF。
另一方面，本發(fā)明提供一種鑒定可改善先兆子癇或子癇的化合物的方法，該方法包括使表達(dá)sFlt-1、VEGF或P1GF核酸分子的細(xì)胞與候選化合物接觸，并將核酸分子在與候選化合物接觸過(guò)的細(xì)胞中的表達(dá)水平和在沒(méi)有與候選化物接觸過(guò)的對(duì)照細(xì)胞中的表達(dá)水平進(jìn)行比較，其中sFlt-1、VEGF或P1GF核酸分子表達(dá)水平的改變可鑒定候選化合物為改善先兆子癇或子癇的化合物。
在其中一個(gè)實(shí)施方案中，所述改變是sFlt-1水平的降低。在其它實(shí)施方案中，所述改變是VEGF或PlGF水平的提高。在其它實(shí)施方案中，所述改變是轉(zhuǎn)錄或翻譯的改變。在另一實(shí)施方案中，當(dāng)所述方法鑒定出候選化合物可提高VEGF表達(dá)水平時(shí)，則該候選化合物還可提高PlGF的表達(dá)水平或降低sFlt-1的表達(dá)水平。
另一方面，本發(fā)明提供一種在藥學(xué)可接受的載體中配制的、含有VEGF或PlGF多肽或其一部分的藥物組合物。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種在藥學(xué)可接受的載體中配制的、含有PlGF核酸分子或其一部分的藥物組合物。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物還含有VEGF核酸分子或其一部分。
另一方面，本發(fā)明提供一種含有特異性結(jié)合sFlt-1的純化抗體或抗原結(jié)合片段的組合物。在其中一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體阻止生長(zhǎng)因子與sFlt-1結(jié)合。在另一實(shí)施方案中，所述抗體是單克隆抗體。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段是人類(lèi)抗體或人源化抗體。在其它實(shí)施方案中，所述抗體缺少Fc部分。在其它實(shí)施方案中，所述抗體是F(ab′)2、Fab、或Fv結(jié)構(gòu)。在其它實(shí)施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段存在于藥學(xué)可接受的載體中。
另一方面，本發(fā)明提供一種鑒定可改善先兆子癇或子癇的化合物的方法。該方法包括使表達(dá)sFlt-1、VEGF、或PlGF多肽的細(xì)胞與候選化合物接觸，并把多肽在與候選化合物接觸過(guò)的細(xì)胞中的表達(dá)水平和多肽在沒(méi)有與候選化合物接觸過(guò)的對(duì)照細(xì)胞中的表達(dá)水平進(jìn)行比較，其中sFlt-1、VEGF或PlGF多肽表達(dá)的改變可鑒定候選化合物為改善先兆子癇或子癇的化合物。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)的改變是利用免疫學(xué)測(cè)定法、酶測(cè)定法或免疫測(cè)定法測(cè)定的。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)的改變是sFlt-1水平的降低。在另一實(shí)施方案中，表達(dá)的改變是VEGF或PlGF水平的提高。
另一方面，本發(fā)明提供一種鑒定可改善先兆子癇或子癇的化合物的方法。該方法包括使表達(dá)sFlt-1、VEGF或PlGF多肽的細(xì)胞與候選化合物接觸，并將多肽在與候選化合物接觸過(guò)的細(xì)胞中的生物學(xué)活性和在沒(méi)有與候選化合物接觸過(guò)的對(duì)照細(xì)胞中的生物學(xué)活性水平進(jìn)行比較，其中sFlt-1、VEGF或P1GF多肽生物學(xué)活性的提高可鑒定該候選化合物為改善先兆子癇或子癇的化合物。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，生物學(xué)活性的提高是用免疫學(xué)測(cè)定法、酶測(cè)定法或免疫測(cè)定法測(cè)定的。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)的改變是sFlt-1活性的降低。在另一實(shí)施方案中，表達(dá)的改變是VEGF或PlGF活性的提高。
另一方面，本發(fā)明提供一種鑒定可改善先兆子癇或子癇的化合物的方法。該方法包括在有候選化合物存在的條件下檢測(cè)sFlt-1多肽與生長(zhǎng)因子之間的結(jié)合，其中相對(duì)于沒(méi)有候選化合物存在的條件下sFlt-1多肽與生長(zhǎng)因子之間的結(jié)合，所述結(jié)合的降低可鑒定該候選化合物為改善先兆子癇或子癇的化合物。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，所述生長(zhǎng)因子是VEGF。在另一實(shí)施方案中，所述生長(zhǎng)因子是PlGF。
另一方面，本發(fā)明提供一種鑒定可阻止sFlt-1多肽與生長(zhǎng)因子之間結(jié)合的多肽或其片段的方法。該方法包括檢測(cè)有候選多肽存在條件下的sFlt-1多肽與生長(zhǎng)因子之間的結(jié)合，其中相對(duì)于沒(méi)有候選多肽存在條件下的sFlt-1多肽與生長(zhǎng)因子之間的結(jié)合，所述結(jié)合的降低可鑒定該候選多肽為可阻止sFlt-1多肽與生長(zhǎng)因子之間結(jié)合的多肽。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，所述生長(zhǎng)因子為VEGF。在另一實(shí)施方案中，所述生長(zhǎng)因子為PlGF。
另一方面，本發(fā)明提供一種鑒定可改善先兆子癇或子癇的化合物的方法，包括檢測(cè)sFlt-1多肽與候選化合物的結(jié)合，其中結(jié)合sFlt-1多肽的化合物可改善先兆子癇或子癇。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種根據(jù)前述方面鑒定的化合物，其中所述化合物是特異性結(jié)合sFlt-1多肽且阻止sFlt-1多肽與VEGF或PlGF結(jié)合的多肽。在其中一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽是抗體。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽是sFlt-1、VEGF或P1GF的片段。
在上述方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，可改善先兆子癇或子癇的化合物可降低sFlt-1的表達(dá)水平或生物學(xué)活性。在上述方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，可改善先兆子癇或子癇的化合物可提高VEGF或PlGF的表達(dá)水平或生物學(xué)活性。
就本發(fā)明的目的而言，在現(xiàn)面定義了下列縮略語(yǔ)和術(shù)語(yǔ)。
“改變”是指通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的本領(lǐng)域已知的方法，如上面描述的那些檢測(cè)的基因或多肽表達(dá)水平的改變(提高或降低)。此處所用的，提高或降低包括表達(dá)水平10％的改變、優(yōu)選表達(dá)水平25％的改變、更優(yōu)選40％的改變、且最優(yōu)選50％或更大的改變?！案淖儭边€指本發(fā)明任一多肽(例如，sFlt-1、VEGF或P1GF)的生物學(xué)活性的改變(提高或降低)。PlGF或VEGF生物學(xué)活性的例子包括通過(guò)免疫測(cè)定法、配體結(jié)合測(cè)定法或斯卡查德圖分析測(cè)量的與受體的結(jié)合，以及通過(guò)BrdU標(biāo)記、細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)、或DNA合成的定量測(cè)定法，如3H-胸腺嘧啶核苷摻入測(cè)量的細(xì)胞增殖或遷移的誘導(dǎo)。sFlt-1生物學(xué)活性的例子包括通過(guò)免疫測(cè)定法、配體結(jié)合測(cè)定法或卡查德圖分析測(cè)量的與PlGF和VEGF的結(jié)合。此處描述了每種多肽生物學(xué)活性的其它例子。此處所用的提高或降低包括生物學(xué)活性的10％改變、優(yōu)選生物學(xué)活性的25％改變、更優(yōu)選40％改變、且最優(yōu)選50％或更大改變。
“反義核酸堿基寡聚物”是指核酸堿基寡聚物，不管多長(zhǎng)，其與sFlt-1基因的編碼鏈或mRNA互補(bǔ)?！昂怂釅A基寡聚物”是指包括至少8個(gè)核酸堿基、優(yōu)選至少12個(gè)、且最優(yōu)選至少16個(gè)堿基鏈的化合物，它們是通過(guò)鍵連接在一起的。包括在此定義中的是天然和非天然的寡核苷酸，修飾和未修飾的，以及寡核苷酸模擬物如蛋白核酸、閉鎖的核酸、以及阿拉伯核酸。很多核酸堿基和連接基團(tuán)都可用于本發(fā)明的核酸堿基寡聚物中，包括在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朜os.20030114412和20030114407中描述的那些，它們引入此處作為參考。所述核酸堿基寡聚物還可指向翻譯的起始和終止位點(diǎn)。優(yōu)選所述反義核酸堿基寡聚物包含約8-30個(gè)核苷酸。該反義核酸堿基寡聚物還可包含至少40、60、85、120或更多連續(xù)的核苷酸，它們與sFlt-1 mRNA或DNA互補(bǔ)，且可像全長(zhǎng)mRNA或基因一樣長(zhǎng)。
“化合物”是指任何小分子化學(xué)化合物、抗體、核酸分子、多肽、或其片段。
“嵌合抗體”是指至少含有與至少一部分其它蛋白相連的抗體分子的抗原結(jié)合部分的多肽(通常，免疫球蛋白的恒定結(jié)構(gòu)域)。
“雙鏈RNA(dsRNA)”是指由正義和反義鏈組成的核糖核酸分子。dsRNA通常用于介導(dǎo)RNA干擾。
“表達(dá)”是指通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的本領(lǐng)域已知的方法檢測(cè)基因或多肽。例如，多肽表達(dá)常常通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)，DNA表達(dá)常常通過(guò)DNA印跡或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)，而RNA表達(dá)常常通過(guò)RNA印跡、PCR、或RNA酶保護(hù)測(cè)定法檢測(cè)。
“片段”是指多肽或核酸分子的一部分。該部分包括，優(yōu)選，對(duì)照核酸分子或多肽整個(gè)長(zhǎng)度的至少10％、20％、30％、40％、50％、或60％。片段可包括10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000個(gè)核苷酸或氨基酸。
“同源的”是指就比較序列的長(zhǎng)度而言，具有與已知基因或蛋白序列至少30％同源性、更優(yōu)選40％、50％、60％、70％、80％，且最優(yōu)選90％或更高同源性的任何基因或蛋白序列?！巴葱浴钡鞍走€可具有比較蛋白的至少一種生物學(xué)活性。就多肽而言，比較序列的長(zhǎng)度通常為至少16個(gè)氨基酸、優(yōu)選至少20個(gè)氨基酸、更優(yōu)選至少25個(gè)氨基酸、且最優(yōu)選35個(gè)氨基酸或更多。就核酸而言，比較序列的長(zhǎng)度通常為至少50個(gè)核苷酸、優(yōu)選至少60個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少75個(gè)核苷酸、且最優(yōu)選至少110個(gè)核苷酸?！巴葱浴边€指用于產(chǎn)生抗體的表位與抗體針對(duì)的蛋白或片段之間的高度相似性。加入這樣的話，同源性是指足以引發(fā)特異性識(shí)別爭(zhēng)論蛋白的抗體產(chǎn)生的相似性。
“人源化抗體”是指能夠結(jié)合預(yù)定抗原的免疫球蛋白氨基酸序列變體或其片段。通常，所述抗體包含兩個(gè)輕鏈以及至少一個(gè)重鏈的可變結(jié)構(gòu)域。所述抗體還包括重鏈的CH1、鉸鏈區(qū)、CH2、CH3、或CH4區(qū)。所述人源化抗體包括主要具有人免疫球蛋白氨基酸序列的構(gòu)架區(qū)(FR)以及主要具有非-人類(lèi)免疫球蛋白氨基酸序列(“輸入”序列)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。
通常，人源化抗體具有引入其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，其來(lái)源是非-人類(lèi)。通常，人源化抗體基本上包含至少一個(gè)、且通常兩個(gè)，可變結(jié)構(gòu)域(Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc、Fv)的全部，其中全部或基本上全部CDR區(qū)與非人類(lèi)免疫球蛋白的那些相對(duì)應(yīng)且全部或基本上全部FR區(qū)是人免疫球蛋白共有序列的那些。所述人源化抗體最優(yōu)選包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的一部分，通常是人免疫球蛋白恒定區(qū)的一部分。
“互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)”是指每個(gè)免疫球蛋白的輕鏈和重鏈內(nèi)，可變區(qū)中的三個(gè)高變序列。
“構(gòu)架區(qū)(FR)”是指位于免疫球蛋白輕鏈和重鏈的三個(gè)高變序列(CDR)任何一側(cè)上的氨基酸序列。
人源化抗體的FR和CDR區(qū)無(wú)需與親代序列準(zhǔn)確對(duì)應(yīng)，例如，輸入CDR或共有FR可通過(guò)至少一個(gè)殘基的置換、插入或缺失而被誘變，這樣該位點(diǎn)的CDR或FR殘基不與共有或輸入抗體相對(duì)應(yīng)。這種突變，然而，不會(huì)不會(huì)擴(kuò)展。通常，至少75％、優(yōu)選90％、且最優(yōu)選95％的人源化抗體殘基與親代FR和CDR序列的那些相對(duì)應(yīng)。
“雜交”是指在各種嚴(yán)格條件下，在互補(bǔ)多核苷酸序列或其一部分之間形成雙鏈分子的對(duì)(見(jiàn)，例如，Wahl和Berger(1987)MethodsEnzymol.152399；Kimmel，Methods Enzymol.152507，1987)。例如，嚴(yán)格的鹽濃度通常低于約750mM NaCl和75mM檸檬酸三鈉，優(yōu)選低于約500mM NaCl和50mM檸檬酸三鈉，且最優(yōu)選低于約250mM NaCl和25mM檸檬酸三鈉。嚴(yán)格性差的雜交可在沒(méi)有有機(jī)溶劑，例如甲酰胺存在的條件下獲得，而嚴(yán)格雜交可在有至少約30％甲酰胺，且最優(yōu)選至少約50％甲酰胺存在的條件下獲得。嚴(yán)格的溫度條件通常包括至少約30℃，更優(yōu)選至少約37℃，且最優(yōu)選至少約42℃的溫度。各種其它參數(shù)，如雜交時(shí)間，洗滌劑，例如十二烷基硫酸鈉(SDS)的濃度，以及是否包括載體DNA都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。各種嚴(yán)格水平是通過(guò)根據(jù)需要把這些不同條件結(jié)合完成的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，雜交是30℃下，在750mM NaCl、75mM檸檬酸三鈉和1％SDS中進(jìn)行的。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，雜交是37℃下，在500mM NaCl、50mM檸檬酸三鈉、1％SDS、35％甲酰胺和100μg/ml變性鮭精DNA(ssDNA)中進(jìn)行的。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，雜交是42℃下，在250mM NaCl、25mM檸檬酸三鈉、1％SDS、50％甲酰胺、和200μg/ml ssDNA中進(jìn)行的。這些條件的有效改變對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
對(duì)于絕大多數(shù)應(yīng)用而言，雜交之后的洗滌步驟還可根據(jù)嚴(yán)格程度不同而改變。洗滌的嚴(yán)格條件可由鹽濃度和溫度來(lái)限定。如上所述，洗滌的嚴(yán)格程度可通過(guò)降低鹽濃度或提高溫度來(lái)提高。例如，洗滌步驟的嚴(yán)格鹽濃度優(yōu)選低于約30mM NaCl和3mM檸檬酸三鈉，且最優(yōu)選低于約15mM NaCl和1.5mM檸檬酸三鈉。洗滌步驟的嚴(yán)格溫度條件通常包括至少約25℃、更優(yōu)選至少約42℃、且最優(yōu)選至少約68℃的溫度。在優(yōu)選實(shí)施方案中，洗滌步驟在25℃下，30mM NaCl、3mM檸檬酸三鈉和0.1％SDS中進(jìn)行。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，洗滌步驟在42℃下，15mM NaCl、1.5mM檸檬酸三鈉和0.1％SDS中進(jìn)行。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，洗滌步驟在68℃下，15mM NaCl、1.5mM檸檬酸三鈉和0.1％SDS中進(jìn)行。這些條件的其它改變對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。雜交技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的且在下面描述，例如Benton和Davis(Science 196180，1977)；Grunstein和Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 723961，1975)；Ausubel等人(Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience，NewYork，2001)；Berger和Kimmel(Guide to Molecular CloningTechniques，1987，Academic Press，New York)；和Sambrook等人，Molecular CloizingA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York。
“子宮內(nèi)生長(zhǎng)停滯(IUGR)”是指導(dǎo)致出生重量相對(duì)于胎兒孕齡的預(yù)測(cè)胎兒重量低10％的綜合征。目前世界衛(wèi)生組織有關(guān)低出生重量的標(biāo)準(zhǔn)是重量低于2,500gm(5lbs.8oz.)或與美國(guó)根據(jù)有關(guān)種族、經(jīng)產(chǎn)情況和嬰兒性別，相對(duì)于孕齡制訂的出生重量表格低于10％(Zhang和Bowes，Obstet.Gynecol 86200-208，1995)。這些低出生重量的嬰兒還被稱(chēng)作“孕齡小(SGA)”。已知先兆子癇是與IUGR或SGA有關(guān)的病癥。
“度量”是指一種測(cè)量。度量可用于，例如，比較目標(biāo)多肽或核酸分子的水平。舉例性的度量包括但不限于，數(shù)學(xué)公式或算法，如比例。所用度量可最好地區(qū)別患有先兆子癇或子癇的被試者與正常對(duì)照被試者之間的sFlt-1、VEGF、或PlGF水平。根據(jù)所用度量不同，子癇或先兆子癇的診斷指標(biāo)可明顯高于或低于對(duì)照值(例如，與未患先兆子癇或子癇的對(duì)照患者相比)。
sFlt-1水平是通過(guò)測(cè)量游離的、結(jié)合的(即與生長(zhǎng)因子結(jié)合的)、或總的sFlt-1(結(jié)合的+游離的)量而測(cè)量的。VEGF或P1GF水平是通過(guò)測(cè)量游離的PlGF或游離的VEGF(即，未與sFlt-1結(jié)合)的量而測(cè)定的。其中一個(gè)舉例性的度量是[sFlt-l/(VEGF+P1GF)]，也被稱(chēng)作先兆子癇抗-血管生成指數(shù)(PAAI)。
“先兆子癇抗-血管生成指數(shù)(PAAI)”是指用作抗-血管生成活性指標(biāo)的sFlt-1/VEGF+P1GF的比例。大于20的PAAI被認(rèn)為可指示先兆子癇或有患先兆子癇的危險(xiǎn)。
“可操縱連接”是指在適宜的分子(例如，轉(zhuǎn)錄激活蛋白)與調(diào)節(jié)序列結(jié)合時(shí)，基因和調(diào)節(jié)序列以允許基因表達(dá)的方式連接。
“藥學(xué)可接受的載體”是指對(duì)于所治療的哺乳動(dòng)物而言是生理學(xué)可接受的且仍然保留了所給予化合物的治療性的載體。其中一個(gè)舉例性的藥學(xué)可接受的載體物質(zhì)是生理鹽水。其它生理可接受的載體和它們的制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的且在下列文獻(xiàn)中描述，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，(第20版)，ed.A.Gennaro，2000，Lippincott，Williams&Wilkins，Philadelphia，PA。
“胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PlGF)”是指哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)因子，它與Genebank登記號(hào)P49763限定的蛋白同源且具有PlGF生物學(xué)活性。P1GF是屬于VEGF家族的糖基化同型二聚體且可通過(guò)選擇性剪接機(jī)理在兩個(gè)不同的同種型中發(fā)現(xiàn)。P1GF被胎盤(pán)中的細(xì)胞-及合胞體滋養(yǎng)層表達(dá)，且PlGF生物學(xué)活性包括內(nèi)皮細(xì)胞，特別是滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移、及活化的誘導(dǎo)。
“先兆子癇”是指多-系統(tǒng)疾病，其特征在于具有蛋白尿或水腫、或兩者、腎小球功能異常、腦水腫、肝水腫、或凝血異常的高血壓，這是由于懷孕或新近懷孕的影響。先兆子癇通常發(fā)生在妊娠第20周后。先兆子癇通常被定義為下列癥狀的一些組合(1)妊娠20周后，收縮壓(BP)＞140mmHg且舒張BP＞90mmHg(通常測(cè)量2次，間隔4-168小時(shí))，(2)新發(fā)生的蛋白尿(利用測(cè)驗(yàn)片進(jìn)行尿液分析為1+，24-小時(shí)尿液收集品中的蛋白＞300mg，或單次隨機(jī)的尿液樣品的蛋白/肌酐比例＞0.3)，和(3)產(chǎn)后12周高血壓及蛋白尿消失。嚴(yán)重的先兆子癇通常被定義為(1)舒張BP＞110mmHg(通常測(cè)量2次，間隔4-168小時(shí))或(2)蛋白尿，其特征在于24-小時(shí)尿液收集品中的蛋白測(cè)量值為3.5g或更高，或利用測(cè)驗(yàn)片測(cè)量，2份隨機(jī)的尿液樣品具有至少3+蛋白。在先兆子癇中，高血壓和蛋白尿通常彼此在7天內(nèi)發(fā)生。在嚴(yán)重的先兆子癇中，可同時(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重的高血壓、嚴(yán)重的蛋白尿和HELLP綜合征(溶血、肝酶升高、血小板較低)或子癇或每次僅出現(xiàn)一個(gè)癥狀。有時(shí)候，嚴(yán)重的先兆子癇可導(dǎo)致癲癇發(fā)生進(jìn)一步發(fā)展。這種嚴(yán)重的綜合征形式被稱(chēng)作“子癇”。子癇還可包括若干器官或組織，如肝臟(例如，肝細(xì)胞損害、門(mén)靜脈周壞死)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(例如，腦水腫和腦出血)的功能異?；驌p害。癲癇發(fā)生的病因被認(rèn)為繼發(fā)于腦水腫和腎臟小血管病灶痙攣。
“蛋白”或“多肽”或“多肽片段”是指任何多于2個(gè)氨基酸的鏈，不管翻譯后的修飾(例如，糖基化或磷酸化)，構(gòu)成天然存在的多肽或肽的全部或一部分，或構(gòu)成非天然存在的多肽或肽。
“降低或抑制”是指通過(guò)前述測(cè)定法(見(jiàn)“表達(dá)”)檢測(cè)的，與沒(méi)用RNA干擾所用的反義核酸堿基寡聚物或dsRNA處理過(guò)的樣品相比，引起蛋白或核酸水平整體降低優(yōu)選20％或更多、更優(yōu)選50％或更多、且最優(yōu)選75％或更多的能力。
“小分子干擾RNA(siRNA)”是指分離的dsRNA分子，優(yōu)選長(zhǎng)度超過(guò)10個(gè)核苷酸，更優(yōu)選長(zhǎng)度超過(guò)15個(gè)核苷酸，且最優(yōu)選長(zhǎng)度超過(guò)19個(gè)核苷酸，其用于鑒定將要降解的靶基因或mRNA。19-25個(gè)核苷酸是siRNA的最優(yōu)選大小。siRNA還可包括短發(fā)夾RNA，其中siRNA雙螺旋的兩個(gè)鏈包括在單一的RNA分子中。siRNA包括任何形式的dsRNA(較大的dsRNA、部分純化的RNA、基本純的RNA、合成RNA、重組產(chǎn)生的RNA的蛋白酶裂解產(chǎn)物)以及不同于天然存在的RNA、通過(guò)一個(gè)或多個(gè)核苷酸的添加、缺失、置換和/或改變而被改變的RNA。這種改變可包括非-核苷酸物質(zhì)的添加，例如向21 to 23 nt RNA的末端添加或內(nèi)部添加(在RNA的一個(gè)或多個(gè)核苷酸上)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述RNA分子包含3′羥基。本發(fā)明RNA分子中的核苷酸還可包括無(wú)鏈的核苷酸，包括非天然存在的核苷酸或脫氧核糖核苷酸。共同地，所有這種改變過(guò)的RNA被稱(chēng)作RNA的類(lèi)似物。本發(fā)明的siRNA只需與天然RNA充分相似，它具有介導(dǎo)RNA干擾(RNAi)的能力。此處所用的RNAi是指通過(guò)在細(xì)胞或生物中引入小分子干擾RNA或dsRNA所致的特異性mRNA分子的ATP-依賴性靶向裂解和降解。此處所用的“介導(dǎo)RNAi”是指區(qū)別或鑒定所降解RNA的能力。
“可溶性Flt-1(sFlt-1)”(也稱(chēng)作VEGF-R1)是指可溶性形式的Flt-1受體，其與Genebank登記號(hào)U01134定義的蛋白同源，且具有sFlt-1生物學(xué)活性。sFlt-1多肽的生物學(xué)活性可使用任何標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定，例如，通過(guò)測(cè)定與VEGF結(jié)合的sFlt-1。sFlt-1缺少Flt-1受體的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。sFlt-1可以高親和性結(jié)合VEGF和PlGF，但不能誘導(dǎo)增殖或血管生成，且因此與Flt-1和KDR受體在功能上有所不同。sFlt-1最初是從人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞純化的且隨后顯示出在體內(nèi)由滋養(yǎng)層細(xì)胞產(chǎn)生。此處所用sFlt-1包括任何sFlt-1家族成員或同種型。
“特異性結(jié)合”是指識(shí)別并結(jié)合本發(fā)明多肽但基本上不識(shí)別并結(jié)合樣品，例如生物學(xué)樣品中其它分子的化合物或抗體，其自然包括本發(fā)明多肽。其中一個(gè)例子是特異性結(jié)合sFlt-1但不結(jié)合Flt-1的抗體。
“被試者”是指哺乳動(dòng)物，包括但不限于，人類(lèi)或除人類(lèi)以外的哺乳動(dòng)物，如牛、馬、狗、羊或貓。包括在該定義中的是懷孕、產(chǎn)后和未懷孕的哺乳動(dòng)物。
“基本上相同”是指僅僅由于保守氨基酸置換而不同的氨基酸序列，例如，用一個(gè)氨基酸置換相同種類(lèi)的另一氨基酸(例如，用纈氨酸置換甘氨酸，用精氨酸置換賴氨酸等)或位于不會(huì)破壞蛋白功能的氨基酸序列位置上的一個(gè)或多個(gè)非-保守置換、缺失或插入。優(yōu)選，所述氨基酸序列與另一氨基酸序列至少70％、更優(yōu)選至少約80％、且最優(yōu)選至少約90％同源。測(cè)定同一性的方法可在公共可得到的計(jì)算機(jī)程序中實(shí)現(xiàn)。測(cè)定兩個(gè)序列之間同一性的計(jì)算機(jī)程序方法包括，但不限于，GCG程序包(Devereux等人，Nucleic Acids Research 12387，1984)、BLASTP、BLASTN、和FASTA(Altschul等人，J.Mol.Biol.215403(1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于測(cè)定同一性。BLAST程序可從NCBI和其它來(lái)源公開(kāi)得到(BLAST Manual，Altschul等人，NCBI NLM NIH，Bethesda，MD 20894；BLAST 2.0，http//www.nobi.nlm.nih.gov/blast/)。這些軟件程序通過(guò)排列與各種置換、缺失和其它修飾的同源性程度而匹配相似的序列。保守置換通常包括下列組內(nèi)的置換甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天門(mén)冬氨酸、谷氨酸、天門(mén)冬酰胺、谷酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。
“先兆子癇的癥狀”是指下列任何一個(gè)(1)妊娠20周后，收縮壓(BP)＞140mmHg且舒張BP＞90mmHg，(2)新發(fā)生的蛋白尿(利用測(cè)驗(yàn)片進(jìn)行尿液分析為1+，24小時(shí)尿液收集品中的蛋白＞300mg，或隨機(jī)尿液的蛋白/肌酐比＞0.3)，和(3)產(chǎn)后12周高血壓及蛋白尿消失。先兆子癇的癥狀還可包括腎功能異常和腎小球內(nèi)皮增生或肥大?！白影B的癥狀”是指由于懷孕或新近懷孕所致的下列癥狀中任何一個(gè)的發(fā)展癲癇發(fā)生、昏迷、血小板減少癥、肝水腫、肺水腫和腦水腫。
“治療量”是指給予患有先兆子癇或子癇的患者時(shí)，足以引起此處所述先兆子癇或子癇癥狀的定性或定量減輕的用量?！爸委熈俊边€指當(dāng)給予患有先兆子癇或子癇的患者時(shí)，通過(guò)此處所述的測(cè)定法測(cè)量，足以引起sFlt-1表達(dá)水平降低或VEGF或PlGF表達(dá)水平提高的用量。
“治療”是指為了預(yù)防和/或治療的目的，給予化合物或藥物組合物?！爸委熂膊　被颉爸委熜蕴幚怼笔侵附o已經(jīng)患病的被試者進(jìn)行治療以改善被試者狀況。優(yōu)選，以下述任何一個(gè)特征癥狀的鑒定為基礎(chǔ)或使用此處所述的診斷方法，診斷被試者是否患有先兆子癇或子癇?！邦A(yù)防疾病”是指還沒(méi)有發(fā)病，但被懷疑，或有發(fā)展特定疾病危險(xiǎn)的被試者的預(yù)防性處理。優(yōu)選，使用此處所述的診斷方法確定被試者是否有發(fā)展先兆子癇或子癇的危險(xiǎn)。因此，在權(quán)利要求和實(shí)施方案中，治療是為了治療或預(yù)防目的而對(duì)哺乳動(dòng)物給藥。
“滋養(yǎng)層”是指覆蓋胚泡的中外胚細(xì)胞層，胚泡可侵蝕子宮粘膜且胚胎通過(guò)它從母體接受營(yíng)養(yǎng)；該細(xì)胞有助于胎盤(pán)的形成。
“血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)”是指與下列文獻(xiàn)中定義的生長(zhǎng)因子同源的哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)因子美國(guó)專(zhuān)利號(hào)Nos.5,332,671；5,240,848；5,194,596；和Charnock-Jones等人(Biol.Reproductoion，481120-1128，1993)，且具有VEGF生物學(xué)活性。VEGF以糖基化同型二聚體的形式存在且包括至少4種不同的可選擇性剪接同種型。天然VEGF的生物學(xué)活性包括促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞或臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的選擇性生長(zhǎng)并誘導(dǎo)血管生成。正如此處所述，VEGF包括任何VEGF家族成員或同種型(例如，VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF189、VEGF165、或VEGF121)。優(yōu)選，VEGF是VEGF121或VEGF165同種型(Tischer等人，J.Biol.Chem.266，11947-11954，1991；Neufed等人，Cancer Metastasis 15153-158，1996)，其在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)Nos.6,447,768；5,219,739；和5,194,596中描述，它們引入此處作為參考。還包括VEGF的突變體形式，如在Gille等人(J.Biol.Chem.2763222-3230，2001)中描述的KDR-選擇性VEGF和Flt-選擇性VEGF。雖然優(yōu)選人的VEGF，但本發(fā)明不限于人類(lèi)的形式且包括VEGF的其它動(dòng)物形式(例如，小鼠、大鼠、狗、或小雞)。
“載體”是指DNA分子，通常來(lái)源于質(zhì)粒或噬菌體，其中可插入或克隆DNA片段。重組載體包括一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特的限制位點(diǎn)，且能夠在規(guī)定的宿主或載體生物中自主復(fù)制，這樣克隆序列就可再生了。載體包括與基因或編碼區(qū)可操縱連接的啟動(dòng)子這樣，轉(zhuǎn)染到受體細(xì)胞中后，就可表達(dá)RNA了。
從下列優(yōu)選實(shí)施方案以及權(quán)利要求的描述，可很容易地了解本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1表示sFlt-1在先兆子癇中的mRNA和蛋白表達(dá)。圖1A表示通過(guò)RNA印跡分析測(cè)定的，來(lái)源于3名先兆子癇患者(P1、P2、P3)和3名血壓正常的足月孕婦(N1、N2、N3)的胎盤(pán)sFlt-1的mRNA表達(dá)。上面的帶(7.5kb)是全長(zhǎng)flt-1 mRNA，而下面更豐富的帶(3.4kb)是可選擇性剪接的sFlt-1 mRNA。GAPDH作為對(duì)照包括在內(nèi)且箭頭表示28S RNA。患者P1和P2患有重度先兆子癇，而患者P3患有輕度先兆子癇。圖1B表示輕度先兆子癇(輕度PE)患者、重度先兆子癇(重度PE)患者以及血壓正常的足月孕婦血清中sFlt-1水平的圖形。sFlt-1水平是通過(guò)相對(duì)于sFlt-1進(jìn)行的ELISA測(cè)量的，其中使用可商業(yè)得到的試劑盒(R&D Systems，Minneapolis，MN)。由于其它原因在足月前分娩的患者(足月前)也包括在內(nèi)作為附加對(duì)照，以排除孕齡特異性改變。所試驗(yàn)的患者數(shù)在X軸的括號(hào)中表示。在分娩前(t＝0)和分娩后(t＝48)采集樣品。圖1C是表示分娩時(shí)抗-血管生成指數(shù)比例(PAAI＝sFlt-1/(VEGF+P1GF))的圖形，這是通過(guò)ELISA相對(duì)于圖1B中描述的所有患者測(cè)定的。
圖2A-2F是表示過(guò)量sFlt-1在先兆子癇中的抗-血管生成作用。內(nèi)皮管測(cè)定法是使用來(lái)源于4名正常孕婦對(duì)照和4名患有先兆子癇患者的血清進(jìn)行的。給出了1名正常對(duì)照和1名先兆子癇患者的代表性實(shí)驗(yàn)。圖2A、2B、和2C表示使用正?；颊哐暹M(jìn)行的測(cè)定，而圖2D、2E、和2F表示使用先兆子癇患者的血清進(jìn)行的測(cè)定。在圖2A中，t＝0(來(lái)源于足月正常孕婦的10％血清)；在圖2B中，t＝48(來(lái)源于分娩后48小時(shí)的正常孕婦的10％血清)；在圖2C中，t＝0+外源性sFlt-1(10ng/ml)；在圖2D中，t＝0(來(lái)源于分娩前先兆子癇婦女的10％血清)；在圖2E中，t＝48(來(lái)源于分娩后48小時(shí)先兆子癇婦女的10％血清)；在圖2F中，t＝0+外源性VEGF(10ng/ml)+P1GF(10ng/ml)。管測(cè)定法是定量的且平均管長(zhǎng)度+/-SEM在每組底部以像素表示。
圖3A和3B是表示sFlt-1對(duì)VEGF和PlGF誘導(dǎo)的腎微血管舒張的抑制的圖形。圖3A表示在3個(gè)不同劑量下測(cè)量的，大鼠腎小動(dòng)脈對(duì)sFlt-1(S)、VEGF(V)、PlGF(P)的舒張反應(yīng)的提高。V+和P+代表在有100ng/ml sFlt-1存在的條件下，各試劑的血管舒張反應(yīng)。所有實(shí)驗(yàn)是在6只不同的解剖過(guò)的大鼠腎微血管中進(jìn)行的，數(shù)據(jù)以平均值+/-SEM表示。*代表與單獨(dú)的各試劑相比，具有p＜0.01的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。圖3B表示生理學(xué)劑量下舒張反應(yīng)的提高VEGF 100pg/ml(V)、P1GF500pg/ml(P)、sFlt-1 10ng/ml(S)、VEGF(100pg/ml)+P1GF500pg/ml(V+P)或VEGF(100pg/ml)+P1GF 500pg/ml+sFlt-110ng/ml(V+P+S)。所有實(shí)驗(yàn)都是在6只不同的解剖過(guò)的大鼠腎微血管中進(jìn)行的且數(shù)據(jù)以平均值+/-SEM表示。*代表與V+P相比，具有p＜0.05的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
圖4A和4B表示腎小球內(nèi)皮增生的sFlt-1誘導(dǎo)。圖4A是表示與對(duì)照相比，在具有擴(kuò)大的腎小球和膨脹的胞質(zhì)的sFlt-1處理過(guò)的動(dòng)物中，毛細(xì)管閉塞的蘇木紫和曙紅(H&E)染色的顯微照片。具有起泡胞質(zhì)的“腎小球內(nèi)皮增生”在sFlt-1處理過(guò)的動(dòng)物中表示，其中進(jìn)行定期席夫酸(PAS)染色。所有淺的顯微照片都是在60X原始放大倍數(shù)下拍攝的。圖4B是sFlt-1處理過(guò)的腎小球電子顯微照片，它證實(shí)了內(nèi)皮毛細(xì)管細(xì)胞的胞質(zhì)膨脹。纖維蛋白的免疫熒光(IF)照片是在40X下拍攝的，EM照片是在2400X的原始放大倍數(shù)下拍攝的。所有照片在相同的放大倍數(shù)下是可再現(xiàn)的。
圖5A-5C表示先兆子癇發(fā)生之前和之后，依據(jù)孕齡測(cè)量的sFlt-1水平。圖5A是表示血壓正常的對(duì)照(具有空心三角形的較淺的線)、先兆子癇之前的病例(實(shí)心圓形)、和先兆子癇之后的病例-分娩前4-5周孕齡窗口內(nèi)的“終點(diǎn)”樣品(實(shí)心正方形)的平均血清濃度pg/ml的曲線圖。括號(hào)表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。星號(hào)表示對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，相對(duì)于相同孕齡窗口內(nèi)的參照樣品的顯著性差異*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001。圖5B是表示在先兆子癇發(fā)生前以周為間隔的時(shí)間內(nèi)，先兆子癇發(fā)生之前和之后病例的sFlt-1平均血清濃度pg/ml的曲線圖。PE表示43份樣品的算術(shù)平均值(在先兆子癇發(fā)生時(shí)或發(fā)生后獲得的)。平均孕齡(天)在下面每個(gè)時(shí)間間隔下用圓括號(hào)表示。水平線表示終點(diǎn)樣品水平。垂直線區(qū)分先兆子癇前的周期≤5周。圖5C是表示以孕齡為窗口表示sFlt-1平均血清濃度pg/ml的曲線圖，其中包括血壓正常的對(duì)照和先兆子癇之前的病例，排除了先兆子癇發(fā)生5周內(nèi)獲得的樣品。沒(méi)有顯著性差異。
圖6A-6C表示按孕齡，先兆子癇之前和之后的PlGF水平。圖6A是表示分娩和生產(chǎn)之前獲得的所有樣品的PlGF水平的曲線圖。方括號(hào)表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。星號(hào)表示進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，相對(duì)于同一時(shí)間間隔內(nèi)的參照樣品的顯著性差異**p＜0.01、***p＜0.001。圖6B是表示在先兆子癇發(fā)生前以周為間隔的時(shí)間內(nèi)，先兆子癇發(fā)生之前和之后的病例PlGF平均血清濃度pg/ml的曲線圖。PE表示43份終點(diǎn)樣品的算術(shù)平均值(先兆子癇發(fā)生時(shí)或發(fā)生之后獲得的)。平均孕齡(天)在每個(gè)時(shí)間間隔下面的圓括號(hào)中表示。水平線表示終點(diǎn)樣品的水平。垂直線表示先兆子癇發(fā)生之前的周期≤5周。圖6C是表示以孕齡為窗口，PlGF的平均血清濃度pg/ml，其中包括血壓正常的對(duì)照和先兆子癇發(fā)生的病例。
圖7A和7B表示根據(jù)先兆子癇的狀況和嚴(yán)重程度，sFlt-1和P1GF的水平。圖7A是表示妊娠第23-32周時(shí)，sFlt-1(黑條)和P1GF(白條)的算術(shù)平均血清濃度，其中包括對(duì)照和下列病例(臨床疾病發(fā)生前)患有輕度先兆子癇、重度先兆子癇、發(fā)生＜37周的先兆子癇、嬰兒孕齡較小(SGA)的先兆子癇、和發(fā)生＜34周的先兆子癇。在下面每對(duì)欄下記錄了樣品數(shù)。對(duì)孕齡和體重指數(shù)的校正導(dǎo)致微小改變，但不會(huì)影響顯著性水平。圖7B是表示妊娠第33-41周時(shí)，sFlt(黑條)和PlGF(白條)算術(shù)平均血清濃度的曲線圖，其中包括對(duì)照和下列病例(臨床疾病發(fā)生前)患有輕度先兆子癇、重度先兆子癇、發(fā)生＜37周的先兆子癇、具有SGA嬰兒的先兆子癇。在下面每對(duì)欄下記錄了樣品數(shù)。對(duì)孕齡和體重指數(shù)的校正導(dǎo)致微小改變，但不會(huì)影響顯著性水平。
詳述我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在從先兆子癇婦女采集的血清樣品中sFlt-1水平提高。sFlt-1以高親和性結(jié)合VEGF和P1GF并阻斷這些生長(zhǎng)因子的促分裂和血管生成活性。因此，sFlt-1是先兆子癇極好的診斷標(biāo)記，且VEGF和PlGF可用于治療先兆子癇。此外，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)干擾sFlt-1與純化VEGF或PlGF結(jié)合的治療劑、或提高生物活性的VEGF或PlGF水平的藥劑可用于治療或預(yù)防被試者的先兆子癇或子癇。這類(lèi)藥劑包括，但不限于，降低sFlt-1水平的sFlt-1抗體、反義或RNAi的寡核苷酸，提高VEGF或PlGF水平的化合物，以及結(jié)合sFlt-1并阻斷生長(zhǎng)因子結(jié)合位點(diǎn)的小分子。本發(fā)明還提供用于測(cè)量生長(zhǎng)因子水平的方法；可用作早期檢測(cè)先兆子癇或發(fā)展先兆子癇或子癇的危險(xiǎn)增加的診斷工具的方法。
而此處提供的詳細(xì)描述特別涉及sFlt-1、VEGF、或PlGF，該詳述還可用于sFlt-1、VEGF、或PlGF家族的成員、同種型、和/或變體、以及結(jié)合sFlt-1的生長(zhǎng)因子對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。下列實(shí)施例用于舉例說(shuō)明本發(fā)明，而不能被解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1.先兆子癇孕婦中的sFlt-1 mRNA和蛋白水平提高在鑒定新的分泌因子的嘗試中，該分泌因子在先兆子癇中發(fā)揮病理學(xué)作用，我們使用Affymetrix U95A微排列晶片完成了患有或沒(méi)有先兆子癇婦女的胎盤(pán)組織的基因表達(dá)分布。我們發(fā)現(xiàn)sFlt-1的基因在患先兆子癇的婦女中被正調(diào)節(jié)。
為了證實(shí)sFlt-1在先兆子癇中的正調(diào)節(jié)，我們進(jìn)行RNA印跡以分析胎盤(pán)sFlt-1 mRNA水平(圖1A)并進(jìn)行ELISA測(cè)定以測(cè)量先兆子癇孕婦中sFlt-1的血清蛋白水平(圖1B)，并與血壓正常的孕婦進(jìn)行比較。先兆子癇被定義為(1)妊娠20周后，收縮壓(BP)＞140mmHg且舒張BP＞90mmHg，(2)新發(fā)生的蛋白尿(利用測(cè)驗(yàn)片進(jìn)行尿液分析為1+，24小時(shí)尿液收集品中的蛋白＞300mg，或隨機(jī)的尿蛋白/肌酐比例＞0.3，和(3)產(chǎn)后12周，高血壓及蛋白尿消失。排除潛在的高血壓、蛋白尿、或腎病患者。以是否存在腎臟范圍的蛋白尿(24小時(shí)尿液收集品中的蛋白＞3g或尿蛋白/肌酐比例大于3.0)為基礎(chǔ)，將患者分成輕度先兆子癇和重度先兆子癇。輕度先兆子癇組中的平均尿蛋白/肌酐比例為0.94+/-0.2，而重度先兆子癇組為7.8+/-2.1。各組的平均孕齡如下正常38.8+/-0.2周、輕度先兆子癇34+/-1.2周、重度先兆子癇31.3+/-0.6周、和足月前29.5+/-2.0周。分娩后立即獲得胎盤(pán)樣品。從每個(gè)胎盤(pán)隨機(jī)采集4份樣品，然后放在RNA穩(wěn)定溶液(Ambion，Austin，TX)中并在-70℃貯藏。使用Qiagen RNAeasy Maxi Kit(Qiagen，Valencia，CA)進(jìn)行RNA分離。
我們檢測(cè)到與血壓正常的孕婦相比，在先兆子癇孕婦中，胎盤(pán)sFlt-1 mRNA和產(chǎn)婦的血清sFlt-1蛋白均提高了。與正常的對(duì)照孕婦相比，重度先兆子癇患者中sFlt-1的平均血清水平幾乎要高4倍。為了排除這種作用是由于先兆子癇病例孕齡較早的可能性，我們還測(cè)量了由于其它原因早產(chǎn)的孕齡匹配、血壓正常婦女的sFlt-1水平(孕齡23-26周)，我們發(fā)現(xiàn)與血壓正常的足月孕婦相比該組沒(méi)有顯著性差異。RNA印跡所用的探針是通過(guò)PCR獲得的，且在源于pUC118人flt-1 cDNA的編碼區(qū)中包括一個(gè)500bp的片段，及用作標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照的GAPDH cDNA。
在正常孕婦中，由胎盤(pán)分泌的促-和抗-血管生成因子之間存在著一種平衡，這是適當(dāng)胎盤(pán)發(fā)育所需的。我們假設(shè)在先兆子癇中，sFlt-1產(chǎn)生的提高和VEGF及PlGF產(chǎn)生的降低可改變有利于抗-血管生成的平衡。為了研究?jī)艨?血管生成活性，我們測(cè)量了VEGF和P1GF血清水平并發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照患者相比，先兆子癇患者的P1GF和VEGF血清水平更低(平均PlGF，235.3+/-45.3pg/ml對(duì)464+/-116.6pg/ml)，正如已經(jīng)描述過(guò)的(Tidwell等人，Am.J.Obstet.Gynecol.，1841267-1272，2001)。當(dāng)我們把sFlt-1、VEGF和PlGF水平引入到抗-血管生成指數(shù)或PAAI中時(shí)，作為凈抗-血管生成活性的指標(biāo)，我們發(fā)現(xiàn)我們可很清楚地將先兆子癇患者與正?；颊邊^(qū)別開(kāi)來(lái)且PAAI似乎與先兆子癇的嚴(yán)重程度有關(guān)(圖1C)。該P(yáng)AAI可用作檢測(cè)孕婦先兆子癇的診斷工具。
實(shí)施例2.在體外內(nèi)皮管測(cè)定法中，先兆子癇婦女的血清可抑制血管生成我們假設(shè)先兆子癇患者中的過(guò)量循環(huán)sFlt-1可引起內(nèi)皮功能異常并導(dǎo)致抗-血管生成狀態(tài)。為了解決這個(gè)問(wèn)題，我們使用內(nèi)皮管測(cè)定法作為血管生成的體外模型。將生長(zhǎng)因子減少的Matrigel(7mg/mL，Collaborative Biomedical Products，Bedford，MA)放在預(yù)冷的48孔細(xì)胞培養(yǎng)平板的孔(100μl/孔)中，37℃下培養(yǎng)25-30分鐘進(jìn)行聚合。用平板接種在涂有Matrigel孔上的10％患者血清處理通道3-5上的人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(30,000+，300μl沒(méi)有血清的內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基，Clonetics，Walkersville，MD)，并在37℃下培養(yǎng)12-16小時(shí)。然后通過(guò)倒置相差顯微鏡(Nikon Corporation，Tokyo，Japan)在4X下評(píng)價(jià)管的形成，使用Simple PCI成像分析軟件進(jìn)行定量分析(管的面積和總長(zhǎng)度)。
調(diào)節(jié)管形成測(cè)定法的條件，使正常的人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞僅在有外源性生長(zhǎng)因子，如VEGF存在的條件下形成管。在這些條件下，我們發(fā)現(xiàn)來(lái)源于血壓正常婦女的血清可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞形成規(guī)則的管-樣結(jié)構(gòu)，來(lái)源于先兆子癇婦女的血清抑制管的形成(圖2)。特別是產(chǎn)后48小時(shí)，這種抗-血管生成作用消失，表明先兆子癇患者的血清對(duì)管的抑制可能是由于胎盤(pán)釋放的循環(huán)因子所致。當(dāng)以和在先兆子癇患者中發(fā)現(xiàn)的那些相似的劑量將sFlt-1加入到血壓正常的血清中時(shí)，不會(huì)發(fā)生管的形成，類(lèi)似使用先兆子癇婦女血清見(jiàn)到的作用。當(dāng)把外源性VEGF和P1GF加入到使用先兆子癇血清的測(cè)定法中時(shí)，管的形成恢復(fù)(圖2)。重組人VEGF、人P1GF、和人Flt-l Fc用于這些測(cè)定法中。這些結(jié)果表明先兆子癇血清的抗-血管生成性是由于內(nèi)源性sFlt-1對(duì)VEGF和PlGF的拮抗作用。這些結(jié)果還表明加入純化VEGF和/或PlGF可逆轉(zhuǎn)或減輕先兆子癇的情況并可治療性使用。
實(shí)施例3.sFlt-1可抑制VEGF和P1GF誘導(dǎo)的腎微血管舒張sFlt-1在血管收縮中的成因作用是利用體外微血管反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)測(cè)定的。微血管反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)是按照先前所述，使用大鼠腎微血管進(jìn)行的(Sato等人，J.Surg.Res.，90138-143，2000)。使用10x-60x解剖顯微鏡(Olympus Optical，Tokyo，Japan)從大鼠腎臟解剖腎動(dòng)脈微血管(70-170μm內(nèi)徑)。將微血管放在單獨(dú)的微血管室中，用測(cè)量30-60μm直徑的雙玻璃微量吸管插管，并用10-0尼龍單絲縫線(Ethicon，Somerville，NJ)縫合。通過(guò)血管室及含有總共100ml溶液的貯器連續(xù)循環(huán)溫?zé)嶂?7℃的氧化(95％氧和5％二氧化碳)Krebs’緩沖溶液。使用填充了Kreb’s緩沖溶液的滴定管壓力計(jì)將血管加壓至40mmHg非流動(dòng)狀態(tài)。用與攝像機(jī)連接的倒置顯微鏡(40x-200x；Olympus CK2，Olympus Optical)，將血管的像投射在黑白電視監(jiān)測(cè)器上。電子維數(shù)分析器(Living System Instrumentation，Burlington，VT)用于測(cè)量?jī)?nèi)腔直徑。用帶狀圖表記錄器(Graphtec，Irvine，CA)記錄測(cè)量值。在進(jìn)行任何干預(yù)之前，將血管在微血管室中浸至少30分鐘。在所有實(shí)驗(yàn)組中，腎臟微血管的舒張反應(yīng)是在微血管預(yù)-收縮后，用U46619(血栓烷激動(dòng)劑)檢測(cè)的，在40mmHg的擴(kuò)張壓下達(dá)到它們基線直徑的40-60％。一旦達(dá)到穩(wěn)定的狀態(tài)，檢測(cè)VEGF、PlGF和sFlt-1對(duì)各種試劑的反應(yīng)。重組大鼠VEGF、小鼠P1GF和小鼠Flt-l Fc用于這些測(cè)定法。所有藥物都是腔外應(yīng)用的。當(dāng)反應(yīng)達(dá)到穩(wěn)定時(shí)進(jìn)行測(cè)量(通常是給藥后2-3分鐘)。對(duì)每個(gè)血管進(jìn)行1-4次干預(yù)。用Krebs’緩沖溶液洗滌血管并在干預(yù)之間，在沒(méi)有藥物的Krebs’緩沖溶液中平衡20-30分鐘。
我們發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的sFlt-1不會(huì)引起顯著的血管收縮，然而它可阻斷VEGF或PlGF誘導(dǎo)的血管收縮的劑量反應(yīng)性提高(圖3A)。此外，我們發(fā)現(xiàn)在孕婦中見(jiàn)到的生理學(xué)水平的VEGF和P1GF可誘導(dǎo)顯著的劑量依賴性小動(dòng)脈舒張，且該作用可通過(guò)加入10ng/ml sFlt-1而被阻斷，這是一種在重度先兆子癇婦女中觀察到的濃度(圖3B)。該結(jié)果表明先兆子癇患者中的循環(huán)sFlt-1可拮抗血管舒張，由此導(dǎo)致高血壓。這些結(jié)果可支持sFlt-1導(dǎo)致先兆子癇的許多臨床和病理學(xué)癥狀，包括高血壓的結(jié)論。通過(guò)定向抗體的使用所致的sFlt-1抑制，例如，可逆轉(zhuǎn)蛋白在先兆子癇婦女中的作用，且這種sFlt-1抑制劑可有效用作治療劑。
實(shí)施例4.sFlt-1在先兆子癇動(dòng)物模型中的作用以上述結(jié)果為基礎(chǔ)，我們假設(shè)加入外源性sFlt-1可在動(dòng)物模型中產(chǎn)生高血壓和蛋白尿。表達(dá)sFlt-1的腺病毒已經(jīng)顯示出可產(chǎn)生與顯著的抗-腫瘤活性有關(guān)的持續(xù)全身sFlt-1水平(Kuo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，984605-4610，2001)。將該編碼鼠sFlt-1的重組腺病毒注射到懷孕第8-9天的Sprague Dawley大鼠的尾部靜脈中。將相等劑量的編碼鼠Fc和sFlk1 Fc的腺病毒(小鼠VEGF受體1 Flkl胞外結(jié)構(gòu)域和Fc蛋白的融合蛋白)用作對(duì)照。Flkl已經(jīng)顯示出可結(jié)合VEGF，但不結(jié)合PlGF。因此，將sFlk-l Fc選作對(duì)照以幫助區(qū)別sFlt1的抗-VEGF活性與抗-PlGF活性。
通過(guò)尾部靜脈注射，給懷孕和未懷孕的Sprague-Dawley大鼠注射1×109pfu的Ad Fc、Ad sFlt-1、或Ad sFlk-1 Fc。這些腺病毒先前已經(jīng)描述過(guò)(Kuo等人，supra)且在Harvard Vector Core Laboratory生產(chǎn)。在懷孕第8-9天，給懷孕的大鼠注射腺病毒(早期中三月)并在懷孕第16-17天測(cè)量血壓(早期末三月)。在未懷孕的動(dòng)物中，在注射腺病毒后第8天測(cè)量BP。用戊巴比妥鈉(60mg/kg，i.p.)麻醉之后，測(cè)量大鼠的BP。分離頸動(dòng)脈并用與壓力傳感器(MillarInstruments，Houston，TX)相連的3-Fr高保真度微尖導(dǎo)管插管。將Millar Mikro-Tip導(dǎo)管插入到動(dòng)脈中記錄血壓。通過(guò)帶狀圖表記錄器(56-1X 40-006158型，Gould Instrument Systems，Cleveland，OH)記錄血壓和心率并求10分鐘時(shí)間內(nèi)的平均值。在安樂(lè)死之前得到血液、組織和尿液樣品。正如別處(Cohen等人，Kidney Intl.，451673-1679，1994)所述，利用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)片測(cè)量尿白蛋白，并通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性酶-聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISA)量化。尿肌酐是利用苦味酸比色方法試劑盒(Sigma，St.Louis，MO)測(cè)量的。我們測(cè)量了妊娠早期末三月的動(dòng)脈內(nèi)血壓，以模擬先兆子癇的自然病狀。這些實(shí)驗(yàn)還在未懷孕的雌性Sprague-Dawley大鼠中進(jìn)行以通過(guò)sFlt-1對(duì)胎盤(pán)的作用確定其作用是直接的還是間接的。測(cè)量血壓那天sFlt-1的全身水平是通過(guò)蛋白質(zhì)印跡加以證實(shí)的，測(cè)量BP那天，在各種sFlt-1處理過(guò)的動(dòng)物中的水平為25-350ng/mL。不同實(shí)驗(yàn)組的血壓和蛋白尿在表1中表示。
表1.大鼠的血壓和蛋白尿
給予懷孕(P)和未懷孕(NP)的大鼠表達(dá)Fc(對(duì)照)、sFlt-1、或sFlk-1Fc蛋白的腺病毒。平均動(dòng)脈血壓(MAP＝舒張+1/3脈壓，mmHg)±S.E.M和尿白蛋白∶Cr比例(mg白蛋白/g肌酐)±S.E.M是在8天后測(cè)量的，與懷孕大鼠的早期末三月相對(duì)應(yīng)。N＝每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的動(dòng)物數(shù)。*代表與對(duì)照組(Fc)相比，具有p＜0.01的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
與Fc對(duì)照相比，用sFlt-1處理過(guò)的懷孕大鼠具有顯著的高血壓和腎病范圍的蛋白尿。給予sFlt-1的未懷孕大鼠還可發(fā)展高血壓和蛋白尿。特別是，sFlk-Fc處理過(guò)的未懷孕大鼠發(fā)展了高血壓和蛋白尿，而sFlk-Fc處理過(guò)的懷孕大鼠則沒(méi)有。在懷孕時(shí)，因此，單獨(dú)VEGF的拮抗作用不足以產(chǎn)生先兆子癇，這可能是由于高水平PlGF的存在。在未懷孕的狀態(tài)下，當(dāng)PlGF事實(shí)上不存在時(shí)，單獨(dú)VEGF的拮抗作用足以破壞促/抗-血管生成平衡且產(chǎn)生和與先兆子癇相關(guān)的那些相似的腎病變。各種染色技術(shù)用于檢驗(yàn)在所有sFlt-1處理過(guò)的大鼠中觀察到的腎損害(圖4)。把從大鼠采集的腎臟固定在Bouin’s溶液中，切片并用H&E和PAS染料染色。就電子顯微鏡而言，將腎臟組織固定在戊二醛中，包埋在araldite-epon混合物中，切成超薄的腎切片(1μm)，并用甲苯藍(lán)染色，使用Zeiss EM 10在各種放大倍數(shù)下評(píng)價(jià)。腎小球內(nèi)纖維蛋白沉淀物的免疫熒光是使用多克隆抗-纖維蛋白抗體進(jìn)行的(ICN，Switzerland)。球形和擴(kuò)散的腎小球內(nèi)皮增生是通常在sFlt-1處理過(guò)的大鼠中觀察到的腎損害。我們通過(guò)內(nèi)皮毛細(xì)管細(xì)胞的膨脹和肥大檢測(cè)具有毛細(xì)管袢閉合的腎小球擴(kuò)大。在腎小球上皮細(xì)胞中可見(jiàn)到若干明顯的蛋白再吸收小滴。沒(méi)有觀察到節(jié)段性腎小球硬化癥。在腎小球內(nèi)見(jiàn)到纖維蛋白的分離“雙重輪廓”和病灶沉積。在沒(méi)有顯著的腎小球系膜插入的條件下，纖維蛋白沉積的這種發(fā)現(xiàn)與典型的人類(lèi)疾病產(chǎn)前階段描述的相似(Kincaid-Smith，Am.J.Kidney Dis.，17144-148，1991)。纖維蛋白的免疫熒光在sFlt-1處理過(guò)的動(dòng)物而不是Fc處理過(guò)的動(dòng)物的腎小球內(nèi)顯示出纖維蛋白沉積病灶。sFlkl處理過(guò)的未懷孕大鼠發(fā)展相同的損害。事實(shí)上，在與sFlt-1相同的水平下使用sFlk1時(shí)，未懷孕大鼠的腎損害更加嚴(yán)重，這是因?yàn)閟Flt-1拮抗的循環(huán)促-血管生成分子更少。這些結(jié)果表明sFlt-1水平的提高可導(dǎo)致與先兆子癇有關(guān)的腎小球內(nèi)皮增生，但這種作用與胎盤(pán)無(wú)關(guān)，這是因?yàn)樵谖磻言屑皯言械拇笫笾芯蓹z測(cè)到腎小球的改變。這些結(jié)果還表明VEGF和PlGF的拮抗作用在先兆子癇的病理學(xué)中較為重要，因?yàn)楫?dāng)PlGF水平較高時(shí)，在sFlk-1處理過(guò)的未懷孕小鼠中出現(xiàn)高血壓和蛋白尿，而在sFlk-1處理過(guò)的懷孕小鼠中則沒(méi)有。
此處建造的動(dòng)物模型可用作實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，從而測(cè)試新的治療化合物。有效治療化合物的功效以及藥理學(xué)和毒性均可使用該動(dòng)物模型進(jìn)行研究。
實(shí)施例5.sFlt-1在子癇動(dòng)物模型中的作用給處于妊娠早期中三月的懷孕大鼠注射外源性sFlt-1。然后對(duì)大鼠進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并在子癇發(fā)展的早期妊娠末三月進(jìn)行測(cè)試。檢測(cè)子癇所用的試驗(yàn)可包括用于水腫發(fā)展的大鼠腦MRI、用于癲癇發(fā)作的大鼠腦EEG、以及大鼠腦的組織學(xué)，從而使用特異性內(nèi)皮標(biāo)記測(cè)定沿著血腦屏障和脈絡(luò)叢是否已經(jīng)發(fā)生內(nèi)皮損害。
此處建立的動(dòng)物模型可用作實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，從而測(cè)試新的治療化合物。有效治療化合物的功效以及藥理學(xué)和毒性均可使用該動(dòng)物模型進(jìn)行研究。
實(shí)施例6尿液的PlGF/肌酐比例可診斷先兆子癇獲得妊娠第16周的10名婦女的尿液樣品(5名正常，4名輕度先兆子癇，1名重度先兆子癇)。這些樣品由Massachusetts GeneralHospital的Dr.Ravi Thadhani提供。正常孕婦的尿液平均游離PlGF/肌酐比例(pg PlGF/mg肌酐)為78+/-10.7，4名輕度先兆子癇為33+/-5.0，1名重度先兆子癇患者為17。因此，尿液中PlGF與肌酐比例的改變可用作患者先兆子癇的診斷指標(biāo)。
實(shí)施例7作為婦女先兆子癇和子癇診斷指標(biāo)的sFlt-1和P1GF蛋白水平就該項(xiàng)研究而言，我們使用Calcium for Preeclampsia Prevention試驗(yàn)的存檔樣品，分析血壓正常和先兆子癇孕婦中循環(huán)sFlt-1、游離PlGF、和游離VEGF的妊娠模式。Calcium for Pre-eclampsiaPrevention、或CPEP是在1992-1995進(jìn)行的隨機(jī)雙盲臨床試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)每日補(bǔ)充2g元素鈣或安慰劑對(duì)先兆子癇發(fā)生率和嚴(yán)重程度的作用(Levine等人，N.Engt.J.Med.37769-76，1997；Levine等人，ControlClin.Trials 17442-469，1996)。5名健康未經(jīng)產(chǎn)的婦女和妊娠13-21周的單身孕婦也加入美國(guó)醫(yī)療中心，直到產(chǎn)后24小時(shí)，其中使用通用的方案和相同的數(shù)據(jù)收集方式。登記時(shí)，所有CPEP參加者的血壓都＜135/85mmHg，且沒(méi)人患有腎功能異?；虻鞍啄颉Ｔ旋g是通過(guò)超聲檢查確定的。在加入到試驗(yàn)中前，獲得參與者的血清樣品(13-21周)，在第26-29周，在第36周，如果仍然懷孕，且在記錄高血壓或蛋白尿時(shí)。“終點(diǎn)樣品”是在先兆子癇癥狀和征兆發(fā)生時(shí)或發(fā)生后，但分娩和生產(chǎn)前獲得的樣品，正如別處所述(Levine等人，1996，supra)。CPEP試驗(yàn)的存檔血液樣品是通過(guò)與NIH的Dr.Richard Levine合作得到的。
參加者我們選擇具有完全輸出信息的被試者，血清樣品從＜22周的活產(chǎn)男性嬰兒獲得。在4,589名CPEP參加者中，我們排除了不能繼續(xù)進(jìn)行的253人，其中21人在20周前懷孕終止，13人遺漏了產(chǎn)婦或產(chǎn)期的輸出數(shù)據(jù)，4人沒(méi)有吸煙史，9人被圖表評(píng)論小組證實(shí)沒(méi)有高血壓，32人死產(chǎn)，剩下4,257名婦女具有合適的信息且活產(chǎn)。其中有2,156名男性嬰兒。排除了1名嬰兒染色體異常的婦女后，381人患有妊娠高血壓，43人沒(méi)有基準(zhǔn)血清樣品，剩下1,731名婦女。這些之中，175人在懷孕過(guò)程中發(fā)展先兆子癇且1,556人的血壓仍然保持正常。
因?yàn)殁}的補(bǔ)充對(duì)先兆子癇的危險(xiǎn)和嚴(yán)重程度沒(méi)有作用，且與促-和抗-血管生成分子的濃度無(wú)關(guān)，因此在與CPEP無(wú)關(guān)的情況下選擇病例和對(duì)照。相對(duì)于每個(gè)先兆子癇病例選擇一個(gè)血壓正常的對(duì)照，登記地點(diǎn)以及第一次采集血清樣品(1周內(nèi))時(shí)的孕齡以及-70℃下的冷凍貯存時(shí)間(12個(gè)月內(nèi))相匹配。隨機(jī)選擇120個(gè)匹配對(duì)(“病例”和“對(duì)照”)，分析分娩前獲得的全部657份血清樣品(表2，下面)。病例和對(duì)照第一次采集血清樣品時(shí)的平均孕齡分別為112.8和113.6天；冷凍貯存的平均持續(xù)時(shí)間為9.35和9.39年。
表2CPEP登記時(shí)病例和對(duì)照以及它們新生嬰兒的特征
除非另有說(shuō)明，否則為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差*p＜0.05**p＜0.01進(jìn)行此項(xiàng)研究時(shí)，高血壓被定義為以4-168小時(shí)為間隔測(cè)量?jī)纱?，舒張壓至少?0mmHg。重度高血壓被定義為以4-168小時(shí)為間隔測(cè)量?jī)纱危鎻垑褐辽贋?10mmHg，如果該婦女已經(jīng)接受了抗-高血壓治療，則測(cè)量一次時(shí)的舒張壓至少為110mmHg。蛋白尿被定義為在24-小時(shí)尿液收集中含300mg或更多蛋白，兩份間隔4-168小時(shí)的隨機(jī)尿液樣品通過(guò)測(cè)驗(yàn)片測(cè)量含至少1+蛋白，單一尿液樣品具有至少0.35的蛋白/肌酐比例，或單一隨機(jī)的尿液樣品通過(guò)測(cè)驗(yàn)片測(cè)量含至少2+蛋白。重度蛋白尿被診斷為24-小時(shí)尿液收集樣品含至少3.5g蛋白，或2份隨機(jī)的尿液樣品通過(guò)測(cè)驗(yàn)片測(cè)量具有至少3+蛋白。先兆子癇被定義為彼此7天內(nèi)出現(xiàn)高血壓和蛋白尿，重度先兆子癇被定義為具有重度高血壓、重度蛋白尿、HELLP綜合征(溶血、肝酶提高、血小板降低)、或子癇的先兆子癇。先兆子癇的發(fā)生是第一次檢測(cè)到血壓提高或尿液樣品中蛋白尿提高的時(shí)間，從而診斷先兆子癇。
孕齡較小(SGA)被定義為根據(jù)種族、經(jīng)產(chǎn)狀況、和嬰兒性別的不同，出生重量比US出生重量表低10％(Zhang和Bowes 1995，supra)。
過(guò)程測(cè)定法是在Beth Israel Deaconess Medical Center由不知道患者的診斷或其它相關(guān)信息的實(shí)驗(yàn)室工作人員進(jìn)行的。進(jìn)行分析的樣品是隨機(jī)安排的。按照制造商的說(shuō)明，使用從R&D Systems(Minneapolis，MN)購(gòu)買(mǎi)的試劑盒相對(duì)于人sFlt-1、游離PlGF、和游離VEGF進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)。將在-70℃貯存的血清樣品等分試樣融化至室溫，用BSA/Tris-緩沖生理鹽水稀釋?zhuān)⒃?6-孔平板中培養(yǎng)2小時(shí)，該平板已經(jīng)用sFlt-1、PlGF、或VEGF的捕獲抗體預(yù)先涂覆。然后將上述孔洗滌3次，與含有過(guò)氧化氫和四甲基聯(lián)苯胺的底物溶液培養(yǎng)20分鐘，并用2N硫酸終止反應(yīng)。測(cè)定450nm處(波長(zhǎng)校正550nm)的光密度。所有測(cè)定都是一式兩份進(jìn)行的。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度，標(biāo)準(zhǔn)曲線是從各重組蛋白的已知濃度得到的。如果兩份之間的差異超過(guò)25％，則重復(fù)測(cè)定并放棄原始結(jié)果。該測(cè)定法相對(duì)于sFlt-1、PlGF和VEGF分別具有5、7和5pg/ml的靈敏度，相對(duì)于sFlt-1具有7.6％和3.3％的測(cè)定間-和測(cè)定內(nèi)-變異系數(shù)，PlGF為11.2％和5.4％，VEGF為7.3％和5.4％。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析在分析產(chǎn)婦或嬰兒特征時(shí)使用卡方和t試驗(yàn)，從而分別比較絕對(duì)或連續(xù)變量。雖然在正文和附圖中給出了濃度的算術(shù)平均值，但除非另有說(shuō)明，統(tǒng)計(jì)學(xué)試驗(yàn)是在對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行的。校正是用對(duì)數(shù)回歸，相對(duì)于對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換濃度進(jìn)行的。
結(jié)果在120個(gè)病例之中，80人發(fā)展成輕度先兆子癇，40人發(fā)展成重度先兆子癇，包括3人具有HELLP綜合征，3人具有子癇。病例患者少于對(duì)照患者，具有較高的體重指數(shù)和較高的基礎(chǔ)血壓(表2)。此外，有很大比例的病例患者在懷孕時(shí)還具有足月前分娩或嬰兒孕齡較小(SGA)。病例患者為研究貢獻(xiàn)平均2.9份血清樣品；對(duì)照為2.6份樣品。
我們首次證實(shí)了與該CPEP研究組中妊娠匹配的對(duì)照相比，發(fā)病時(shí)，先兆子癇患者中sFlt-1、P1GF和VEGF均發(fā)生改變。與孕齡和前面公開(kāi)的報(bào)告相似的對(duì)照相比，在建立臨床先兆子癇時(shí)獲得樣品(終點(diǎn)樣品)的sFlt-1水平顯著提高，PlGF水平降低，且VEGF水平降低(在23個(gè)孕齡匹配對(duì)中，病例和對(duì)照分別為4382 vs.1643pg/ml，sFltl，p＜0.0001；137 vs.669pg/ml P1GF，p＜0.0001；6.41 vs.13.86pg/mlVEGF，p＝0.06)(Maynard等人，J.Clin.Invest.111649-658，2003)。
為了評(píng)價(jià)sFlt-1、PlGF和VEGF水平的妊娠模式，我們測(cè)量了各孕齡窗口內(nèi)的病例患者和對(duì)照患者血清樣品的循環(huán)sFlt-1、PlGF、和VEGF濃度。120名先兆子癇和120名對(duì)照婦女的sFlt-1蛋白的妊娠模式在圖5A中表示。對(duì)照患者的sFlt-1水平保持恒定直到33-36周，它們每周升高約145pg/ml直到分娩和生產(chǎn)。在出現(xiàn)臨床癥狀前的病例患者中，sFlt-1似乎在第21-24周時(shí)開(kāi)始急劇升高，并在第29-32周時(shí)與對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(圖5A)?？偟恼f(shuō)來(lái)，妊娠中，在臨床癥狀發(fā)生前測(cè)量的病例和對(duì)照患者之間的差異為17％(p＜0.05)。與發(fā)病前獲得的樣品相比，終點(diǎn)樣品顯著升高。為了評(píng)價(jià)臨床疾病發(fā)生前sFlt-1升高的機(jī)理，我們繪制了先兆子癇發(fā)生前，以周為單位，sFlt-1濃度對(duì)所有先兆子癇的圖(圖5B)。在先兆子癇發(fā)生前，繪制所有周的病例患者樣品中的平均sFlt-1濃度。從先兆子癇前第5周開(kāi)始，sFlt-1濃度顯著升高直到疾病發(fā)生前1周，當(dāng)它們達(dá)到在終點(diǎn)樣品中觀察到的濃度時(shí)。在平均孕齡改變較小的情況下，先兆子癇發(fā)生前第4、3、2和1周，sFlt-1水平提高，但這不能通過(guò)隨著孕齡提前后期末三月增長(zhǎng)來(lái)解釋。從先兆子癇前8-6至5周，sFlt-1升高了962pg/ml，而平均孕齡提前了31天。sFlt-1這種升高的約1/3不能歸因于妊娠提前。在除去先兆子癇發(fā)生前≤5周獲得的樣品后，根據(jù)對(duì)照組和病例組孕齡和sFlt-1繪制的曲線圖中，沒(méi)有觀察到較大的差異(圖5C)。這些數(shù)據(jù)表明先兆子癇發(fā)生前，病例患者中sFlt-1濃度較高是由于在臨床疾病發(fā)生前的5周內(nèi)sFlt-1急劇升高。
然后我們按照?qǐng)D6A所示，繪制同一患者組中PlGF蛋白的妊娠模式。在前六個(gè)月內(nèi)對(duì)照PlGF蛋白濃度升高，在第29-32周達(dá)到峰值，并在后期妊娠過(guò)程中下降。在先兆子癇發(fā)生前的病例患者中，PlGF蛋白濃度遵循相似的妊娠模式，但明顯低于1316周的對(duì)照組?？偟恼f(shuō)來(lái)，在妊娠中，臨床癥狀發(fā)生前測(cè)量的病例患者與對(duì)照之間的PlGF差異為35％(p＜0.0001)。先兆子癇發(fā)生前病例的P1GF水平是在先兆子癇發(fā)生前以周為單位描述的(圖6B)，而在除去先兆子癇發(fā)生前＜5周的樣品后，是以孕齡為單位描述的(圖6C)。先兆子癇發(fā)生前1周，濃度達(dá)到了先兆子癇發(fā)生后觀察到的那些濃度(圖6B)。與對(duì)照組相比，病例患者的PlGF水平適當(dāng)降低，與分娩時(shí)的水平相距較遠(yuǎn)，在分娩前第5和3周大大降低。對(duì)照患者的濃度從分娩前17-15到3周保持較高，然后迅速下降。排除了先兆子癇前≤5周獲得的樣品后，表示PlGF水平的曲線圖表明在妊娠第29-32周，相對(duì)于對(duì)照，病例組稍稍降低，且在第33-36周，從病例患者獲得的樣品中則完全沒(méi)有了(圖6C)。這表明發(fā)病前幾周內(nèi)PlGF濃度的下降是導(dǎo)致疾病發(fā)生時(shí)PlGF水平明顯較低的原因(或圖6A所示的終點(diǎn)樣品)。
懷孕過(guò)程中的VEGF濃度非常低，且與先兆子癇發(fā)生前對(duì)照和病例的相似，只是在第37-41周，病例患者中的VEGF濃度明顯降低。排除了先兆子癇前5周獲得的樣品的病例中，第23-32周時(shí)的平均VEGF濃度與對(duì)照組沒(méi)有明顯不同(11.6 vs.12.8pg/ml)，而包括分娩前≤5周樣品的病例組濃度則有明顯不同(5.1 vs.12.8pg/ml，p＜0.01)。在第33-41周，先兆子癇發(fā)生前＞5或≤5周的病例VEGF濃度分別高于和低于對(duì)照組(11.2pg/ml和8.3 vs.9.7pg/ml)，雖然這些差異并不顯著。
圖7描述根據(jù)先兆子癇狀態(tài)和嚴(yán)重狀態(tài)，第23-32周(圖7A)和第33-41周(圖7B)的sFlt-1和PlGF。該曲線圖表明先兆子癇發(fā)生前的sFlt-1提高和PlGF降低與疾病嚴(yán)重程度、發(fā)生時(shí)間、以及SGA嬰兒是否存在有關(guān)。在第23-32周，先兆子癇發(fā)生前，具有SGA嬰兒的病例患者的sFlt-1和P1GF分別明顯高于或低于具有SGA嬰兒的對(duì)照患者的相應(yīng)濃度。此外，與足月前分娩的對(duì)照患者相比，足月前分娩的病例患者具有更高的sFlt-1和明顯更低的PlGF。
然后我們測(cè)定我們是否可使用首三月的PlGF和/或sFlt-1循環(huán)濃度來(lái)鑒定婦女是否有發(fā)展先兆子癇的危險(xiǎn)。在第8-20周，校正孕齡、體重指數(shù)和sFlt-1后，與在三個(gè)更高四分點(diǎn)中具有PlGF的病例相比，在對(duì)照值分布的最低四分點(diǎn)中具有PlGF的病例患者的在＜34周時(shí)，患先兆子癇的危險(xiǎn)幾乎增加了12-倍(Odds Ratio[OR]11.7，p＜0.05)(表3)。與最高的四分點(diǎn)相比，在最低四分點(diǎn)中，＜34周時(shí)患先兆子癇的危險(xiǎn)幾乎增加了16倍(OR 15.8，p＜0.01)。
表3利用第8-20周時(shí)對(duì)照PlGF分布的四分點(diǎn)得到的早期發(fā)生先兆子癇的優(yōu)勢(shì)比(OR)
*針對(duì)孕齡、體重指數(shù)、log sFlt-1校正的優(yōu)勢(shì)比(OR)**p＜0.01***p＜0.001 95％CI＝95％置信限這些結(jié)果證實(shí)sFlt-1水平在先兆子癇癥狀發(fā)生前約5周迅速提高。與sFlt-1提高相比，游離PlGF和游離VEGF水平降低，表明PlGF及VEGF降低可能至少部分是由于sFlt-1的拮抗作用，而不是由于PlGF和VEGF胎盤(pán)產(chǎn)生的降低。與對(duì)照或患有輕度先兆子癇的婦女相比，在第23-32周和第33-41周，3個(gè)先兆子癇小組-嚴(yán)重的先兆子癇、疾病早期發(fā)生、以及SGA嬰兒-具有較高的sFlt-1和較低的PlGF濃度。我們還證實(shí)了在可能發(fā)展先兆子癇的婦女中，中三月開(kāi)始較早的游離PlGF稍稍降低，但不顯著。這些結(jié)果證實(shí)PlGF水平的降低可以成為早期發(fā)生的先兆子癇的有效預(yù)測(cè)值。
在這里我們首次描述了sFlt-1在正常孕婦中的妊娠模式，在妊娠過(guò)程中觀察到相對(duì)穩(wěn)定的水平，接著在第33-36周開(kāi)始觀察到穩(wěn)定的升高。這種升高與其他人(Torry等人，J.Soc.Gyfaecol.Invest.10178-188，1998；Taylor等人，Am.J.Obstet.Gynecol.188177-182，2003)在正常孕婦中觀察到晚期妊娠PlGF降低相對(duì)應(yīng)，結(jié)果在此處描述。臨時(shí)聯(lián)合，連同sFlt-1干擾PlGF ELISA測(cè)量的知識(shí)(Maynard等人，supra)表明后期妊娠過(guò)程中游離PlGF水平的降低可能是由于sFlt-1水平提高。在首三月及中三月，當(dāng)胎盤(pán)生長(zhǎng)需要跟上胎兒要求的增加時(shí)，PlGF濃度較高而sFlt-1濃度較低，產(chǎn)生相對(duì)促-血管生成的狀態(tài)。妊娠后期，當(dāng)需要調(diào)節(jié)并停止胎盤(pán)血管生長(zhǎng)時(shí)，抗-血管生成的sFlt-1升高且PlGF降低。在先兆子癇婦女中，sFlt-1在妊娠早期開(kāi)始升高，癥狀發(fā)生前約5周，平均約在妊娠第29-32周。因此，在先兆子癇中，抗-血管生成“閘”可很快且很有效地使用，導(dǎo)致正常生理過(guò)程夸大，其阻止胎盤(pán)生長(zhǎng)。似乎很清楚的是，表征先兆子癇的病理性胎盤(pán)改變?cè)谌焉镌缙?10-14周)，以及sFlt-1迅速提高前出現(xiàn)。所致胎盤(pán)局部缺血本身可提高sFlt-1產(chǎn)生，最終引發(fā)sFlt-1爆發(fā)。
除了在臨床癥狀發(fā)展前5周內(nèi)見(jiàn)到的較大差異外，可能發(fā)展先兆子癇的婦女人數(shù)較少，但統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著，在早至妊娠13-16周的游離PlGF降低。PlGF的這種降低通常并不伴有sFlt-1水平的相等增加。然而，雖然不是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的，但在首三月過(guò)程中，病例的sFlt-1水平具有稍稍提高的傾向(例如，在第17-20周窗口，病例的平均sFlt-1水平為865.77pg/ml，對(duì)照組為795.25)。妊娠早期PlGF水平的這種降低可反映出在伴有疾病，如先兆子癇或SGA的孕婦中PlGF的少量胎盤(pán)產(chǎn)生。重要的是，在伴有SGA的先兆子癇患者中，我們發(fā)現(xiàn)疾病出現(xiàn)前，sFlt-1提高和PlGF降低的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性增加。還有可能的是，先兆子癇中PlGF的胎盤(pán)產(chǎn)生沒(méi)有改變，且胎盤(pán)中局部sFlt-1水平的提高可導(dǎo)致循環(huán)游離PlGF降低。這可由下列發(fā)現(xiàn)支持，即通過(guò)免疫組織化學(xué)測(cè)量的胎盤(pán)PlGF在先兆子癇中沒(méi)有改變(Zhou等人，Am.J.Ptathol.1601405-1423，2002)。
總之，我們已經(jīng)說(shuō)明在臨床疾病發(fā)生前至少5周，先兆子癇中的sFlt-1開(kāi)始升高，其伴有循環(huán)游離PlGF和游離VEGF的降低。首三月PlGF的降低可預(yù)測(cè)先兆子癇且sFlt-1升高可預(yù)測(cè)接近臨床疾病。該數(shù)據(jù)結(jié)合上述證實(shí)了單獨(dú)sFlt-1在嚙齒動(dòng)物中誘導(dǎo)先兆子癇樣癥狀的動(dòng)物試驗(yàn)表明了sFlt-1在先兆子癇發(fā)病中的可能病原作用。作為與病例患者的對(duì)照，我們有關(guān)對(duì)照組中SGA嬰兒和足月前分娩的有限數(shù)據(jù)表明在具有SGA嬰兒的先兆子癇孕婦中觀察到的蛋白水平比差異提高很多，只是由于子宮內(nèi)生長(zhǎng)的限制或沒(méi)有先兆子癇情況下的足月前分娩。
診斷學(xué)本發(fā)明涉及用于檢測(cè)先兆子癇、子癇、或發(fā)展這種病的傾向的診斷測(cè)定法。測(cè)量被試者樣品中的游離或總的VEGF、P1GF、或sFlt-1水平并用作先兆子癇、子癇、或發(fā)展這種病的傾向的指標(biāo)。
在其中一個(gè)實(shí)施方案中，度量用于確定至少兩種蛋白水平之間的關(guān)系是否可指示先兆子癇或子癇。標(biāo)準(zhǔn)方法可用于測(cè)量任何體液，包括但不限于，尿液、血清、血漿、唾液、羊水、或腦脊液中VEGF、PlGF、或sFlt-1多肽的水平。這類(lèi)方法包括免疫測(cè)定法、ELISA、使用VEGF、PlGF或sFlt-1抗體的蛋白質(zhì)印跡、以及定量酶免疫測(cè)定技術(shù)，如Ong等人(Obstet.Gynecol.98608-611，2001)和Su等人(Obstet.Gynecol.，97898-904，2001)描述的那些。ELISA測(cè)定法是測(cè)量VEGF、PlGF、或sFlt-1水平的優(yōu)選方法。大于2ng/ml的sFlt-1血清水平被認(rèn)為是先兆子癇的陽(yáng)性指標(biāo)。此外，sFlt-1、VEGF、或PlGF水平相對(duì)于正常水平的任何可檢測(cè)改變是子癇、先兆子癇、或發(fā)展這種病傾向的指標(biāo)。優(yōu)選，測(cè)量sFlt-1，更優(yōu)選將VEGF和PlGF的測(cè)量與這種測(cè)量結(jié)合，且最優(yōu)選測(cè)量全部三種蛋白(或指示蛋白水平的mRNA水平)。
在另一實(shí)施方案中，將PAAI(sFlt-1/VEGF+P1GF)用作抗-血管生成指數(shù)，診斷先兆子癇、子癇、或發(fā)展這類(lèi)病的傾向。如果PAAI大于20，那么被試者被認(rèn)為患有先兆子癇或有即將發(fā)展這類(lèi)病的危險(xiǎn)。PAAI(sFlt-l/VEGF+PlGF)比例僅僅是可用作診斷指標(biāo)的有效度量的其中一個(gè)例子。它不用來(lái)限制本發(fā)明。事實(shí)上，可檢測(cè)患有子癇的被試者中抗-血管生成指數(shù)相對(duì)于正常對(duì)照的改變的任何度量都可用作診斷指標(biāo)。
特定核酸或多肽的表達(dá)水平可能與特定的疾病狀況(例如，先兆子癇或子癇)相關(guān)聯(lián)，且因此用于診斷。來(lái)源于sFlt-1、PlGF或VEGF核酸序列的寡核苷酸或較長(zhǎng)片段可用作探針，不僅可監(jiān)測(cè)表達(dá)，而且可鑒定sFlt-1、PlGF或VEGF核酸分子具有基因變異、突變、或多態(tài)性的被試者，而這些是先兆子癇發(fā)展成疾病的指標(biāo)。這種多態(tài)性是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的且由Parry等人(Eur.J.Immunogenet.26321-3，1999)描述。這種基因改變可存在于sFlt-1基因的啟動(dòng)子序列、可讀框、內(nèi)含序列、或未翻譯的3’區(qū)中。有關(guān)基因改變的信息可用于診斷患有先兆子癇、子癇、或發(fā)展這類(lèi)病傾向的被試者。正如全文所述，sFlt-1、VEGF、和/或PlGF生物學(xué)活性水平的特定改變可能與先兆子癇或子癇或發(fā)展這類(lèi)病的可能性有關(guān)。結(jié)果，本領(lǐng)域技術(shù)人員在檢測(cè)了已知的突變后，可測(cè)定蛋白生物活性的一個(gè)或多個(gè)度量，從而確定突變是否可引起或增加先兆子癇或子癇的可能性。
在其中一個(gè)實(shí)施方案中，患有先兆子癇、子癇、或具有發(fā)展這類(lèi)病傾向的被試者將表現(xiàn)出編碼sFlt-1核酸的表達(dá)水平的提高或PlGF或VEGF水平的改變。用于檢測(cè)這種改變的方法是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法且由Ausubel等人，supra描述。在其中一個(gè)實(shí)施例中，RNA印跡或?qū)崟r(shí)PCR用于檢測(cè)sFlt-1、PlGF或VEGF mRNA水平。
在另一實(shí)施方案中，與能夠檢測(cè)sFlt-1核酸分子，包括基因組序列或緊密相關(guān)分子的PCR探針雜交可用于和來(lái)源于患有先兆子癇或子癇或具有發(fā)展這類(lèi)病危險(xiǎn)的被試者的核酸序列雜交。探針的特異性，不論是從高度特異性區(qū)，例如5’調(diào)節(jié)區(qū)，還是從特異性較低的區(qū)，例如，保守基序制造的，以及雜交或擴(kuò)增的嚴(yán)格程度(最高、高、中等、或低)，都可確定探針是否與天然存在的序列、等位基因變體、或其它相關(guān)序列雜交。雜交技術(shù)可用于鑒定表示先兆子癇或子癇的sFlt-1核酸分子的突變，或可用于監(jiān)測(cè)編碼sFlt-1多肽的基因表達(dá)水平(例如，通過(guò)RNA印跡，Ausubel等人，supra)。
在另一實(shí)施方案中，通過(guò)直接分析sFlt-1、VEGF、或PlGF核酸分子的序列可診斷人類(lèi)是否具有發(fā)展先兆子癇或子癇的傾向。
患有先兆子癇、子癇或具有發(fā)展這類(lèi)病傾向的被試者將表現(xiàn)出sFlt-1多肽表達(dá)水平的提高。特異性結(jié)合sFlt-1多肽的抗體可用于診斷先兆子癇或子癇或用于鑒定被試者是否有發(fā)展這類(lèi)病的危險(xiǎn)。用于測(cè)量這類(lèi)多肽表達(dá)水平改變的各種方案是已知的，包括免疫學(xué)方法(如ELISA和RIA)，并提供診斷先兆子癇或子癇或是否具有發(fā)展這類(lèi)病危險(xiǎn)的基礎(chǔ)。又，該多肽水平的提高可診斷患有先兆子癇、子癇、或具有發(fā)展這類(lèi)病傾向的被試者。
在其中一個(gè)實(shí)施方案中，sFlt-l、VEGF或P1GF多肽或核酸，或其任意組合的水平至少測(cè)量?jī)纱?，且與正常參考水平相比，其水平隨時(shí)間的改變可用作先兆子癇、子癇、或發(fā)展這類(lèi)病傾向的指標(biāo)。
患有先兆子癇、子癇或具有發(fā)展這類(lèi)病傾向的被試者體液中的sFlt-1、VEGF或PlGF水平相對(duì)于正常對(duì)照組的sFlt-1、VEGF、或PlGF水平可改變少至10％、20％、30％或40％，或多至50％、60％、70％、80％或90％。存在于患有先兆子癇、子癇或具有發(fā)展這類(lèi)病傾向的被試者體液中的sFlt-1水平相對(duì)于正常對(duì)照被試者的水平可提高1.5-倍、2-倍、3-倍、4-倍，甚或多至10倍或更多。
在其中一個(gè)實(shí)施方案中，在先兆子癇癥狀發(fā)生前的懷孕早期，收集被試者的體液樣品(例如，尿液、血漿、血清、羊水)。在另一實(shí)施例中，樣品可以是先兆子癇癥狀發(fā)生前，在懷孕早期收集的組織或細(xì)胞。非限制性例子包括胎盤(pán)組織、胎盤(pán)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞如單核細(xì)胞。在人類(lèi)中，例如，在妊娠的首三月、中三月或后三月中，收集孕婦肘前靜脈的產(chǎn)婦血清樣品。優(yōu)選，測(cè)定是在首三月，例如第4、6、8、10或12周進(jìn)行的，或在中三月，例如第14、16、18、20、22或24周進(jìn)行的。這種測(cè)定還可在中三月結(jié)束時(shí)或末三月開(kāi)始時(shí)(約28周)進(jìn)行。優(yōu)選，在該時(shí)間周期內(nèi)，將sFlt-1、VEGF或PlGF水平測(cè)量?jī)纱?。就產(chǎn)后先兆子癇或子癇的診斷而言，sFlt-1、VEGF或P1GF的測(cè)定可在產(chǎn)后進(jìn)行。
在其中一個(gè)特定實(shí)施例中，可在懷孕過(guò)程中收集連續(xù)的血液樣品并通過(guò)ELISA測(cè)定可溶性sFlt-1水平。在使用該技術(shù)的其中一項(xiàng)研究中，編碼sFlt-1的可選擇性剪接mRNA由滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)，且在孕婦血漿中很容易檢測(cè)到該蛋白。在20-36周妊娠期間，觀察到sFlt-1水平提高了大約3倍。在隨后繼續(xù)發(fā)展先兆子癇的高危婦女中，觀察到該水平明顯更高(Charnock-Jones等人，J.Soc.GyiiecoL Investig.10(2)230，2003)。
在獸醫(yī)實(shí)踐中，可在懷孕過(guò)程中的任何時(shí)間進(jìn)行測(cè)定，但優(yōu)選在懷孕早期，先兆子癇癥狀發(fā)生前進(jìn)行。已知懷孕時(shí)間隨著物種不同而廣泛變化，測(cè)定時(shí)間由獸醫(yī)決定，但通常與人類(lèi)懷孕過(guò)程的測(cè)定時(shí)間相對(duì)應(yīng)。
此處所述的診斷方法可單獨(dú)使用或與此處所述的任何其它診斷方法結(jié)合使用，以更準(zhǔn)確地診斷先兆子癇或子癇是否存在、嚴(yán)重程度或可能的發(fā)生時(shí)間。此外，此處所述的診斷方法可與用于準(zhǔn)確診斷先兆子癇或子癇是否存在、嚴(yán)重程度、或可能的發(fā)生時(shí)間的任何其它診斷方法結(jié)合使用。
此處所述診斷方法還可用于監(jiān)測(cè)并處理被試者的先兆子癇或子癇。在其中一個(gè)實(shí)施例中，如果被試者被測(cè)定具有10ng/mL的血清sFlt-1蛋白水平和100pg/mL的游離PlGF血清水平，那么可給予VEGF直到血清PlGF水平升高到約400pg/mL。在該實(shí)施方案中，反復(fù)測(cè)量sFlt-1、P1GF和VEGF，或這些的任一或全部水平，該方法不僅能診斷疾病而且可監(jiān)測(cè)先兆子癇和子癇的治療和處理。
診斷試劑盒本發(fā)明還提供一種診斷試驗(yàn)試劑盒。例如，診斷試驗(yàn)試劑盒可包括sFlt-1、VEGF或P1GF抗體，用于檢測(cè)，且更優(yōu)選用于評(píng)價(jià)抗體與sFlt-1、VEGF或P1GF多肽之間結(jié)合的工具。進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，標(biāo)記抗體或sFlt-1、VEGF、或P1GF多肽，且抗體或sFlt-1、VEGF或P1GF多肽是底物-結(jié)合的，這樣sFlt-1、VEGF或P1GF多肽-抗體的相互作用可通過(guò)在抗體與sFlt-1、VEGF或PlGF多肽結(jié)合后，測(cè)定與底物結(jié)合的標(biāo)記量而建立。常規(guī)的ELISA是本領(lǐng)域已知的通用方法，用于檢測(cè)抗體-底物的相互作用并與本發(fā)明試劑盒一起提供。sFlt-1、VEGF或P1GF多肽可在任何體液，包括但不限于尿液、血清、血漿、唾液、羊水或腦脊液中實(shí)際檢測(cè)。測(cè)定sFlt-1、VEGF或PlGF多肽水平相對(duì)于對(duì)照，如正常對(duì)照水平的改變的試劑盒可用作本發(fā)明方法中的診斷試劑盒。
篩選測(cè)定法正如上面所討論的，sFlt-1核酸或多肽的表達(dá)水平在患有先兆子癇、子癇或具有發(fā)展這類(lèi)病傾向的被試者中提高。基于這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的組合物可用于候選化合物的高通量底成本篩選，從而鑒定可調(diào)節(jié)sFlt-1、VEGF或PlGF多肽或核酸分子表達(dá)的那些，其中它們的表達(dá)在患有先兆子癇或子癇的被試者中被改變。
許多方法都可進(jìn)行篩選測(cè)定從而鑒定改變sFlt-1、VEGF或PlGF核酸分子表達(dá)的新的候選化合物。在其中一個(gè)可實(shí)行的實(shí)施例中，將各種濃度的候選化合物加入到表達(dá)sFlt-1、VEGF或PlGF核酸序列的培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中。然后測(cè)量基因表達(dá)，例如，通過(guò)微排列分析、RNA印跡分析(Ausubel等人supra)或RT-PCR，其中使用從核酸制備的任何適宜片段作為雜交探針。將有候選化合物存在條件下的基因表達(dá)水平與在缺少候選化合物的對(duì)照培養(yǎng)基中測(cè)量的水平進(jìn)行比較。促進(jìn)改變，如VEGF或PlGF基因、核酸分子或多肽表達(dá)水平提高，或sFlt-1基因、核酸分子或多肽或其功能等價(jià)物表達(dá)水平降低的化合物被認(rèn)為可用于本發(fā)明中；可使用這類(lèi)分子作為治療被試者先兆子癇或子癇的療法。
在另一可實(shí)行的實(shí)施例中，候選化合物的作用可使用相同的一般方法和標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)技術(shù)，以多肽產(chǎn)生水平測(cè)量，如使用sFlt-1、VEGF或PlGF多肽的特異性抗體進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡或免疫沉淀。例如，免疫測(cè)定法可用于檢測(cè)或監(jiān)測(cè)本發(fā)明至少一種多肽在生物中的表達(dá)。能夠結(jié)合這種多肽的多克隆或單克隆抗體(如上所述產(chǎn)生的)可用于任何標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定形式(例如，ELISA、蛋白質(zhì)印跡或RIA測(cè)定)中，以測(cè)量所述多肽的水平。在某些實(shí)施方案中，促進(jìn)改變，如VEGF或PlGF多肽的表達(dá)或生物活性提高或sFlt-1多肽的表達(dá)或生物活性降低的化合物被認(rèn)為特別有效。又，可使用這類(lèi)分子，例如，作為延遲、緩和、或治療被試者先兆子癇或子癇，或先兆子癇或子癇癥狀的療法。
在另一可實(shí)行的實(shí)施例中，可篩選候選化合物中特異性結(jié)合sFlt-1、VEGF或PlGF多肽的那些。這種候選化合物的功效取決于它與這類(lèi)多肽或其功能性等價(jià)物相互作用的能力。這種相互作用可很容易地使用許多標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合技術(shù)和功能測(cè)定法(例如，Ausubel等人，supra描述的那些)測(cè)定。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，可體外測(cè)試候選化合物特異性結(jié)合本發(fā)明多肽的能力。在另一實(shí)施方案中，可通過(guò)降低sFlt-1多肽與生長(zhǎng)因子，如VEGF或PlGF的結(jié)合而測(cè)試候選化合物降低sFlt-1多肽生物學(xué)活性的能力。
在另一可實(shí)行實(shí)施例中，sFlt-1、VEGF或PlGF核酸表達(dá)為與可檢測(cè)報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯融合體，并在異源啟動(dòng)子，如誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下在分離的細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物或昆蟲(chóng)細(xì)胞)中表達(dá)。然后使表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞與候選化合物接觸，將可檢測(cè)報(bào)道基因在該細(xì)胞中的表達(dá)與可檢測(cè)報(bào)道基因在未處理過(guò)的對(duì)照細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行比較。降低sFlt-1可檢測(cè)報(bào)道基因表達(dá)、或提高VEGF或PlGF可檢測(cè)報(bào)道基因表達(dá)的候選化合物是用于治療先兆子癇或子癇的化合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述候選化合物改變與核酸融合的報(bào)道基因或核酸的表達(dá)。
在其中一個(gè)特定的可實(shí)行實(shí)施例中，結(jié)合sFlt-1多肽的候選化合物可使用色譜技術(shù)鑒定。例如，本發(fā)明的重組多肽可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從被改造表達(dá)所述多肽的細(xì)胞純化(例如，上述那些)且可固定在柱上。然后使候選化合物的溶液通過(guò)柱子，以其結(jié)合多肽并固定在柱上的能力為基礎(chǔ)鑒定對(duì)sFlt-1多肽特異的化合物。為了分離該化合物，洗滌柱子以除去非-特異性結(jié)合的分子，使目標(biāo)化合物從柱上釋放出來(lái)并收集。類(lèi)似的方法可用于分離與多肽微排列結(jié)合的化合物。通過(guò)該方法(或任何其它適宜方法)分離的化合物可，如果需要，被進(jìn)一步純化(例如，通過(guò)高效液相色譜)。此外，還可測(cè)試這些候選化合物降低sFlt-1多肽活性或提高VEGF信號(hào)途徑的能力(如此處所述)?？墒褂猛ㄟ^(guò)該方法分離的化合物，例如，作為治療人類(lèi)被試者先兆子癇或子癇的療法。具有小于或等于10mM親和常數(shù)的、被鑒定結(jié)合本發(fā)明多肽的化合物被認(rèn)為可特別用于本發(fā)明中?？蛇x擇性地，任何體內(nèi)蛋白相互作用檢測(cè)系統(tǒng)，例如，任何二-雜種測(cè)定均可用于鑒定結(jié)合本發(fā)明多肽的化合物或蛋白。
有效的拮抗劑包括結(jié)合sFlt-1核酸序列或sFlt-1多肽的有機(jī)分子、肽、肽類(lèi)似物、多肽、核酸、以及抗體。
sFlt-1 DNA序列還可用于治療先兆子癇或子癇的治療化合物的發(fā)現(xiàn)和研究。編碼蛋白，在表達(dá)后，可用作藥物篩選的目標(biāo)。此外，編碼所編碼蛋白氨基末端區(qū)的DNA序列或Shine-Delgarno序列或促進(jìn)各mRNA翻譯的其它序列可用于構(gòu)建降低sFlt-1編碼序列表達(dá)的序列。這類(lèi)序列可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離(Ausubel等人，supra)。
任選地，在上述任何測(cè)定法中鑒定的化合物被證實(shí)在降低sFlt-1生物學(xué)活性或提高VEGF信號(hào)途徑活性的化合物測(cè)定法中有效。
本發(fā)明的小分子優(yōu)選具有低于2,000道爾頓，更優(yōu)選300-1,000道爾頓、最優(yōu)選400-700道爾頓的分子量。優(yōu)選這些小分子是有機(jī)分子。
針對(duì)VEGF信號(hào)途徑的治療VEGF是有效的內(nèi)皮細(xì)胞-特異性促分裂原，可刺激血管生成、血管滲透性過(guò)高以及血管舒張。已經(jīng)鑒定了VEGF的三種酪氨酸-激酶信號(hào)受體。VEGF-受體的結(jié)合可引發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)，使得磷脂酶Cγ1發(fā)生酪氨酸磷酸化，導(dǎo)致肌醇1，4，5-三磷酸的胞內(nèi)水平提高和胞內(nèi)鈣提高，從而激活一氧化氮合酶產(chǎn)生一氧化氮(NO)。NO的形成可激活血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，引起cGMP產(chǎn)生。這種NO/cGMP級(jí)聯(lián)被認(rèn)為可介導(dǎo)VEGF的血管作用。似乎涉及介導(dǎo)VEGF血管作用的其它途徑是前列腺環(huán)素釋放途徑。VEGF經(jīng)由磷脂酶A2的活化而誘導(dǎo)PGI2產(chǎn)生，這是由于MAPK級(jí)聯(lián)的開(kāi)始。
VEGF水平的提高可用于治療先兆子癇或子癇。針對(duì)VEGF信號(hào)途徑或VEGF信號(hào)途徑組分，且提高VEGF信號(hào)途徑活性的治療化合物也可用于治療先兆子癇和子癇。這類(lèi)化合物包括西地那非、前列腺環(huán)素類(lèi)似物，如依前列醇鈉、Remodulin、和Tracleer。
試驗(yàn)化合物和提取物通常，能夠降低sFlt-1多肽活性或提高VEGF或PlGF活性的化合物是根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，從天然產(chǎn)物或合成(半-合成)提取物的大型庫(kù)或化學(xué)庫(kù)或多肽或核酸庫(kù)中鑒定的。藥物研發(fā)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解試驗(yàn)提取物或化合物的準(zhǔn)確來(lái)源對(duì)于本發(fā)明的篩選過(guò)程并不特別重要。用于篩選的化合物可包括已知化合物(例如，用于其它疾病或病癥的已知治療)?？蛇x擇性地，事實(shí)上使用此處所述方法可篩選許多未知的化學(xué)提取物或化合物。這種提取物或化合物的例子包括但不限于，植物-、真菌-、原核生物-或動(dòng)物提取物、發(fā)酵肉湯、及合成化合物，以及現(xiàn)有化合物的改變。還有很多方法也可用于產(chǎn)生許多化學(xué)化合物，包括但不限于糖-、脂類(lèi)-、肽-、及核酸化合物的隨機(jī)或定向合成(例如，半-合成或總合成)。合成化合物庫(kù)可從BrandonAssociates(Merrimack，NH)和Aldrich Chemical(Milwaukee，WI)商業(yè)得到?？蛇x擇性地，細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物形式的天然化合物庫(kù)可從很多來(lái)源商業(yè)得到，包括Biotics(Sussex，UK)、Xenova(Slough，UK)、Harbor Branch Oceangraphics Institute(Ft.Pierce，F(xiàn)L)和PhannaMar，U.S.A.(Cambridge，MA)。此外，如果需要，按照本領(lǐng)域已知的方法，例如，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)提取和分離方法產(chǎn)生天然及合成產(chǎn)生的庫(kù)。此外，如果需要，可使用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)、物理、或生物化學(xué)方法很容易地改變?nèi)魏螏?kù)或化合物。
此外，藥物研發(fā)領(lǐng)域的技術(shù)人員可很容易地理解不論何時(shí)，都可應(yīng)用脫復(fù)制(例如，分類(lèi)脫復(fù)制、生物學(xué)脫復(fù)制、以及化學(xué)脫復(fù)制、或其任意組合)或除去脫-破裂活性已知的物質(zhì)的復(fù)制或重復(fù)的方法。
當(dāng)發(fā)現(xiàn)粗提物可降低sFlt-1多肽活性，或結(jié)合sFlt-1多肽時(shí)，確實(shí)很重要的提取物的進(jìn)一步分級(jí)分離是分離導(dǎo)致所觀察作用的化學(xué)組分所必需的。因此，提取、分級(jí)分離、和純化的目的是認(rèn)真描述和鑒定可降低sFlt-1多肽活性的粗提物內(nèi)的化學(xué)實(shí)體。這種異源提取物的分級(jí)分離和純化方法是本領(lǐng)域已知的。如需要，根據(jù)本領(lǐng)域已知方法，對(duì)可有效治療人先兆子癇或子癇的化合物進(jìn)行化學(xué)改變。
治療本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防被試者先兆子癇或子癇的方法。優(yōu)選在懷孕過(guò)程中給予治療，用于治療或預(yù)防先兆子癇或子癇，或在懷孕后給予以治療產(chǎn)后先兆子癇或子癇。用于給藥的技術(shù)和劑量根據(jù)化合物(抗體、反義、核酸載體等)的類(lèi)型而變化，且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的或很容易確定的。
本發(fā)明的治療化合物可在單位劑量形式中，與藥學(xué)可接受的稀釋劑、載體或賦形劑一起給予。給藥可以是腸胃外、靜脈內(nèi)、皮下、口服或局部直接注射到羊水中。通過(guò)連續(xù)輸注而靜脈內(nèi)送遞是給予本發(fā)明治療化合物的優(yōu)選方法。
所述組合物可以是口服給藥的丸劑、片劑、膠囊劑、液體或持續(xù)釋放的片劑；或用于靜脈內(nèi)、皮下或腸胃外給藥的液體；或用于局部給藥的聚合物或其它持續(xù)釋放的賦形劑。
用于制備制劑的本領(lǐng)域熟知的方法見(jiàn)，例如，“RemingtonTheScience and Practice of Pharmacy”(20th ed.，ed.A.R.Gennaro AR.，2000，Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，PA)。用于腸胃外給藥的制劑可，例如，包含賦形劑、無(wú)菌水、生理鹽水、聚亞烷基二醇如聚乙二醇、植物來(lái)源的油、或氫化萘。生物相容的、可生物降解的交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可用于控制化合物的釋放。毫微顆粒制劑(例如，可生物降解的毫微顆粒、固體脂類(lèi)毫微顆粒、脂質(zhì)體)可用于控制化合物的生物分布。其它可能有效的腸胃外送遞系統(tǒng)包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物顆粒、滲透泵、可植入的融合系統(tǒng)及脂質(zhì)體。制劑中化合物的濃度取決于多種因素，包括所給予藥物的劑量以及給藥途徑。
所述化合物可任選以藥學(xué)可接受的鹽，如制藥工業(yè)通常使用的無(wú)毒酸加成鹽或金屬絡(luò)合物的形式給藥。酸加成鹽的例子包括有機(jī)酸如乙酸、乳酸、撲酸、馬來(lái)酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、抗壞血酸、琥珀酸、苯甲酸、棕櫚酸、辛二酸、水楊酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸、三氟醋酸等；聚合酸如鞣酸、羧甲基纖維素等；和無(wú)機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸等。金屬絡(luò)合物包括鋅、鐵等。
用于口服使用的制劑包括混合物中含有活性成分和無(wú)毒的藥學(xué)可接受賦形劑的片劑。這些賦形劑可以是，例如，惰性稀釋劑或填充劑(例如，蔗糖和山梨糖醇)、潤(rùn)滑劑、glidants、和抗-粘合劑(例如，硬脂酸鎂、硬脂酸鋅、硬脂酸、二氧化硅、氫化植物油、或滑石粉)。
口服使用的制劑還可以咀嚼片的形式給藥，或以硬明膠膠囊的形式給藥，其中將活性成分與惰性固體稀釋劑混合，或以軟明膠膠囊的形式給藥，其中將或形成與水或油性介質(zhì)混合。
給予化合物的劑量和時(shí)間取決于多種臨床因素，包括被試者的整體健康狀況和先兆子癇癥狀的嚴(yán)重程度。一般而言，一旦檢測(cè)出先兆子癇或具有發(fā)展先兆子癇的傾向，則純化蛋白的連續(xù)輸注用于治療或預(yù)防所述疾病的進(jìn)一步發(fā)展。治療可持續(xù)1-100天，更優(yōu)選1-60天，且最優(yōu)選1-20天，或直到懷孕結(jié)束。劑量可根據(jù)每種化合物以及疾病的嚴(yán)重程度不同而變化，且被滴定獲得穩(wěn)態(tài)的血清濃度，即1-500ng/mLVEGF或P1GF，或兩者、優(yōu)選1-100ng/mL、更優(yōu)選5-50ng/mL且最優(yōu)選5-10ng/mL VEGF或P1GF，或兩者。
提高VEGF或PlGF蛋白表達(dá)的方法本發(fā)明提供用于提高被診斷患有先兆子癇或子癇的被試者中VEGF和PlGF水平的方法。VEGF或PlGF水平的提高可使用下面所述的若干不同方法獲得。
純化蛋白在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，將純化形式的VEGF或PlGF或兩者給予被試者，從而治療或預(yù)防先兆子癇或子癇。
純化的VEGF或VEGF-樣蛋白包括所具有的氨基酸序列與VEGF或任何VEGF家族成員的氨基酸序列同源，更優(yōu)選基本相同的蛋白，其可誘導(dǎo)血管生成或能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞或臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的選擇性生長(zhǎng)。純化VEGF化合物的例子是來(lái)源于Genentech，Inc.(SanFrancisco，CA)的人重組VEGF。
純化的P1GF或PlGF-樣蛋白包括所具有的氨基酸序列與PlGF或任何PlGF家族成員的氨基酸序列同源，更優(yōu)選基本相同的蛋白，其可誘導(dǎo)血管生成或能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞或臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的選擇性生長(zhǎng)。可商業(yè)得到的純化PlGF的例子是來(lái)源于R&D Systems(目錄號(hào)264-PG，R&D Systems，Minneapolis，MN)的人重組PlGF形式。ThromboGenics Ltd也正在研制一種純化形式的PlGF，用于治療局部缺血性中風(fēng)；推測(cè)這種形式的PlGF可有效用于本發(fā)明描述的應(yīng)用中。
提高VEGF或PlGF活性的治療化合物本發(fā)明提供已知刺激或提高VEGF或PlGF血清水平，或這些多肽的生物活性的任何化合物用于治療或預(yù)防被試者先兆子癇的用途。這些化合物可單獨(dú)使用或與上述純化蛋白或此處所述用于提高VEGF或PlGF蛋白水平的任何其它方法聯(lián)合使用。
可刺激VEGF產(chǎn)生的化合物的其中一個(gè)例子是煙堿。雖然吸煙可危害孕婦以及她正在發(fā)育中的胎兒的整體健康，但據(jù)信煙堿本身比煙草要安全且可用于高危被試者的短期治療。例子包括Nicorette(煙堿polacrilex)，其是由Smith Kline Beecham和NicoDerm CQ制造的買(mǎi)賣(mài)雙方直接交易的煙堿樹(shù)膠產(chǎn)品，由Hoechst Marion RousselInc.(formerly Marion Merrell Dow)制造的買(mǎi)賣(mài)雙方直接交易的煙堿膏。經(jīng)由煙草送遞的煙堿被特別排除在本發(fā)明的方法之外，其中還沒(méi)有使用本發(fā)明方法診斷所述患者。
煙堿是在先兆子癇或子癇診斷之后，使用膏或樹(shù)膠給予的。劑量取決于疾病的嚴(yán)重程度以及被試者的整體健康狀況。通常，按照制造商的說(shuō)明獲得5-500ng/mL、更優(yōu)選5-100ng/mL、且最優(yōu)選50-100ng/mL的煙堿血清水平。
茶堿是可用于治療或預(yù)防先兆子癇或子癇的其它化合物的又一例子。茶堿是支氣管擴(kuò)張藥，常常用于治療哮喘，且有很多商標(biāo)名(例如，Aerolate Sr、Asmalix、Elxophyllin等)以及總名稱(chēng)。給藥方法和劑量取決于每位制造商，且根據(jù)被試者的整體健康狀況和疾病的嚴(yán)重程度來(lái)選擇。通常，每日劑量為1-500mg、更優(yōu)選100-400mg、且最優(yōu)選250-350mg，每天給藥兩次，以達(dá)到5-50μg/mL的茶堿血清水平。
腺苷是可用于治療或預(yù)防先兆子癇或子癇的其它化合物的又一例子。腺苷(Fujisawa Pharmaceutical Co.)通常被用作抗-高血壓藥物。給藥方法和劑量取決于每位制造商且根據(jù)被試者的整體健康狀況和疾病的嚴(yán)重程度來(lái)選擇。通常，腺苷的每日劑量為50mg/kg，每天給藥兩次。
硝苯地平是可用于治療或預(yù)防先兆子癇或子癇的其它化合物的又一例子。硝苯地平(Bayer Pharmaceuticals)通常被用作抗-高血壓藥物。給藥方法和劑量取決于每位制造商且根據(jù)被試者的整體健康狀況和疾病的嚴(yán)重程度來(lái)選擇。通常，硝苯地平的每日劑量為1-2mg/kg，每天口服或皮下給藥兩次。
米諾地爾是可用于治療或預(yù)防先兆子癇或子癇的其它化合物的又一例子。米諾地爾(Pfizer，Inc.)通常被用作抗-高血壓藥物。給藥方法和劑量取決于每位制造商且根據(jù)被試者的整體健康狀況和疾病的嚴(yán)重程度來(lái)選擇。通常，米諾地爾的每日劑量為0.25-1.0mg/kg，每天口服或皮下給藥兩次。
硫酸鎂是可用于治療或預(yù)防先兆子癇或子癇的其它化合物的又一例子。硫酸鎂是普通藥物，通常被用作抗-高血壓的藥物。給藥方法和劑量取決于每位制造商且根據(jù)被試者的整體健康狀況和疾病的嚴(yán)重程度來(lái)選擇。通常，硫酸鎂的每日劑量為1-2gm，每四小時(shí)靜脈內(nèi)給藥一次。
除了使用可提高VEGF或PlGF血清水平的化合物之外，本發(fā)明提供與任何一種針對(duì)VEGF或PlGF的化合物結(jié)合使用的任何慢性高血壓藥物治療的用途。用于治療懷孕過(guò)程中高血壓的藥物包括甲基多巴、鹽酸肼苯噠嗪、或拉貝洛爾。對(duì)于這些藥物治療中的每一種而言，給藥方式和劑量可由醫(yī)師或按照制造商的說(shuō)明確定。
治療性核酸近來(lái)的研究表明，將能夠表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞促分裂原，如VEGF的核酸(DNA或RNA)送遞到血管損傷部位可誘導(dǎo)受損血管的增殖和再次內(nèi)皮化。雖然本發(fā)明不涉及血管損傷，但是這些研究中使用的、用于送遞編碼內(nèi)皮細(xì)胞促分裂原如VEGF和PlGF的核酸的技術(shù)也可用于本發(fā)明中。這些技術(shù)在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)Nos.5,830,879和6,258,787中描述，它們引入此處作為參考。
在本發(fā)明中，核酸可以是任何核酸(DNA或RNA)，包括編碼VEGF或P1GF或任何VEGF或P1GF家族成員的基因組DNA、cDNA、和mRNA。所述核酸還可包括編碼結(jié)合sFlt-1受體的蛋白的任何核酸。編碼所需蛋白的核酸可使用本領(lǐng)域的常規(guī)過(guò)程，例如，重組DNA、PCR擴(kuò)增獲得。
抑制sFlt-1表達(dá)的治療性核酸本發(fā)明還提供反義核酸堿基寡聚物直接負(fù)調(diào)節(jié)sFlt-1 mRNA表達(dá)的用途。通過(guò)結(jié)合互補(bǔ)核酸序列(正義或編碼鏈)，反義核酸堿基寡聚物能夠抑制蛋白表達(dá)，這大概是通過(guò)RNA酶H對(duì)RNA鏈的酶裂解。優(yōu)選反義核酸堿基寡聚物能夠降低sFlt-1蛋白在表達(dá)過(guò)量水平sFlt-1的細(xì)胞中的表達(dá)。優(yōu)選，相對(duì)于用對(duì)照寡核苷酸處理的細(xì)胞，sFlt-1蛋白的表達(dá)降低至少10％、更優(yōu)選25％、且最優(yōu)選50％或更高。選擇和制備反義核酸堿基寡聚物的方法是本領(lǐng)域熟知的。使用反義核酸堿基寡聚物負(fù)調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)的例子見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)No.6,410,322，其引入此處作為參考。測(cè)定蛋白表達(dá)水平的方法是本領(lǐng)域熟知的且包括蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀、和ELISA。
本發(fā)明還提供RNA干擾(RNAi)抑制sFlt-1表達(dá)的用途。RNA干擾(RNAi)是近來(lái)發(fā)現(xiàn)的翻譯后基因沉默(PTGS)的機(jī)理，其中與目標(biāo)基因或mRNA相對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA(dsRNA)被引入到生物中，導(dǎo)致相應(yīng)的mRNA降解。在RNAi反應(yīng)中，dsRNA分子的正義和反義鏈被加工成21-23個(gè)核苷酸長(zhǎng)且具有2-核苷酸3’尾部的小分子RNA片段或節(jié)段。可選擇性地，合成dsRNA，它們長(zhǎng)21-23nt，且具有2-核苷酸3’尾部，可被合成，純化并用于反應(yīng)中。這些21-23 nt dsRNA被稱(chēng)作“導(dǎo)向RNA”或“短的干擾RNA”(siRNA)。
然后siRNA雙螺旋與核酸酶復(fù)合物結(jié)合，該核酸酶復(fù)合物由針對(duì)和破壞內(nèi)源性mRNA的蛋白構(gòu)成，所述內(nèi)源性mRNA與復(fù)合物內(nèi)的siRNA具有同源性。雖然復(fù)合物內(nèi)的蛋白同一性仍然不清楚，但復(fù)合物的功能是通過(guò)其中一個(gè)siRNA鏈和內(nèi)源性mRNA之間的堿基對(duì)相互作用而針對(duì)同源性mRNA分子的。然后從siRNA的3’末端裂解下一個(gè)大約12nt的mRNA并降解。以這種方式，可針對(duì)特異性基因并降解，由此導(dǎo)致蛋白自靶基因的表達(dá)水平損失。
dsRNA的特殊要求和修飾在PCT公開(kāi)號(hào)No.WO01/75164(引入此處作為參考)中描述。因?yàn)閐sRNA分子的長(zhǎng)度可發(fā)生變化，因此最優(yōu)選使用siRNA分子，其是21-23核苷酸dsRNA，具有特殊的2-3-核苷酸3’突出末端，通常為(2’脫氧)胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶。siRNA通常包含3’羥基。還可使用單鏈的siRNA以及鈍頭形式的dsRNA。為了進(jìn)一步提高RNA的穩(wěn)定性，可使3’突出端穩(wěn)定以防止降解。在其中一個(gè)這類(lèi)實(shí)施方案中，RNA是通過(guò)包括嘌呤核苷酸，如腺苷或鳥(niǎo)苷穩(wěn)定的?？蛇x擇性地，用修飾類(lèi)似物置換嘧啶核苷酸，例如，用(2’-脫氧)胸苷置換尿苷2-核苷酸突出端是可耐受的，不會(huì)影響RNAi的效能。沒(méi)有2’羥基可顯著提高組織培養(yǎng)基中突出端的核酸酶抗性。
可選擇性地，siRNA可使用PCT公開(kāi)號(hào)No.WO01/75164(引入此處作為參考)中提出的方法或使用RNA體外轉(zhuǎn)錄的標(biāo)準(zhǔn)過(guò)程和Elbashir等人(Genes & Dev.，15188-200，2001)描述的dsRNA退火過(guò)程的任何一種制備。siRNA還可按照Elbashir等人所述獲得，即在加工dsRNA產(chǎn)生約21-約23個(gè)核苷酸的siRNA的條件下，培養(yǎng)與合胞體胚盤(pán)果蠅胚胎的沒(méi)有細(xì)胞的果蠅溶解產(chǎn)物中的靶基因序列相對(duì)應(yīng)的dsRNA，然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)分離。例如，凝膠電泳可用于分離21-23nt RNA，并從凝膠切片上將RNA洗脫下來(lái)。此外，色譜(例如，大小排阻色譜)、甘油梯度離心、及用抗體進(jìn)行親和純化都可用于分離21-23nt RNA。
在本發(fā)明中，dsRNA或siRNA與sFlt-1 mRNA的mRNA序列互補(bǔ)，可降低或抑制sFlt-1的表達(dá)。優(yōu)選，相對(duì)于用對(duì)照dsRNA或siRNA處理過(guò)的細(xì)胞，sFlt-1蛋白的表達(dá)降低了至少10％、更優(yōu)選至少25％、且最優(yōu)選至少50％。測(cè)定蛋白表達(dá)水平的方法也是本領(lǐng)域熟知的且包括蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀和ELISA。
在本發(fā)明中，所用核酸包括以任何方式提高核酸穩(wěn)定性或功能的任何修飾。例子包括對(duì)磷酸主鏈、核苷酸之間的鍵或糖部分的修飾。
為了簡(jiǎn)化編碼sFlt-1結(jié)合蛋白的核酸的操縱和處理，優(yōu)選將該核酸插入到與啟動(dòng)子可操縱連接的基因盒中。啟動(dòng)子必須能夠驅(qū)動(dòng)sFlt-1結(jié)合蛋白在所需靶宿主細(xì)胞中的表達(dá)。適宜啟動(dòng)子的選擇可很容易實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選，可使用高水平表達(dá)的啟動(dòng)子。適宜啟動(dòng)子的例子是763-堿基-對(duì)巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子。還可使用魯斯氏肉瘤病毒(RSV)(Davis等人，Hum.Gene Ther.4151-159，1993)和小鼠乳癌病毒(MMTV)啟動(dòng)子。某些蛋白可使用它們的天然啟動(dòng)子表達(dá)。還可包括可提高表達(dá)的其它元件(例如，產(chǎn)生高水平表達(dá)的增強(qiáng)子或系統(tǒng)，如tat基因和tar元件)。重組載體可以是質(zhì)粒載體如pUC118、pBR322、或其它已知的質(zhì)粒載體，包括，例如大腸桿菌復(fù)制源(見(jiàn)，Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory press，1989)。質(zhì)粒載體還可包括可選擇標(biāo)記，如氨芐西林抗性β內(nèi)酰胺酶基因，條件是標(biāo)記多肽不會(huì)不利地影響所治療生物的代謝。所述基因盒還可與合成送遞系統(tǒng)，如PCT公開(kāi)號(hào)No.WO95/22618中公開(kāi)的系統(tǒng)中的核酸結(jié)合部分結(jié)合。
可通過(guò)適于所用載體的任何方法將核酸引入到細(xì)胞中。許多這類(lèi)方法都是本領(lǐng)域熟知的(Sambrook等人，supra和Watson等人，“Recombinant DNA”，Chapter 12，2d edition，Scientific AmericanBooks，1992)。重組載體可通過(guò)如磷酸鈣沉淀、電穿孔、脂質(zhì)體-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、基因槍、微量注射、病毒衣殼-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、聚凝胺-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、或原生質(zhì)體融合等方法轉(zhuǎn)移。關(guān)于脂質(zhì)體制備、內(nèi)含物的靶向和送遞過(guò)程見(jiàn)Mannino和Gould-Fogerite(Bio Techniques，6682-690，1988)，F(xiàn)elgner和Holm(Betliesda Res.Lab.Focus，1121，1989)以及Maurer(Bethesda Res.Lab.Focus，1125，1989)。
重組載體(質(zhì)粒載體或病毒載體)的轉(zhuǎn)移可通過(guò)直接注射到羊水中或通過(guò)靜脈內(nèi)送遞完成。
還可使用腺病毒載體或腺伴隨病毒載體(AAV)進(jìn)行基因送遞。腺病毒存在于許多動(dòng)物中，致病性并不高，且可在分裂和靜止的細(xì)胞中相等復(fù)制。通常，基因送遞所用的腺病毒缺少病毒復(fù)制所需的一個(gè)或多個(gè)基因。用于VEGF、PlGF或任何sFlt-1結(jié)合蛋白送遞的復(fù)制-缺損型重組腺病毒載體可根據(jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)生產(chǎn)(見(jiàn)，Quantin等人，Proc.Natl.Acad.Sco.USA，892581-2584，1992；Stratford-Perricadet等人，J Clin.Invest.，90626-630，1992；和Rosenfeld等人，Cell，68143-155，1992)?；虔煼ㄔ谧訉m中使用的實(shí)施例見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)No.6,399,585。
可使用各種方法將dsRNA或寡核苷酸轉(zhuǎn)染或引入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。例如，有若干可商業(yè)得到的轉(zhuǎn)染試劑，包括但不限于TransIT-TKOTM(Mirus，目錄號(hào)MIR 2150)、TransmessengerTM(Qiagen，目錄號(hào)301525)和OligofectamineTM(Invitrogen，目錄號(hào)MIR12252-011)。每種轉(zhuǎn)染試劑的方案都可從制造商處獲得。
一旦轉(zhuǎn)染，核酸由損傷部位的細(xì)胞表達(dá)一段時(shí)間，這段時(shí)間足以提高VEGF、PlGF、或任何其它sFlt-1結(jié)合蛋白的血清水平。因?yàn)橥ǔ：兴龊怂岬妮d體沒(méi)有被摻入到細(xì)胞基因組中，因此目標(biāo)蛋白的表達(dá)只進(jìn)行一段有限的時(shí)間。通常，所述蛋白以治療水平表達(dá)約2天到幾周，優(yōu)選約1-2周。DNA的再次應(yīng)用可用于提供治療性蛋白表達(dá)的額外時(shí)間。近來(lái)使用VEGF治療哺乳動(dòng)物血管疾病的基因療法的例子可在Deodato等人(Gene Ther.，9777-785，2002)；Isner等人(HumanGene Ther.，121593-1594，2001)；Lai等人(Gene Ther.，9804-813，2002)及Freedman和Isner(Ann.Intern.Med.，13654-71，2002)和IsnerJM(Nature，415234-239，2002)中找到。
基因和蛋白表達(dá)的測(cè)定法下列方法可用于評(píng)價(jià)蛋白或基因表達(dá)并測(cè)定用于提高VEGF、PlGF或任何其它sFlt-1結(jié)合蛋白水平，或降低sFlt-1蛋白水平的上述任何一種方法的功效。
測(cè)量被試者血清中已知結(jié)合sFlt-1的VEGF、PlGF、或任何蛋白配體的水平。用于測(cè)量蛋白血清水平的方法包括ELISA、蛋白質(zhì)印跡、或使用特異性抗體的免疫測(cè)定法。此外，可進(jìn)行體外血管生成測(cè)定法以確定被試者的血液是否已經(jīng)從抗-血管生成狀態(tài)轉(zhuǎn)化至促-血管生成狀態(tài)。這種測(cè)定法在上面實(shí)施例2中描述。陽(yáng)性結(jié)果被認(rèn)為已知結(jié)合sFlt-1的VEGF、PlGF或任何蛋白配體的血清水平提高了至少20％、優(yōu)選30％、更優(yōu)選至少50％且最優(yōu)選至少60％。使用體外血管生成測(cè)定法獲得的陽(yáng)性結(jié)果還可被認(rèn)為從抗-血管生成狀態(tài)轉(zhuǎn)化為促-血管生成狀態(tài)。
本領(lǐng)域已知的測(cè)定基因表達(dá)的方法有很多。一些例子包括分離被試者血液樣品的RNA，并使用RNA進(jìn)行RNA印跡、PCR擴(kuò)增或RNA酶保護(hù)測(cè)定法。
抗體用于治療性處理的用途在從患有先兆子癇孕婦采集的血清樣品中發(fā)現(xiàn)的sFlt-1水平提高表明sFlt-1可作為“生理庫(kù)”與功能性VEGF和PlGF的滋養(yǎng)層細(xì)胞和產(chǎn)婦內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合并使其缺失。結(jié)合sFlt-1并阻斷VEGF或PlGF結(jié)合的化合物，如抗體的使用可通過(guò)增加游離的VEGF或PlGF而幫助預(yù)防或治療先兆子癇或子癇。這種增加將使滋養(yǎng)層的增殖、遷移和胎盤(pán)發(fā)育及胎兒營(yíng)養(yǎng)所需的血管生成增加，且使全身的產(chǎn)婦內(nèi)皮細(xì)胞健康。
本發(fā)明提供特異性結(jié)合sFlt-1配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體。所述抗體用于抑制sFlt-1，且最有效的機(jī)理?yè)?jù)信是通過(guò)直接阻斷VEGF或PlGF的結(jié)合位點(diǎn)，然而，不排除其它機(jī)理。用于治療目的的抗體的制備和使用方法在許多專(zhuān)利中描述，包括美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,054,297；5,821,337；6,365,157；和6,165,464，它們引入此處作為參考?？贵w可以是多克隆的或單克隆的；優(yōu)選單克隆抗體。
單克隆抗體，特別是來(lái)源于嚙齒動(dòng)物包括小鼠的那些已經(jīng)用于治療各種疾?。蝗欢?，它們的使用有限，包括誘導(dǎo)引起快速清除和治療功效降低的人抗-小鼠免疫球蛋白。例如，嚙齒動(dòng)物單克隆抗體臨床使用的主要限制是治療過(guò)程中的抗-球蛋白反應(yīng)(Miller等人，Blood，62988-995 1983；Schroff等人，Cancer Res.，45879-885，1985)。
現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)嘗試通過(guò)構(gòu)建“嵌合”抗體克服這個(gè)問(wèn)題，其中動(dòng)物抗原-結(jié)合可變結(jié)構(gòu)域與人恒定結(jié)構(gòu)域偶聯(lián)(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)No.4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855，1984；Boulianne等人，Nature，312643-646，1984；Neuberger等人，Nature，314268-270，1985)。這種嵌合抗體的生產(chǎn)和使用在下面描述。
結(jié)合sFlt-1的配體的競(jìng)爭(zhēng)性抑制可用于預(yù)防或治療先兆子癇或子癇。sFlt-1的抗體可阻斷VEGF或PlGF與sFlt-1結(jié)合，導(dǎo)致VEGF或PlGF水平提高。這種提高可援救內(nèi)皮功能異常，并使促-血管生成/抗-血管生成因子的平衡向著血管生成方向轉(zhuǎn)變。
本發(fā)明單克隆抗體的混合物可用作先兆子癇或子癇的有效治療。該混合物可包括少至2、3或4種不同抗體或多至6、8或10種不同抗體。此外，本發(fā)明抗體可與抗-高血壓藥物(例如，甲基多巴、鹽酸肼苯噠嗪、或拉貝洛爾)或用于治療先兆子癇、子癇或與先兆子癇或子癇有關(guān)的癥狀的任何其它藥物結(jié)合使用。
抗體的制備特異性結(jié)合sFlt-1受體的單克隆抗體可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法生產(chǎn)。這些方法包括由Kohler和Milstein(Nature，256495-497，1975)以及Campbell(“Monoclonal Antibody Technology，The Productionand Characterization of Rodent and Human Hybridomas”，Burdon等人，Eds.，Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology，Volume 13，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，1985)描述的免疫學(xué)方法，以及Huse等人(Science，246，1275-1281，1989)描述的重組DNA方法。
單克隆抗體可從培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的上清液或從通過(guò)將雜交瘤細(xì)胞腹膜內(nèi)接種到小鼠中誘導(dǎo)的腹水制備。最初由Kohler和Milstein(Eur.J.Immunol，6，511-519，1976)描述的雜交瘤技術(shù)已經(jīng)廣泛用于生產(chǎn)雜種細(xì)胞系，分泌高水平的抗許多特異性抗原的單克隆抗體。
宿主動(dòng)物或從其培養(yǎng)的抗體-產(chǎn)生細(xì)胞的途徑和程序通常是用于抗體刺激和產(chǎn)生的已建立和常規(guī)的技術(shù)。通常，將小鼠用作試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，然而，任何哺乳?dòng)物被試者包括人類(lèi)被試者或來(lái)源于它的抗體產(chǎn)生細(xì)胞可按照本發(fā)明方法被操縱以作為哺乳動(dòng)物，包括人雜種細(xì)胞系產(chǎn)生的基礎(chǔ)。
免疫之后，免疫淋巴樣細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生雜種細(xì)胞系，它們可被無(wú)限培養(yǎng)和亞培養(yǎng)，從而產(chǎn)生大量單克隆抗體。就本發(fā)明的目的而言，相對(duì)于融合體選擇的免疫淋巴樣細(xì)胞是淋巴細(xì)胞和它們正常的分化后代，采集自免疫動(dòng)物的淋巴結(jié)組織或脾臟組織。優(yōu)選使用脾細(xì)胞，這是因?yàn)樗鼈兛商峁┫鄬?duì)于小鼠系統(tǒng)更濃且適宜的抗體產(chǎn)生細(xì)胞來(lái)源。骨髓瘤細(xì)胞提供用于融合雜種連續(xù)繁殖的基礎(chǔ)。骨髓瘤細(xì)胞是來(lái)源于漿細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞。鼠骨髓瘤細(xì)胞系可例如，從AmericanType Culture Collection(ATCC；Manassas，VA)獲得。還描述過(guò)人骨髓瘤和小鼠-人異雜交瘤細(xì)胞系(Kozbor等人，J.Immunol.，1333001-3005，1984；Brodeur等人，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications，Marcel Dekker，Inc.，New York，pp.51-63，1987)。
所述雜種細(xì)胞系可在細(xì)胞培養(yǎng)基中體外維持。一旦建立了雜交瘤細(xì)胞系，就可在各種營(yíng)養(yǎng)適宜的培養(yǎng)基，如次黃嘌呤-氨基嘌呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)培養(yǎng)基中維持。此外，雜種細(xì)胞系可以許多常規(guī)方式貯藏并保存，包括冷凍和在液氮下貯藏?？墒估鋬黾?xì)胞系復(fù)蘇并用重新開(kāi)始的單克隆抗體的合成和分泌無(wú)限培養(yǎng)。通過(guò)常規(guī)方法，如沉淀、離子交換色譜、親和色譜等回收組織培養(yǎng)物上清液中的分泌抗體。
所述抗體可在任何哺乳動(dòng)物中制備，包括小鼠、大鼠、兔、山羊和人。所述抗體可以是下列其中一個(gè)免疫球蛋白種類(lèi)的成員IgG、IgM、IgA、IgD或IgE及其亞類(lèi)，優(yōu)選是IgG抗體。
當(dāng)用于產(chǎn)生單克隆抗體的優(yōu)選動(dòng)物是小鼠時(shí)，本發(fā)明不限于此；事實(shí)上，可使用人類(lèi)的抗體并可證實(shí)是優(yōu)選的。這類(lèi)抗體可使用人雜交瘤獲得(Cole等人，“Monoclonal Antibodies and CancerTherapy”，Alan R.Liss Inc.，p.77-96，1985)。在本發(fā)明中，可使用通過(guò)剪接適宜抗原特異性小鼠抗體分子的基因連同人類(lèi)抗體分子的基因而生產(chǎn)嵌合抗體的技術(shù)(Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.81，6851-6855，1984；Neuberger等人，Nature 312，604-608，1984；Takeda等人，Nature 314，452-454，1985)；這類(lèi)抗體包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)并在下面描述。
作為細(xì)胞融合技術(shù)的另一選擇，Epstien-Barr病毒(EBV)無(wú)限增殖化B細(xì)胞可用于生產(chǎn)本發(fā)明的單克隆抗體(Crawford D.等人，J ofGen.Virol.，64697-700，1983；Kozbor和Roder，J.Immunol.，41275-1280，1981；Kozbor等人，Methods in Enzymology，121120-140，1986)。通常，該過(guò)程包括從適宜來(lái)源，通常是感染細(xì)胞系分離Epstein-Barr病毒，并使靶抗體分泌細(xì)胞與含病毒的上清液接觸。洗滌細(xì)胞，并在適宜的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。隨后，存在于細(xì)胞培養(yǎng)物中的病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞可通過(guò)Epstein-Barr病毒核抗原的存在而鑒定，且轉(zhuǎn)化的抗體分泌細(xì)胞可使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法鑒定。產(chǎn)生單克隆抗體，如重組DNA的其它方法也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
sFlt-l免疫原的制備sFlt-1本身可作為免疫原使用，或可與載體蛋白或其它物體，如瓊脂糖珠連接使用。sFlt-1可從已知表達(dá)內(nèi)源性蛋白的細(xì)胞，如人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞純化(HUVEC；Kendall等人，Biochem.Biophys.Res.Coma.，226324-328，1996)。此外，編碼sFlt-1的核酸分子或其一部分可使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)而被插入到已知載體中用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)。適合sFlt-1表達(dá)的宿主細(xì)胞包括桿狀病毒細(xì)胞(例如，Sf9細(xì)胞)、細(xì)菌細(xì)胞(例如，大腸桿菌)、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，NIH3T3細(xì)胞)。
此外，可合成肽并用作免疫原。制備肽抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的且通常需要將肽與適宜的載體分子，如血清白蛋白偶聯(lián)。肽包括與Genebank登記號(hào)U01134相對(duì)應(yīng)的sFlt-1氨基酸序列的任一部分基本相同的任何氨基酸序列。肽可以是任何長(zhǎng)度，優(yōu)選10個(gè)氨基酸或更多，更優(yōu)選25個(gè)氨基酸或更多，且最優(yōu)選40、50、60、70、80或100個(gè)氨基酸或更多。優(yōu)選，所述氨基酸序列與U01134序列至少60％、更優(yōu)選85％、且最優(yōu)選95％相同。肽可以是商業(yè)獲得的或使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)制備的，如，例如Merrifield固相方法(Science，232341-347，1985)。所述過(guò)程可使用商業(yè)得到的合成儀，如Biosearth9500自動(dòng)化肽機(jī)器，阻斷氨基酸的裂解是使用氟化氫獲得的，且使用Waters Delta Prep 3000儀器，在15-20μm Vydac C4 PrepPAK柱上，通過(guò)制備型HPLC純化肽。
抗體的功能等價(jià)物本發(fā)明還包括本說(shuō)明書(shū)中描述的抗體的功能等價(jià)物。功能等價(jià)物包括所具有的氨基酸序列與本發(fā)明抗體可變或高變區(qū)的氨基酸序列基本上相同的多肽。功能等價(jià)物具有可與抗體那些相比較的結(jié)合特性，且包括，例如，嵌合的、人源化單鏈抗體及其片段。生產(chǎn)這種功能等價(jià)物的方法在PCT公開(kāi)號(hào)No.WO93/21319；歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朜o.239,400；PCT公開(kāi)號(hào)No.WO89/09622；歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朜o.338,745；歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朜o.332424；以及美國(guó)專(zhuān)利號(hào)No.4,816,567中公開(kāi)；每篇均引入此處作為參考。
嵌合抗體優(yōu)選具有基本上或僅僅來(lái)源于人類(lèi)抗體恒定區(qū)的恒定區(qū)以及基本上或僅僅來(lái)源于除人類(lèi)以外的哺乳動(dòng)物可變區(qū)序列的可變區(qū)。這類(lèi)人源化抗體是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗體的其它抗原-結(jié)合子序列)，其包括來(lái)源于非-人類(lèi)免疫球蛋白的最小序列。使非-人類(lèi)抗體人源化的方法是本領(lǐng)域熟知的(見(jiàn)Vaswani和Hamilton，Ann Allergy AsthmaImmunol.，81105-119，1998和Carter，Nature Reviews Cancer，1118-129，2001)。通常，人源化抗體具有引入其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，它的來(lái)源是非人類(lèi)。這些非人類(lèi)氨基酸殘基常常被稱(chēng)作輸入殘基，它們通常是從輸入可變結(jié)構(gòu)域得到的。人源化本來(lái)可在本領(lǐng)域已知的方法之后(Jones等人，Nature，321522-525，1986；Riechmann等人，Nature，332323-329，1988；和Verhoeyen等人，Science，2391534-1536，1988)，通過(guò)用嚙齒動(dòng)物的CDR或其它CDR序列置換人類(lèi)抗體的相應(yīng)序列進(jìn)行。因此，這種人源化抗體是嵌合抗體，其中大大小于完整的人可變結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被來(lái)源于非-人類(lèi)的相應(yīng)序列置換(見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)No.4,816,567)。實(shí)際上，人源化抗體通常是人類(lèi)的抗體，其中某些CDR殘基且很可能某些FR殘基被來(lái)源于嚙齒動(dòng)物類(lèi)似位點(diǎn)的殘基置換(Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596，1992)。
制備人源化抗體的其它方法可在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)Nos.5,821,337和6,054,297以及Carter(supra)中描述，它們?nèi)恳氪颂幾鳛閰⒖肌娜我幻庖咔虻鞍追N類(lèi)中選擇人源化抗體，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同種型，包括IgG、IgG2、IgG3和IgG4。當(dāng)不需要細(xì)胞毒素活性時(shí)，如在本發(fā)明中，恒定結(jié)構(gòu)域優(yōu)選IgG2類(lèi)。人源化抗體可包括來(lái)源于不止一個(gè)種類(lèi)或同種型的序列，選擇特定的恒定結(jié)構(gòu)域以使所需效應(yīng)子功能達(dá)到最佳也在本領(lǐng)域技術(shù)人員范圍之內(nèi)。
人類(lèi)抗體還可使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)產(chǎn)生，包括噬菌體展示庫(kù)(Marks等人，J.Mol.Biol.，222581-597，1991和Winter等人，Annu.Rev.Immu7lol.，12433-455，1994)。Cole等人和Boerner等人的技術(shù)還可用于制備人單克隆抗體(Cole等人，supra；Boerner等人，J.Immunol.，14786-95，1991)。
除人類(lèi)以外適宜的哺乳動(dòng)物包括可從其制備單克隆抗體的任何哺乳動(dòng)物。除人以外哺乳動(dòng)物的例子包括，例如，兔、大鼠、小鼠、山羊、或靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物；優(yōu)選小鼠。
抗體的功能等價(jià)物還包括單鏈抗體片段，也稱(chēng)作單鏈抗體(scFv)。單鏈抗體片段是重組多肽，其通常結(jié)合抗原或受體；這些片段包含與抗體可變輕鏈序列(VL)結(jié)合的抗體可變重鏈氨基酸序列(VH)的至少一個(gè)片段，其中具有或沒(méi)有一個(gè)或多個(gè)相互連接的連接體。這種連接替可以是短的、可彎曲的肽，它們是為確保VL和VH結(jié)構(gòu)域一旦連接即發(fā)生適當(dāng)?shù)娜S折疊而選擇的，以便維持衍生單鏈抗體片段的完全抗體的靶分子結(jié)合-特異性。通常，VL或VH序列的羧基末端通過(guò)這種肽連接體與互補(bǔ)VL和VH序列的氨基末端共價(jià)連接。單鏈抗體片段可通過(guò)分子克隆、抗體噬菌體展示庫(kù)或類(lèi)似技術(shù)產(chǎn)生。這些蛋白可在真核生物細(xì)胞或原核生物細(xì)胞，包括細(xì)菌中產(chǎn)生。
單鏈抗體片段包含的氨基酸序列具有在本說(shuō)明書(shū)中描述的完全抗體的至少一個(gè)可變區(qū)或CDR，但缺少那些抗體恒定結(jié)構(gòu)域的一部分或全部。這些恒定結(jié)構(gòu)域不是抗原結(jié)合所必需的，但構(gòu)成完全抗體結(jié)構(gòu)的主要部分。單鏈抗體片段可因此克服與使用含恒定結(jié)構(gòu)域一部分或全部的抗體有關(guān)的某些問(wèn)題。例如，單鏈抗體片段傾向于缺少生物分子與重鏈恒定區(qū)之間的不需要的相互作用，或其它不需要的生物學(xué)活性。此外，單鏈抗體片段明顯小于完全抗體且因此比完全抗體具有更大的毛細(xì)管滲透性，使單鏈抗體片段局部化并更有效結(jié)合靶抗原-結(jié)合位點(diǎn)。且，抗體片段可在原核生物細(xì)胞中相對(duì)大規(guī)模地產(chǎn)生，由此促進(jìn)它們的產(chǎn)生。此外，相對(duì)較小的單鏈抗體片段可使得它們與完全抗體相比不太可能誘導(dǎo)受體的免疫反應(yīng)。
功能等價(jià)物還包括與完全抗體那些具有相同或可比較的結(jié)合特性的抗體片段。這種抗體可包含一個(gè)或兩個(gè)Fab片段或F(ab′)2片段。優(yōu)選，抗體片段包括完全抗體的全部6個(gè)CDR，雖然含有比這類(lèi)區(qū)全部要少，如3、4或5個(gè)CDR的片段也是功能性的。
此外，功能等價(jià)物可以是或可結(jié)合下列任一免疫球蛋白種類(lèi)的成員IgG、IgM、IgA、IgD或IgE，及其亞類(lèi)。
抗體功能等價(jià)物的制備抗體等價(jià)物是通過(guò)本領(lǐng)域已知方法制備的。例如，抗體片段可從完整抗體酶制備。優(yōu)選，抗體等價(jià)物是從編碼這種等價(jià)物的DNA制備的。編碼抗體片段的DNA可通過(guò)幾乎使編碼全長(zhǎng)抗體的DNA所需部分缺失而制備。
編碼嵌合抗體的DNA可通過(guò)使DNA重組而制備，該DNA基本或僅僅編碼人恒定區(qū)，且該DNA編碼基本或僅僅來(lái)源于除人類(lèi)以外的哺乳動(dòng)物可變區(qū)序列的可變區(qū)。編碼人源化抗體的DNA可通過(guò)使編碼除了基本或僅僅來(lái)源于相應(yīng)人類(lèi)抗體區(qū)的CDR之外的恒定區(qū)和可變區(qū)的DNA重組并使編碼基本或僅僅來(lái)源于除人類(lèi)以外的哺乳動(dòng)物的CDR的DNA重組而制備。
編碼抗體片段的DNA分子的適宜來(lái)源包括細(xì)胞，如雜交瘤，它表達(dá)全長(zhǎng)抗體。所述片段本身可作為抗體等價(jià)物使用，或可如上所述被重組成等價(jià)物。
本部分所述的DNA缺失和重組可通過(guò)已知方法進(jìn)行，如在上列公開(kāi)的專(zhuān)利申請(qǐng)中描述的那些。
抗體的篩選和選擇使用標(biāo)準(zhǔn)的本領(lǐng)域已知的方法分離并純化單克隆抗體。例如，可使用標(biāo)準(zhǔn)的本領(lǐng)域已知的方法，如相對(duì)于sFlt-1肽抗原進(jìn)行ELISA或進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡篩選抗體。這種技術(shù)的實(shí)施例在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)No.6,365,157的實(shí)施例II和III中描述，其引入此處作為參考。
抗體的治療用途當(dāng)體內(nèi)用于治療或預(yù)防先兆子癇或子癇時(shí)，以治療有效量將本發(fā)明抗體給予被試者。優(yōu)選，腸胃外給予所述抗體或通過(guò)連續(xù)輸注靜脈內(nèi)給予所述抗體。劑量和給藥方法取決于疾病的嚴(yán)重程度以及被試者的整體健康狀況。所給予抗體的用量通常為約0.01-約10mg/kg被試者體重。
進(jìn)行腸胃外給藥時(shí)，將抗體與藥學(xué)可接受的腸胃外賦形劑配制成單位劑量可注射形式(溶液、混懸液、乳狀液)。這種賦形劑本身是無(wú)毒且無(wú)-治療性的。這種賦形劑的例子是水、生理鹽水、Ringer′s溶液、葡萄糖溶液、以及5％人血清白蛋白。還可使用不含水的賦形劑如不揮發(fā)油以及油酸乙酯?？蓪⒅|(zhì)體用作載體。所述賦形劑可包含微量助劑如提高等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)，例如緩沖液及防腐劑。通常以約1mg/ml-10mg/ml的濃度在這種賦形劑中配制抗體。
抑制sFlt-1的治療性化合物已知在患有先兆子癇、子癇或具有發(fā)展這類(lèi)病傾向的被試者中，sFlt-1水平提高，因此可降低sFlt-1多肽或核酸分子表達(dá)的任何藥劑都可用于本發(fā)明的方法中。這種藥劑包括可破壞sFlt-1與VEGF或PlGF、反義核酸堿基寡聚物、以及用于介導(dǎo)RNA干擾的dsRNA結(jié)合的小分子。
聯(lián)合療法任選地，先兆子癇或子癇的治療可與任何其它標(biāo)準(zhǔn)的先兆子癇或子癇療法聯(lián)合進(jìn)行；這種方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的且在此處描述。本發(fā)明的先兆子癇或子癇治療可與提高VEGF途徑活性的任何化合物聯(lián)合給予。還可誘導(dǎo)內(nèi)源性VEGF產(chǎn)生的藥劑的非限制性例子包括煙堿、米諾地爾、硝苯地平、腺苷、硫酸鎂和茶堿。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，PlGF蛋白可與上列誘導(dǎo)內(nèi)源性VEGF產(chǎn)生的任何藥劑聯(lián)合使用。
被試者監(jiān)測(cè)患有先兆子癇、子癇或具有發(fā)展這類(lèi)病傾向的被試者的疾病狀況或治療可使用本發(fā)明的方法和組合物監(jiān)測(cè)。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，監(jiān)測(cè)sFlt-1、VEGF或PlGF多肽在體液，如尿液、血漿、羊水或CSF中的表達(dá)。這種監(jiān)測(cè)可能是有用的，例如，在評(píng)價(jià)特定藥物在被試者中的功效或評(píng)價(jià)疾病發(fā)展時(shí)。降低sFlt-1核酸分子或多肽表達(dá)或提高VEGF或PlGF核酸分子或多肽表達(dá)的治療在本發(fā)明中特別有效。
其它實(shí)施方案根據(jù)上述描述，很顯然可對(duì)此處描述的發(fā)明進(jìn)行各種改變和修改，并將它用于各種用途和情況。這種實(shí)施方案也在下列權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
本說(shuō)明書(shū)中提到的所有出版物均以相等程度引入此處作為參考，就好像每個(gè)獨(dú)立的出版物或?qū)＠暾?qǐng)?zhí)貏e且單獨(dú)引入此處作為參考。此外，美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/451796，2003年3月3日提交、60/397,481，2002年7月19日提交、和60/467,390，2003年5月2日提交，均整體引入此處作為參考。
權(quán)利要求
1.一種治療或預(yù)防被試者先兆子癇或子癇的方法，該方法包括給予所述被試者能夠結(jié)合可溶性Flt-1受體(sFlt-1)的化合物的步驟，其中所述給藥時(shí)間和用量足以治療或預(yù)防該被試者的先兆子癇或子癇。
2.一種治療或預(yù)防被試者先兆子癇或子癇的方法，該方法包括給予所述被試者提高能夠結(jié)合sFlt-1的生長(zhǎng)因子水平的化合物的步驟，其中所述給藥時(shí)間和用量足以治療或預(yù)防該被試者的先兆子癇或子癇。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述化合物是煙堿。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述化合物是茶堿。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述化合物選自腺苷、硝苯地平、和米諾地爾。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述化合物是純化的sFlt-1抗體或sFlt-1抗原結(jié)合片段。
7.一種治療或預(yù)防被試者先兆子癇或子癇的方法，該方法包括給予所述被試者與至少一部分sFlt-1核酸序列互補(bǔ)的反義核酸堿基寡聚物的步驟，其中所述給藥足以治療或預(yù)防該被試者的先兆子癇或子癇。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述反義核酸堿基寡聚物的長(zhǎng)度為8-30個(gè)核苷酸。
9.一種治療或預(yù)防被試者先兆子癇或子癇的方法，該方法包括給予所述被試者含有至少一部分sFlt-1核酸序列的雙鏈RNA的步驟，其中所述給藥足以治療或預(yù)防該被試者的先兆子癇或子癇。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述雙鏈RNA被加工成19-25個(gè)核苷酸長(zhǎng)的小分子干擾RNA(siRNA)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述化合物是生長(zhǎng)因子。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述生長(zhǎng)因子是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述生長(zhǎng)因子是VEGF121。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述生長(zhǎng)因子是VEGF165。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述生長(zhǎng)因子是胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(P1GF)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1、2、7或9所述的方法，還包括給予被試者抗-高血壓化合物的步驟。
17.根據(jù)權(quán)利要求1、2、7或9所述的方法，其中所述被試者是懷孕的人。
18.根據(jù)權(quán)利要求1、2、7或9所述的方法，其中所述被試者是產(chǎn)后的人。
19.根據(jù)權(quán)利要求1、2、7或9所述的方法，其中所述被試者是非-人類(lèi)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述被試者選自牛、馬、綿羊、豬、山羊、狗或貓。
21.一種治療或預(yù)防先兆子癇或子癇的方法，該方法包括給予需要這種治療的被試者有效量的含有VEGF或PlGF多肽的藥物組合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述組合物含有VEGF多肽。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述組合物含有PlGF多肽。
24.一種治療或預(yù)防先兆子癇或子癇的方法，該方法包括給予需要這種治療的被試者有效量的含有編碼VEGF或PlGF的核酸分子的藥物組合物。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述組合物含有VEGF核酸分子。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述組合物含有PlGF核酸分子。
27.一種治療或預(yù)防被試者先兆子癇或子癇的方法，該方法包括給予所述被試者抑制sFlt-1多肽結(jié)合生長(zhǎng)因子的化合物的步驟，其中所述給藥足以治療或預(yù)防被試者的先兆子癇或子癇。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述化合物結(jié)合sFlt-1并阻斷生長(zhǎng)因子的結(jié)合。
29.根據(jù)權(quán)利要求21、24或27所述的方法，還包括給予被試者抗-高血壓化合物的步驟。
30.根據(jù)權(quán)利要求21、24或27所述的方法，其中所述被試者是懷孕的人。
31.根據(jù)權(quán)利要求21、24或27所述的方法，其中所述被試者是產(chǎn)后的人。
32.根據(jù)權(quán)利要求21、24或27所述的方法，其中所述被試者是非-人類(lèi)。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述被試者選自牛、馬、綿羊、豬、山羊、狗、或貓。
34.一種診斷被試者患有先兆子癇或子癇、或具有發(fā)展先兆子癇或子癇傾向的方法，該方法包括測(cè)量所述被試者樣品中的sFlt-1、VEGF、和PlGF多肽水平。
35.一種診斷被試者患有先兆子癇或子癇、或具有發(fā)展先兆子癇或子癇傾向的方法，該方法是通過(guò)測(cè)量所述被試者樣品中sFlt-1、VEGF、和PlGF多肽中至少兩個(gè)的水平并利用度量計(jì)算所述sFlt-1、VEGF、或PlGF水平之間的關(guān)系，其中被試者樣品中所述水平之間的關(guān)系相對(duì)于參照樣品的改變可診斷該被試者的先兆子癇或子癇或發(fā)展先兆子癇或子癇的傾向。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述度量是先兆子癇抗-血管生成指數(shù)(PAAI)[sFlt-l/VEGF+P1GF]。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中大于20的PAAI值是先兆子癇或子癇的診斷指標(biāo)。
38.根據(jù)權(quán)利要求34或35所述的方法，其中所述測(cè)量是用免疫學(xué)測(cè)定法進(jìn)行的。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述免疫學(xué)測(cè)定法是ELISA。
40.根據(jù)權(quán)利要求34或35所述的方法，其中所述樣品是血清。
41.根據(jù)權(quán)利要求34或35所述的方法，其中sFlt-1水平大于2ng/ml是先兆子癇或子癇的診斷指標(biāo)。
42.根據(jù)權(quán)利要求34或35所述的方法，其中所述sFlt-1水平是游離的、結(jié)合的或總的sFlt-1水平。
43.根據(jù)權(quán)利要求34或35所述的方法，其中所述VEGF或PlGF的水平是游離的VEGF或PlGF的水平。
44.一種診斷被試者患有先兆子癇或子癇、或具有發(fā)展先兆子癇或子癇傾向的方法，該方法包括測(cè)量所述被試者樣品中的sFlt-1、VEGF、或PlGF核酸分子的水平并把它與參照樣品進(jìn)行比較，其中所述水平的改變可診斷該被試者的先兆子癇或子癇，或診斷發(fā)展先兆子癇或子癇的傾向。
45.一種診斷被試者患有先兆子癇或子癇、或具有發(fā)展先兆子癇或子癇傾向的方法，該方法包括測(cè)定被試者樣品中sFlt-1、VEGF、或PlGF基因的核酸序列，并把它與參照序列進(jìn)行比較，其中被試者核酸序列的改變是指基因產(chǎn)物在所述被試者中的表達(dá)水平的改變，可診斷患有先兆子癇或子癇的被試者，或發(fā)展先兆子癇或子癇的傾向。
46.根據(jù)權(quán)利要求34、35、44或45所述的方法，其中所述樣品是該被試者的體液，其中所述sFlt-1、VEGR或P1GF可正常檢測(cè)。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述體液選自尿液、羊水、血清、血漿或腦脊液。
48.根據(jù)權(quán)利要求34、35、44或45所述的方法，其中所述樣品是細(xì)胞。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞。
50.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述細(xì)胞是白細(xì)胞。
51.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述細(xì)胞是單核細(xì)胞。
52.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述細(xì)胞是來(lái)源于胎盤(pán)的細(xì)胞。
53.根據(jù)權(quán)利要求34、35、44或45所述的方法，其中所述樣品是組織。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述組織是胎盤(pán)組織。
55.根據(jù)權(quán)利要求34、35、44或45所述的方法，其中所述被試者是未懷孕的人且該方法可診斷發(fā)展先兆子癇或子癇的傾向。
56.根據(jù)權(quán)利要求34、35、44或45所述的方法，其中所述被試者是懷孕的人。
57.根據(jù)權(quán)利要求34、35、44或45所述的方法，其中所述被試者是產(chǎn)后的人。
58.根據(jù)權(quán)利要求34、35、44或45所述的方法，其中所述被試者是非-人類(lèi)。
59.根據(jù)權(quán)利要求34、35、44或45所述的方法，其中所述被試者是選自牛、馬、綿羊、豬、山羊、狗或貓的非-人類(lèi)。
60.根據(jù)權(quán)利要求34、35、44或45所述的方法，其中測(cè)量的至少一種所述水平是sFlt-1的水平。
61.根據(jù)權(quán)利要求34、35、44或45所述的方法，其中測(cè)量VEGF水平時(shí)，也測(cè)量sFlt-1或PlGF水平。
62.根據(jù)權(quán)利要求34、35、44或45所述的方法，其中sFlt-1核酸或多肽水平相對(duì)于對(duì)照的提高是先兆子癇或子癇的診斷指標(biāo)。
63.根據(jù)權(quán)利要求34、35、44或45所述的方法，其中游離VEGF核酸或多肽水平相對(duì)于對(duì)照的降低是先兆子癇或子癇的診斷指標(biāo)。
64.根據(jù)權(quán)利要求34、35、44或45所述的方法，其中游離PlGF核酸或多肽水平相對(duì)于對(duì)照的降低是先兆子癇或子癇的診斷指標(biāo)。
65.根據(jù)權(quán)利要求34、35或44所述的方法，其中所述水平的測(cè)量在兩種或多種場(chǎng)合下進(jìn)行且測(cè)量之間所述水平的改變是先兆子癇或子癇的診斷指標(biāo)。
66.一種用于診斷被試者先兆子癇或子癇的試劑盒，它包括選自sFlt-1、VEGF和P1GF核酸分子或與其互補(bǔ)的序列、或其任意組合的核酸序列。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的試劑盒，其中所述核酸序列包括用于檢測(cè)所述核酸分子的至少兩個(gè)核酸探針。
68.一種用于診斷被試者先兆子癇或子癇的試劑盒，它包括檢測(cè)sFlt-1、VEGF、或P1GF多肽、或其任意組合的工具。
69.根據(jù)權(quán)利要求68所述的試劑盒，其中所述檢測(cè)工具選自免疫學(xué)測(cè)定、酶測(cè)定、和比色測(cè)定。
70.根據(jù)權(quán)利要求66或68所述的試劑盒，其中所述試劑盒可診斷懷孕或未懷孕的被試者發(fā)展先兆子癇或子癇的傾向。
71.根據(jù)權(quán)利要求66或68所述的試劑盒，其中所述試劑盒可檢測(cè)sFlt-1。
72.根據(jù)權(quán)利要求66或68所述的試劑盒，其中所述試劑盒可檢測(cè)PlGF。
73.根據(jù)權(quán)利要求66或68所述的試劑盒，其中所述試劑盒檢測(cè)VEGF時(shí)，還可檢測(cè)sFlt-1或PlGF。
74.一種鑒定可改善先兆子癇或子癇的化合物的方法，該方法包括使表達(dá)sF1t-1、VEGF、或PlGF核酸分子的細(xì)胞與候選化合物接觸，并將該核酸分子在與所述候選化合物接觸過(guò)的細(xì)胞中的表達(dá)水平和在沒(méi)有與所述候選化合物接觸過(guò)的對(duì)照細(xì)胞中的表達(dá)水平進(jìn)行比較，其中所述sFlt-1、VEGF、或PlGF核酸分子表達(dá)的改變可鑒定所述候選化合物為改善先兆子癇或子癇的化合物。
75.根據(jù)權(quán)利要求74所述的方法，其中所述改變是sFlt-1水平的降低。
76.根據(jù)權(quán)利要求74所述的方法，其中所述改變是VEGF或PlGF水平的提高。
77.根據(jù)權(quán)利要求74所述的方法，其中所述表達(dá)的改變是轉(zhuǎn)錄的改變。
78.根據(jù)權(quán)利要求74所述的方法，其中所述表達(dá)的改變是翻譯的改變。
79.一種在藥學(xué)可接受的載體中配制的、包括VEGF或PlGF多肽或其一部分、以及降低高血壓的化合物的藥物組合物。
80.一種適于給予懷孕哺乳動(dòng)物的、在藥學(xué)可接受的載體中配制的、包括PlGF核酸分子或其一部分的藥物組合物。
81.根據(jù)權(quán)利要求79所述的組合物，它還包含VEGF核酸分子或其一部分。
82.一種包含可特異性結(jié)合sFlt-1的純化抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物。
83.根據(jù)權(quán)利要求82所述的組合物，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段可阻止生長(zhǎng)因子與sFlt-1結(jié)合。
84.根據(jù)權(quán)利要求82所述的組合物，其中所述抗體是單克隆抗體。
85.根據(jù)權(quán)利要求82所述的組合物，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段是人類(lèi)的抗體或人源化抗體。
86.根據(jù)權(quán)利要求82所述的組合物，其中所述抗體缺少Fc部分。
87.根據(jù)權(quán)利要求82所述的組合物，其中所述抗體是F(ab′)2、Fab、或Fv結(jié)構(gòu)。
88.根據(jù)權(quán)利要求82所述的組合物，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段存在于藥學(xué)可接受的載體中。
89.一種鑒定可改善先兆子癇或子癇的化合物的方法，該方法包括使表達(dá)sFlt-1、VEGF或PlGF多肽的細(xì)胞與候選化合物接觸，并將所述多肽在與所述候選化合物接觸過(guò)的細(xì)胞中的表達(dá)水平和多肽在沒(méi)有與所述候選化合物接觸過(guò)的對(duì)照細(xì)胞中的表達(dá)水平進(jìn)行比較，其中所述sFlt-1、VEGF、或PlGF多肽表達(dá)的改變可鑒定所述候選化合物為改善先兆子癇或子癇的化合物。
90.根據(jù)權(quán)利要求89所述的方法，其中所述表達(dá)的改變是用免疫學(xué)測(cè)定法、酶測(cè)定法、或免疫測(cè)定法測(cè)定的。
91.根據(jù)權(quán)利要求89所述的方法，其中所述表達(dá)的改變是sFlt-1水平的降低。
92.根據(jù)權(quán)利要求89所述的方法，其中所述表達(dá)的改變是VEGF或PlGF水平的提高。
93.一種鑒定可改善先兆子癇或子癇的化合物的方法，該方法包括使表達(dá)sFlt-1、VEGF或PlGF多肽的細(xì)胞與候選化合物接觸，并將所述多肽在與該候選化合物接觸過(guò)的細(xì)胞中的生物學(xué)活性和在沒(méi)有與該候選化合物接觸過(guò)的對(duì)照細(xì)胞中的生物學(xué)活性進(jìn)行比較，其中所述sFlt-1、VEGF、或PlGF多肽生物學(xué)活性的改變可鑒定所述候選化合物為改善先兆子癇或子癇的化合物。
94.根據(jù)權(quán)利要求93所述的方法，其中所述生物學(xué)活性的改變是sFlt-1活性降低。
95.根據(jù)權(quán)利要求93所述的方法，其中所述生物學(xué)活性的改變是VEGF或PlGF活性提高。
96.根據(jù)權(quán)利要求93所述的方法，其中所述生物學(xué)活性的改變是用免疫學(xué)測(cè)定法、酶測(cè)定法或免疫測(cè)定法測(cè)定的。
97.一種鑒定可改善先兆子癇或子癇的化合物的方法，該方法包括在有候選化合物存在的條件下檢測(cè)sFlt-1多肽與生長(zhǎng)因子之間的結(jié)合，其中相對(duì)于在沒(méi)有所述候選化合物存在的條件下sFlt-1多肽與生長(zhǎng)因子之間的結(jié)合，所述結(jié)合的降低可鑒定所述候選化合物為改善先兆子癇或子癇的化合物。
98.一種鑒定阻止sFlt-1多肽與生長(zhǎng)因子之間結(jié)合的多肽或其片段的方法，該方法包括在有所述候選多肽存在的條件下檢測(cè)sFlt-1多肽與生長(zhǎng)因子之間的結(jié)合，其中相對(duì)于在沒(méi)有候選多肽存在的條件下sFlt-1多肽與生長(zhǎng)因子之間的結(jié)合，所述結(jié)合的降低可鑒定該候選多肽為可阻止sFlt-1多肽與生長(zhǎng)因子之間結(jié)合的多肽。
99.根據(jù)權(quán)利要求97或98所述的方法，其中所述生長(zhǎng)因子是VEGF。
100.根據(jù)權(quán)利要求97或98所述的方法，其中所述生長(zhǎng)因子是PlGF。
101.一種鑒定可改善先兆子癇或子癇的化合物的方法，包括檢測(cè)sFlt-1多肽與候選化合物之間的結(jié)合，其中結(jié)合該sFlt-1多肽的化合物可改善先兆子癇或子癇。
102.根據(jù)權(quán)利要求101所述方法鑒定的化合物，其中所述化合物包含特異性結(jié)合sFlt-1多肽且阻止所述sFlt-1多肽與VEGF或PlGF結(jié)合的多肽。
103.根據(jù)權(quán)利要求102所述的化合物，其中所述多肽是抗體。
104.根據(jù)權(quán)利要求102所述的化合物，其中所述多肽是sFlt-1、VEGF或PlGF的片段。
全文摘要
此處公開(kāi)了用于診斷先兆子癇和子癇的方法。此處還公開(kāi)了使用提高VEGF或PlGF水平的化合物或降低sFlt－1水平的化合物治療先兆子癇和子癇的方法。此處還公開(kāi)了用于治療先兆子癇或子癇的、抑制VEGF或PlGF與sFlt1結(jié)合的化合物。
文檔編號(hào)G01N33/74GK1777443SQ03822180
公開(kāi)日2006年5月24日 申請(qǐng)日期2003年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月19日
發(fā)明者S·A·卡魯曼基, S·梅納德, V·P·蘇克哈特姆 申請(qǐng)人:貝絲以色列女執(zhí)事醫(yī)療中心