專(zhuān)利名稱(chēng)：用于診斷男性生育能力的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉 及用于診斷男性生育能力的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
近15%的夫妻在初次懷孕嘗試時(shí)會(huì)遭遇失敗。過(guò)去20年的有關(guān)數(shù)據(jù)顯示，這些 臨床病理中有大約30%單獨(dú)出現(xiàn)在男性中，另有20%出現(xiàn)在夫婦雙方均異常的人群中。 因此，在大約50%的不孕夫婦中男性要負(fù)至少一半責(zé)任。男性不育是一個(gè)影響大部分人的重要醫(yī)學(xué)問(wèn)題。大概半數(shù)的男性不育的原因甚 至在全面檢查后通常也顯示不出任何確定的具體原因。一般認(rèn)為，與男性生育能力有關(guān)的主要因素中有三個(gè)因素對(duì)成功的授精是有害 的活動(dòng)精子的數(shù)量或百分比、運(yùn)動(dòng)的速度及其方向。最常見(jiàn)的缺陷與精子的運(yùn)動(dòng)特 點(diǎn)，尤其是精子向前運(yùn)動(dòng)的能力有關(guān)，這種運(yùn)動(dòng)由精子的尾部(鞭毛)的有效擺動(dòng)控制和 產(chǎn)生。這種運(yùn)動(dòng)或所謂的精子的前向運(yùn)動(dòng)力被大多數(shù)IVF實(shí)驗(yàn)室認(rèn)為是男性生育能力最 具有預(yù)測(cè)性的指標(biāo)。根據(jù)男性生育能力的世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn)，決定男性生育能力的主要因素 是精液量、精子細(xì)胞密度、活動(dòng)性、向前前進(jìn)和形態(tài)?！罢！钡腤HO指標(biāo)是每毫升 一千萬(wàn)個(gè)活動(dòng)精子。傳統(tǒng)上，前向運(yùn)動(dòng)力(向前前進(jìn))由有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)員通過(guò)樣本的(光學(xué)) 顯微鏡分析來(lái)確定和量化。樣本經(jīng)過(guò)觀察并且精子細(xì)胞成分的幾個(gè)方面經(jīng)過(guò)量化，如活 動(dòng)百分比、密度、形態(tài)異常百分比和前向運(yùn)動(dòng)力。有大量用來(lái)評(píng)估樣本中精子的運(yùn)動(dòng)力 和數(shù)量的方法。如前所述，最普遍的方法就是顯微鏡分析法，此法一般在醫(yī)院或商業(yè)性 實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。最近，研制出了許多用以簡(jiǎn)化精子檢測(cè)的試驗(yàn)用試劑盒。W095/29188公開(kāi)了一種基于人精子SP-10抗原抗體的試驗(yàn)。ΕΡ_Α_0387873公 開(kāi)了一種使用固體珠(solidbead)的試劑盒，這種固體珠同人精子細(xì)胞頂體特有的抗體相 連。這種珠和樣本混合在一起，進(jìn)行培養(yǎng)、分離、清洗，并且檢測(cè)與此珠相連的精子數(shù) 量，優(yōu)選在顯微鏡的輔助下得以測(cè)量和檢測(cè)。W097/40386公開(kāi)了一種基于+kL，即基 于人附睪精子蛋白質(zhì)的免疫檢測(cè)的試劑盒。樣本中的精子在Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水中 通過(guò)離心作用被清洗三遍。隨后樣本在95°C下加熱變性，在14000g下產(chǎn)生離心作用，然 后用上清液來(lái)進(jìn)行分析。近年來(lái)，用途單一并能完成精液基本分析的非處方產(chǎn)品成為可能。檢測(cè)精液質(zhì) 量的比色分析法在本領(lǐng)域也眾所周知。例如，國(guó)際公布第W0/2001/060968號(hào)申請(qǐng)公開(kāi) 了 Genosis Ltd(英國(guó)，泰晤士河畔金斯頓)生產(chǎn)的以商標(biāo)“Fertell”出售的產(chǎn)品。Fertell 男性生育能力試驗(yàn)促使精子游上一個(gè)充滿液體的腔，模仿精子設(shè)法到達(dá)卵的過(guò)程。用與 膠體金相結(jié)合的抗-CD59單克隆抗體檢測(cè)精子的存在。與抗體相連的精子被捆在硝化纖 維素條上，同時(shí)未反應(yīng)的綴合物則被沖離含有過(guò)量緩沖劑的條帶。國(guó)際公布第W099/66331號(hào)申請(qǐng)公開(kāi)了一種從樣本中的非活動(dòng)精子和/或活動(dòng)性 減弱的精子中分離活動(dòng)精子或檢測(cè)活動(dòng)精子的方法和試劑盒。本發(fā)明的方法包括把一個(gè)精子樣本放在一個(gè)厚度為25-2500微米的多孔層上，并且允許樣本中的任何活動(dòng)精子通 過(guò)多孔層移動(dòng)到檢測(cè)帶，在該檢測(cè)帶檢測(cè)活動(dòng)精子。第2005287571號(hào)美國(guó)公布文本公開(kāi)了用于根據(jù)與精子相關(guān)的EP2D水平評(píng)估男 性生育能力的方法，并且還公布了用于評(píng)估男性生育能力的試劑盒。發(fā)明概述 本領(lǐng)域的診斷用試劑盒和方法的主要缺點(diǎn)之一就是他們無(wú)法用簡(jiǎn)單、快速和精 確的方法區(qū)分出樣本中的活動(dòng)和非活動(dòng)精子。此外，許多已知的診斷用試劑盒所具有的 組件增加了消費(fèi)者所能使用的試劑盒的成本和/或不能用于家庭使用的程序。現(xiàn)在，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)成功地發(fā)明了一種用于檢測(cè)是否存在具有所要求的 前向運(yùn)動(dòng)力的精子并能進(jìn)行量化分析的方法和試劑盒。本發(fā)明的方法和試劑盒與現(xiàn)存的 或已知的用于診斷男性生育能力的方法和試劑盒相比，有下列優(yōu)點(diǎn)(1)可以在醫(yī)療機(jī)構(gòu)之外，在男性受試者的家里舒舒服服地使用本診斷方法，從 而克服了原先不得不去上述機(jī)構(gòu)獲取分析樣本的尷尬；(2)本診斷方法的實(shí)施或分析(即樣本中活動(dòng)精子的存在與否)不需要醫(yī)護(hù)人員 的參與；(3)診斷實(shí)施和結(jié)果的分析僅需要幾分鐘；(4)本方法的成功實(shí)施不需要大量的精子；(5)本診斷方法可以在受試者選擇的任一時(shí)間實(shí)施；(6)本診斷可以在夫妻關(guān)系的前期實(shí)施以允許他們確定是否存在生育問(wèn)題。(7)用來(lái)實(shí)施本發(fā)明方法所使用的試劑盒價(jià)格不高；(8)本試劑盒既可以用來(lái)確定男性的生育能力又可以用來(lái)確定有前向運(yùn)動(dòng)力的精 子與沒(méi)有運(yùn)動(dòng)力的精子的百分比；(9)本試劑盒可以用來(lái)確定精子、精液中其它細(xì)胞(如白血球和未成熟的精子細(xì) 胞)和精液的PH值，從而提供精子數(shù)據(jù)、活動(dòng)能力和生育能力；(10)本試劑盒可以用來(lái)確定精液中細(xì)胞的濃度；(11)本試劑盒也可以選擇性地包括清洗精子的裝置，以在準(zhǔn)備用于宮內(nèi)授精 (IUI)的精子之前清洗精子，從而使精子有更好的存活和受精機(jī)會(huì)；而且(12)本發(fā)明的方法和試劑盒不僅可以用來(lái)分析人類(lèi)的精子，而且可以用來(lái)在遠(yuǎn) 離實(shí)驗(yàn)室的地方分析動(dòng)物精子。因此，本發(fā)明的首要方面就是提供了一種診斷男性生育能力的方法，所述方法 包括(a)把精子的樣本(如在診斷馬上開(kāi)始前或診斷前任一時(shí)段從受試者中獲得的精 子)放置在劑的附近(如不直接接觸)，在與含有精子的樣本接觸時(shí)，所述劑能夠改變其 至少一種可測(cè)的性質(zhì)；(b)給予所述樣本中的精子充足的時(shí)間，以使其朝向所述劑運(yùn)動(dòng)并與其接觸； 以及(c)確定所述樣本中存在或不存在具有前向運(yùn)動(dòng)力的精子，其中，所述劑的至少一種可測(cè)的性質(zhì)的改變表明存在具有前向運(yùn)動(dòng)力的精子。本方法在一些實(shí)施方案中還包括確定具有前向運(yùn)動(dòng)力的精子的數(shù)量，從而診斷男性生育能力。在本發(fā)明 的一些實(shí)施方案中，精子的樣本被放置在物理的屏障上，該物理的屏 障把樣本和劑分離開(kāi)來(lái)，并允許精子移動(dòng)通過(guò)所述物理的屏障。樣本一般是精液，即取 自男性受試者的或通過(guò)醫(yī)學(xué)手段獲得的含有精子的精液，或如果要評(píng)估非人類(lèi)雄性的生 育能力，可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過(guò)已知的方法獲得。樣本也可以是含有受試者精液或精子的任意樣本。這樣的樣本可以由男性受試 者通過(guò)主動(dòng)射精直接放置(儲(chǔ)存)在屏障上，或在由受試者或醫(yī)務(wù)人員收集后間接放在屏 障上。精子樣本可以是直接從男性受試者獲得的樣本、從女性陰道或人工陰道中獲得 的樣本，所述樣本要容量充足以足夠用于有效診斷。在一些實(shí)施方案中，容量少于0.3毫 升，而在其它實(shí)施方案中，容量則大于0.3毫升。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒和方法中使用的精子樣本是新鮮的精 子樣本。在其它的一些實(shí)施方案中，精子樣本是經(jīng)儲(chǔ)存的精液樣本。可以用任意的儲(chǔ)存 方法來(lái)儲(chǔ)存精液樣本，例如，在診斷前冷凍精液樣本。解凍的精子樣本可以使用本領(lǐng)域 內(nèi)任意已知的用于過(guò)濾精子的方法進(jìn)行過(guò)濾，以去除冷凍精子時(shí)所用的基底。本發(fā)明的試劑盒中選取的物理的屏障具有至少下述任一特征⑴粘度足以提供一個(gè)完整可靠的屏障；( )流動(dòng)性足以促進(jìn)精子通過(guò)其的活動(dòng)性；(iii)能夠防止精子與精子或與試劑盒的任一成分粘連；并且(iv)對(duì)精子沒(méi)有有害的影響。物理的屏障一邊與樣本接觸，而另一邊與試劑接觸，這使得樣本的位置很接近 或就在用來(lái)進(jìn)行定量和/或定性分析的試劑的附近。在一些實(shí)施方案中，如果試劑盒包 括至少兩個(gè)屏障，那么至少有一個(gè)屏障是與樣本相接觸的，并且/或者至少另一個(gè)是和 試劑相接觸的。還可以存在一個(gè)或多個(gè)附加的屏障。任何屏障物質(zhì)都應(yīng)該有足夠的容 量或厚度，以防止除了精子外其它任何樣本成分回流或擴(kuò)散通過(guò)該屏障。實(shí)際上，活動(dòng) 精子穿越屏障的能力與它積極向前運(yùn)動(dòng)的能力有關(guān)而與它消極擴(kuò)散入屏障物質(zhì)的能力無(wú) 關(guān)。如發(fā)明人所示，由于不含有具有向前運(yùn)動(dòng)力的精子的精液中的成分無(wú)法穿過(guò)屏 障，因此這樣的精液對(duì)試劑的至少一種可測(cè)的性質(zhì)的任何改變都沒(méi)有影響。此外，物理的屏障既不會(huì)與樣本中的精子也不會(huì)與含有精子的樣本中的其它成 分相互作用，并且它也不會(huì)使所述劑的至少一種可測(cè)的性質(zhì)產(chǎn)生任何變化。在一些實(shí)施方案中，屏障是液體屏障。使用液體屏障的話，所述屏障可包含懸 浮體，而懸浮體包括大量各種聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，這種懸浮體可以在油、水或其混 合物中相混合。一般來(lái)說(shuō)，PVP的濃度在每毫升0.05-0.5毫克之間，在一些實(shí)施方案中， 濃度在每毫升0.1-0.3毫克之間。該懸浮體也可能含有分散劑或其它成分，如羧甲基纖維 素鈉、透明質(zhì)酸鹽、丁二酸二辛酯磺酸鈣(dioctyl calcium sulfosuccinate)或其它物質(zhì)，這 些物質(zhì)可以組合在所述懸浮體中，并且能加強(qiáng)所描述的發(fā)明的試劑盒中使用的屏障的期 望屬性。液體屏障也可以包括油，如礦物油、甘油、丙二醇或粘液。在一些實(shí)施方案中，屏障包括礦物油，或者就是礦物油，或是一些適于用來(lái)進(jìn)行組織培養(yǎng)的物質(zhì)。在其它實(shí)施方案中，屏障是固體、半固體或凝膠屏障(gellousbarrier)。屏障可以是單一成分屏障或是多成分屏障，由至少兩種不同的屏障物質(zhì)組成， 如兩種相互之間不能溶合的不同油；兩種不同的固體(混合或?qū)盈B在一起)；油屏障以 及固體屏障等等。各種屏障物質(zhì)可以根據(jù)其相互間的關(guān)系來(lái)構(gòu)成，例如，根據(jù)它們的粘 性、孔隙率等等。在一些實(shí)施方案中，屏障由兩種不同的物質(zhì)構(gòu)成第一種是礦物質(zhì)油層，而第 二種是固體基質(zhì)，如含有可以讓精子經(jīng)由其運(yùn)動(dòng)的孔的固體網(wǎng)狀物。這種固體網(wǎng)狀物可 以放置在屏障層與劑之間或是屏障層的上部，從而把屏障物質(zhì)和含有精子的樣本分離開(kāi)來(lái)。一般來(lái)說(shuō)，使用固體基質(zhì)的話，此基質(zhì)應(yīng)有大小在50-200微米之間大小的孔。在一些實(shí)施方案中，這種固體網(wǎng)狀物是基于絲的網(wǎng)狀物(silk-based net)。一個(gè) 這種商業(yè)上普遍使用的網(wǎng)狀物就是Nitrex。在其它實(shí)施方案中，可把液體PVP屏障(含有不同比率的水/油/PVP)和礦物 油層或固體基質(zhì)混合。如下進(jìn)一步所述，本發(fā)明的方法或試劑盒并不需要使用或是出現(xiàn)任何一種額外 的化學(xué)或是物理裝置來(lái)阻止無(wú)前向運(yùn)動(dòng)力或前向運(yùn)動(dòng)力減緩的精子通過(guò)屏障朝著劑的方 向的運(yùn)動(dòng)。如下所示，本研究發(fā)現(xiàn)，屏障物質(zhì)和/或所使用的構(gòu)造足以使基本上只有具 有前向運(yùn)動(dòng)力的精子才會(huì)移動(dòng)。在本發(fā)明范圍內(nèi)，“劑”是一種化學(xué)物質(zhì)，其在與精子接觸時(shí)，會(huì)改變?nèi)魏我?種可測(cè)的性質(zhì)，如物理性質(zhì)。此物理性質(zhì)可以從下述可測(cè)的性質(zhì)中選擇顏色、濃度、 物理狀態(tài)(如固態(tài)到液態(tài))、任何一種電性質(zhì)或任何一種可測(cè)的光譜性質(zhì)。在一些實(shí)施方 案中，物理性質(zhì)的變化用肉眼就可以識(shí)別。在其它一些實(shí)施方案中，物理性質(zhì)的變化要 通過(guò)分光鏡進(jìn)行確定和/或測(cè)定。一般來(lái)說(shuō)，此劑在與本方法或試劑盒中使用的其它成分(即反應(yīng)物)，如屏障物 質(zhì)，接觸時(shí)不會(huì)改變所述至少任一種可測(cè)的性質(zhì)中的任何一種。在一些實(shí)施方案中，物理性質(zhì)是顏色，并且一旦與精子接觸，所產(chǎn)生的變化用 肉眼就可以確定和/或測(cè)定。在其它實(shí)施方案中，此劑是一種指示劑，它在與精子接觸時(shí)會(huì)改變顏色和/或 濃淡(色調(diào))，在顏色和/或濃淡上的所述變化可被定性和/或定量地測(cè)量到，從而既可 以診斷男性的生育能力又可以確定具有前向運(yùn)動(dòng)力的精子的百分比。此劑可以是例如以 Bradford、Biuret和Lowry為名稱(chēng)的商用的一種或兩種試劑。可以商業(yè)地使用這些分析試 劑，或者可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的試驗(yàn)過(guò)程來(lái)準(zhǔn)備這些分析試劑。在一些實(shí)施方案中，指示劑就是Bradford。"Bradford"是一種光譜分析試驗(yàn)，它用于根據(jù)所測(cè)蛋白質(zhì)的氨基酸組成成分 來(lái)測(cè)量樣本中蛋白質(zhì)的濃度。此試驗(yàn)以顏料考馬斯法(dye Coomassie)中的吸光度偏移 (absorbance shift)為基礎(chǔ)。此:Bradford試劑產(chǎn)品由甲醇和磷酸中的亮藍(lán)G組成。到目前 為止，Bradford試驗(yàn)還沒(méi)有有關(guān)用于精子檢測(cè)和/或定量分析的報(bào)告。根據(jù)樣本中精子的存在與否和 活動(dòng)精子的數(shù)量(一般百分比活動(dòng)性是可測(cè)的)，Bradford在一接觸精子就產(chǎn)生的顏色變化是一種從grey-violate色(或從任何一種原始顏 色)向任何深淺的藍(lán)色(或基于原始顏色的任何深淺的其它顏色)的變化。如下所示， 顏色的變化是活動(dòng)精子數(shù)量的標(biāo)示，與方法中使用的樣本數(shù)量無(wú)關(guān)?？砂杨伾兓膹?qiáng)度與預(yù)先標(biāo)定的顏色基準(zhǔn)相對(duì)比，此顏色基準(zhǔn)是診斷用試劑 盒的一部分。因此，本發(fā)明的方法也包括把與精子接觸的劑的顏色與用于進(jìn)行定性和/ 或定量測(cè) 定的預(yù)先標(biāo)定的顏色基準(zhǔn)相對(duì)比的步驟。例如，通過(guò)把結(jié)果顏色與預(yù)先標(biāo)定的 顏色基準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比，此男性受試者可以確定是否實(shí)驗(yàn)樣本中精子含量多余規(guī)定容量中正 常精子數(shù)，如，多于每毫升二千萬(wàn)個(gè)(稱(chēng)為陽(yáng)性反應(yīng))或者少于每毫升二千萬(wàn)個(gè)(稱(chēng)為陰 性反應(yīng))。在其它實(shí)施方案中，指示劑是一種Biuret試劑?！癇iuret試劑”是由氫氧化鉀 (KOH)和硫酸銅(CuSO4)及酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6 · 4H20)組成的。這種藍(lán)色試劑在 精子出現(xiàn)時(shí)會(huì)變成紫色/粉色。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，指示劑是一種用于Lowry蛋白分析的試劑。在一些進(jìn)一步的實(shí)施方案中，樣本中的精子濃度通過(guò)使用測(cè)定精子的組織特異 性的蛋白質(zhì)抗原的第一抗體來(lái)確定，其條件是允許所述抗體與所述樣本中出現(xiàn)的任意抗 原相粘合，并且確定所述粘合在有或無(wú)一種第二抗體時(shí)的頻率，其中，所述粘合的發(fā)生 頻率指示出所述樣本中整個(gè)精子的濃度。此處所用抗體是在本領(lǐng)域中已知的任意一種檢 測(cè)精子的抗體，如精子中心?？贵w、抗精液肝素結(jié)合蛋白的抗體(antibody against seminal fluid heparin-binding protein)、抗動(dòng)力蛋白(細(xì)胞質(zhì)的或基因絲的)抗體和結(jié)合到精子的頂 體部位的抗體。在一些情況下，在使用抗體檢測(cè)時(shí)，精子樣本一經(jīng)收集就迅速冷凍以防止所述 樣本中的抗原被降解。精子通過(guò)屏障朝著劑的方向的主動(dòng)運(yùn)動(dòng)是通過(guò)重力作用實(shí)現(xiàn)的，例如，通過(guò)把 樣本放在劑的上方的位置，從而使得精子朝著重力的方向運(yùn)動(dòng)。在其它實(shí)施方案中，精 子的移動(dòng)是一種被迫的移動(dòng)，通過(guò)這種方法，使精子被迫穿過(guò)屏障。這樣的被迫移動(dòng)允 許構(gòu)造水平的試劑盒，其中，樣本大體上被放在指示劑的旁邊，例如，放在指示劑的右 邊或左邊，而不是象在垂直構(gòu)造中那樣放在劑上方。在一些實(shí)施方案中，劑被放置在至少一種能夠協(xié)助精子朝著劑的方向移動(dòng)的化 學(xué)引誘物的附近。另一方面，本發(fā)明所用的方法進(jìn)一步考慮到根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何一種步驟 (例子詳見(jiàn)http://sharedicmmev.com/kd/sperm washing.html)把此處所示的生育能力診斷
與生育能力診斷之前的精子清洗步驟或與之相平行的精子清洗步驟相結(jié)合以為實(shí)施IUI試 驗(yàn)準(zhǔn)備好精子，從而考慮到了精子存活和受精的更好時(shí)機(jī)。此方法的優(yōu)點(diǎn)在于單一原始 的一定量的精液被分成了兩種樣本，一種用于生育潛能分析，另一種用于IUI試驗(yàn)。本領(lǐng)域總所周知的是，精子清洗把精子細(xì)胞從精液中分離出來(lái)，去掉了樣本中 死亡或移動(dòng)緩慢的精子，也去除了會(huì)損害受精的額外化學(xué)成分。因此，一旦精子經(jīng)過(guò)清 洗，就可以用于IUI試驗(yàn)以實(shí)現(xiàn)懷孕。精子清洗過(guò)程包括使用精子清洗液去除可能在子宮中產(chǎn)生不良反應(yīng)的化學(xué)物 質(zhì)。此處所使用的精子清洗液可以是本領(lǐng)域已知的任意一種精子清洗液。例如，清洗液可含有密度梯度化合物，如右旋糖酐、碘克沙醇、蔗糖、聚合物、密度梯度分離液 (nycodenz)或聚乙烯吡咯烷酮、覆蓋著二氧化硅的平衡鹽溶液和大分子。 本發(fā)明的另一個(gè)方面在于提供了一種確定樣本懷孕潛能或在兩個(gè)或多個(gè)精子樣 本中識(shí)別具有懷孕潛能的精子樣本的方法，所述方法包括(i)從男性受試者(如捐獻(xiàn)者)處得到至少一種精子樣本，其中，可隨著時(shí)間的 推移獲得額外的樣本(如從同一個(gè)受試者處)；( )從所述至少一種精子樣本中各獲得一等分試樣；(iii)根據(jù)本發(fā)明的方法測(cè)試所述等分試樣以確定懷孕潛能；和(iv)確定樣本是否具有懷孕潛能或確定具有懷孕潛能的至少一種精子樣本。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括此處所述的精子清洗步驟。在一些進(jìn) 一步的實(shí)施方案中，具有懷孕潛能的精子樣本，即那些具有必要的活動(dòng)精子量的精子樣 本，可以用于受精，如利用人工生殖術(shù)(ART)。本診斷方法被用來(lái)甄選精子樣本以檢測(cè)精子樣本的懷孕潛能。在一些實(shí)施方案 中，該甄選以確定活動(dòng)精子的數(shù)量為基礎(chǔ)。本發(fā)明的這種方法可以用來(lái)識(shí)別大量精子樣 本中有懷孕潛能的樣本或確定個(gè)體精子質(zhì)量(如活動(dòng)精子率等)隨著時(shí)間推移的變化(如 波動(dòng))。因此，本發(fā)明還涉及到一種識(shí)別潛在不育男性或鑒定男性在影響其生育能力的 事件，如放射治療、輸精管切除術(shù)、器官再造的傷害、年齡、一般醫(yī)療狀況和其它醫(yī)護(hù) 人員可以確定的事件后的生育能力的方法。本發(fā)明的方法，尤其是它的定量分析方面可 以用于估算樣本中活動(dòng)精子的數(shù)量。例如，每毫升少于大約兩千萬(wàn)個(gè)精子的定量分析結(jié) 果顯示出樣本懷孕潛能低；每毫升多余大約兩千萬(wàn)個(gè)精子但少于大約四千萬(wàn)個(gè)精子的定 量分析結(jié)果顯示出樣本懷孕潛能不明確；而多余每毫升大約四千萬(wàn)個(gè)精子的定量分析結(jié) 果顯示出樣本懷孕潛能高。而在其它方面，本發(fā)明提供了精子診斷用試劑盒，在一些實(shí)施方案中，這些試 劑盒含有大量簡(jiǎn)單的試劑和裝在盒子里的裝置。確定男性生育能力的方法或此處所示的 其它方法所使用的試劑盒包括⑴用來(lái)盛放含有精子的樣本的至少一個(gè)容器；(ii)接收器，該接收器在其第一端具有第一隔層(compartment)，此第一隔層含 有至少一種劑，在與含有精子的樣本接觸時(shí)，所述至少一種劑能夠改變其至少一種可測(cè) 的性質(zhì)，并且該接收器在其第二端具有用于盛放樣本的第二隔層，一屏障把所述第一隔 層與所述第二隔層分離開(kāi)來(lái)，以允許樣本中的精子穿過(guò)而在所述樣本和所述劑之間不直 接接觸；和(iii)使用指南。此處所用術(shù)語(yǔ)“隔層”可以指用物理方法與其它腔室分離出來(lái)的任何腔室，或 指接收器的不能用任意一種物理方法與其它容積分離出來(lái)的任意容積。本試劑盒還包括用于盛放精子樣本和把它分成兩個(gè)或更多個(gè)部分的至少一個(gè)測(cè) 量單元。本試劑盒進(jìn)一步包含用于盛放精子清洗液的至少一個(gè)額外的接收器以使精子得 以清洗。本試劑盒更包括一種促進(jìn)精子收集的精子隔離裝置(sperm isolation means)(如成漏斗狀)。本試劑盒也包括如上所述的至少一個(gè)預(yù)先標(biāo)定的顏色基準(zhǔn)以確定樣本中精子的 濃度。本發(fā)明的試劑盒可以在沒(méi)有醫(yī)務(wù)人員的干預(yù)下，由進(jìn)行測(cè)試的男性自行操作。本發(fā)明的方法和試劑盒對(duì)于確定動(dòng)物的生育能力，尤其是有與人類(lèi)相同的精子 濃度和大小的動(dòng)物，如狗、牛、馬、兔子等的生育能力也十分有用。附圖簡(jiǎn)述
為了理解本發(fā)明以及其在實(shí)際中的運(yùn)用，將以非限制性實(shí)施例的方式結(jié)合所附 視圖來(lái)描述實(shí)施方案，其中

圖1是依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案構(gòu)建的一個(gè)一般的試劑盒的示意圖。圖2A和2B是本發(fā)明的試劑盒的兩個(gè)實(shí)施方案的示意圖。圖3是本發(fā)明的試劑盒的一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案的示意圖。圖4是本發(fā)明的試劑盒的另一個(gè)實(shí)施方案的示意圖。示例性實(shí)施方案的詳述此處顯示的方法和試劑盒易于實(shí)施和操作并且可以在不到15分鐘的時(shí)間內(nèi)完 成。如上所述，這些方法和試劑盒提供了許多有用信息，例如，監(jiān)控由于諸如飲食、睡 眠、運(yùn)動(dòng)、暴露在煙霧或其它致癌物質(zhì)中以及酒精或毒品的攝取等變化因素對(duì)之后產(chǎn)生 的精子樣本的生育能力的影響。而且，這些方法和試劑盒也能顯示出某一特定男性的男性生育能力或避孕治療 是否有效或者隨后從同一男性中提取的精子是否具有懷孕的能力。此外，這些方法和試 劑盒對(duì)決定特定精子樣本是否適合于在ART中使用也十分有用。圖1顯示了本發(fā)明的試劑盒的一個(gè)示例性的實(shí)施方案。放置有一個(gè)容器10，該 容器10用來(lái)盛放例如指示劑12的劑、屏障14以及位于屏障14的頂部的來(lái)自男性受試者 的精液樣本16 (可能含有活動(dòng)和非活動(dòng)精子)。如圖4所示結(jié)構(gòu)，容器10可以具有不同 形狀的底部。雖然圖中顯示的容器10大體上是個(gè)矩形，但其可被設(shè)置成具有任何所選擇 的形狀，例如，設(shè)置成漏斗型容器以便于男性捐獻(xiàn)者收集和獲得精子樣本。容器10可選 用任意生物相容性材料來(lái)制造，如玻璃或塑料。容器可以制成任意大小。一旦把精子樣 本16加入容器10中屏障層14的頂部，活動(dòng)精子就開(kāi)始通過(guò)屏障14朝著位于容器10底 部的指示劑12移動(dòng)。一段足夠的時(shí)間后(大約15分鐘)，如果精子樣本中含有活動(dòng)精 子，則指示劑12會(huì)產(chǎn)生顏色變化。沒(méi)有使用任何間隔物進(jìn)行分離，容積12、14和16在 此各被稱(chēng)為一個(gè)隔層。容器可以選擇性地包括一個(gè)附加的接收器A來(lái)盛放精子清洗液B以在例如宮內(nèi) 人工授精(IUI)過(guò)程之前清除死亡樣本或移動(dòng)緩慢的精子以及可能損害受精過(guò)程的其他化 學(xué)制劑。由此，精子樣本得以等分，一等分試樣用來(lái)進(jìn)行生育能力診斷，而另一等分試 樣則用此處所述精子清洗液進(jìn)行清洗。在第二等分試樣精子樣本在經(jīng)過(guò)清洗后，會(huì)被送 到一個(gè)附加的接收器C中進(jìn)行儲(chǔ)存以用于宮內(nèi)人工授精(IUI)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案 中，為了連接用于放置精子樣本的注射器或一次性吸管，接收器A的外表面呈螺紋狀。在本發(fā)明的實(shí)施過(guò)程中，較大或較小的接收器均可使用，不會(huì)超出本發(fā)明的范 圍。為了最大限度利用特定診斷目的精子診斷/清洗和宮內(nèi)人工授精(IUI)過(guò)程，可以采用用于不同數(shù)量的精子樣本、精子清洗液和屏障物質(zhì)的這些其他尺寸的接收器?；蛘?，如圖2A所示，把精子樣本16加入具有包含在容器10的底部的指示劑12 的容器20中，在指示劑12上方放有屏障層14，并且該屏障層14用例如絲層(Silklayer)IS 包邊，以防止所加入的精子樣本與屏障物質(zhì)相混合。如圖2B所示，也可以在指示劑12 和屏障層14中間放入另一個(gè)絲層18A。

如圖3所示，在本發(fā)明的試劑盒的另一個(gè)示范實(shí)施方案中，容器30中 盛放了位 于容器底部的指示劑12、位于指示劑12與可能和指示劑12相同或不同的第二種指示劑 12A之間的屏障層14，以及位于指示劑12A和精子樣本16之間的第二屏障層14A。與 之前一樣，屏障層14和14A均可用固體基質(zhì)，如絲層，包住其一邊或兩邊。如前所示，容器可以是大體上豎直的或水平的，可以有不同的隔層，隔層的擺 放順序與以上任一實(shí)施方案相似。
權(quán)利要求
1.一種用于診斷男性生育能力的方法，所述方法包括(a)把精子的樣本放在劑的附近，在與含有精子的樣本接觸時(shí)，所述劑能夠改變其至 少一種可測(cè)的性質(zhì)；(b)給予所述樣本中的精子充足的時(shí)間，以使其朝向所述劑移動(dòng)并與所述劑接觸；以及(c)確定所述樣本中存在或不存在具有前向運(yùn)動(dòng)力的精子，其中，所述劑的至少一種物理性質(zhì)的改變表明存在具有前向運(yùn)動(dòng)力的精子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，能夠改變其至少一種可測(cè)的性質(zhì)的所述劑是指 示劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述指示劑是Bradford。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述指示劑是雙縮脲試劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述指示劑是通過(guò)Lowry蛋白分析獲得的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述精子的樣本被放置在物理的屏障上，所述 物理的屏障把樣品和劑相分離并允許精子移動(dòng)通過(guò)所述物理的屏障。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述屏障是液體屏障。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述屏障是固體、半固體或凝膠。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述固體是具有大小為50-200微米范圍的孔 的固體基質(zhì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其中，所述基質(zhì)是基于絲的網(wǎng)狀物。
11.根據(jù)權(quán)利要求6至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述屏障是單一成分屏障。
12.根據(jù)權(quán)利要求6至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述屏障是多成分屏障。
13.根據(jù)權(quán)利要求6至7、11或12中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述屏障是懸浮體的 形式，所述懸浮體含有至少一種聚乙烯吡咯烷酮、油、水以及其混合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13中所述的方法，其中，所述油是礦物油。
15.根據(jù)權(quán)利要求6至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述屏障還包含丙三醇、丙二 醇和粘液中的至少一種。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法， 述改變能用肉眼識(shí)別和/或測(cè)量。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法， 精子濃度的步驟。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法， 的附近。
19.一種確定精子樣本中懷孕潛能的方法，所述方法包括(a)從男性受試者處獲得至少一個(gè)精子樣本；(b)從所述至少一個(gè)精子樣本中的每一個(gè)中獲得一等分試樣；(C)根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的方法檢測(cè)各等分試樣，以確定懷孕潛能；和(d)確定所述至少一個(gè)精子樣本具有懷孕潛能。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括精子清洗的步驟，從 而，在所述診斷之前，或所述診斷的同時(shí)，大量精子得以清洗。2其中，所述劑的至少一種物理性質(zhì)的所 其中，所述方法還包含確定所述樣本中 其中，所述劑位于至少一種化學(xué)引誘物
21.一種在確定男性生育能力的方法中使用的試劑盒，所述試劑盒包括(a)至少一個(gè)容器，其用于盛放含有精子的樣本；(b)接收器，其在第一端具有第一隔層，所述第一隔層含有至少一種劑，在與含有精 子的樣本接觸時(shí)，所述至少一種劑能夠改變其至少一種可測(cè)的性質(zhì)，并且所述接收器在 所述接收器的第二端具有用于盛放樣本的第二隔層，所述第一隔層與所述第二隔層通過(guò) 一屏障分離開(kāi)來(lái)，以允許所述樣本和所述劑液體之間相通但不直接接觸；以及(C)使用指南。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，還包括精子隔離裝置。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，還包括用于確定樣本中精子濃度的至少一個(gè)預(yù)先 標(biāo)定的顏色基準(zhǔn)。
24.根據(jù)權(quán)利要求21至23中任一項(xiàng)所述的試劑盒，所述試劑盒還包括用于盛放精子 樣本并把所述樣本分離成兩個(gè)或更多個(gè)部分的至少一個(gè)測(cè)量單元。
25.根據(jù)權(quán)利要求21至24中任一項(xiàng)所述的試劑盒，所述試劑盒還包括用于盛放精子 清洗液以清洗精子的至少一個(gè)附加接收器。
26.根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求21至25中任一項(xiàng)所述 的試劑盒，其中，所述樣本一旦被收集，就立即予以冷凍。
27.—種方法，其如說(shuō)明書(shū)和說(shuō)明書(shū)附圖所公開(kāi)的。
28.—種試劑盒，其如說(shuō)明書(shū)和說(shuō)明書(shū)附圖所公開(kāi)的。
全文摘要
公開(kāi)了一種用于診斷男性生育能力的方法和試劑盒。
文檔編號(hào)G01N33/58GK102016591SQ200980114881
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2009年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月20日
發(fā)明者泰德哈爾·贊巴爾 申請(qǐng)人:泰德哈爾·贊巴爾