專利名稱：一種檢測雙烯雌酚的金標(biāo)免疫層析半定量檢測試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明免疫檢測和獸藥殘留檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種雌激素雙烯雌酚殘
留的快速檢測工具，具體而言，本發(fā)明涉及一種雙烯雌酚金標(biāo)免疫層析半定量檢測試紙 及其制備方法和使用方法。
背景技術(shù)：
雙烯雌酚(dienestrol， DE)是一種人工合成的非甾體類雌激素，其化學(xué)名為3， 4-雙(對羥基苯基)-2， 4-己二烯，含有酚羥基，是一種弱酸性化合物，主要應(yīng)用于提高 奶牛產(chǎn)奶量和畜禽動物的生長催肥。相對于天然雌激素，人工合成雌激素通常比較穩(wěn) 定，在體內(nèi)滯留時間長，易在人和動物的脂肪及其他組織中殘留，因此，可以通過食物 鏈危害人類健康。具體表現(xiàn)為女性幼兒提前發(fā)育，男性兒童乳腺發(fā)育成女性化；男性生 殖發(fā)育異常與病變及女性乳腺癌和子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生率上升，同時具有致癌作用。目 前，世界上許多國家禁止其應(yīng)用。 現(xiàn)有的雙烯雌酚檢測方法為色譜法，但是這些方法需要有完善的實驗室，有經(jīng) 驗的技術(shù)人員及昂貴的儀器設(shè)備，且檢測過程繁瑣，不適應(yīng)現(xiàn)場大量樣本的篩查。基于 抗原抗體免疫反應(yīng)的免疫學(xué)檢測技術(shù)為小分子殘留物的分析檢測提供了一個新的途徑。 基于此原理建立的酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)具有便捷，快速，靈敏等特點，但是該技術(shù)要 求檢測人員具有較高的技術(shù)水準(zhǔn)，也需要酶標(biāo)儀等簡單的設(shè)備，分析時間一般l-4小時， 仍然有其局限性。因此，需要我們研制更加簡單快捷方便的檢測工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種簡便、快捷、靈敏、價格低廉的雙烯雌酚免疫層析 半定量檢測試紙及其使用方法。 本發(fā)明提供的雙烯雌酚金標(biāo)免疫層析半定量檢測試紙是在涂有不干膠不吸水的 聚氯乙烯(polyvinyl chloride, PVC)背襯上依次貼有樣品吸收墊、膠體金標(biāo)記墊、檢測反 應(yīng)墊和吸水墊。 所述的膠體金標(biāo)記墊為玻璃纖維或醋酸纖維或尼龍膜，其上標(biāo)記的物質(zhì)為雙烯 雌酚多克隆抗體。 所述的檢測反應(yīng)墊上面包被有雙烯雌酚人工抗原作為檢測線，同時還包被有第
二抗體作為質(zhì)控線。本發(fā)明中雙烯雌酚人工抗原為雙烯雌酚與載體蛋白的偶聯(lián)物，載體
蛋白一般用牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)。 第二抗體是與雙烯雌酚抗體不同種動物的抗雙烯雌酚抗體的抗體。 本發(fā)明所述的雙烯雌酚免疫層析半定量檢測試紙的各部分制備方法與及功能如
下 1、背襯為一面涂有不干膠的韌性材料，如PVC板，起固定支持試紙其他組 成部分的功能。
3
2、樣品吸收墊的制備將濾紙或玻璃纖維紙浸入pH7.4的PBS溶液中2分鐘， 取出8(TC烘干或其他方式干燥，作為樣品吸收墊，便于樣品溶液向上移動。
3、膠體金標(biāo)記物墊的制備該部分起承載膠體金標(biāo)記抗體的作用。包括金溶膠 的制備，雙烯雌酚抗體的金標(biāo)記，膠體金標(biāo)記物的處理。 (1)膠體金溶膠的制備將HAuCl4先配制成0.01 %水溶液，取100ml加熱至 沸。攪動下準(zhǔn)確加入1.2ml的1 %檸檬酸三鈉(Na3C6H507.2H20)水溶液。繼續(xù)加熱煮沸 15min。此時可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑 色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。全過程約2 3min。冷卻至室溫后用蒸餾水恢復(fù)至原體積。 電子顯微鏡觀察金溶膠顆粒的均勻度，經(jīng)測定所制備的膠體金溶膠顆粒直徑為40nm。
(2)膠體金標(biāo)記雙烯雌酚抗體取兩支試管，向其中各加入1.2ml步驟(1)中制 備的40nm膠體金溶膠，加入適量25mMK2C03把pH調(diào)整為90，分別加入10iU濃度 為lmg/ml雙烯雌酚抗體，混勻，室溫放置10min，分別加入12iU 2% PEG20000，室溫 放置5min， 10000rpm離心20min，輕輕吸除上清，用20 y 1 PBS溶液重懸浮松散的膠體 金沉淀，并集中到新管中，分別加20iU甘油，充分混勻，即為膠體金標(biāo)記雙烯雌酚抗 體，-201:保存?zhèn)溆谩?(3)膠體金標(biāo)記墊的制備用Biodot點膜機(jī)將膠體金標(biāo)記雙烯雌酚抗體噴點在膠 體金結(jié)合墊上，將雙烯雌酚-BSA偶聯(lián)物和羊抗兔IgG包被在硝酸纖維素膜的檢測區(qū)和質(zhì) 控區(qū)，充分干燥。 4.吸水墊的制備將玻璃纖維紙或濾紙或吸水紙室溫干燥后，即為吸水墊。吸 水墊的主要作用是吸收移動上來的多余樣品溶液。 本發(fā)明所述雙烯雌酚免疫層析半定量檢測試紙的組裝在背襯上依次貼有樣品 吸收墊、膠體金標(biāo)記墊、檢測反應(yīng)墊和吸水墊，即得本發(fā)明所述的雙烯雌酚免疫層析半 定量檢測試紙。檢測時，可根據(jù)需要將所述試紙切成合適寬度的試劑條。
另一方面，本發(fā)明提供了一種檢測雙烯雌酚殘留的方法，該方法優(yōu)選使用本發(fā) 明所述的檢測試紙。所述檢測方法包括(l)任選地，檢測前先將凍存的待檢樣本和試劑 條在室溫下放置一段時間，通常為l小時以上，使其恢復(fù)至室溫；(2)將試紙條浸入樣品 溶液4-6秒，液面不得超過試紙條上的MARK線，平放在試驗臺上，5分鐘后觀察結(jié)果。 如果是試劑板，在加樣孔中滴加3滴樣品溶液，5分鐘后即可觀察結(jié)果。結(jié)果判斷如 果樣品中有雙烯雌酚存在，則只出現(xiàn)紅色的質(zhì)控線條帶，此時結(jié)果為陽性。如果檢測線 和質(zhì)控線都出現(xiàn)紅色條帶，則結(jié)果為陰性。如果質(zhì)控線沒有出現(xiàn)紅色條帶則試劑失效。
具體實施例方式
檢測線包被有濃度為0.2-20 ii g/ml的雙稀雌酚單克隆抗體或雙稀雌酚檢測用抗原 l條，寬lmm;兩條線包被有濃度為2-6mm。當(dāng)檢測線比對照線顏色淺時，則樣品為陽 性。對照線始終顯色，若對照線不顯色，表明試紙失敗。
本發(fā)明的有益效果 ①特異性強(qiáng)。該試紙檢測方法特異性極強(qiáng)，與己稀雌酚、雌二醇等藥物基本沒
有交叉反應(yīng)，避免了其它藥物對檢測的干擾。 ②靈敏度高。本試紙最低檢測限為10iig/kg。
③能夠?qū)崿F(xiàn)半定量檢測。本檢測方法不但能夠定性檢測，更重要的是根據(jù)檢測 線顏色與對照線顏色對比達(dá)到定量檢測目的。 ④操作簡單方便。對牛奶、動物尿液可直接檢測，肉類等組織樣品簡單處理后 即可檢測。本試紙不需任何專業(yè)培訓(xùn)，不需任何儀器設(shè)備，普通人員都可操作，只要將 試紙插入檢測液中，用肉眼判讀。因此，本方法適用面寬，衛(wèi)生檢測監(jiān)督部門、動物養(yǎng) 殖單位、屠宰場以及消費者個人均可使用。 ⑤速度快，通量大，顏色穩(wěn)定。試紙插入樣液中，5min以后便可觀察結(jié)果，一 個人可以同時、連續(xù)檢測，檢測通量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于HPLC法，比雙稀雌酚ELTSA試劑盒檢測 速度則快50倍以上，并且其顏色可永久保存，而不會象ELISA底物那樣很快就變色。
⑥溫度適宜范圍寬。在4-35t:均可使用，結(jié)果正常，不需在低溫下進(jìn)行，不需 采取保溫措施，室內(nèi)野外均可使用。 ⑦試紙保質(zhì)期長。據(jù)加速老化試驗結(jié)果，干燥條件下試紙保質(zhì)期可達(dá)2年。
⑧成本低廉。本方法檢測成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于雙稀雌酚ELISA試劑盒檢測法，隨著規(guī) 模化生產(chǎn)后，其成本還會大幅度降低。 提供下述實施例是為了更好地進(jìn)一步理解本發(fā)明，而決不對本發(fā)明的內(nèi)容和保
護(hù)范圍構(gòu)成任何限制。 實施例 實施例1免疫原的合成及免疫血清的制備
1.1雙稀雌酚人工抗原的制備 雙稀雌酚偶合抗原分為免疫用抗原和檢測用抗原，前者用于免疫動物，后者用
于抗體制備中抗體的檢測篩選和試紙制備中的膠體金標(biāo)記或檢測線包被。 免疫用抗原制備稱取26.6毫克(O.lmmol)雙烯雌酚溶于lmlDMSO中，充分?jǐn)嚢枋蛊渫耆芙猓?加入11.7毫克氯乙酸鈉，室溫攪拌1小時； 稱取50毫克KLH，以O(shè).lmol/L的PBS溶解，緩慢滴加DMSO充分?jǐn)嚢?，使?占總?cè)芤旱?0%，將氯乙酸鈉活化的雙烯雌酚加入到KLH溶液中，以10M氫氧化鈉調(diào)溶 液pH值至ll，加入EDC0.2-0.3M(約100mg)，攪拌反應(yīng)過夜，即得雙烯雌酚-KLH偶聯(lián)物。然后，將偶聯(lián)物過SephadexG-25M凝膠層析純化，用0.01M pH 7.4PBS三倍柱床
體積平衡，調(diào)節(jié)流速至3ml/min，樣品濃縮至5ml加入到平衡好的層析柱中層析提純偶聯(lián)
物，洗脫液用pH7.4 0.01MPBS。 提純后的免疫原分裝后-20°〇凍存。 1.2包被用抗原的制備 稱取26.6毫克(O.lmmol)的雙烯雌酚溶于lml無水吡啶中，加入10毫克琥珀酸 酐，室溫下攪拌4小時，W吹干，以一定體積DMSO復(fù)溶。 稱取40毫克卵清蛋白(OVA)，以O(shè).lmol/L的PBS溶解，緩慢滴加DMSO充分?jǐn)?拌，使其占總?cè)芤旱?0%，將琥珀酸酐活化的雙烯雌酚加入到OVA溶液中，以10M氫氧 化鈉調(diào)溶液pH值至ll，加入EDC0.2-0.3M(約100-150mg)，攪拌反應(yīng)過夜，即得雙烯雌 酚-卵清蛋白偶聯(lián)物(DE-OVA)。
然后，將上述DE-OVA過SephadexG-25M凝膠層析純化，用0.01M pH 7.4PBS三
倍柱床體積平衡，調(diào)節(jié)流速至3ml/min，樣品濃縮至5ml加入到平衡好的層析柱中層析提 純偶聯(lián)物，洗脫液用pH 7.4 0.01M PBS。
提純后的包被抗原分裝后-2(TC保存。
1.3雙稀雌酚單克隆抗體制備 取健康4周齡雌性二級Balb/c小鼠5只進(jìn)行免疫。第一次基礎(chǔ)免疫將O.lmL雙 稀雌酚免疫用抗原與等量完全弗氏佐劑用攪拌器充分混勻乳化，進(jìn)行腹腔注射，注射量 0.2mL/只。2周后開始進(jìn)行加強(qiáng)免疫，佐劑換為不完全弗氏佐劑，每隔兩周加強(qiáng)免疫一 次，末次免疫3d后取脾臟融合。先將HAT培養(yǎng)液、TMDM不完全培養(yǎng)液、IMDM完全培養(yǎng)液和50% PEG-2000
溶液于37t:水浴中預(yù)溫，同時將另一盛水的燒杯放入37t:水浴中預(yù)溫。將上述制備好的 脾細(xì)胞和骨髓細(xì)胞和脾細(xì)胞按1 : 4的比例混合，在50mL的塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng) 液洗1次，1000r/min離心8min，棄上清，用滴吸凈殘留液體。置37。C水浴中，將吸管 插入管底，在60s內(nèi)邊攪拌邊加入預(yù)熱的1M1、 50%PEG-2000。 靜置60s后，于37"水 浴中60s內(nèi)加入10mL預(yù)熱的完全培養(yǎng)液。輕輕輕懸浮一次，以1000r/min離心6min棄 去上清，先用6mL左右完全培養(yǎng)液。輕輕混勻，將混勻懸液接種于有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔 板中，每孔O.lmL， 一次接種8塊板。將培養(yǎng)板置于37t:、 5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融 合后7d，用HT培養(yǎng)液半量換液1次，在13d后根據(jù)增值情況改用20XNBS的完全培養(yǎng) 液。約7d后出現(xiàn)雜交瘤細(xì)胞集落，細(xì)胞大、圓且透亮。待集落長至孔底l/3時，在培 養(yǎng)板的蓋板上克隆生長標(biāo)記，此時即可取上清檢測相應(yīng)的特異性抗體。細(xì)胞完全克隆化 后，將細(xì)胞注入小鼠腹腔，間隔一段時間等腹水足夠多時，取腹水，將腹水用蛋白A免 疫親和層析純化后，即得到雙稀雌酚單克隆抗體。
1.4單克隆抗體效價和特異性測定
1.4.1間接ELISA檢測抗體效價 以10 ii g/ml的DE-BSA按每孔100 ii 1包被酶標(biāo)板，4"包被24h，洗滌5次，拍 干，每孔加入200iU2X的牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖液(封閉液)，fC下封閉12h，洗滌3 次，拍干。加入不同稀釋倍數(shù)的單克隆抗體100iU， 37t:孵育2h，洗滌三次，立即加入 100iU酶標(biāo)羊抗鼠抗體，37t:孵育30min，洗滌三次，加50 y 1顯色劑A液和50 y 1顯色 劑B液，室溫避光作用15min，加50 y 1終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測OD值(450nm)。 同時設(shè)置陰性血清對照孔和平行重復(fù)孔?？贵w以1000倍、2000倍、4000倍、8000倍、 16000倍、32000倍稀釋。以兩倍于陰性血清OD值的抗體稀釋度為抗體效價。檢測結(jié) 果見表-1 表-1抗體效價檢測結(jié)果(平均OD值)
抗體稀 釋倍數(shù)10002000 德OO 8000160測32000陰性對照
01.)但.2. t)822,0671.574 1.2750, 6390.2890. 0870, 048
6
從表-l可知，抗體效價為32000以上，滿足實驗要求。
1.4.2間接競爭ELISA檢測抗體特異性 ELISA操作方法同l。 每孔加入100iU不同濃度的游離雙烯雌酚與包被物競 爭隨后加入抗體，得出不同的OD值。根據(jù)1.4.1的結(jié)果，所用多克隆抗體最佳濃度為 1 : 2000。雙烯雌酚系列濃度和試驗孔的排列順序見表-2，同時設(shè)置平行重復(fù)孔和空白 對照孔。以0抑制孔的OD值為最大值B。，其它抑制濃度孔OD值為B， B/B。二50X時 對應(yīng)的雙烯雌酚濃度為此抗體的IC5。值。檢測結(jié)果見表-2 [OO55] 表-2抗體特異性檢測結(jié)果(OD平均值)
抑制濃度yg013927空白對照
s爆雌驗2, 047l.卿1.5450,9280,德20J10. 053
己烯雌齢2,1182,,2.0672.0552,1282. 0750. 06
己烷雌酚2,1032, 0682.0142.0162.1152, 0560.057 由表-2數(shù)據(jù)可知，雙烯雌酚多克隆抗體IQ。值在9yg/L左右，其它幾個類似物 的IQ。值在所試驗的濃度范圍內(nèi)未見明顯抑制，此范圍內(nèi)，幾乎沒有交叉反應(yīng)性，表明 本發(fā)明制備的抗體特異性符合要求。 實施例2雙烯雌酚免疫層析半定量檢測試紙的制備
2.1樣液吸收墊處理將濾紙或玻璃纖維浸入0.2mol/L pH7.4的PBS中2min，取出，8(TC烘干或其他
方式干燥，即成樣液吸收墊。 2.2膠體金標(biāo)記墊的制備和處理 膠體金標(biāo)記墊的制備和處理包括膠體金溶膠制備、膠體金標(biāo)雙稀雌酚抗體、膠 體金標(biāo)記墊處理。 膠體金溶膠制備將HAuCl4先配制成0.01X水溶液，取100ml加熱至沸。攪動 下準(zhǔn)確加入1.2ml的1 %檸檬酸三鈉(Na3C6H507 2H20)水溶液。繼續(xù)加熱煮沸15min。 此時可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨 后逐漸穩(wěn)定成紅色。全過程約2 3min。冷卻至室溫后用蒸餾水恢復(fù)至原體積。電子 顯微鏡觀察金溶膠顆粒的均勻度，經(jīng)測定所制備的膠體金溶膠顆粒直徑為40nm。
膠體金標(biāo)記雙稀雌酚單克隆抗體制備取兩支試管，向其中各加入1.2ml步驟 (1)中制備的40nm膠體金溶膠，加入適量25mMK2C03把pH調(diào)整為9.0，分別加入10iU 濃度為lmg/ml雙烯雌酚抗體，混勻，室溫放置10min，分別加入12 y 1 2% PEG20000， 室溫放置5min， 10000rpm離心20min，輕輕吸除上清，用20 y 1 PBS溶液重懸浮松散的膠 體金沉淀，并集中到新管中，分別加20iU甘油，充分混勻，即為膠體金標(biāo)記雙烯雌酚抗 體，-201:保存?zhèn)溆谩?金標(biāo)雙稀雌酚單克隆抗體倒入一槽中，將玻璃纖維或濾紙浸入lmin，取出，室 溫干燥或真空冷凍干燥，即成為膠體金標(biāo)記墊。
2.3雙烯雌酚免疫層析半定量檢測試紙的組裝 在背襯上依次貼有樣品吸收墊、膠體金標(biāo)記墊、檢測反應(yīng)墊和吸水墊，即得本發(fā)明所述的雙烯雌酚免疫層析半定量檢測試紙。檢測時，可根據(jù)需要將所述試紙切成合適寬度的試劑條。 實施例3雙烯雌酚金標(biāo)免疫層析半定量檢測試紙靈敏度實驗取雙稀雌酚濃度分別為5ng/ml、 10ng/ml、 15ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度準(zhǔn)備
IO份制備好的試紙條，按要求將試紙條插入上述溶液中，5分鐘后觀察結(jié)果。 結(jié)果顯示插入10ng/ml和15ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液中的試紙條上的檢測線不可見，
而插入5ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的試紙條上的出現(xiàn)的檢測線顏色與對照線差別不明顯。 從此可見，本發(fā)明所述的雙烯雌酚金標(biāo)免疫層析半定量檢測試紙靈敏度很高，
檢測限為10ng/ml。 實驗例4試紙條保存期試驗 試紙條保存條件為2-『C，經(jīng)過12個月的測定，試紙條的質(zhì)量沒變化、對照線、檢測線顯色正常，檢測靈敏度沒有變化?？紤]在運輸和使用過程中，會有非正常保存條件出現(xiàn)，將試紙條在37t:保存條件下放置兩周，進(jìn)行破壞實驗，結(jié)果表明該試紙條各項指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可得出試紙條可以在2-『C保存12個月以上。
實施例5樣品中雙烯雌酚添加檢測試驗
5.1、樣品前處理 準(zhǔn)確稱取lg魚肉樣品于5ml離心管中，研磨成粥狀，加入雙稀雌酚標(biāo)準(zhǔn)品100ng，混勻，隨后加入10ml甲醇超聲振蕩1小時，離心取上清，氮氣吹干，用lmlDMSO溶解樣品，用樣品稀釋液稀釋10倍，制備樣品溶液。
5.2、用試紙條進(jìn)行檢測 將試紙條插入上述制備好的溶液中，5分鐘后觀察結(jié)果，出現(xiàn)一條帶的為陽性，出現(xiàn)兩條帶的為陰性。結(jié)果表明，添加樣品只有一條帶顯色，樣品判定為陰性。
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權(quán)利要求
一種檢測雙烯雌酚的一種檢測雙烯雌酚的金標(biāo)免疫層析半定量檢測試紙，其中包括雙烯雌酚特異性單克隆抗體、雙烯雌酚-載體蛋白偶聯(lián)物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙烯雌酚的金標(biāo)免疫層析半定量檢測試紙，其特征在于 所述檢測試紙還包括背襯、背襯上的樣品吸收墊、膠體金標(biāo)記物墊、層析墊及吸水墊。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試紙，其特征在于所述雙烯雌酚特異性抗體為單克 隆抗體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試紙，其特征在于所述的載體蛋白為牛血清白蛋 白、卵清蛋白或鑰孔銅蘭蛋白。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測試紙，其特征在于所述的層析墊上包被有雙烯雌 酚-載體蛋白偶聯(lián)物和第二抗體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測試紙，其特征在于所述的雙烯雌酚-載體蛋白偶聯(lián)物 包被線為檢測線。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測試紙，其特征在于所述的第二抗體包被線為質(zhì)控線。
8. —種檢測樣品中雙烯雌酚含量的方法，包括步驟(1) 樣品前處理，采用粉碎、勻漿等方法利用有機(jī)溶劑提取樣品中的雙稀雌酚。(2) 用權(quán)利要求l-7任一所述的檢測試紙進(jìn)行檢測，將檢測試紙插入樣品溶液中，五 分鐘后觀察結(jié)果。(3) 分析檢測結(jié)果，只出現(xiàn)一條紅色帶樣品為陽性，出現(xiàn)兩條帶為陰性。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種雙烯雌酚金標(biāo)免疫層析半定量檢測試紙，該試紙的背襯上粘帖有樣品吸收墊、膠體金標(biāo)記物墊、層析墊及吸水墊。檢測反應(yīng)墊上包被有雙烯雌酚抗原作為檢測線，同時包被有第二抗體作為質(zhì)控線。本發(fā)明檢測試紙的特異性強(qiáng)，能夠?qū)崿F(xiàn)半定量檢測，4-40℃都可使用，5分鐘以后即可得出結(jié)果，適合于衛(wèi)生、質(zhì)檢、海關(guān)、家畜養(yǎng)殖場以及食品企業(yè)對動物源性食品樣品中的雙烯雌酚藥物進(jìn)行快速檢測。
文檔編號G01N33/74GK101692091SQ20091017791
公開日2010年4月7日 申請日期2009年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月19日
發(fā)明者于洪俠, 張薇薇, 楊曙明, 邱靜, 陳剛 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所