專利名稱：基于量子點的核酸傳感器及其制備方法和檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物傳感器，特別涉及基于量子點的核酸傳感器，還涉及該核 酸傳感器的制備方法和檢測方法。
背景技術(shù)：
在核酸分析領(lǐng)域，核酸傳感器作為準(zhǔn)確、簡便、快速的檢測方法，已受到 越來越多的關(guān)注。其基本原理是將帶有標(biāo)記物的能夠識別特定核酸序列的寡核 香酸探針固定于固相支持物上，測定時與待測核酸樣品進(jìn)行雜交反應(yīng)，并將雜 交反應(yīng)結(jié)果轉(zhuǎn)化為可以讀取的信號輸出，從而實現(xiàn)對待測核酸樣品中特定核酸
序列的定性或定量^r測。
核酸傳感器檢測時的輸出信號可以是電信號或光信號等，這取決于具體所 采用的檢測技術(shù)。焚光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是指能量從一種受激發(fā)的熒光物質(zhì) (給體)以非輻射的方式轉(zhuǎn)移到另一種熒光物質(zhì)(受體)的物理現(xiàn)象。當(dāng)給體的發(fā)射 光譜與受體的吸收光諳能夠有效地重疊，并且給體和受體之間的距離在l ~ 10nm 以內(nèi)，給體和受體之間就會發(fā)生FRET,使給體熒光強(qiáng)度降低，受體熒光強(qiáng)度增 強(qiáng)或不發(fā)射熒光，同時伴隨二者熒光壽命的相應(yīng)縮短和延長。利用生物體自身 的熒光或者將有機(jī)熒光染料分子標(biāo)記到研究對象上，F(xiàn)RET技術(shù)已被成功地應(yīng)用 于核酸檢測、免疫分析、生物大分子相互作用研究等諸多方面。
一個理想的FRET體系，要求給體的發(fā)射光譜和受體的吸收光譜有明顯的重 疊，給體的發(fā)射光譜和受體的發(fā)射光譜完全分開，在給體的激發(fā)波長下對受體 無激發(fā)。但傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料吸收光譜較窄，并且吸收峰和發(fā)射峰之間的斯 托克斯位移較小，在給體的有效激發(fā)波長下常常會造成對受體的激發(fā)；此外， 給體的發(fā)射光譜較寬且常常伴有拖尾，經(jīng)常與受體的發(fā)射光譜重疊，造成光譜千擾；再者，許多有機(jī)熒光染料的光漂白和光降解現(xiàn)象比較嚴(yán)重，造成體系不 穩(wěn)定，從而使FRET技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用受到一定限制。
量子點的出現(xiàn)為克服以上問題帶來了希望。量子點(quantumdots， QDs)是一 種直徑在1 10nm之間，能夠接受激發(fā)光產(chǎn)生熒光的半導(dǎo)體納米顆粒，由周期
表中n-vi族或ni-v族元素組成。其相對于有機(jī)染料具有許多優(yōu)點(l)量子點的
激發(fā)波長范圍寬，從紫外區(qū)到近紅外區(qū)，可以用同一波長的光激發(fā)不同粒徑的 量子點，并且可以通過選擇合適的激發(fā)波長來避免對受體分子的直接激發(fā)；(2) 量子點的粒徑越大，熒光波長越長，可以通過改變量子點的粒徑來調(diào)節(jié)量子點 發(fā)射光i普與受體吸收光譜的重疊程度，從而可以調(diào)節(jié)FRET效率；(3)量子點的 焚光譜峰狹窄而對稱，半高峰寬通常為25 45nrn; (4)量子點的發(fā)光強(qiáng)度高，對 光漂白有強(qiáng)烈的抵制作用。由于這些獨(dú)特的量子優(yōu)勢，近年來將量子點應(yīng)用于 FRET的研究更為深入，范圍不斷擴(kuò)展，但迄今為止，尚未見將量子點制成基于 固相支持物的核酸傳感器的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供第一種基 于量子點的核酸傳感器，可以實現(xiàn)待測核酸樣品中特定核酸序列的準(zhǔn)確、靈敏、 簡便、快速、高通量檢測。
為達(dá)到此目的，在本發(fā)明的第一方面，提供了第一種基于量子點的核酸傳 感器，包括固相支持物和固定在固相支持物表面的寡核苷酸探針陣列，所述寡 核苷酸探針陣列由一種不含自身互補(bǔ)序列的寡核苷酸探針組成，所述寡核苷酸 探針一端標(biāo)記量子點并通過量子點固定在固相支持物的表面。
進(jìn)一步，所述量子點選自MgS、 MgSe、 MgTe、 CaS、 CaSe、 CaTe、 ZnO、 ZnS、 ZnSe、 ZnTe、 SrS、 SrSe、 SeTe、 CdS、 CdSe、 CdTe、 BaS、 BaSe、 BaTe、 HgS、 HgSe、 HgTe、 PbSe、 CaAs、 lnP、 InAs、 InCaAs、 ZnS/CdS、 ZnS/CdS/ZnS、 ZnS/HgS/ZnS/CdS、 CdS/ZnS、 CdS/Ag2S、 CdS/HgS、 CdS/HgS/CdS、 CdS/PbS、 CdS/Cd(OH)2、 CdSe/CuSe、 CdSe/ZnS、 CdSe/ZnSe、 CdSe/CdS、 CdSe/HgSe、CdSe/HgSe/CdSe、 CdSe/HgTe、 CdTe/HgS、 CdTe/HgTe、 InAs/ZnSe、 InAs/CdSe、 InAs/InP、 ZnS:Mn、 ZnS:Cu、 CdS:Mn和CdS:Cu中的任一種，或以上述任一種 為核、二氧化硅為殼的核殼型量子點。
本發(fā)明的目的之二在于提供所述第一種基于量子點的核酸傳感器的制備方法。
為達(dá)到此目的，在本發(fā)明的第二方面，提供了所述第一種基于量子點的核 酸傳感器的制備方法，包括以下步驟
a、 制備隨霉親和素標(biāo)記的量子點；
b、 制備不含自身互補(bǔ)序列且一端生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針；
c、 將步驟b所得一端生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針與步驟a所得鏈霉親和素 標(biāo)記的量子點通過生物素-鏈霉親和素的特異性結(jié)合進(jìn)行偶聯(lián)，制備一端量子點 標(biāo)記的寡核苷酸探針；
d、 將固相支持物的表面用生物素標(biāo)記，再利用生物素-鏈霉親和素的特異性 結(jié)合將步驟c所得一端量子點標(biāo)記的寡核苷酸探針通過量子點固定至固相支持
物的表面，同時固定多個寡核苷酸探針至形成陣列，即得核酸傳感器。
本發(fā)明的目的之三在于提供所述第一種基于量子點的核酸傳感器的檢測方法。
為達(dá)到此目的，在本發(fā)明的第三方面，提供了所述第一種基于量子點的核 酸傳感器的檢測方法，包括以下步驟
a、 制備一端熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記的待測核酸樣品；
b、 將步驟a所得一端熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記的待測核酸樣品與核酸傳感器表面 的寡核香酸探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，當(dāng)寡核苷酸探針和待測核酸樣品中的特定核酸 序列雜交后，量子點和熒光猝滅基團(tuán)彼此靠近并發(fā)生FRET;
c、 以一定波長的激發(fā)光照射雜交反應(yīng)后的核酸傳感器，通過雜交前后量子 點熒光強(qiáng)度的變化進(jìn)行待測核酸樣品中特定核酸序列的檢測。
進(jìn)一步，所述熒光淬滅基團(tuán)選自5-羧基熒光素(5-FAM)、 6-FAM、異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明B、羅丹明101、羅丹明123、羅丹明640、羅丹明6G、 四曱基-6-羧基羅丹明(TAMRA)、四乙基羅丹明異硫氰酸鹽(TRITC)、羅丹明紅 -X(RRX)、阿歷克斯350(Alexa350)、 Alexa488、 Alexa555、 Alexa568、 Alexa594、 Alexa647、 Alexa680、花青染料2(Cy2)、 Cy3 、 Cy5 、黑猝滅劑-1 (Black Hole Quencher l,BHQ-l)、 BHQ-2、 BHQ-3、 LightCycler-Red 640(LC-Red640)、 LC-Red705、德 克薩斯紅(TR)、氨曱香豆素乙酸(AMCA)、 4-(4'-二曱基氨基)偶氮苯基苯曱酸 (DABCYL)、賽博綠-I(SYBR Green I)和納米金中的任一種。
本發(fā)明的目的之四在于提供第二種基于量子點的核酸傳感器，可以實現(xiàn)待 測核酸樣品中特定核酸序列的準(zhǔn)確、靈敏、簡便、快速、高通量檢測。
為達(dá)到此目的，在本發(fā)明的第四方面，提供了第二種基于量子點的核酸傳 感器，包括固相支持物和固定在固相支持物表面的寡核苷酸探針陣列，所述寡 核苷酸探針陣列由一種分子信標(biāo)組成，所述分子信標(biāo)的一端標(biāo)記量子點并通過 量子點固定在固相支持物的表面，另 一端標(biāo)記熒光猝滅基團(tuán)。
進(jìn)一步，所述量子點選自MgS、 MgSe、 MgTe、 CaS、 CaSe、 CaTe、 ZnO、 ZnS、 ZnSe、 ZnTe、 SrS、 SrSe、 SeTe、 CdS、 CdSe、 CdTe、 BaS、 BaSe、 BaTe、 HgS、 HgSe、 HgTe、 PbSe、 CaAs、 InP、 InAs、 InCaAs、 ZnS/CdS、 ZnS/CdS/ZnS、 ZnS/HgS/ZnS/CdS、 CdS/ZnS、 CdS/Ag2S、 CdS/HgS、 CdS/HgS/CdS、 CdS/PbS、 CdS/Cd(OH)2、 CdSe/CuSe、 CdSe/ZnS、 CdSe/ZnSe、 CdSe/CdS、 CdSe/HgSe、 CdSe/HgSe/CdSe、 CdSe/HgTe、 CdTe/HgS、 CdTe/HgTe、 InAs/ZnSe、 InAs/CdSe、 InAs/InP、 ZnS:Mn、 ZnS:Cu、 CdS:Mn和CdS:Cu中的任一種，以及以上述任一 種為核、二氧化硅為殼的核殼型量子點；
進(jìn)一步，所述熒光淬滅基團(tuán)選自5-FAM、 6-FAM、 FITC、羅丹明B、羅丹 明101、羅丹明123、羅丹明640、羅丹明6G、 RRX、 TAMRA、 TRITC、 Alexa350、 Alexa488、 Alexa555、 Alexa568、 Alexa594、 Alexa647、 Alexa680、 Cy2、 Cy3、 Cy5、 BHQ-1、 BHQ-2、 BHQ-3、 LC-Red640、 LC-Red705、 TR、 AMCA、 DABCYL、SYBR Green和納米金中的任一種。
本發(fā)明的目的之五在于提供所述第二種基于量子點的核酸傳感器的制備方法。
為達(dá)到此目的，在本發(fā)明的第五方面，4是供了所述第二種基于量子點的核 酸傳感器的制備方法，包括以下步驟
a、 制備鏈霉親和素標(biāo)記的量子點；
b、 制備一端生物素標(biāo)記、另一端熒光猝滅基團(tuán)標(biāo)記的分子信標(biāo)；
c、 將步驟b所得一端生物素標(biāo)記、另一端熒光猝滅基團(tuán)標(biāo)記的分子信標(biāo)與 步驟a所得鏈霉親和素標(biāo)記的量子點通過生物素-鏈霉親和素的特異性結(jié)合進(jìn)行 偶聯(lián)，制備一端量子點標(biāo)記、另一端熒光猝滅基團(tuán)標(biāo)記的分子信標(biāo)；
d、 將固相支持物的表面用生物素標(biāo)記，再利用生物素-鏈霉親和素的特異性 結(jié)合將步驟c所得一端量子點標(biāo)記、另一端熒光猝滅基團(tuán)標(biāo)記的分子信標(biāo)通過 量子點固定至固相支持物的表面，同時固定多個分子信標(biāo)至形成陣列，即得核 酸傳感器。
本發(fā)明的目的之六在于提供所述第二種基于量子點的核酸傳感器的檢測方法。
為達(dá)到此目的，在本發(fā)明的第六方面，提供了所述第二種基于量子點的核 酸傳感器的檢測方法，包括以下步驟
a、 將待測核酸樣品與核酸傳感器表面的分子信標(biāo)進(jìn)行雜交反應(yīng)，當(dāng)分子信 標(biāo)和待測核酸樣品中的特定核酸序列雜交后，量子點和熒光猝滅基團(tuán)彼此遠(yuǎn)離 而不發(fā)生FRET;
b、 以一定波長的激發(fā)光照射雜交反應(yīng)后的核酸傳感器，通過雜交前后量子 點熒光強(qiáng)度的變化進(jìn)行待測核酸樣品中特定核酸序列的檢測。
本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明基于堿基互補(bǔ)配對原則和FRET現(xiàn)象，建 立了基于量子點的核酸傳感器，第一種形式是將不含自身互補(bǔ)序列且一端量子
9點標(biāo)記的寡核苷酸探針通過量子點固定在固相支持物的表面，其可以與熒光猝 滅基團(tuán)標(biāo)記的特定核酸序列進(jìn)行雜交，從而使量子點和熒光猝滅基團(tuán)彼此靠近
并發(fā)生FRET;第二種形式是將一端量子點標(biāo)記、另一端熒光猝滅基團(tuán)標(biāo)記的分 子信標(biāo)通過量子點固定在固相支持物的表面，其可以與特定核酸序列進(jìn)行雜交， 從而使量子點和熒光猝滅基團(tuán)彼此遠(yuǎn)離而不發(fā)生FRET;通過雜交前后量子點熒 光強(qiáng)度的變化可以檢測核酸樣品中的特定核酸序列，且具有制備簡單，檢測準(zhǔn) 確、靈敏、簡便、快速等優(yōu)點；此外，采用將不含自身互補(bǔ)序列的寡核苷酸探 針或分子信標(biāo)重復(fù)設(shè)置多個形成寡核苷酸探針陣列的形式，還可以實現(xiàn)一個樣 品的多次重復(fù)檢測或多個樣品的同步、快速檢測；應(yīng)用前景好。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)
明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中
圖1為第一種基于量子點的核酸傳感器的制備和檢測示意圖2為第二種基于量子點的核酸傳感器的制備和檢測示意圖3為不同回流反應(yīng)時間制得的CdSe量子點的紫外-可見吸收光譜圖4為應(yīng)用第一種基于量子點的核酸傳感器進(jìn)行;險測時熒光強(qiáng)度與特定核
酸序列濃度的關(guān)系曲線；
圖5為分別以Na2SeS03和NaHSe為前驅(qū)體制得的CdSe量子點隨回流反應(yīng)
時間的最大吸收波長變化趨勢圖6為分別以Na2SeS03和NaHSe為前驅(qū)體制得的CdSe量子點隨回流反應(yīng)
時間的粒徑(由圖3的最大吸收波長算得)變化趨勢圖7為不同回流反應(yīng)時間制得的CdTe/CdSe量子點的熒光光譜圖； 圖8為CdTe核和CdTe/CdSe核殼結(jié)構(gòu)的紫夕卜可見吸收光譜圖； 圖9為CdTe核和CdTe/CdSe核殼結(jié)構(gòu)的X射線粉末衍射(XRD)圖。
具體實施例方式
本發(fā)明的基于量子點的核酸傳感器主要包括兩種形式
第一種基于量子點的核酸傳感器的制備和4全測示意圖如圖1所示，該核酸傳感器的制備是先將不含自身互補(bǔ)序列的寡核苷酸與量子點通過生物素-親和素(親和素或鏈霉親和素)系統(tǒng)進(jìn)行偶聯(lián)，制得一端量子點標(biāo)記的寡核苷酸探針；再將量子點與固相支持物(對于核酸傳感器，可供選擇的固相支持物包括硅片、玻片、瓷片、聚丙烯膜或尼龍膜等)通過生物素-親和素(親和素或鏈霉親和素)系統(tǒng)進(jìn)行偶聯(lián)，從而將寡核苷酸探針通過量子點固定在固相支持物的表面；采用相同方法同時固定多個寡核苷酸探針至形成寡核苷酸探針陣列；應(yīng)用該核酸傳感器進(jìn)行檢測時是先將待測核酸樣品的一端標(biāo)記熒光猝滅基團(tuán)，再將其與核酸傳感器表面的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，如果待測核酸樣品中含有與寡核苷酸探針互補(bǔ)的特定核酸序列，則其與寡核普酸探針的結(jié)合會使量子點和熒光猝滅基團(tuán)彼此靠近并發(fā)生FRET,使量子點發(fā)出的熒光被熒光猝滅基團(tuán)吸收而猝滅，且熒光猝滅程度與特定核酸序列濃度成正比，通過雜交前后量子點熒光強(qiáng)度的變化可實現(xiàn)待測核酸樣品中特定核酸序列的定性和/或定量檢測。
第二種基于量子點的核酸傳感器的制備和檢測示意圖如圖2所示，該核酸傳感器的制備是先將含有自身互補(bǔ)序列的寡核苷酸(發(fā)卡型寡核苷酸)與量子點通過生物素-親和素(親和素或鏈霉親和素)系統(tǒng)進(jìn)行偶聯(lián)，制得一端量子點標(biāo)記、另一端熒光猝滅基團(tuán)標(biāo)記的分子信標(biāo)；再將量子點與固相支持物(對于核酸傳感器，可供選擇的固相支持物包括硅片、玻片、瓷片、聚丙烯膜或尼龍膜等)通過生物素-親和素(親和素或鏈霉親和素)系統(tǒng)進(jìn)行偶聯(lián)，從而將分子信標(biāo)通過量子點固定在固相支持物的表面；采用相同方法同時固定多個分子信標(biāo)至形成寡核苦酸探針陣列；應(yīng)用該核酸傳感器進(jìn)行檢測時是將待測核酸樣品與核酸傳感器表面的分子信標(biāo)進(jìn)行雜交反應(yīng)，雜交反應(yīng)前，分子信標(biāo)呈發(fā)卡式結(jié)構(gòu)，量子點和焚光猝滅基團(tuán)相距較近并發(fā)生FRET，使量子點發(fā)出的熒光幾乎完全被熒光猝滅基團(tuán)吸收而猝滅，熒光本底極低；雜交反應(yīng)后，如果待測核酸樣品中含有與分子信標(biāo)互補(bǔ)的特定核酸序列，則其與分子信標(biāo)的結(jié)合會使量子點和熒光猝滅
基團(tuán)彼此遠(yuǎn)離而不發(fā)生FRET,使量子點的熒光恢復(fù)，且萸光恢復(fù)強(qiáng)度與特定核酸序列濃度成正比，通過雜交前后量子點熒光強(qiáng)度的變化可實現(xiàn)待測核酸樣品中特定核S吏序列的定性和/或定量檢測。
本發(fā)明使用的量子點主要包括單核量子點(如CdS、 CdSe、 CdTe等)和核殼結(jié)構(gòu)的量子點(如CdS/ZnO、 CdSe/ZnS、 CdTe/CdS等)。核殼結(jié)構(gòu)的量子點是在一種材料(如CdSe等)的外部包覆另一種具有較大能帶隙的材料(如CdS、ZnS等)所構(gòu)成的量子點，其光學(xué)特性由內(nèi)核決定，外殼具有明顯的提高量子產(chǎn)率和增強(qiáng)光化學(xué)穩(wěn)定性的作用。此外，還包括摻雜過渡金屬元素的量子點(如CdS:Mn、CdS:Cu等)和二氧化硅包被的量子點等，通過摻入一定比例的Mn、 Cu等過渡金屬元素可有效改善量子點的光譜性質(zhì)，而二氧化硅殼層的構(gòu)建除了可以提高量子點的熒光穩(wěn)定性，便于量子點的表面功能化外，還有利于降低因量子點光分解所導(dǎo)致的細(xì)胞毒性問題。
量子點的制備方法主要有兩種 一種是在水相中制備，另一種是采用膠體化學(xué)方法在有機(jī)相中制備。在水溶液中加入穩(wěn)定劑如巰基乙酸等，可以直接制得表面修飾有羧基的水溶性量子點，具有操作簡單、所用材料價格低、毒性小等優(yōu)點，但量子點的熒光產(chǎn)率相對較低，粒徑分布范圍相對較大。采用膠體化學(xué)方法在有機(jī)相中可制得熒光產(chǎn)率較高和粒徑分布范圍較小的量子點，但其不溶于水，在應(yīng)用于核酸標(biāo)記時，必須先用一定的雙功能團(tuán)對其表面進(jìn)行修飾，使其在具備一定水溶性的同時又能與核酸發(fā)生偶聯(lián)。目前已有多種制備水溶性
量子點的方法(l)配體交換法，用親水性的雙功能化配體替代原量子點表面的三正辛基氧化膦/三正辛基膦(TOPO/TOP)配體，這種雙功能化配體主要由兩部分構(gòu)成， 一部分能固定在量子點的表面(如-SH)，另一部分為親水性基團(tuán)(如-OH、-COOH); (2)裝入法，如通過聚合的硅殼將量子點裝入，聚合硅殼的內(nèi)層是-SH,外層是親水性基團(tuán)；(3)新配體制備法，保留原量子點表面的TOPO/TOP配體，使得親水性。
量子點與寡核苷酸的偶聯(lián)，以及量子點與固相支持物的偶聯(lián)除了采用上述生物素-親和素(親和素或鏈霉親和素)系統(tǒng)以外，還可以通過抗體-抗原或配體-受體等特異性結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)行，同樣可發(fā)到本發(fā)明目的。
以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。
實施例1
一、核酸傳感器的制備
1、鏈霉親和素標(biāo)記的量子點的制備
(1) 量子點的制備
將硫酸鈉與硒粉按摩爾比為3 : 1混合，加入去離子水150mL,在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下回流反應(yīng)至硒粉完全溶解，制得澄清的硒代硫酸鈉溶液；將氯化鎘0.46g溶于去離子水240mL中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下攪拌反應(yīng)30分鐘，再滴加巰基乙酸0.36mL,用濃度為lmol/L的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至11.2,繼續(xù)攪拌反應(yīng)30分鐘后，快速滴加上述硒代石克酸鈉溶液12mL,通過控制回流反應(yīng)的時間，制得發(fā)射波長為492nm、表面修飾有羧基的的CdSe量子點溶液。
不同回流反應(yīng)時間制得的CdSe量子點的紫外-可見吸收光譜如圖3所示，其中a至i的回流時間分別為0、 15、 30、 45、 60、 90、 120、 150、 210分鐘，由圖可知，隨著回流時間延長，CdSe量子點的特征吸收峰逐漸紅移，其原因在于回流時間延長加速了奧氏熟化過程，量子點粒徑增大引起峰位紅移；特征吸收峰從300nm(a)紅移至450nm(i)，即半導(dǎo)體帶隙從4.13eV減小至2.76eV,均大于CdSe晶體的本征帶隙，表明CdSe量子點的粒徑很小，表現(xiàn)出明顯的量子尺寸效應(yīng)，使其帶隙遠(yuǎn)大于體相材料；特征吸收峰在回流60分鐘后紅移減小，表明CdSe量子點的生長速度減慢。
(2) 量子點的鏈霉親和素標(biāo)記
在濃度為0.1 mol/L、 pH為8.5的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，加入表面》務(wù)飾有羧基的CdSe量子點和l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞(EDC)(EDC用量為量子點的50~100倍)，混勻，再加入鏈霉親和素，室溫下攪拌反應(yīng)3小時后，上SephadexG100層析柱，用濃度為O.l mol/L、 pH為7.4的PBS洗脫，得純化的鏈霉親和素標(biāo)記的CdSe量子點溶液；采用竟?fàn)幰种品磻?yīng)法纟全測《連霉親和素標(biāo)記后的生物活性。
2、 不含自身互補(bǔ)序列且一端生物素標(biāo)記的寡核香酸探針的制備設(shè)計不含自身互補(bǔ)序列且能夠識別特定核酸序列的寡核香酸探針，委托上
海英俊生物技術(shù)公司進(jìn)行制備和5，端生物素標(biāo)記，寡核苷酸探針序列為5，-生4勿素-cataaaagagctccatatccaacctg cacg-3'。
3、 一端量子點標(biāo)記的寡核苷酸探針的制備
在濃度為0.1 mol/L、 pH為8.0的PBS中，將鏈霉親和素標(biāo)記的CdSe量子點溶液與5'端生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針溶液通過生物素-鏈霉親和素的特異性結(jié)合進(jìn)行偶聯(lián)，室溫下避光反應(yīng)24小時，制得5，端量子點標(biāo)記的寡核脊酸探針溶液，采用層析柱進(jìn)4亍分離純化。
4、 一端量子點標(biāo)記的寡核苦酸探針在固相支持物表面的固定先將玻片表面標(biāo)記上生物素，充分洗滌玻片去除未結(jié)合的生物素后，再在
玻片表面每間隔一定距離滴加5'端量子點標(biāo)記的寡核苷酸探針溶液形成點陣(本實施例共設(shè)6個點)，室溫下避光反應(yīng)3小時，利用生物素-鏈霉親和素的特異性結(jié)合將寡核苷酸探針通過量子點固定在玻片表面，用pH為8.0的PBS洗滌玻片3次，晾干，即得核酸傳感器，置溫度4。C保存，備用。二、核酸傳感器的^r測
1 、 一端熒光猝滅基團(tuán)標(biāo)記的待測核酸樣品的制備
本實施例的待測核酸樣品為與寡核苷酸探針具有互補(bǔ)序列的核酸，委托上海英^f復(fù)生物技術(shù)7>司進(jìn)行制備和3，端BHQ-1標(biāo)記，核酸序列為5 ，-cgtgcaggttggatatg gagctcttttatg-BHQ-1 -3 ，，用去離子水溶解制成溶液，備用。2、 一端熒光猝滅基團(tuán)標(biāo)記的待測核酸樣品與寡核苷酸纟笨針的雜交將3，端BHQ-1標(biāo)記的待測核酸樣品溶液與雜交液(由5xSSC、質(zhì)量百分濃度為0.1 %的SDS、 lxDenhardt試劑和0.1嗎/fiL的鮭精DNA組成)按體積比為 1 : 5混合，所得混合液10pL滴加至核酸傳感器表面的寡核普酸探針點，同時設(shè) 3個復(fù)點，再將核酸傳感器置雜交盒中，溫度60。C反應(yīng)IO小時，雜t良應(yīng)后的 核酸傳感器依次置洗液A(由lxSSC和質(zhì)量百分濃度為0.2%的SDS組成)、洗液 B(0.2xSSC)和洗液C(0.1xSSC)中各洗滌數(shù)次，再置溫度37'C干燥，避光保存。 3、 FRET信號的4全測
用激光共聚焦掃描儀GenePix 4000掃描雜交反應(yīng)后的核酸傳感器，獲得分 析精度為10pm的16位TIFF圖像，扣除背景后，熒光強(qiáng)度以3個復(fù)點的均值表 示，并繪制熒光強(qiáng)度與特定核酸序列濃度的關(guān)系曲線。結(jié)果見圖4，當(dāng)寡核苷酸 探針和其特定核酸序列雜交后，量子點與熒光猝滅基團(tuán)之間彼此靠近并發(fā)生 FRET,使量子點的熒光猝滅，熒光強(qiáng)度與特定核酸序列濃度呈反比。
實施例2
一、核酸傳感器的制備
1、鏈霉親和素標(biāo)記的量子點的制備
(1)量子點的制備
Na2SeS03溶液的制備在250mL三頸瓶中，加入Na2S03 6.302g(0.05mo1) 和Se粉1.579g(0.02mo1)，加高純水100mL使溶解，在攪拌、N2保護(hù)條件下升 溫至90。C回流反應(yīng)，隨反應(yīng)時間延長，含灰黑色沉淀的溶液漸變清澈透明，反 應(yīng)6小時后停止加熱，抽濾，得無色透明濾液，即濃度約為0.2mol/L的Na2SeS03 溶液，置溫度7(TC(防止氧化)保存，備用。
NaHSe溶液的制備在20mL小燒瓶中，加入Se粉0.1895g(0.0024mo1)， 加高純水6mL使溶解，再加入新制的NaBH4溶液[將NaBH4 0.1903g(0.005mol) 溶于高純水6mL中即得]，攪拌5分鐘后，黑色Se粉消失，反應(yīng)產(chǎn)物立即用水 浴冷卻，在溫度rc、轉(zhuǎn)速5000r/min條件下離心IO分鐘，取上清液，即濃度約 為0.2mol/L的NaHSe溶液，備用。
15CdSe量子點的制備在250mL三頸瓶中，加入CdCl2 .2.5H20 1.1418g(0.005 mol),加高純水50mL使溶解，再加入巰基乙酸稀釋液[將巰基乙酸0.84mL(0.012 mol)用高純水60mL稀釋即得]，用濃度為lmol/L的NaOH 24mL(0.024mol)調(diào)節(jié) 溶液pH值至10,在攪拌條件下加入Na2SeS03溶液(或NaHSe溶液)12mL(0.024 mol),回流反應(yīng)，每隔一段時間取樣檢測其熒光，通過控制回流反應(yīng)的時間，制 得適當(dāng)發(fā)射波長、表面修飾有羧基的CdSe量子點。
分別以Na2SeS03和NaHSe為前驅(qū)體制得的CdSe量子點隨回流反應(yīng)時間的 最大吸收波長變化趨勢圖和粒徑變化趨勢圖分別如圖5和圖6所示。
(2)量子點的鏈霉親和素標(biāo)記
在濃度為0.1 mol/L、 pH為8.5的PBS中，加入表面修飾有羧基的CdSe量 子點和EDC(EDC用量為量子點的50 100倍)，混勻，再加入鏈霉親和素，室溫 下攪拌反應(yīng)3小時后，上Sephadex G100層析柱，用濃度為0.1 mol/L、 pH為
7.4的PBS洗脫，得純化的鏈霉親和素標(biāo)記的CdSe量子點溶液；采用竟?fàn)幰种?反應(yīng)法4企測鏈霉親和素標(biāo)記后的生物活性。
2、 不含自身互補(bǔ)序列且一端生物素標(biāo)記的寡核苷酸纟笨針的制備 根據(jù)細(xì)胞色素P450 3A4(CYP3A4)基因第五號外顯子第14026位點的單核苦
酸多態(tài)性設(shè)計不含自身互補(bǔ)序列的寡核香酸探針，并委托上海英俊生物技術(shù)公 司進(jìn)行制備和5'端生物素標(biāo)記，寡核苷酸探針序列如下5'-生物素-agattactatca ttgc-3'。
3、 一端量子點標(biāo)記的寡核苷酸探針的制備
在濃度為0.1 mol/L、 pH為8.0的PBS中，將鏈霉親和素標(biāo)記的CdSe量子 點溶液與5'端生物素標(biāo)記的寡核苷g交探針溶液通過生物素-鏈霉親和素的特異性 結(jié)合進(jìn)行偶聯(lián)，室溫下避光反應(yīng)24小時，制得5，端CdSe量子點標(biāo)記的寡核苷 酸探針溶液，采用層析柱進(jìn)行分離純化。
4、 一端量子點標(biāo)記的寡核苷酸探針在固相支持物表面的固定 先將玻片表面標(biāo)記上生物素，充分洗滌玻片去除未結(jié)合的生物素后，再在玻片表面每間隔一定距離滴加5，端CdSe量子點標(biāo)記的寡核苷酸4笨針溶液形成點 陣(本實施例共設(shè)6個點)，室溫下避光反應(yīng)3小時，利用生物素-鏈霉親和素的 特異性結(jié)合將寡核苷酸探針通過量子點固定在玻片表面，用pH為8.0的PBS洗 滌玻片3次，晾干，即得核酸傳感器，置溫度4t:保存，備用。 二、核酸傳感器的檢測
1 、 一端熒光猝滅基團(tuán)標(biāo)記的待測核酸樣品的制備
根據(jù)CYP3A4基因第五號外顯子第14026位點及其側(cè)翼序列設(shè)計如下引物 F: 5，-cacattttctacaaccatggagacc-3，； R: 5，-tttatacctgtccccaccagattc-3，, 委托上海英 俊生物技術(shù)公司進(jìn)行制備。
以5，-gttggagacagcaatgatc(t)gtaatctcttccattct-Cy3-3，為才莫4反(其對應(yīng)于CYP3A4 基因第五號外顯子第14026位點及其側(cè)翼序列，序列中間堿基分別為C或T, 對應(yīng)于該位點處的野生型或突變型堿基)，以引物F和R為上、下游引物進(jìn)行不 對稱PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為由濃度為100(imol/L的dNTP、濃度為O.lpmol/L 的引物F、濃度為l|_imol/L的引物R、 lOng模板、1U Taq DNA聚合酶和lxPCR 緩沖液組成，總體積為20fiL;反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性5分鐘，然后94。C變性 30秒、6(TC退火30秒、72。C延伸30秒，共30個循環(huán)，最后72。C延伸5分鐘； 調(diào)整反應(yīng)體系中Cy3-dCTP與dCTP的比例和用量，得3，端Cy3標(biāo)記的PCR產(chǎn) 物(野生型或突變型)。
2、 一端熒光猝滅基團(tuán)的待測核酸樣品與寡核苷酸探針的雜交
將3，端Cy3標(biāo)記的PCR產(chǎn)物(野生型或突變型)與雜交液(由5xSSC、質(zhì)量百 分濃度為0.1%的SDS、 lxDenhardt試劑和O.ljig/^iL的鮭精DNA組成)按體積比 為1 : 5混合，取混合液10pL滴加至核酸傳感器表面的寡核香S吏探針點，同時 設(shè)3個復(fù)點，再將核酸傳感器置雜交盒中，溫度60。C反應(yīng)IO小時，雜交反應(yīng)后 的核酸傳感器依次置洗液A(由lxSSC和質(zhì)量百分濃度為0.2%的SDS組成)、洗 液B(0.2xSSC)和洗液C(O.lxSSC)中各洗滌數(shù)次，再置溫度37。C干燥，避光保存。
3、 FRET信號的檢測用激光共聚焦掃描儀GenePix 4000掃描雜交反應(yīng)后的核酸傳感器，獲得分 析精度為10pm的16位TIFF圖像，扣除背景后，熒光強(qiáng)度以3個復(fù)點的均值表 示，并繪制熒光猝滅程度與PCR產(chǎn)物中特定核酸序列濃度的關(guān)系曲線。結(jié)果顯 示，寡核苷S婦罙針與突變型PCR產(chǎn)物中的特定核酸序列雜交后，量子點與熒光 猝滅基團(tuán)之間彼此靠近并發(fā)生FRET,使量子點的熒光猝滅，且熒光猝滅程度與 特定核酸序列濃度呈正比；而寡核香酸探針與野生型PCR產(chǎn)物之間不發(fā)生雜交， 雜交前后量子點的熒光強(qiáng)度無變化。
實施例3
一、核酸傳感器的制備
1、鏈霉親和素標(biāo)記的量子點的制備
(1)量子點的制備
在250mL三頸瓶中，加入高純水100mL，再加入CdCl2 . 2.5H20 0.2864g 和巰基乙酸222^L,用濃度為lmol/L的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至11.2，通氮?dú)?30分鐘后，在攪拌條件下加入新制的無氧NaHTe溶液(由Te粉80mg和NaBH4 50mg反應(yīng)制得)，回流反應(yīng)56小時；取反應(yīng)液20mL,加高純水稀釋至1 OOmL ， 再加入CdCl2 . 2.5H20 0.0576g和巰基乙酸32mL，用濃度為lmol/L的NaOH調(diào) 節(jié)溶液pH值至11.2,通氮?dú)?0分鐘后，將NaHSe溶液(將Se 4分0.0195g和NaBH4 0.0184g充分混合后，加水lmL密封，即得)注射到濃度為0.5mol/L的稀^ii酸中 產(chǎn)生H2Se氣體并隨氮?dú)馔ㄈ敕磻?yīng)液中，回流反應(yīng)，每隔一段時間取樣檢測其熒 光，通過控制回流反應(yīng)的時間，制得發(fā)射波長為518nm、表面修飾有羧基的 CdTe/CdSe量子點溶液。
不同回流反應(yīng)時間制得的CdTe/CdSe量子點的熒光光譜圖如圖7所示，通 過控制回流反應(yīng)的時間，可以制備發(fā)射不同波長熒光的CdTe/CdSe量子點。
CdTe核和CdTe/CdSe核殼結(jié)構(gòu)的紫夕卜可見吸收光語圖如圖8所示，與CdTe 核比較，CdTe/CdSe核殼結(jié)構(gòu)的紫外吸收光譜有明顯不同，峰位移動方向和峰形與文獻(xiàn)報道一致，在加入硒源后無長波缺陷發(fā)射峰，說明CdTe核經(jīng)表面修飾后 表面缺陷減少。
CdTe核和CdTe/CdSe核殼結(jié)構(gòu)的XRD圖如圖9所示，CdTe/CdSe核殼結(jié)構(gòu)的3 個最強(qiáng)衍射峰位置分別是20=26.0°、 44.0°、 51.5°，與CdTe核的3個最強(qiáng)衍射峰位 置(20=24.5。、 40.8°、 47.4。)基本一致，與CdTe標(biāo)準(zhǔn)XRD圖和文獻(xiàn)報道一致，說 明CdTe/CdSe量子點制備成功。
(2)量子點的鏈霉親和素標(biāo)記
在濃度為0.1 mol/L、pH為8.5的PBS中，加入表面修飾有J^的CdTe/CdSe 量子點和EDC(EDC用量為量子點的50 100倍)，混勻，再加入鏈霉親和素，室 溫下攪4半反應(yīng)3小時后，上SephadexG100層析^主，用濃度為0.1 mol/L、 pH為 7.4的PBS洗脫，得純化的鏈霉親和素標(biāo)記的CdTe/CdSe量子點溶液；采用竟 爭抑制反應(yīng)法^r測鏈霉親和素標(biāo)記后的生物活性。
2、 不含自身互補(bǔ)序列且一端生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針的制備
設(shè)計不含自身互補(bǔ)序列且能識別肺炎鏈球菌特定核酸序列的寡核苷酸探 針，委托上海英俊生物技術(shù)公司進(jìn)行制備和5'端生物素標(biāo)記，寡核苷酸4笨針序 歹寸如下5 ，-生物素-gttgatagcgcaggacattaag-3 ，。
3、 一端量子點標(biāo)記的寡核苷酸探針的制備
在濃度為0.1 mol/L、 pH為8.0的PBS中，將鏈霉親和素標(biāo)記的CdTe/CdSe 量子點溶液與5'端生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針溶液通過生物素-鏈霉親和素的特 異性結(jié)合進(jìn)行偶聯(lián)，室溫下避光反應(yīng)24小時，制得5，端CdTe/CdSe量子點標(biāo)記 的寡核苷酸4冢針溶液，采用層析柱進(jìn)行分離純化。
4、 一端量子點標(biāo)記的寡核苷酸探針在固相支持物表面的固定 先將玻片表面標(biāo)記上生物素，充分洗滌玻片去除未結(jié)合的生物素后，再在
玻片表面每間隔一定距離滴加5，端CdTe/CdSe量子點標(biāo)記的寡核苷酸探4朽容液 形成點陣(本實施例共設(shè)6個點)，室溫下避光反應(yīng)3小時，利用生物素-鏈霉親 和素的特異性結(jié)合將寡核苷酸探針通過量子點固定在玻片表面，用pH為8.0的PBS洗滌玻片3次，晾干，即得核酸傳感器，置溫度4。C保存，備用。
二、核酸傳感器的檢測
1、 一端熒光猝滅基團(tuán)標(biāo)記的待測核酸樣品的制備
(1) 待測核酸樣品的制備
采用酚-氯仿抽提法提純肺炎鏈球菌基因組DNA:取菌液lmL， 3500r/min 離心棄上清，細(xì)菌沉淀用TE緩沖液(pH8.0) 200pL重懸，再加入質(zhì)量百分濃度 為10%的十二烷基石克酸鈉120pL，輕輕混勻，置溫度60。C水浴30分鐘后，加入 等體積的酚-氯仿(l : 1)，輕輕混勻，12000r/min離心IO分鐘，取上清，加入無 水乙醇0.25體積和濃度為5mol/L的醋酸鉀0.1體積，12000r/min離心10分鐘， 取上清，加入冰冷的無水乙醇2體積，20。C靜置30分鐘后，12000r/min離心10 分鐘，棄上清，沉淀用70%乙醇洗2次，無水乙醇洗l次，干燥后加入適量TE (pH8.0)溶解，備用。
i殳計并合成如下引物F: 5，-aaactcaaaggaattgacgg-3，； R: 5'-gacgggcggtgtgta caa-3，。
以肺炎鏈球菌基因組DNA為模板，引物F和R為上、下游引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為lOxbuffer 2.5(iL、 25mmol/L的MgCl2 3jxL、 1Ommol/L的dNTP 0.5fiL、 74pmol/L的引物F和R各0.085pL、 5U/fiL的Taq酶O.lfiL、模板lpL、 雙蒸水補(bǔ)足體積至25jaL;反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性5分鐘，然后94。C變性1分 鐘，60。C退火1分鐘，70。C延伸l分鐘，共40個循環(huán)；將所得PCR產(chǎn)物作為待 測核酸樣品。
(2) 待測核酸樣品的一端熒光猝滅基團(tuán)標(biāo)記
用TDT酶(末端轉(zhuǎn)移酶)催化Cy5-dCTP在待測核酸樣品突出的3'端進(jìn)行非模 板依賴性的加尾反應(yīng)，反應(yīng)體系為5x反應(yīng)緩沖液2fxL,待測核酸樣品6pL， TDT酶終濃度為0.5 U/fxL， Cy5-dCTP終濃度為40(xmol/L，總體積為lO(iL;溫 度37。C反應(yīng)2小時，制得3'端Cy5標(biāo)記的待測核酸^f品。
此外，待測核酸樣品的焚光猝滅基團(tuán)標(biāo)記也可以進(jìn)行無需PCR的直接標(biāo)記
20法，但該法對DNA含量的要求較高。無需PCR的直接標(biāo)記法為將細(xì)菌裂解 后采用消化酶消化，再按上述(2)所述方法進(jìn)行標(biāo)記。
2、 一端萸光幹滅基團(tuán)標(biāo)記的待測核酸樣品與寡核苷酸探針的雜交
將3，端Cy5標(biāo)記的待測核酸樣品與雜交液(由5xSSC、質(zhì)量百分濃度為0.1% 的SDS、 lxDenhardt試劑和0.1|ig/|iL的鮭精DNA組成)按體積比為1 : 5混合， 取混合液1(VL滴加至核酸傳感器表面的寡核苷酸探針點，同時設(shè)3個復(fù)點，再 將核酸傳感器置雜交盒中，溫度60。C反應(yīng)IO小時，雜交反應(yīng)后的核酸傳感器依 次置洗液A(由lxSSC和質(zhì)量百分濃度為0.2%的SDS組成)、洗液B(0.2xSSC) 和洗液C(0.1 xSSC)中各洗滌數(shù)次，溫度37 °C干燥，避光保存。
3、 FRET信號的4全測
用激光共聚焦掃描儀GenePix 4000掃描雜交反應(yīng)后的核酸傳感器，獲得分 析精度為10pm的16位TIFF圖像，扣除背景后，熒光強(qiáng)度以3個復(fù)點的均值表 示，并繪制熒光猝滅程度與特定核酸序列濃度的關(guān)系曲線。結(jié)果顯示，當(dāng)寡核 苷酸探針和其特定核酸序列雜交后，量子點與熒光猝滅基團(tuán)之間彼此靠近并發(fā) 生FRET,使量子點的熒光猝滅，且熒光猝滅程度與特定核酸序列濃度呈正比。
實施例4
一、核酸傳感器的制備
1、鏈霉親和素標(biāo)記的量子點的制備
(1)量子點的制備
將CdCl2 .2.5H20溶于高純水中，加入巰基乙酸，用濃度為1 mol/L的NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH至10.2,通氮?dú)?0分鐘后，在攪拌條件下加入新制的無氧NaHTe 溶液(由Te粉與NaBH4反應(yīng)制得)，回流反應(yīng)，通過控制回流反應(yīng)的時間，制得 發(fā)射波長為585 nm、表面修飾有羧基的CdTe量子點溶液；在CdTe量子點:容液 中加入適量異丙醇以降低CdTe量子點的溶解度，再于10000r/min離心30分鐘， 棄上清，得純化的CdTe量子點。外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜；運(yùn)用透射電子顯微鏡和電子衍射圖判斷所得 CdTe量子點的徑力分布和衍射環(huán)的情況；根據(jù)上述檢測結(jié)果對量子點的制備反 應(yīng)條件(PH值、摩爾比、回流反應(yīng)時間等)進(jìn)行優(yōu)化。 (2)量子點的鏈霉親和素標(biāo)記
在濃度為0.1 mol/L、 pH為8.5的PBS中，加入表面修_飾有羧基的CdTe量 子點0.6 mg和濃度為8.7g/L的EDC 250 |aL,混勻，再加入鏈霉親和素0.12mg, 室溫下攪拌反應(yīng)3小時后，上SephadexG100層析柱，用濃度為0.1 mol/L、 pH 為7.4的PBS洗脫，得純化的鏈霉親和素標(biāo)記的CdTe量子點溶液；采用竟?fàn)幰?制反應(yīng)法檢測鏈霉親和素標(biāo)記后的生物活性。
2、 一端生物素標(biāo)記、另一端熒光猝滅基團(tuán)標(biāo)記的分子信標(biāo)的制備 針對耐利福平(RFP)結(jié)核桿菌的基因突變位點核糖核酸聚合酶亞單位(rpoB)
基因的第506~534位，采用軟件Beacon Designer, DNAstar等設(shè)計分子信標(biāo)， 并采用軟件Insight進(jìn)行分子信標(biāo)的分子模擬，判斷莖環(huán)結(jié)構(gòu)中5，、 3，端兩個熒 光分子間的最小距離和最大距離，分析FRET效率；設(shè)計的分子信標(biāo)委托生物 技術(shù)公司進(jìn)行制備和5，端生物素標(biāo)記、3，端DABCYL標(biāo)記。
3、 一端量子點標(biāo)記、另一端熒光猝滅基團(tuán)標(biāo)記的分子信標(biāo)的制備 在濃度為0.1 mol/L、 pH為8.0的PBS中，將鏈霉親和素標(biāo)記的CdTe量子
點溶液與5'端生物素標(biāo)記、3，端DABCYL標(biāo)記的分子信標(biāo)溶液通過生物素-鏈霉 親和素的特異性結(jié)合進(jìn)4f偶聯(lián)，室溫下避光反應(yīng)24小時，制得5，端CdTe量子 點標(biāo)記、3 ，端DABCYL標(biāo)記的分子信標(biāo)溶液，采用層析柱進(jìn)行分離純化。
4、 一端量子點標(biāo)記、另一端熒光猝滅基團(tuán)標(biāo)記的分子信標(biāo)在固相支持物表 面的固定
先將玻片表面標(biāo)記上生物素，充分洗滌玻片去除未結(jié)合的生物素后，再在 玻片表面每間隔一定距離滴加5，端CdTe量子點標(biāo)記、3，端DABCYL標(biāo)記的分 子信標(biāo)溶液形成點陣(本實施例共設(shè)6個點)，室溫下避光反應(yīng)3小時，利用生物素-鏈霉親和素的特異性結(jié)合將寡核苷酸探針通過量子點固定在玻片表面，用pH
為8.0的PBS洗滌玻片3次，晾干，即得核酸傳感器，置溫度4。C保存，備用。 二、核酸傳感器的檢測
1、 待測核酸樣品的制備
從痰液或血清標(biāo)本中分離出耐RPP結(jié)核桿菌，采用蛋白酶K加表面活性劑 法進(jìn)行裂解，再采用Chaotrop-silica法提取結(jié)核桿菌基因組DNA:用二氧化硅 吸附裂解菌體釋放出的DNA,吸附DNA后的二氧化硅用70%乙醇洗滌、干燥、 溫度55。C雙蒸水洗脫，得結(jié)核桿菌基因組DNA。
針對結(jié)核桿菌的插入序列IS6110，采用BeaconDesigner軟件設(shè)計引物F和 R,設(shè)計原則是在保證能檢出所有結(jié)核桿菌的前提下盡量避免其他分子桿菌屬的 DNA分子的干擾，設(shè)計結(jié)果經(jīng)blast比對。
以結(jié)核桿菌基因組DNA為模板，以引物F和R為上、下游引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為PCR緩沖液5pL、 0.4mmol/L的dNTP 0.5pL、 MgCl2 10 |iL、 1OD/20fiL的引物F 0.5fiL、 10D/20|dL的引物R 0.5pL、 100mmol/L的模板2 pL、 TaqEl)iL、雙蒸水補(bǔ)足體積至50jiL;反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性5分鐘；然后94 。C變性30秒、65'C退火1分鐘、72。C延長l分鐘，共35個循環(huán)；最后94。C變 性30秒，72。C延伸l分鐘，將所得PCR產(chǎn)物作為待測核酸樣品。
2、 待測核酸樣品與分子信標(biāo)的雜交
將待測核酸樣品與雜交液(由5xSSC、質(zhì)量百分濃度為0.1%的SDS、 lxDenhardt試劑和0.1嗎/jiL的鮭精DNA組成)按體積比為1 : 5混合，取混合 液10pL滴加至核酸傳感器表面的分子信標(biāo)點，同時設(shè)3個復(fù)點，再將核酸傳感 器置雜交盒中，溫度6(TC反應(yīng)10小時，雜交反應(yīng)后的核酸傳感器依次置洗液 A(由lxSSC和質(zhì)量百分濃度為0.2%的SDS組成)、洗液B(0.2xSSC)和洗液 C(0.1xSSC)中各洗滌數(shù)次，溫度37。C干燥，避光保存。
3、 FRET信號的檢測
將雜交反應(yīng)后的核酸傳感器正面朝上置熒光顯微鏡載物臺上，以可見光找到點樣點并聚焦清晰，預(yù)熱熒光管后轉(zhuǎn)換熒光觀察，選擇適宜激發(fā)波長觀察點
樣點熒光，打開光路通道開關(guān)，打開顯微鏡圖像記錄軟件spot,選擇相應(yīng)參數(shù),
預(yù)覽圖像后照像保存并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示，當(dāng)分子信標(biāo)和其特定核酸序 列雜交后，分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開，量子點與熒光幹滅基團(tuán)之間彼此遠(yuǎn)離而
不發(fā)生FRET，使量子點的熒光恢復(fù)，且熒光恢復(fù)程度與特定核酸序列濃度呈正 比。
最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管 通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其做出各種各樣的改變，而不偏離所 附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。<110>中國人民解》欠軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院
< 12 0>基于量子點的核酸傳感器及其制備方法和檢測方法
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<210> 1
<211> 30
<212> 腿 <213>人工序列
<220〉
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針序列Pl
<400> 1
cataaaagag ctccatatcc aacctgcacg 30
<210> 2
<211> 30
<212> 腿 <213〉人工序列
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<223>人工序列的描述核酸序列Dl
<400〉 2
cgtgcaggtt ggatatggag ctcttttatg 30
<210> 3
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<212> 腿
<213> 人工序列
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<223>人工序列的描述寡核苷酸探針序列P2
<400> 3
25<formula>formula see original document page 26</formula><220〉
<223> 人工序列的描述核酸序列D3
<400> 7
gttggagaca gcaatgattg taatctcttc cattct 36
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213〉 人工序列
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<223〉人工序列的描述寡核苷酸探針序列P3
<400> 8
gttgatagcg caggacatta ag 22
<210> 9
<211> 20
<212> 腿
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述引物序列F2
<400> 9
aaactcaaag gaattgacgg 20
<210> 10
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<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述引物序列R2
<400> 10
gacgggcggt gtgtacaa 18
權(quán)利要求
1、基于量子點的核酸傳感器，其特征在于包括固相支持物和固定在固相支持物表面的寡核苷酸探針陣列，所述寡核苷酸探針陣列由一種不含自身互補(bǔ)序列的寡核苷酸探針組成，所述寡核苷酸探針一端標(biāo)記量子點并通過量子點固定在固相支持物的表面。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點的核酸傳感器，其特征在于所述量 子點選自MgS、 MgSe、 MgTe、 CaS、 CaSe、 CaTe、 ZnO、 ZnS、 ZnSe、 ZnTe、 SrS、 SrSe、 SeTe、 CdS、 CdSe、 CdTe、 BaS、 BaSe、 BaTe、 HgS、 HgSe、 HgTe、 PbSe、 CaAs、 InP、 InAs、 InCaAs、 ZnS/CdS、 ZnS/CdS/ZnS、 ZnS/HgS/ZnS/CdS 、 CdS/ZnS、 CdS/Ag2S、 CdS/HgS 、 CdS/HgS/CdS 、 CdS/PbS 、 CdS/Cd(OH)2 、 CdSe/CuSe、 CdSe/ZnS、 CdSe/ZnSe、 CdSe/CdS、 CdSe/HgSe、 CdSe/HgSe/G4Se^ CdSe/HgTe、 CdTe/HgS、 CdTe/HgTe、 InAs/ZnSe、 InAs/CdSe、 InAs/InP、 ZnS:Mn、 ZnS:Cu、 CdS:Mn和CdS:Cu中的任一種，或以上述任一種為核、二氧化硅為殼 的核殼型量子點。
3、 權(quán)利要求1所述的基于量子點的核酸傳感器的制備方法，其特征在于 包括以下步驟a、 制備鏈霉親和素標(biāo)記的量子點；b、 制備不含自身互補(bǔ)序列且一端生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針；c、 將步驟b所得一端生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針與步驟a所得鏈霉親和素 標(biāo)記的量子點通過生物素-鏈霉親和素的特異性結(jié)合進(jìn)行偶聯(lián)，制備一端量子點 標(biāo)記的寡核苦酸探針；d、 將固相支持物的表面用生物素標(biāo)記，再利用生物素-鏈霉親和素的特異性 結(jié)合將步驟c所得一端量子點標(biāo)記的寡核苷酸:i笨針通過量子點固定至固相支持物的表面，同時固定多個寡核苷酸探針至形成陣列，即得核酸傳感器。
4、 權(quán)利要求1所述的基于量子點的核酸傳感器的檢測方法，包括以下步驟a、 制備一端熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記的待測核酸樣品；b、 將步驟a所得一端熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記的待測核酸樣品與核酸傳感器表面 的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，當(dāng)寡核苷酸探針和待測核酸樣品中的特定核酸 序列雜交后，量子點和熒光猝滅基團(tuán)彼此靠近并發(fā)生FRET;c、 以一定波長的激發(fā)光照射雜交反應(yīng)后的核酸傳感器，通過雜交前后量子 點熒光強(qiáng)度的變化進(jìn)行待測核酸樣品中特定核酸序列的檢測。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于量子點的核酸傳感器的檢測方法，其特征在 于所述熒光淬滅基團(tuán)選自5-FAM、 6-FAM、 FITC、羅丹明B、羅丹明101、 羅丹明123、羅丹明640、羅丹明6G、RRX、TAMRA、TRITC、Alexa350、Alexa488、 Alexa555、 Alexa568、 Alexa594、 Alexa647、 Alexa680、 Cy2、 Cy3、 Cy5、 BHQ-1、 BHQ-2、 BHQ-3、 LC-Red640、 LC-Red705、 TR、 AMCA、 DABCYL、 SYBR Green 和納米金中的任一種。
6、 基于量子點的核酸傳感器，其特征在于包括固相支持物和固定在固相 支持物表面的寡核苷g復(fù)探針陣列，所述寡核苷酸探針陣列由一種分子信標(biāo)組成， 所述分子信標(biāo)的一端標(biāo)記量子點并通過量子點固定在固相支持物的表面，另一 端標(biāo)記熒光猝滅基團(tuán)。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于量子點的核酸傳感器，其特征在于所述量 子點選自MgS、 MgSe、 MgTe、 CaS、 CaSe、 CaTe、 ZnO、 ZnS、 ZnSe、 ZnTe、 SrS、 SrSe、 SeTe、 CdS、 CdSe、 CdTe、 BaS、 BaSe、 BaTe、 HgS、 HgSe、 HgTe、 PbSe、 CaAs、 InP、 InAs、 InCaAs、 ZnS/CdS、 ZnS/CdS/ZnS、 ZnS/HgS/ZnS/CdS 、 CdS/ZnS、 CdS/Ag2S、 CdS/HgS 、 CdS/HgS/CdS 、 CdS/PbS 、 CdS/Cd(OH)2 、 CdSe/CuSe、 CdSe/ZnS、 CdSe/ZnSe、 CdSe/CdS、 CdSe/HgSe、 CdSe/HgSe/CdSe、 CdSe/HgTe、 CdTe/HgS、 CdTe/HgTe、 InAs/ZnSe、 InAs/CdSe、 InAs/InP、 ZnS:Mn、 ZnS:Cu、 CdS:Mn和CdS:Cu中的任一種，或以上述任一種為核、二氧化硅為殼 的核殼型量子點。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于量子點的核酸傳感器的檢測方法，其特征在于所述熒光淬滅基團(tuán)選自5-FAM、 6-FAM、 FITC、羅丹明B、羅丹明101、 羅丹明123、羅丹明640、羅丹明6G、RRX、TAMRA、TRITC、Alexa350、Alexa488、 Alexa555、 Alexa568、 Alexa594、 Alexa647、 Alexa680、 Cy2、 Cy3、 Cy5、 BHQ-1、 BHQ-2、 BHQ-3、 LC-Red640、 LC-Red705、 TR、 AMCA、 DABCYL、 SYBR Green和納米金中的任一種。
9、 權(quán)利要求6所述的基于量子點的核酸傳感器的制備方法，其特征在于 包括以下步驟a、 制備鏈霉親和素標(biāo)記的量子點；b、 制備一端生物素標(biāo)記、另一端熒光猝滅基團(tuán)標(biāo)記的分子信標(biāo)；c、 將步驟b所得一端生物素標(biāo)記、另一端焚光猝滅基團(tuán)標(biāo)記的分子信標(biāo)與 步驟a所得鏈霉親和素標(biāo)記的量子點通過生物素-鏈霉親和素的特異性結(jié)合進(jìn)行 偶聯(lián)，制備一端量子點標(biāo)記、另一端熒光猝滅基團(tuán)標(biāo)記的分子信標(biāo)；d、 將固相支持物的表面用生物素標(biāo)記，再利用生物素-鏈霉親和素的特異性 結(jié)合將步驟c所得一端量子點標(biāo)記、另一端熒光猝滅基團(tuán)標(biāo)記的分子信標(biāo)通過 量子點固定至固相支持物的表面，同時固定多個分子信標(biāo)至形成陣列，即得核 酸傳感器。
10、 權(quán)利要求6所述的基于量子點的核酸傳感器的檢測方法，包括以下步驟a、 將待測核酸樣品與核酸傳感器表面的分子信標(biāo)進(jìn)行雜交反應(yīng)，當(dāng)分子信 標(biāo)和待測核酸樣品中的特定核酸序列雜交后，量子點和熒光猝滅基團(tuán)彼此遠(yuǎn)離 而不發(fā)生FRET;b、 以一定波長的激發(fā)光照射雜交反應(yīng)后的核酸傳感器，通過雜交前后量子 點熒光強(qiáng)度的變化進(jìn)行待測核酸樣品中特定核酸序列的檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了基于量子點的核酸傳感器及其制備方法和檢測方法，該核酸傳感器包括固相支持物和固定在固相支持物表面的寡核苷酸探針陣列，寡核苷酸探針陣列由一種不含自身互補(bǔ)序列的寡核苷酸探針組成，寡核苷酸探針的一端標(biāo)記量子點并通過量子點固定在固相支持物的表面；或者寡核苷酸探針陣列由一種分子信標(biāo)組成，分子信標(biāo)的一端標(biāo)記量子點并通過量子點固定在固相支持物的表面，另一端標(biāo)記熒光猝滅基團(tuán)；利用堿基互補(bǔ)配對原則和FRET現(xiàn)象，可以實現(xiàn)核酸樣品中特定核酸序列的檢測，且制備簡單、檢測準(zhǔn)確、靈敏、簡便、快速，可同時檢測多個樣品。
文檔編號G01N21/64GK101519696SQ20091010321
公開日2009年9月2日 申請日期2009年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月19日
發(fā)明者府偉靈, 玨 王, 陽 羅 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院