專利名稱：碳納米纖維電化學(xué)生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于利用碳納米纖維(CNF)和乙醇脫氫酶制備的乙醇電化學(xué)生物 傳感器及其對人體血液中酒精含量的檢測，特別涉及一種碳納米纖維電化學(xué) 生物傳感器。
背景技術(shù)：
隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，全球汽車數(shù)量激增，車禍發(fā)生率也扶搖直上，據(jù)歐盟 白皮書提供的數(shù)字，全歐每年因車禍造成的死亡和受傷人數(shù)分別為4. 1萬和 170萬，直接經(jīng)濟(jì)損失為1600億歐元。而世界衛(wèi)生組織公布的數(shù)字更令人震 驚，全球每年有130萬人死于交通事故，1200多萬人受傷，經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)5180 億歐元，相當(dāng)于每年一個米蘭市被從地球上抹掉。在中國，因交通事故死亡 的每年都有10多萬人，遠(yuǎn)高于近幾年時間世界大小戰(zhàn)爭的死亡人數(shù)，粗略計 算，平均每五分鐘就有一個中國人被汽車奪取生命。數(shù)據(jù)顯示，雖然中國汽 車保有畺只占全世界的2%，但事故死亡人數(shù)卻占全世界的15%左右。據(jù)道 路交管權(quán)威機(jī)關(guān)統(tǒng)計每年，發(fā)生在全國各地的道路交通事故中，有37%的事 故是因酒后駕車所致。酒后駕駛嚴(yán)重威脅著交通安全，己成為交通事故中的 "一大殺手"。酒后駕車容易引發(fā)事故的原因在于酒的主要成分乙醇，因為 乙醇會對人的神經(jīng)系統(tǒng)有很大的影響。駕駛員開車時判斷的依據(jù)80%是來自 視覺判斷，在視覺清晰、意識清醒的狀態(tài)下，交通事故就不易發(fā)生，但喝酒 會使人視力模糊不清。而且，由于酒精的作用，人的平衡能力、動作的準(zhǔn)確 程度都會大大降低，從而使動作發(fā)生變異。此外，飲酒還會使大腦對突發(fā)事 件的反應(yīng)能力降低、運(yùn)動能力失調(diào)，因酒精麻醉作用，人的手、腳觸覺較平 時降低，往往無法正?？刂朴烷T、剎車及方向盤。這時駕車如遇突發(fā)事件極 易引起事故。許多國家都制定了血液中乙醇含量與交通事故責(zé)任認(rèn)定的關(guān)系， 建立了多種能夠檢測血液中乙醇含量的方法。如GC/MS等儀器檢測乙醇成分， 雖然這些方法可以定量，但是存在著購買儀器價格昂貴,檢測成本高，需專門 培訓(xùn),無法在案發(fā)現(xiàn)場快速檢測等缺限。呼氣式乙醇測定儀可以在現(xiàn)場使用， 但是價格也十分昂貴，檢測成本高，而且不衛(wèi)生，容易發(fā)生交叉感染疾病和容易受人為假呼氣影響等。公安部在二oo七年二月十九日發(fā)布《關(guān)于對酒
后駕車交通違法行為開展專項整治工作的緊急通知》，嚴(yán)禁酒后駕駛，遏制重 特大道路交通事故的發(fā)生，確保人民群眾的安全，是一項艱巨而又偉大的任 務(wù)，是一項全民工程，是一場新時期的人民戰(zhàn)爭，交警是這場戰(zhàn)爭的先頭部 隊，但是需要技術(shù)力量后援，急需一種現(xiàn)場快速酒精檢驗的方法和設(shè)備來滿 足現(xiàn)實發(fā)展的需要。
還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和它的氧化形式(NAD+)是一種傳 遞質(zhì)子(更準(zhǔn)確來說是氫離子)的輔酶，它出現(xiàn)在細(xì)胞很多代謝反應(yīng)中，是 參與三百多酶反應(yīng)的輔因子。由于NADH在酶反應(yīng)中作為輔因子的重要性，所 以人們期望利用對NADH的電化學(xué)氧化來制備生物傳感器。但由于在一般電極 表面氧化NADH有很高的過電位且會對電極表面產(chǎn)生污染，所以許多物質(zhì)被用 來催化NADH電化學(xué)氧化，減少過電位及電極表面污染。近年來，納米材料是 當(dāng)今熱點研究領(lǐng)域之一。碳納米纖維(CNF)是一種納米級尺寸的非空心的碳 纖維。由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，它在催化劑載體、探針針尖及燃料電池等 方面具有廣泛的潛在應(yīng)用。CNF經(jīng)過硝酸氧化處理后會產(chǎn)生很多含氧基團(tuán)而其 主體結(jié)構(gòu)不會被破壞。這些產(chǎn)生的含氧基團(tuán)能促進(jìn)對還原型煙酰胺腺嘌呤二 核苷酸(NADH)的電催化。因為碳材料在大多數(shù)溶劑中的分散性很差，而酸 化處理的CNF在水中具有較好的溶解性，有利于在電極表面的修飾和穩(wěn)定性。 本發(fā)明利用CNF對NADH展現(xiàn)了高靈敏度的電催化性能。然后結(jié)合乙醇脫氫酶 (ADH),制備一種高靈敏的酒精電化學(xué)生物傳感器。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種碳納米纖維電化學(xué)生物傳感器。 其對血液中酒精含量的檢測。在存在NAD+的條件下，固定在修飾電極中的ADH 可以催化乙醇，同時NAD+被還原為NADH。由于CNF對NADH具有很好的電化學(xué)氧 化性能，所以我們利用檢測生成的NADH來間接地檢測樣品中的乙醇含量。
本發(fā)明的技術(shù)方案是
一種碳納米纖維電化學(xué)生物傳感器的制備方法 其制備過程如下 (1 ).碳納米纖維CNF的處理
lmg-100 mg碳納米纖維CNF分散到10—60 ml， 10%_60%硝酸溶液中，混合物在30'C到15(TC加熱1小時到48小時；產(chǎn)物經(jīng)過離心和水洗后得到羧化的 CNF;通過碳納米纖維CNF在水中超聲分散得到l-10mg/ml的碳納米纖維CNF水
溶液；
(2 ) . CNF和酶修飾電極的制備
玻碳電極依次用l， 0. 3和0. 05 u m的三氧化二鋁粉拋光，然后用二次水沖 洗；用氮?dú)獯蹈珊?，l-20"L，0.5-10mg/ml乙醇脫氫酶的0.2M，pH 5-9的磷酸 緩沖溶液滴到玻碳電極，在干燥器中干燥30min;然后再滴1-20yL的碳納米 纖維CNF溶液滴到玻碳電極上并在干燥器中干燥得碳納米纖維電化學(xué)生物傳 感器。
本發(fā)明效果是-
本一種碳納米纖維電化學(xué)生物傳感器，其可對人體血液中酒精含量的檢 測。在存在NAD+的條件下，固定在修飾電極中的ADH可以催化乙醇，同時NAD+ 被還原為NADH。由于CNF對NADH具有很好的電化學(xué)氧化性能，所以我們利用檢 測生成的NADH來間接地檢測樣品中的乙醇含量。
以此可制作人體酒精含量現(xiàn)場快速檢測分析器，可用于行車現(xiàn)場對駕駛 員進(jìn)行即時快速的血液乙醇含量的測試，從而可在現(xiàn)場即時快速地判斷出駕 駛員是否飲酒。因而可有效地制止飲酒人駕車，避免交通事故的發(fā)生。
具體實施例方式
本發(fā)明提供一種碳納米纖維電化學(xué)生物傳感器。 制備過程如下 1 .CNF的處理
lmg-100 mg CNF分散到10-60 ml， 10%_60%硝酸溶液中，混合物在3(TC到 15(TC加熱lh到48h。產(chǎn)物經(jīng)過離心和水洗后得到羧化的CNF。通過CNF在水中 超聲分散得到卜10mg/ml的CNF水溶液。 2.CNF和酶修飾電極的制備
玻碳電極依次用1， 0. 3和0. 05 U m的三氧化二鋁粉拋光，然后用二次水沖 洗。用氮?dú)獯蹈珊?，?0uL，0.5-10mg/ml乙醇脫氫酶的0.2M，pH 5_9的磷酸 緩沖溶液滴到玻碳電極，在干燥器中干燥30min。然后再滴 1-20 u L的CNF溶液滴到玻碳電極上并在干燥器中干燥得乙醇生物傳感器。 3 . CNF和酶修飾電極對酒精的電化學(xué)檢測
在含5mMNAD+的pH5-9的緩沖溶液中，用電化學(xué)分析儀CHI660 (CH公司，美國)以三電極工作體系(工作電極為修飾的玻碳電極，對電極為鉑絲，參比電極
為飽和甘汞電極SCE)，在O. 1V電位下進(jìn)行電流隨血液中酒精濃度變化的檢測。 在血液酒精濃度為10-425mM下，響應(yīng)電流隨酒精濃度成線性變化，檢測限為 3yM,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.1%。
實施例l:
1 .CNF的處理:
lmg mg CNF分散到10 ml，l(F。硝酸溶液中，混合物在5(TC加熱lh。產(chǎn)物經(jīng) 過離心和水洗后得到羧化的CNF。通過CNF在水中超聲分散得到lmg/ml的CNF水 溶液。
2 . CNF和酶修飾電極的制備
玻碳電極依次用l，0.3和0.05ym的三氧化二鋁粉拋光，然后用二次水沖 洗。用氮?dú)獯蹈珊?，luL，0.5mg/ml乙醇脫氫酶的0.2M，pH 5的磷酸緩沖溶液 滴到玻碳電極，在干燥器中干燥30min。然后再滴luL的CNF溶液滴到玻碳電 極上并在干燥器中干燥得乙醇生物傳感器。
3 . CNF和酶修飾電極對酒精的電化學(xué)檢測
在含5mMNAD+的pH5的緩沖溶液中，用電化學(xué)分析儀CHI660(CH公司，美國) 以三電極工作體系(工作電極為修飾的玻碳電極，對電極為鉑絲，參比電極 為飽和甘汞電極SCE)，在O. 1V電位下進(jìn)行電流隨血液中酒精濃度變化的檢測。 檢測線性范圍是10-30raM。
實施例2:
2mg CNF分散到30 ml， 10%硝酸溶液中，混合物在5(TC加熱7h。產(chǎn)物經(jīng) 過離心和水洗后得到羧化的CNF。通過CNF在水中超聲分散得到3mg/ml的CNF水 溶液。
2 . CNF和酶修飾電極的制備
玻碳電極依次用l, 0. 3和0. 05 u m的三氧化二鋁粉拋光，然后用二次水沖 洗。用氮?dú)獯蹈珊螅? u L， 10mg/ml乙醇脫氫酶的0， 2M， pH 5的磷酸緩沖溶液滴 到玻碳電極，在干燥器中干燥30min。然后再滴luL的CNF溶液滴到玻碳電極 上并在干燥器中干燥得乙醇生物傳感器。
3 . CNF和酶修飾電極對酒精的電化學(xué)檢測
在含5mMNAD+的pH7的緩沖溶液中，用電化學(xué)分析儀CHI660(CH公司，美國)以三電極工作體系(工作電極為修飾的玻碳電極，對電極為鉑絲，參比電極
為飽和甘汞電極SCE)，在O. 1V電位下進(jìn)行電流隨血液中酒精濃度變化的檢須IJ。 檢測線性范圍是10-50mM。 實施例3:
1 .CNF的處理
10mg CNF分散到20 ml，l(^硝酸溶液中，混合物在80。C加熱12h。產(chǎn)物 經(jīng)過離心和水洗后得到羧化的CNF。通過CNF在水中超聲分散得到3mg/ml的CNF 水溶液。
2 . CNF和酶修飾電極的制備
玻碳電極依次用l，0.3和0.05um的三氧化二鋁粉拋光，然后用二次水沖 洗。用氮?dú)獯蹈珊螅?0uL，0.5mg/ml乙醇脫氫酶的0.2M，pH 5的磷酸緩沖溶液 滴到玻碳電極，在干燥器中干燥30min。然后再滴10uL的CNF溶液滴到玻碳電 極上并在干燥器中干燥得乙醇生物傳感器。
3 . CNF和酶修飾電極對酒精的電化學(xué)檢測
在含5mMNAD+的pH5的緩沖溶液中，用電化學(xué)分析儀CHI660(CH公司，美國)
以三電極工作體系(工作電極為修飾的玻碳電極，對電極為鉑絲，參比電極 為飽和甘汞電極SCE)，在O. 1V電位下進(jìn)行電流隨血液中酒精濃度變化的檢測。 檢測線性范圍是40-80mM。 實施例4: 1 .CNF的處理
2mg CNF分散到30 ml，l(F。硝酸溶液中，混合物在50。C加熱7h。產(chǎn)物經(jīng)過 離心和水洗后得到羧化的CNF。通過CNF在水中超聲分散得到3mg/ml的CNF水溶 液。
2.CNF和酶修飾電極的制備
玻碳電極依次用1， 0. 3和0. 05 u m的三氧化二鋁粉拋光，然后用二次水沖 洗。用氮?dú)獯蹈珊螅? y L， 10mg/ml乙醇脫氫酶的0. 2M， pH 5的磷酸緩沖溶液滴 到玻碳電極，在干燥器中干燥30min。然后再滴5uL的CNF溶液滴到玻碳電極
上并在干燥器中干燥得乙醇生物傳感器。
3 . CNF和酶修飾電極對酒精的電化學(xué)檢測
在含5mMNAD+的pH7的緩沖溶液中，用電化學(xué)分析儀CHI660 (CH公司，美國) 以三電極工作體系(工作電極為修飾的玻碳電極，對電極為鉑絲，參比電極為飽和甘汞電極SCE)，在O. 1V電位下進(jìn)行電流隨血液中酒精濃度變化的檢測。 檢測線性范圍是20-100mM。 實施例5:
1 .CNF的處理
10mg CNF分散到40 ml，l(^硝酸溶液中，混合物在8(TC加熱2h。產(chǎn)物經(jīng) 過離心和水洗后得到羧化的CNF。通過CNF在水中超聲分散得到10mg/ml的CNF
水溶液。
2 . CNF和酶修飾電極的制備
玻碳電極依次用1, 0. 3和0. 05 u m的三氧化二鋁粉拋光，然后用二次水沖 洗。用氮?dú)獯蹈珊螅?ixL， 10mg/ml乙醇脫氫酶的0.2M,pH 5的磷酸緩沖溶液滴 到玻碳電極，在干燥器中干燥30min。然后再滴2uL的CNF溶液滴到玻碳電極 上并在干燥器中干燥得乙醇生物傳感器。
3 . CNF和酶修飾電極對酒精的電化學(xué)檢測
在含5mMNAD+的pH7的緩沖溶液中，用電化學(xué)分析儀CHI660 (CH公司，美國)
以三電極工作體系(工作電極為修飾的玻碳電極，對電極為鉑絲，參比電極 為飽和甘汞電極SCE)，在O. 1V電位下進(jìn)行電流隨血液中酒精濃度變化的檢測。 檢測線性范圍是25-150mM。 實施例6:
1 .CNF的處理
20mg CNF分散到60 ml，l(F。硝酸溶液中，混合物在120。C加熱48h。產(chǎn)物 經(jīng)過離心和水洗后得到羧化的CNF。通過CNF在水中超聲分散得到20mg/ml的 CNF水溶液。
2 . CNF和酶修飾電極的制備
玻碳電極依次用1， 0. 3和0. 05 u m的三氧化二鋁粉拋光，然后用二次水沖 洗。用氮?dú)獯蹈珊螅?uL， 10mg/ml乙醇脫氫酶的0.2M，pH 5的磷酸緩沖溶液滴 到玻碳電極，在干燥器中干燥30min。然后再滴4uL的CNF溶液滴到玻碳電極 上并在干燥器中干燥得乙醇生物傳感器。
3 . CNF和酶修飾電極對酒精的電化學(xué)檢測
在含5mMNAD+的pH7的緩沖溶液中，用電化學(xué)分析儀CHI660(CH公司，美國)
以三電極工作體系(工作電極為修飾的玻碳電極，對電極為鉑絲，參比電極 為飽和甘汞電極SCE)，在O. 1V電位下進(jìn)行電流隨血液中酒精濃度變化的檢測。檢測線性范圍是20-350mM。 實施例7:
1 .CNF的處理
20mg CNF分散到40 ml，1096硝酸溶液中，混合物在15(TC加熱48h。產(chǎn)物 經(jīng)過離心和水洗后得到羧化的CNF。通過CNF在水中超聲分散得到8mg/ml的CNF 水溶液。
2 . CNF和酶修飾電極的制備
玻碳電極依次用l， 0. 3和0. 05y m的三氧化二鋁粉拋光，然后用二次水沖 洗。用氮?dú)獯蹈珊螅?5uL，10mg/ml乙醇脫氫酶的0.2M，pH 5的磷酸緩沖溶液 滴到玻碳電極，在干燥器中干燥30min。然后再滴15uL的CNF溶液滴到玻碳電 極上并在干燥器中干燥得乙醇生物傳感器。
3 . CNF和酶修飾電極對酒精的電化學(xué)檢測
在含5mMNAD+的pH7的緩沖溶液中，用電化學(xué)分析儀CHI660(CH公司，美國) 以三電極工作體系(工作電極為修飾的玻碳電極，對電極為鉑絲，參比電極 為飽和甘汞電極SCE)，在O. 1V電位下進(jìn)行電流隨血液中酒精濃度變化的檢測。 檢測線性范圍是80-400mM。
實施例8:
1 .CNF的處理
60mg CNF分散到40 ml, 10%硝酸溶液中，混合物在5(TC加熱48h。產(chǎn)物經(jīng) 過離心和水洗后得到羧化的CNF。通過CNF在水中超聲分散得到10mg/ml的CNF 水溶液。
2 . CNF和酶修飾電極的制備
玻碳電極依次用l， 0. 3和0. 05 II m的三氧化二鋁粉拋光，然后用二次水沖 洗。用氮?dú)獯蹈珊螅?0uL，10mg/ml乙醇脫氫酶的0.2M，pH 5的磷酸緩沖溶液 滴到玻碳電極，在干燥器中干燥30min。然后再滴20y L的CNF溶液滴到玻碳電 極上并在干燥器中干燥得乙醇生物傳感器。
3.CNF和酶修飾電極對酒精的電化學(xué)檢測"
在含5mMNAD+的pH7的緩沖溶液中，用電化學(xué)分析儀CHI660 (CH公司，美國) 以三電極工作體系(工作電極為修飾的玻碳電極，對電極為鉑絲，參比電極 為飽和甘汞電極SCE)，在O. 1V電位下進(jìn)行電流隨血液中酒精濃度變化的檢測。 檢測線性范圍是20-280mM。1 .CNF的處理
100mg CNF分散到40 ml，109&硝酸溶液中，混合物在80。C加熱48h。產(chǎn)物 經(jīng)過離心和水洗后得到羧化的CNF。通過CNF在水中超聲分散得到9mg/ml的CNF 水溶液。
2 . CNF和酶修飾電極的制備
玻碳電極依次用l， 0. 3和0. 05 P m的三氧化二鋁粉拋光，然后用二次水沖 洗。用氮?dú)獯蹈珊螅?5uL，10mg/ml乙醇脫氫酶的0.2M,pH 5的磷酸緩沖溶液 滴到玻碳電極，在干燥器中干燥30min。然后再滴15uL的CNF溶液滴到玻碳電 極上并在干燥器中干燥得乙醇生物傳感器。
3 . CNF和酶修飾電極對酒精的電化學(xué)檢測
在含5mMNAD+的pH7的緩沖溶液中，用電化學(xué)分析儀CHI660 (CH公司，美國) 以三電極工作體系(工作電極為修飾的玻碳電極，對電極為鉑絲，參比電極 為飽和甘汞電極SCE)，在O. 1V電位下進(jìn)行電流隨血液中酒精濃度變化的檢測。 檢測線性范圍是20-380mM。
實施例10:
1 .CNF的處理
60mg CNF分散到20 ml， 10%硝酸溶液中，混合物在150'C加熱lh。產(chǎn)物經(jīng) 過離心和水洗后得到羧化的CNF。通過CNF在水中超聲分散得到8mg/ml的CNF水 溶液。
2 . CNF和酶修飾電極的制備
玻碳電極依次用l， 0. 3和0. 05 y m的三氧化二鋁粉拋光，然后用二次水沖 洗。用氮?dú)獯蹈珊螅?0uL， 10mg/ml乙醇脫氫酶的0.2M，pH 5的磷酸緩沖溶液 滴到玻碳電極，在干燥器中干燥30min。然后再滴10uL的CNF溶液滴到玻碳電 極上并在干燥器中干燥得乙醇生物傳感器。 3 . CNF和酶修飾電極對酒精的電化學(xué)檢測
在含5mMNAD+的pH7的緩沖溶液中，用電化學(xué)分析儀CHI660(CH公司，美國)以三
電極工作體系(工作電極為修飾的玻碳電極，對電極為鉑絲，參比電極為飽 和甘汞電極SCE)，在O. 1V電位下進(jìn)行電流隨血液中酒精濃度變化的檢測。檢 測線性范圍是20-210mM。
權(quán)利要求
1、一種碳納米纖維電化學(xué)生物傳感器的制備方法其制備過程如下(1).碳納米纖維CNF的處理1mg-100mg碳納米纖維CNF分散到10-60ml，10％-60％硝酸溶液中，混合物在30℃到150℃加熱1小時到48小時；產(chǎn)物經(jīng)過離心和水洗后得到羧化的CNF；通過碳納米纖維CNF在水中超聲分散得到1-10mg/ml的碳納米纖維CNF水溶液；(2).CNF和酶修飾電極的制備玻碳電極依次用1，0.3和0.05μm的三氧化二鋁粉拋光，然后用二次水沖洗；用氮?dú)獯蹈珊螅?-20μL，0.5-10mg/ml乙醇脫氫酶的0.2M，pH 5-9的磷酸緩沖溶液滴到玻碳電極，在干燥器中干燥30min；然后再滴1-20μL的碳納米纖維CNF溶液滴到玻碳電極上并在干燥器中干燥得碳納米纖維電化學(xué)生物傳感器。
全文摘要
一種碳納米纖維電化學(xué)生物傳感器的制備方法先對碳納米纖維CNF的處理，再對CNF和酶修飾電極的制備。此傳感器在存在NAD⁺的條件下，固定在修飾電極中的ADH可以催化乙醇，同時NAD⁺被還原為NADH。由于CNF對NADH具有很好的電化學(xué)氧化性能，所以我們利用檢測生成的NADH來間接地檢測樣品中的乙醇含量。以此可制作人體血液酒精含量現(xiàn)場快速檢測分析器，可用于行車現(xiàn)場對駕駛員進(jìn)行即時快速的血液乙醇含量的測試，從而可在現(xiàn)場即時快速地判斷出駕駛員是否飲酒。因而可有效地制止飲酒人駕車，避免交通事故的發(fā)生。
文檔編號G01N27/30GK101634641SQ200910070229
公開日2010年1月27日 申請日期2009年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月25日
發(fā)明者丁國興, 峰 劉, 李慶生, 武長順, 京 王, 王泰明 申請人:天津市公安局