專利名稱：：體外診斷結(jié)腸直腸癌的肝脂肪酸結(jié)合蛋白、cea和ca19-9測(cè)定方法體外診斷結(jié)腸直腸癌的肝脂肪酸結(jié)合蛋白、CEA和CA19-9測(cè)定方法本發(fā)明涉及癌學(xué)領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明提供了通過(guò)確定取自患者的生物學(xué)樣品中肝脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABP)組合CEA和CA19-9標(biāo)記物的存在而體外診斷人類患者中的結(jié)腸直腸癌的方法，所述方法可用于早期診斷、篩選、治療隨診以及預(yù)后，還可用于結(jié)腸直腸癌的復(fù)發(fā)診斷。結(jié)腸直腸癌(CRC)是主要的公共健康問(wèn)題。據(jù)估計(jì)1996年其在世界范圍的新發(fā)病例為875000例^考慮到男女性別，其是最常在西方國(guó)家發(fā)生的癌癥，其通常被分類為癌癥所致死亡的前3個(gè)主要因素之一。考慮到所有階段，5年存活率在60%范圍內(nèi)。只有早期診斷才能賦予治愈性治療的希望。然而，目前還沒(méi)有血清學(xué)篩選檢驗(yàn)，也沒(méi)有早期特異性診斷檢驗(yàn)方法。目前在歐洲使用兩種不同方法篩選結(jié)腸直腸癌首先，使用臨床異常性(paraclinical)檢驗(yàn)，其包括檢查糞便中是否存在血(FaecalOccultBloodTest-FOBT，例如以Hemocxult名稱銷售)。已經(jīng)證實(shí)這個(gè)技術(shù)的臨床實(shí)用性。當(dāng)每2年對(duì)在50-74歲之間的個(gè)體使用該技術(shù)時(shí)，可以使結(jié)腸直腸癌導(dǎo)致的死亡率降低15-20%2。為此，一半以上的人群必須定期參與篩選，且必須對(duì)陽(yáng)性檢驗(yàn)事件進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查，任選隨后進(jìn)行適當(dāng)治療。然而，這種篩選技術(shù)具有如下一些不利之處這個(gè)檢驗(yàn)的主要缺點(diǎn)是其特別是對(duì)于腺瘤(癌前異常增生(dysplastic)病變、)的靈敏性較差，如果腺瘤較大，將導(dǎo)致1/10的病例發(fā)展為癌癥。這個(gè)檢驗(yàn)也不是非常特異性的。糞便中出現(xiàn)血可以與非腫瘤病變相關(guān)潰瘍性結(jié)腸炎、痔瘡、肛瘺等。在這種情況中，必須進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查，結(jié)腸鏡檢查的缺點(diǎn)在后文描述?！ぷ詈螅琀emoccult檢驗(yàn)難以解釋；因此其必須在專業(yè)中心由有資格的能勝任的人員詮釋。也已經(jīng)描述了特異于人血紅蛋白的免疫學(xué)檢驗(yàn)(FecaEIA,HemeSelect等)。與Hemoccult相比，它們大概有進(jìn)步，但是基本上還存在相同問(wèn)題。因此，由Enterix公司銷售的InSure使得可以檢測(cè)87%患有CRC的患者，以及47%具有癌前息肉的患者。這是一種檢測(cè)糞便中人血紅蛋白、特別是檢測(cè)這個(gè)分子中的珠蛋白部分的檢驗(yàn)方法。第二種篩選方法是在50歲以后對(duì)人系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查，這樣在理論上可以降低由于結(jié)腸直腸癌所致死亡率。然而，對(duì)于使用內(nèi)窺鏡進(jìn)行篩選的政策，健康個(gè)體對(duì)這種檢查的可接受性太低而不能降低死亡率(已經(jīng)建立這個(gè)篩選計(jì)劃的歐洲國(guó)家結(jié)腸鏡檢查的順從水平是大約2%)。結(jié)腸鏡檢查存在并非不顯著的結(jié)腸穿孔和出血(0.)及死亡(1/10000)的風(fēng)險(xiǎn)，而且對(duì)于公共衛(wèi)生事業(yè)也是非常昂貴的。此外，結(jié)腸鏡檢查需要非常嚴(yán)格的預(yù)先結(jié)腸準(zhǔn)備，這在很大程度上解釋了順從性不佳的原因。長(zhǎng)久以來(lái)已經(jīng)描述了可以通過(guò)免疫測(cè)定化驗(yàn)結(jié)腸直腸癌的腫瘤標(biāo)記物。所述腫瘤標(biāo)記物特別是癌胚抗原(CEA)和CA19-9。CEA用于隨診。由于其靈敏性和特異性不足而不可用于篩選或者早期診斷結(jié)腸直腸癌。這是因?yàn)樵摌?biāo)記物由其它類型癌癥及在良性病變中表達(dá)。無(wú)論如何，通過(guò)組合CEA與另一種腫瘤標(biāo)記物如CA19-9或CA72-4可以增加靈敏性而不喪失其特異性。CA19-9的生理學(xué)改變的原因很罕見(jiàn)，但是其它良性病變(肝膽病癥、胰腺病癥)或者惡性病癥可以導(dǎo)致CA19-9增高。因此，單獨(dú)這個(gè)標(biāo)記物對(duì)于診斷也無(wú)意義。然而，由于其血清濃度與腫瘤的大小和存在轉(zhuǎn)移瘤相關(guān)，因此其也可以用于治療隨診或者早期證實(shí)復(fù)發(fā)。另外，已經(jīng)提議可商購(gòu)的檢驗(yàn)，如>Colopath/ColorectAlertm,由Ambrilia銷售，其是一種快速且相對(duì)非侵入性CRC的篩選檢驗(yàn)。Colopath檢測(cè)患有結(jié)腸直腸病變個(gè)體的直腸粘液中的縮醛磷脂(是磷脂的一部分的復(fù)合脂質(zhì))，而ColorectAlert檢測(cè)直腸粘液中的一種復(fù)合糖，即T-抗原。Colopath/ColorectAlertm檢驗(yàn)包括將直腸粘液涂于檢驗(yàn)條帶上，陽(yáng)性或陰性結(jié)果基于Schiff反應(yīng)。Ambrilia已經(jīng)研究了1787個(gè)個(gè)體，證實(shí)Colopath/ColorectAlert"1檢測(cè)出54%的早期結(jié)腸直腸癌病例和49%所有階段組合病例。>COLARIS,由MyriadGenetics銷售，是在血液中檢測(cè)MLHl和MSH2基因突變以篩選遺傳性非息肉性結(jié)腸癌(HNPCC綜合征)。該檢驗(yàn)的結(jié)果在3周內(nèi)獲得。Myriad使用目前可利用的最靈敏和最特異性的測(cè)序技術(shù)。該檢驗(yàn)成本昂貴。70，由AMDL銷售，是一種篩選各種類型癌癥(肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等)的檢驗(yàn)。因此其對(duì)于CRC不具有特異性。該檢驗(yàn)的原理是基于雙夾心ELISA技術(shù)(測(cè)定DR-70抗原)。通過(guò)酶反應(yīng)(抗體與生物素或者鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合)進(jìn)行揭示。生色反應(yīng)表示癌癥的存在。本申請(qǐng)人令人驚奇地證實(shí)腫瘤標(biāo)記物(L-FABP)組合CEA和CA19-9標(biāo)記物的用途，其由結(jié)腸腫瘤釋放至癌組織之外，由此可以在遠(yuǎn)離腫瘤的生物學(xué)樣品及在腫瘤自身中檢測(cè)到，使得可以實(shí)質(zhì)性改善結(jié)腸直腸癌的診斷。因此，本發(fā)明第一方面是體外診斷結(jié)腸直腸癌的方法，其通過(guò)確定取自疑似患有結(jié)腸直腸癌的患者的生物學(xué)樣品、優(yōu)選遠(yuǎn)離腫瘤的生物學(xué)樣品中肝脂肪酸結(jié)合蛋白、CEA和CA19-9標(biāo)記物的存在而進(jìn)行診斷。本發(fā)明還涉及這種方法在結(jié)腸直腸癌的早期診斷、篩選、治療隨診及預(yù)后中以及在結(jié)腸直腸癌的復(fù)發(fā)診斷中的應(yīng)用。本發(fā)明的方法因此可以通過(guò)簡(jiǎn)便的檢驗(yàn)方法特異性且早期診斷結(jié)腸直腸癌，所述檢驗(yàn)方法包括檢查取自患者的生物學(xué)樣品中L-FABP、CEA和CA19-9標(biāo)記物的存在。在遠(yuǎn)離或非遠(yuǎn)離腫瘤的生物學(xué)樣品中確定L-FABP、CEA和CA19-9標(biāo)記物的存在、其在這種生物學(xué)樣品中的濃度相對(duì)于根據(jù)健康患者確定的參考值是增加的，使得可以推斷查找的病變。本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可以使用遠(yuǎn)離潛在腫瘤的樣品作為診斷樣品，從而可以進(jìn)行簡(jiǎn)便且非侵入性診斷，而組織學(xué)診斷需要進(jìn)行侵入性活組織檢查。事實(shí)上，例如對(duì)組織切片進(jìn)行的組織標(biāo)記物的研究(免疫組織化學(xué))也許具有預(yù)后意義，但是對(duì)于篩選或者診斷結(jié)腸直腸癌無(wú)意義。肝脂肪酸結(jié)合蛋白標(biāo)記物(SwissProtNo.P07148，也稱作L_FABP、FABP1、FABPL、Z-蛋白或者固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)屬于FABP家族，其包含9個(gè)同種型。每個(gè)同種型根據(jù)首先檢測(cè)到該同種型的組織命名。這些同種型具有共有的功能及相似的三維結(jié)構(gòu)，但是其序列同源性不高。L-FABP在1985年被測(cè)序3。其是15kDa的小型蛋白質(zhì)，高豐度存在于細(xì)胞溶膠中，且具有結(jié)合游離脂肪酸和膽紅素的能力。近來(lái)的一些研究似乎表明L-FABP蛋白表達(dá)的削弱可誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生。對(duì)于前列腺癌，腫瘤活檢組織中L-FABPmRNA表達(dá)水平比在正常組織中高10倍4。對(duì)于結(jié)腸癌，一些研究小組使用二維電泳技術(shù)已經(jīng)鑒別了與在正常結(jié)腸粘膜組織中的表達(dá)相比L-FABP蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)降低5。這個(gè)結(jié)果也已經(jīng)通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)證實(shí)。此外，L-FABP蛋白在已經(jīng)轉(zhuǎn)移至肝的結(jié)腸直腸癌患者中是預(yù)后肝臟切除的標(biāo)記物6。自1965年P(guān).Gold和S.Freedman提出測(cè)定CEA(癌胚抗原)診斷結(jié)腸直腸癌7，但是血液中這個(gè)標(biāo)記物的測(cè)定對(duì)于診斷處于相對(duì)非高級(jí)階段的結(jié)腸直腸癌敏感性差。因此測(cè)定血清CEA對(duì)于評(píng)估肝轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)8和治療性隨診是特別推薦的。另外，其是對(duì)于結(jié)腸直腸癌不是非常特異的標(biāo)記物；其實(shí)際上在許多其他癌癥(肝、乳腺等)可能都是提高的。另一方面，測(cè)定糞便CEA似乎比測(cè)定血清CEA或者測(cè)定糞便血液更敏感和更特異9。然而，這個(gè)測(cè)定還未被常規(guī)提出。反應(yīng)性抗原決定簇1116-NS-19-9，更通常稱為CA19-9(碳水化合物抗原19.9)由高分子量蛋白質(zhì)攜帶1(1。測(cè)定血液中的CA19-9比測(cè)定CEA更特異。在結(jié)腸直腸癌、胰腺癌和肝癌(肝膽管型肝癌)情況中血液CA19-9水平提高，但是在非癌癥病癥(膽管炎等)情況中也是。其與CEA的組合應(yīng)用在診斷癌癥和病癥隨診時(shí)中均是推薦的。短語(yǔ)“確定腫瘤標(biāo)記物的存在”是指確定所述蛋白質(zhì)或者其信使RNA的存在，或者檢測(cè)其基因上編碼或非編碼序列中的修飾如甲基化。短語(yǔ)“由結(jié)腸腫瘤釋放”是指無(wú)論機(jī)制如何由腫瘤細(xì)胞自身或者由鄰近的非腫瘤細(xì)胞在損傷后的主動(dòng)或被動(dòng)分泌或者釋放的腫瘤標(biāo)記物，或者是由腫瘤進(jìn)展引起的細(xì)胞表型的修飾。短語(yǔ)“對(duì)其進(jìn)行本發(fā)明方法的生物學(xué)樣品”是指可能含有感興趣的腫瘤標(biāo)記物的任何生物學(xué)樣品?？梢蕴峒暗姆沁h(yuǎn)離腫瘤的生物學(xué)樣品例如可以是固體樣品如源自患者的腫瘤、該腫瘤的活檢組織、淋巴結(jié)或者轉(zhuǎn)移瘤的組織，以及純化自這些固體樣品的細(xì)胞。可以提及的遠(yuǎn)離腫瘤的生物學(xué)樣品例如是生物學(xué)液體如全血或其衍生物例如血清或血漿、尿液、唾液和滲出液、骨髓以及糞便，以及純化自這些液體樣品的細(xì)胞。優(yōu)選血液及其衍生物以及糞便、滲出液和純化自這些液體樣品的細(xì)胞。本發(fā)明的方法可以通過(guò)檢測(cè)除了L_FABP、CEA和CA19-9之外還檢測(cè)至少一種其它腫瘤標(biāo)記物而改善，所述標(biāo)記物也適當(dāng)?shù)赜山Y(jié)腸腫瘤釋放至癌組織之外。因此，組合至少4個(gè)標(biāo)記物使得可以改善診斷結(jié)腸直腸癌的檢驗(yàn)的特異性和靈敏性。因此，本發(fā)明另一方面也包括確定選自如下兩組標(biāo)記物(單獨(dú)或組合考慮)的至少一種其它腫瘤標(biāo)記物的存在-A組白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑、埃茲蛋白(Ezrin)、?；被崴饷?、腸脂肪酸結(jié)合蛋白、載脂蛋白Al、載脂蛋白All、半乳凝素-3(Galectin-3)和I-絲束蛋白(I-Plastin)，其中一些標(biāo)記物是本申請(qǐng)人鑒別的新標(biāo)記物；-B組具有額外的診斷意義的標(biāo)記物，SPβ2-微球蛋白、蛋白酶體20S、L-乳酸脫氫酶B鏈、鈣網(wǎng)蛋白、再生胰島衍生蛋白3α(RegeneratingIslet-DerivedProtein3α)、腫瘤相關(guān)鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)蛋白1、細(xì)胞骨架角蛋白II型8、細(xì)胞骨架角蛋白I型18、細(xì)胞骨架角蛋白I型19、上皮鈣粘蛋白(Epithelial-Cadherin)、絨毛蛋白(Villin),CA242、CA50、CA72-2、睪酮、TIMP-1、Cripto-1、Intelectin-1、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、細(xì)胞角蛋白20、翻譯控制的腫瘤蛋白、防衛(wèi)素(原)-A5((Pro)defensin-A5)，血液中甲基化模式特異性改變的DNA片段的檢測(cè)，例如AXL4基因的甲基化DNA(無(wú)芒樣同源框-4基因(aristaless-likehomeobox_4gene)甲基化)或者s印tin_9基因的甲基化DNA，糞便DNA片段中特異性改變的檢測(cè)，如糞便DNA的特異性突變或者糞便DNA的甲基化模式的特異性改變，以及糞便人血紅蛋白的檢測(cè)。本發(fā)明的方法因此可以通過(guò)檢測(cè)至少4個(gè)標(biāo)記物而改善，最少3個(gè)標(biāo)記物是L-FABP,CEA和CA19-9，另一個(gè)是選自A組的另一腫瘤標(biāo)記物，所述A組即白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑、埃茲蛋白、?；被崴饷?、腸脂肪酸結(jié)合蛋白、載脂蛋白Al、載脂蛋白All、半乳凝素_3和I-絲束蛋白?！靶旅枋龅哪[瘤標(biāo)記物”是指蛋白質(zhì)或信使RNA或者相應(yīng)基因的特異性修飾，如突變或者甲基化。白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑腫瘤標(biāo)記物(SwissProtNo.P30740，也稱作LEI、SerpinBi、單核細(xì)胞/中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑、M/NEI或ΕΙ)在1992年測(cè)序"。LEI特異性抑制具有彈性蛋白酶型或者糜蛋白酶型性質(zhì)的蛋白酶，其通過(guò)在SDS作用下形成不可解離的復(fù)合物而起抑制作用12。因此LEI抑制由中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的三種主要的蛋白酶白細(xì)胞彈性蛋白酶、蛋白酶_3和組織蛋白酶G。這些蛋白酶能通過(guò)蛋白酶解細(xì)胞外或吞噬的底物而使得免疫系統(tǒng)防御該生物體。然而，當(dāng)這些蛋白酶過(guò)量時(shí)，其可造成炎癥反應(yīng)。因此，LEI在調(diào)節(jié)和限制細(xì)胞蛋白酶誘導(dǎo)的炎癥作用中起作用。本申請(qǐng)人令人驚奇地揭示這種蛋白質(zhì)在取自結(jié)腸直腸癌患者的生物學(xué)樣品中是良好的標(biāo)記物，所述樣品可以是遠(yuǎn)離該腫瘤的樣品。埃茲蛋白標(biāo)記物(SwissProtNo.P15311，也稱作p81，Cytovillin或絨毛蛋白_2)是提供細(xì)胞膜與細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白絲之間結(jié)合的蛋白質(zhì)，特別是在腸上皮細(xì)胞的微絨毛中13。W.G.Jiang和S.Hiscox14已經(jīng)揭示了白細(xì)胞介素IL_2、IL_8、IL-IO等可以抑制埃茲蛋白在HT29人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)。同一作者15也揭示了HT115和HRT18結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系中埃茲蛋白表達(dá)的抑制降低細(xì)胞之間的粘附，且增加細(xì)胞的活動(dòng)性和侵入行為。他們推斷埃茲蛋白通過(guò)與細(xì)胞粘附分子E-鈣粘蛋白和β-連環(huán)蛋白(β-Catenin)的相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞/細(xì)胞和細(xì)胞/基質(zhì)之間的粘附。他們提出埃茲蛋白在控制癌細(xì)胞的侵潤(rùn)潛力中可以起重要作用。此外，Τ.Xiao等14使用ELISA量化肺癌患者的血漿埃茲蛋白。然而，他們未觀測(cè)到與對(duì)照個(gè)體的任何差異。本申請(qǐng)人令人驚奇地揭示了這種蛋白質(zhì)在取自結(jié)腸直腸癌患者的生物學(xué)樣品中是良好的標(biāo)記物，所述樣品遠(yuǎn)離或者非遠(yuǎn)離所述腫瘤。酰化氨基酸水解酶1標(biāo)記物(SwissProtNo.Q03154,也稱作EC3.5.1.14，N-酰基-L-氨基酸氨基水解酶或ACY-1)是?；被崴饷讣易宓囊徊糠帧Ｋ鼈兪谴呋；陌被崴庖蕴峁┲舅岷桶被岬拿?7。對(duì)?；被崴饷富钚赃M(jìn)行的免疫化學(xué)測(cè)定在早如1975年由K.Lorentz等18揭示，其用于檢驗(yàn)各種組織和血清19。研究示出在肝病變的病例中?；被崴饷富钚栽黾樱窃诮Y(jié)腸癌病例中不增加。此外，酰化氨基酸水解酶1基因已經(jīng)在染色體3p21.1上鑒別2°。在小細(xì)胞肺癌中3p21.1區(qū)域降低為純合性，在這種情況中酰化氨基酸水解酶表達(dá)被抑制或不可檢測(cè)21。相似地，S.Balabanov等22已經(jīng)揭示在腎癌病例中?；被崴饷副磉_(dá)被抑制。本申請(qǐng)人令人驚奇地揭示了這種蛋白質(zhì)在取自結(jié)腸直腸癌患者的生物學(xué)樣品中是良好的標(biāo)記物，所述樣品遠(yuǎn)離或者非遠(yuǎn)離所述腫瘤。腸脂肪酸結(jié)合蛋白標(biāo)記物(SwissProtNo.P12104，也稱作I-FABP、FABP-2或FABPI)在1987年被測(cè)序23。其是15kDa的小型蛋白質(zhì)，高豐度存在于細(xì)胞溶膠中，且具有結(jié)合游離脂肪酸和膽紅素的能力。I-FABP蛋白在小腸的腸上皮細(xì)胞中表達(dá)，且可以組成這種類型細(xì)胞蛋白質(zhì)含量的大約2%。在組織水平，十二指腸和空腸與結(jié)腸相比顯然含有較高數(shù)量的I-FABP(空腸4.8μg/g，結(jié)腸0.25μg/g)24。I-FABP在健康個(gè)體的血漿樣品中不可被檢測(cè)到。另一方面，在某些病理學(xué)情況如腸缺血、克羅恩病或者原發(fā)性膽汁性肝硬化中，可以證實(shí)在某些個(gè)體中血漿I-FABP濃度增加24。對(duì)于前列腺癌，已經(jīng)揭示了I-FABPmRNA在腫瘤活檢組織比在正常組織中的表達(dá)水平高7倍2°。在大鼠中用氧化偶氮甲烷(azoxymethane)誘導(dǎo)的結(jié)腸直腸癌模型中，當(dāng)給予動(dòng)物降低癌癥發(fā)生的食物(大豆蛋白或者乳清水解產(chǎn)物)時(shí)，I-FABPmRNA的表達(dá)水平降低2.92-3.97倍25。本申請(qǐng)人令人驚奇地揭示了這種蛋白質(zhì)在取自結(jié)腸直腸癌患者的生物學(xué)樣品中是良好的標(biāo)記物，所述樣品遠(yuǎn)離所述腫瘤。載脂蛋白是由極性氨基酸組成的蛋白質(zhì)家族，其可以通過(guò)形成稱作脂蛋白的親水性大分子復(fù)合物而轉(zhuǎn)運(yùn)血液中的脂質(zhì)。對(duì)于每種人血漿載脂蛋白，存在衍生自遺傳多態(tài)性和/或翻譯后修飾的同種型，其在血液中的存在與某些病變相關(guān)26。載脂蛋白的血漿濃度并非是不顯著的，在mg/ml級(jí)別27。載脂蛋白AI標(biāo)記物(NCBINo.490098，也稱作ApoA-I,ApoAI和ApoAl)是具有243個(gè)氨基酸的28kDa蛋白質(zhì)。其基本上由肝和腸合成。通過(guò)SELDI-T0F，揭示了這種蛋白質(zhì)在結(jié)腸直腸癌患者血清與在健康個(gè)體血清中相比豐度不高28。然而，這篇文章指出通過(guò)組合ApoAI與其它蛋白質(zhì)標(biāo)記物區(qū)別CRC患者與健康個(gè)體。此外，這篇文章指出由另一研究小組進(jìn)行的通過(guò)濁度免疫測(cè)定分析ApoAI未證實(shí)這種蛋白質(zhì)在CRC患者血清中的豐度不高29。Hachem等3°測(cè)定了在結(jié)腸直腸癌轉(zhuǎn)移之后患有肝癌的患者血清中的ApoAl。本申請(qǐng)人:令人驚奇地揭示了通過(guò)免疫測(cè)定分析可以證實(shí)這種蛋白質(zhì)在結(jié)腸直腸癌患者中的濃度降低，與先前Engwegen等28提出的結(jié)果相反，其僅通過(guò)實(shí)施SELDI-T0F技術(shù)才能證實(shí)這種降低。通過(guò)在生物學(xué)樣品中進(jìn)行免疫測(cè)定分析ApoAI是診斷結(jié)腸直腸癌的良好方法，所述樣品遠(yuǎn)離所述腫瘤，進(jìn)行的免疫測(cè)定分析不是Zhang等的小組所用的比濁法29。載脂蛋白AII標(biāo)記物(SwissProtNo.P02652,也稱作ApoAII、Apo-AII和ApoA2)是由每個(gè)鏈具有77個(gè)氨基酸的兩個(gè)多肽鏈組成的17380-Da蛋白質(zhì)，所述兩個(gè)多肽鏈通過(guò)二硫鍵連接。如載脂蛋白AI—樣，載脂蛋白AII也基本上由肝和腸合成。除了ApoAI之外，Hachem等3°也測(cè)定了在結(jié)腸直腸癌轉(zhuǎn)移之后患有肝癌的患者血清中的ApoAll。然而，結(jié)果無(wú)意義，且不能得以推斷病癥。本申請(qǐng)人令人驚奇地揭示了結(jié)腸直腸癌患者中這種蛋白質(zhì)濃度降低，使其在取自結(jié)腸直腸癌患者的生物學(xué)樣品中是良好的標(biāo)記物，所述樣品遠(yuǎn)離所述腫瘤。I-絲束蛋白標(biāo)記物(SwissProtNo.Q14651，也稱作腸特異性絲束蛋白或者絲束蛋白1)屬于人絲束蛋白家族，該家族具有三個(gè)代表性成員I-絲束蛋白、L-絲束蛋白和T-絲束蛋白。一些作者將絲束蛋白類稱為“微絲結(jié)合蛋白類(Fimbrins)”，另一些作者將I-絲束蛋白稱為微絲結(jié)合蛋白。絲束蛋白類是結(jié)合肌動(dòng)蛋白形成細(xì)胞骨架的蛋白質(zhì)。它們是70kDa蛋白質(zhì)，在真核生物進(jìn)化中相對(duì)良好保守。它們呈現(xiàn)出良好組織特異性，在一個(gè)時(shí)期僅一種同種型在正常組織中存在31。絲束蛋白類在癌癥中的應(yīng)用已經(jīng)在專利US-A-5360715中描述，該專利提議了一種確定細(xì)胞是造血細(xì)胞還是血管發(fā)生性即癌性細(xì)胞的方法。這種方法要求在細(xì)胞水平測(cè)定L-絲束蛋白和T-絲束蛋白，更特別是測(cè)定其mRNA。然而，盡管呈現(xiàn)這些性質(zhì)，但是先前未進(jìn)行研究以評(píng)估絲束蛋白在使用血清或糞便樣品診斷結(jié)腸直腸癌中的重要性。此外，從未設(shè)想I-絲束蛋白作為潛在的癌標(biāo)記物32。本申請(qǐng)人令人驚奇地揭示了這種蛋白質(zhì)在取自結(jié)腸直腸癌患者的生物學(xué)樣品中是良好的標(biāo)記物，所述樣品遠(yuǎn)離所述腫瘤。半乳凝素-3標(biāo)記物(SwissProtNo.P17931，也稱作Gal_3、半乳糖特異性凝集素3、MAC-2抗原、IgE-結(jié)合蛋白、35kDa凝集素、碳水化合物結(jié)合蛋白35、CBP35、昆布氨酸_結(jié)合蛋白、凝集素L-29、L-31、半乳糖苷結(jié)合蛋白或者GALBP)是能結(jié)合N-乙酰氨基乳糖(acetyllactosamine)型的β_半乳糖苷結(jié)構(gòu)的凝集素。其是參與多種生物學(xué)功能的多功能蛋白質(zhì)，所述功能包括腫瘤細(xì)胞的粘附、增殖、分化、血管發(fā)生、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)移癌進(jìn)展33O多項(xiàng)研究表明Gal-3可以與許多分子形成復(fù)合物CEA、IgE、昆布氨酸(Laminin)、粘蛋白(Mucin)、Mac-2BP、LAMPl、LAMP2、纖連蛋白(Fibronectin)等。Gal_3的血清測(cè)定已經(jīng)由I.Iurisci等34描述。Gal-3在用Mac-2-結(jié)合蛋白(Gal_3-結(jié)合蛋白)包被的微滴定平板上被捕獲，然后用抗-Gal-3大鼠抗體揭示。這項(xiàng)研究揭示了Gal-3在胃腸道癌癥、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑素瘤和非霍奇金淋巴瘤中增加的血清水平。在對(duì)其進(jìn)行本發(fā)明方法的生物學(xué)樣品中，選自A組的腫瘤標(biāo)記物的濃度根據(jù)考慮的標(biāo)記物與在健康個(gè)體中確定的參考值相比增加或降低。本發(fā)明的方法也可以通過(guò)組合檢測(cè)L-FABP、CEA和CA19-9標(biāo)記物與選自B組的一種其它腫瘤標(biāo)記物而改善，所述B組標(biāo)記物即標(biāo)記物β2-微球蛋白、蛋白酶體20S、L-乳酸脫氫酶B鏈、鈣網(wǎng)蛋白、再生胰島衍生蛋白3α、腫瘤相關(guān)鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)蛋白1、細(xì)胞骨架角蛋白II型8、細(xì)胞骨架角蛋白I型18、細(xì)胞骨架角蛋白I型19、上皮鈣粘蛋白(Epithelial-Cadherin)、絨毛蛋白、CA242、CA50、CA72-2、睪酮、ΤΙΜΡ-1、Cripto-1、Intelectin-1、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、細(xì)胞角蛋白20、翻譯控制的腫瘤蛋白、防衛(wèi)素(原)-A5；血液中甲基化DNA的檢測(cè)，優(yōu)選AXL4基因的甲基化DNA(無(wú)芒樣同源框_4基因甲基化)或者s印tin-9基因的甲基化DNA；糞便DNA片段中特異性改變的檢測(cè)，如糞便DNA的特異性突變或者糞便DNA的甲基化模式的特異性改變，以及糞便人血紅蛋白的檢測(cè)。當(dāng)然，本發(fā)明的方法也可以在同一測(cè)定中檢測(cè)LEI、選自B組的至少一種腫瘤標(biāo)記物以及選自A組的至少一種其它腫瘤標(biāo)記物。β2-微球蛋白標(biāo)記物(SwissProtNo.P61769，也稱作β2_微球蛋白，β2Μ)是在大多數(shù)有核人細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)的一種低分子量(ll_12kDa)蛋白質(zhì)。在某些癌癥患者中，血清β2-微球蛋白水平增加，這種增加不是特異性的，或者與腫瘤的性質(zhì)、疾病的階段或嚴(yán)重性不相關(guān)。在其它疾病如紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、淋巴系統(tǒng)惡性疾病(多發(fā)性骨髓瘤、B細(xì)胞淋巴瘤)、某些病毒性疾病(肝炎或AIDS)以及在血友病患者中也觀測(cè)到顯著增加。由于β2-微球蛋白被腎小球?yàn)V過(guò)，且由近端小管重吸收，因此在腎臟疾病中其在血液中的濃度可以改變。因此測(cè)定β2-微球蛋白主要用于診斷腎臟病癥，或者用于獲得性免疫缺陷病毒感染的隨診中。然而，已知這種標(biāo)記物是腫瘤標(biāo)記物，特別是結(jié)腸癌的標(biāo)記物。蛋白酶體20S標(biāo)記物(也稱作Prosome)是蛋白酶體的中心結(jié)構(gòu)，其自身是參與遍在蛋白的細(xì)胞內(nèi)降解的分子復(fù)合物35。蛋白酶體是由在7個(gè)亞基的4個(gè)環(huán)締合的28個(gè)亞基組成的700kDa的分子復(fù)合物。在人體中，已知7個(gè)α單位(α，α2，α3，α4，α5，α6禾口α7)及10個(gè)β單位(β1，β2，β3，β4，β5，β6，β7，βΠ,β2i禾口β5i)。通過(guò)其催化性質(zhì)，蛋白酶體在細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)和凋亡中且因此在癌化途徑中起關(guān)鍵作用。用Bortezomib(Velcade)抑制蛋白酶體是公認(rèn)的治療多發(fā)性骨髓瘤的方法?，F(xiàn)在正對(duì)血液癌癥或腫瘤進(jìn)行II期或III期治療試驗(yàn)。T.Lavabre-Bertrand等36揭示了在某些病理狀況特別是在癌癥(骨髓瘤、淋巴瘤和實(shí)體瘤)中，蛋白酶體的血清水平可增加。L-乳酸脫氫酶B鏈標(biāo)記物(SwissProtNo.P07195,也稱作LDH-B，LDH心單位或LDH-H)是可以以同源四聚體形式形成復(fù)合物的蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)也可以與L-乳酸脫氫酶A鏈蛋白(SwissProtNo.P00338，也稱作LDH-A、LDH肌單位或LDH-M)以異源四聚體形式形成復(fù)合物。血流中稱作LDH的這種四聚體復(fù)合物的血清劑量和/或血清酶活性在許多實(shí)體瘤中與腫瘤大小成比例地增加。推薦其與人絨毛膜促性腺激素(β-hCG)和胎盤堿性磷酸酶組合用于精囊癌的隨診中。LDH被認(rèn)為是預(yù)后淋巴瘤、白血病或者結(jié)腸癌的重要標(biāo)記物37。鈣網(wǎng)蛋白標(biāo)記物(SwissProtNo.P27797,也稱作CRP55、Calregulin,HACBP,ERp60或grp60)是多功能蛋白質(zhì)。其是能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的幾乎所有單糖基化蛋白質(zhì)瞬時(shí)相互作用的凝集素。D.J.McCool等38因此已經(jīng)揭示了鈣網(wǎng)蛋白參與結(jié)腸粘蛋白MUC2的成熟。在組織、糞便或體液中使用鈣網(wǎng)蛋白測(cè)定診斷CRC的方法在專利申請(qǐng)WO03/065003中描述。再生胰島衍生蛋白3α標(biāo)記物(SwissProtNo.Q06141，也稱作RegΙΙΙ-α、胰腺炎相關(guān)蛋白1或者胰腺炎相關(guān)蛋白I(PAPl))是在正常胰腺中微弱表達(dá)的蛋白質(zhì)。其在急性胰腺炎和在某些慢性胰腺炎患者中過(guò)表達(dá)。在這種情況中，其出現(xiàn)在胰液和血流中39。Y.Motoo等4°通過(guò)ELISA已經(jīng)揭示了某些結(jié)腸癌、胃癌、肝癌或胰腺癌以及在腎功能衰竭患者血液中PAPl水平增加。為此，他們使用Dynabio(LaGaude，F(xiàn)rance)公司銷售的ELISA測(cè)定法(PANCEPAP)。腫瘤相關(guān)鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)蛋白1標(biāo)記物(SwissProtNo.P16422，也稱作主要胃腸道腫瘤相關(guān)蛋白GA733-2、上皮細(xì)胞表面抗原、EpCAM、上皮糖蛋白EGP、腺癌相關(guān)抗原、KSA、KS1/4抗原、細(xì)胞表面糖蛋白Trop-I或者CD326抗原)根據(jù)其由結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的抗體識(shí)別的能力在1979年被鑒定41。已知這種蛋白質(zhì)有許多名稱，如上文描述，但是最常用的是稱其為EpCAM。其是在某些上皮細(xì)胞以及許多癌癥細(xì)胞的基底面中表達(dá)的跨膜蛋白42。在1982年，Herlyn等43揭示了注射抗-EpCAM單克隆抗體可以抑制結(jié)腸直腸癌患者體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。這些結(jié)果使得可以基于稱作Edrecolomab的抗-EpCAM抗體開(kāi)發(fā)抗腫瘤治療方法。這種治療以Panorex名稱銷售。此外，H.Abe等44通過(guò)ELISA揭示了稱作MK-I的可溶形式的EpCAM在10%研究的癌癥患者血流中增加。細(xì)胞角蛋白是組成上皮細(xì)胞細(xì)胞骨架的中間絲的蛋白質(zhì)部分。目前已經(jīng)鑒別了超過(guò)20種的人細(xì)胞角蛋白。細(xì)胞角蛋白8(SwissProtNo.P05787，也稱作細(xì)胞角蛋白、CK-8、角蛋白-8或K8)、18(SwissProtNo.P05783，也稱作細(xì)胞角蛋白_18、CK_18、角蛋白-18或K18)和19(SwissProtNo.P08727，也稱作細(xì)胞角蛋白-19、CK-19、角蛋白-19或K19)在上皮細(xì)胞中豐度最高，且是診斷癌病變的有效工具45。這種臨床重要性與細(xì)胞凋亡或增殖期上皮細(xì)胞釋放細(xì)胞角蛋白相關(guān)。在細(xì)胞凋亡情況中，這個(gè)釋放以可溶片段形式出現(xiàn)，似乎在半胱氨酸蛋白酶的蛋白酶解作用下出現(xiàn)。血流中未降解的細(xì)胞角蛋白形式從未有報(bào)道。三種臨床最常用的細(xì)胞角蛋白測(cè)定是組織多肽抗原(TPA)測(cè)定，組織多肽特異性抗原(TPS)測(cè)定和CYFRA21-1測(cè)定。TPA是測(cè)量細(xì)胞角蛋白8、18和19的廣譜檢驗(yàn)法。TPS和CYFRA21-1測(cè)定分別更特異性測(cè)量細(xì)胞角蛋白18和細(xì)胞角蛋白19的片段。這三種檢測(cè)法檢測(cè)可溶的細(xì)胞角蛋白片段，所述片段可以以其自身或者以蛋白質(zhì)復(fù)合物形式呈現(xiàn)。TPA、TPS或者CYFRA-21-1已經(jīng)用于結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和某些ENT癌的治療隨診中。事實(shí)上，血液中可溶的細(xì)胞角蛋白的測(cè)定在篩選腫瘤復(fù)發(fā)或者評(píng)估所用治療(放療、化療、激素治療)的反應(yīng)中具有臨床價(jià)值。定期檢測(cè)使得特別可以評(píng)估腫瘤的進(jìn)展?？扇艿难杭?xì)胞角蛋白的量也具有預(yù)后腫瘤階段和轉(zhuǎn)移形成的意義。目前，最常用的細(xì)胞角蛋白血液測(cè)定是CYFRA21-1。高度推薦其用于非小細(xì)胞肺癌患者的隨診。有許多可商購(gòu)的TPA(ABSangtecMedicalCo.，Byk-Roland等)、TPS(IDLBiotechAB,BEKIDiagnosiss等)禾口CYFRA-21-1(RocheDiagnosiss,CISBio-International,FujirebioDiagnosiss等)的試劑盒。此外，H.Kim等46揭示了測(cè)定糞便細(xì)胞角蛋白19(DiNonAInc.)組合便潛血測(cè)定可用于篩選胃腸道疾病。最后，細(xì)胞角蛋白20(SwiSSProtNo.P35900，也稱作細(xì)胞骨架I型角蛋白20、CK-20、角蛋白-20、K20或者IT蛋白)在結(jié)腸直腸癌中作為標(biāo)記物的應(yīng)用在專利申請(qǐng)US2002/0160382中描述。上皮鈣粘蛋白標(biāo)記物(SwissProtNo.P12830，也稱作E-鈣粘蛋白、Uvomorulin、鈣粘蛋白-1、CAM120/80或者CD324抗原)是介導(dǎo)鈣離子依賴性細(xì)胞粘附的跨膜蛋白。其在上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)，在此參與維持其表型。E-鈣粘蛋白的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合β-連環(huán)蛋白，其自身結(jié)合細(xì)胞骨架的肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)。這種E-鈣粘蛋白/β-連環(huán)蛋白結(jié)合在穩(wěn)定上皮組織的細(xì)胞/細(xì)胞粘附中起重要作用。因此，E-鈣粘蛋白的喪失可降低細(xì)胞粘附且增加癌細(xì)胞的侵潤(rùn)能力。E-鈣粘蛋白或者連環(huán)蛋白的表達(dá)降低通常與腫瘤特別是胃腸道癌癥的更大的侵潤(rùn)性和去分化性相關(guān)聯(lián)。因此，F(xiàn).Roca等47揭示了患有結(jié)腸直腸癌且E-鈣粘蛋白低表達(dá)的患者與具有正常表達(dá)水平的患者相比具有更不利的預(yù)后。在1983年，Damsky等48揭示了可溶形式的E-鈣粘蛋白可以由MCF-7乳腺癌細(xì)胞系釋放。這種可溶形式相應(yīng)于E-鈣粘蛋白胞外部分的裂解。隨后，Μ.Katayama等49揭示了可溶形式的E-鈣粘蛋白在癌癥情況中可以釋放進(jìn)入血流中；C.Willmarms等5(1揭示了血液中E-鈣粘蛋白量增加與結(jié)腸直腸癌的腫瘤階段相關(guān)聯(lián)。此外，可商購(gòu)的試劑盒由TakaraBioChemicals(Tokyo,Japan)公司提供。J.Holmgren等51揭示了在結(jié)腸直腸癌患者血清中CA50抗原的量增加。CA50抗原根據(jù)其由特異性單克隆抗體識(shí)別的能力定義。關(guān)于CA72標(biāo)記物，T.L.Klug等52揭示了在結(jié)腸直腸癌患者血清中CA72抗原的量增加。CA72抗原根據(jù)其由特異性單克隆抗體識(shí)別的能力定義。相似地，P.Kuusela等53揭示了在結(jié)腸直腸癌患者血清中CA242抗原的量增加。CA242抗原根據(jù)其由特異性單克隆抗體識(shí)別的能力定義。M.Holland等54提議測(cè)定睪酮以診斷結(jié)腸直腸癌。這些作者揭示了結(jié)腸直腸癌患者血液睪酮水平降低。關(guān)于TIMP-1，或者1型基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制劑這個(gè)標(biāo)記物，專利申請(qǐng)US2007/0020707描述了通過(guò)測(cè)定體液中TIMP-I診斷結(jié)腸直腸癌。F.Model等55在2006年7月在胃腸道癌癥國(guó)際會(huì)議期間揭示了可以檢測(cè)結(jié)腸直腸癌患者血漿中s印tin-9基因的甲基化形式。M.P.Ebert等56揭示了ALX4基因或者無(wú)芒樣同源框_4基因在結(jié)腸直腸癌患者血清中比在對(duì)照血清中更通常被甲基化(P<0.0001)。使用41.4pg/mL閾值，他們獲得了83.3%的靈敏性和70%的特異性。絨毛蛋白在專利申請(qǐng)F(tuán)R2581456中被描述為診斷結(jié)腸直腸癌的血液標(biāo)記物。C.Bianco等57揭示了在結(jié)腸直腸癌患者血清中Cripto-Ι的量增加。測(cè)定Intelectin_l(SwissProtNo.Q8WWA0，也稱作腸乳鐵蛋白受體、呋喃半乳糖結(jié)合凝集素、內(nèi)皮細(xì)胞凝集素HL-I或者Omentin)用以診斷結(jié)腸直腸癌在專利申請(qǐng)US2003/0082533中描述。蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(SwissProtNo.P07237,也稱作EC5.3.4.1、PDI、脯氨酰4-羥化酶β亞基、細(xì)胞甲狀腺激素結(jié)合蛋白或者ρ55)、翻譯控制的腫瘤蛋白(SwissProtNo.P13693，也稱作TCTP、p23、組胺釋放因子、HRF或Fortilin)以及防衛(wèi)素(原)-A5(SwissProtNo.Q01523)用作結(jié)腸直腸癌標(biāo)記物分別在專利申請(qǐng)EP1724586、US2003/0172388和US2006/0179496中描述。術(shù)語(yǔ)“防衛(wèi)素(原)”是指前體(即裂解前的防衛(wèi)素原)；前肽(即防衛(wèi)素原裂解后的N末端部分)；以及成熟蛋白質(zhì)(即防衛(wèi)素，相應(yīng)于裂解后C末端部分)。最后，測(cè)定人糞便血紅蛋白是已知的檢驗(yàn)法，且可以如前述實(shí)施。對(duì)其進(jìn)行本發(fā)明方法的生物學(xué)樣品中選自B組的腫瘤標(biāo)記物的濃度根據(jù)考慮的標(biāo)記物與在健康個(gè)體中確定的參考值相比是增加或降低的。優(yōu)選地，B組腫瘤標(biāo)記物選自β2-微球蛋白、蛋白酶體20S、L-乳酸脫氫酶B鏈、鈣網(wǎng)蛋白、再生胰島衍生蛋白3α、腫瘤相關(guān)鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)蛋白1、上皮鈣粘蛋白、睪酮、TIMP-I、Intelectin-I、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、細(xì)胞角蛋白20、翻譯控制的腫瘤蛋白、防衛(wèi)素(原)"Α5及檢測(cè)人糞便血紅蛋白。當(dāng)然，本發(fā)明的方法也可包括檢測(cè)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的結(jié)腸直腸癌任何其它標(biāo)記物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選包含至少以下標(biāo)記物的組合-L-FABP,CEA、CA19-9和半乳凝素_3，-L-FABP,CEA、CA19-9和載脂蛋白Al，-L-FABP,CEA、CA19-9和白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑，-L-FABP,CEA、CA19-9、白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑和酰化氨基酸水解酶1，-L-FABP,CEA、CA19-9、白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑、?；被崴饷?、β2_微球蛋白、蛋白酶體20S、PAP和E-鈣粘蛋白，或-L-FABP,CEA、CA19-9、白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑、?；被崴饷?、β2_微球蛋白、蛋白酶體20S、半乳凝素_3和載脂蛋白AI。如上所述，感興趣的腫瘤標(biāo)記物以蛋白質(zhì)形式或者以信使RNA形式或者通過(guò)相應(yīng)DNA改變(突變或甲基化修飾)而被檢測(cè)。可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的確定樣品中蛋白質(zhì)存在的任何方法確定生物學(xué)樣品中感興趣的“蛋白質(zhì)”腫瘤標(biāo)記物的存在，例如生物化學(xué)檢驗(yàn)，包括免疫測(cè)定，或者通過(guò)質(zhì)譜分析。所述生物化學(xué)檢驗(yàn)可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何檢驗(yàn)，包括分子相互作用，即所述腫瘤標(biāo)記物與特異于或者非特異于所述腫瘤標(biāo)記物的一或多種結(jié)合配偶體之間的反應(yīng)。優(yōu)選地，所述生物化學(xué)檢驗(yàn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的免疫測(cè)定，包括腫瘤標(biāo)記物(即抗原)與一或多種特異性結(jié)合配偶體(即該抗原的抗體)之間的免疫學(xué)反應(yīng)。本發(fā)明方法中特異于或非特異于腫瘤標(biāo)記物的結(jié)合配偶體是能結(jié)合所述標(biāo)記物的任何配偶體。當(dāng)其能以高特異性、甚至以100%特異性結(jié)合這些標(biāo)記物時(shí)，認(rèn)為其是特異性的。當(dāng)其與這些標(biāo)記物的結(jié)合特異性較低且同時(shí)能結(jié)合其它配體如蛋白質(zhì)時(shí)，認(rèn)為其是非特異性的。例如，可以提及的是抗體、抗體一部分、受體及能結(jié)合這個(gè)標(biāo)記物的任何其它分子。所述結(jié)合配偶體抗體是例如多克隆抗體或者單克隆抗體。多克隆抗體可以通過(guò)用相關(guān)的腫瘤標(biāo)記物免疫動(dòng)物，隨后回收純化形式的希望的抗體而獲得，通過(guò)從所述動(dòng)物取血清，將所述抗體從其它血清組分中分離，特別是在附著有該抗體特異性識(shí)別的抗原、特別是所述標(biāo)記物的柱上通過(guò)親和層析分離。單克隆抗體可以通過(guò)雜交瘤技術(shù)獲得，其一般原理在后文描述。首先，用感興趣的腫瘤標(biāo)記物免疫動(dòng)物(通常是小鼠)，隨后所述動(dòng)物的B淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生該抗原的抗體。這些產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞隨后與“永生化的”骨髓瘤細(xì)胞(例如鼠)融合以產(chǎn)生雜交瘤。使用由此獲得的細(xì)胞異源混合物，選擇能產(chǎn)生特定抗體且無(wú)限增殖的細(xì)胞。每個(gè)雜交瘤均以克隆形式增殖，導(dǎo)致單克隆抗體產(chǎn)生，其由所述腫瘤標(biāo)記物識(shí)別的性質(zhì)可例如通過(guò)ELISA、通過(guò)一維或二維Western印跡、通過(guò)免疫熒光或者通過(guò)生物傳感器檢測(cè)。隨后純化由此選擇的單克隆抗體，特別是通過(guò)上述親和層析技術(shù)純化。所述單克隆抗體也可以是通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的遺傳工程化技術(shù)獲得的重組抗體。已知抗-白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑抗體的實(shí)例，且可得自Abcam目錄兔抗-LEI多克隆抗體，Cat.No.Ab47731。抗-LEI單克隆抗體，克隆ELA-I，由Yasumatsu等描述58。已知抗-埃茲蛋白抗體的實(shí)例，且可得自Abcam目錄，抗-埃茲蛋白單克隆抗體，克隆3C12，Cat.No.Ab4069和兔抗-埃茲蛋白多克隆抗體，Cat.No.Ab47418。已知抗-?；被崴饷?抗體的實(shí)例，且可得自Abnova目錄，抗-?；被崴饷?單克隆抗體，克隆4F1-B7，Cat.No.H00000095-M01，以及Abcam目錄，雞抗-?；被崴饷?多克隆抗體，Cat.No.Ab26173。已知抗-肝脂肪酸結(jié)合蛋白抗體的實(shí)例，且可得自Abcam目錄，抗_L_FABP單克隆抗體，克隆6B6，Cat.No.Abl0059，及兔抗-L-FABP多克隆抗體，Cat.No.Ab7807。已知抗-腸脂肪酸結(jié)合蛋白抗體，且可得自R&DSystems目錄，抗-I-FABP單克隆抗體，克隆323701，Cat.NO.MAB3078，及Abcam目錄，兔抗-I-FABP多克隆抗體，Cat.No.Ab7805o已知抗-載脂蛋白AI抗體的實(shí)例，且可得自BiodesignMeridianLifeSciences目錄，抗-ApoAI單克隆抗體，克隆4A90，Cat.No.H45402M，和山羊抗-ApoAI多克隆抗體，Cat.No.K45252P。已知抗-載脂蛋白AII抗體的實(shí)例，且可得自USBiological目錄，抗-ApoAII單克隆抗體，克隆1402，Cat.No.A2299-31C，及BiodesignMeridianLifeSciences目錄，山羊抗-ApoAII多克隆抗體，Cat.No.K74001P。已知抗-I-絲束蛋白多克隆抗體的實(shí)例，且可得自SantaCruzBiotechnology目錄。兔多克隆抗體H-300(Cat.No.sc-28531)與I-絲束蛋白、L-絲束蛋白和T-絲束蛋白反應(yīng)。本申請(qǐng)人揭示了I-絲束蛋白的單克隆抗體。已知抗-β2-微球蛋白、抗-CEA、抗-CA19-9和抗-睪酮抗體的實(shí)例，且可用于本申請(qǐng)人:的測(cè)定試劑盒中，分別是Vidasβ2-微球蛋白、VidasCEA、VidasCA19-9和Vidas睪酮。已知抗-蛋白酶體20S抗體的實(shí)例，且可得自AffinitiyResearchProducts目錄。已知抗-半乳凝素-3、抗-L-乳酸脫氫酶B鏈、抗-鈣網(wǎng)蛋白、抗-腫瘤腫瘤相關(guān)鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)蛋白1、抗-細(xì)胞骨架II型角蛋白8、抗-細(xì)胞骨架I型角蛋白18、抗-細(xì)胞骨架I型角蛋白19、抗-上皮-鈣粘蛋白、抗_絨毛蛋白和抗-TIMP-I抗體的實(shí)例，且可得自Abcam目錄。已知抗-再生胰島衍生蛋白3α抗體的實(shí)例，且用于Dynabio測(cè)定試劑盒(LaGaude,France)中。已知抗-CA242、抗-CA50和抗-CA72-4抗體的實(shí)例，且可得自Fujirebio目錄。已知抗-Intelectin-I抗體的實(shí)例，且可得自AlexisBiochemicals目錄，抗-Intelectin-I單克隆抗體，克隆Saly-I，Cat.No.ALX-804-850-C100，以及rabbit抗-Intelectin-I多克隆抗體，Cat.No.ALX-210-941。已知抗-蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶抗體的實(shí)例，且可得自Abcam目錄，抗-PDI單克隆抗體，克隆RL77，Cat.No.Ab5484，以及兔抗-PDI多克隆抗體，Cat.No.Ab3672，已知抗-細(xì)胞角蛋白20抗體的實(shí)例，且可得自Abcam目錄，抗-細(xì)胞角蛋白20單克隆抗體，克隆Ks20.8，Cat.No.Ab962,以及兔抗-細(xì)胞角蛋白20多克隆抗體，Cat.No.Ab367560已知抗-TCTP抗體的實(shí)例，且可得自目錄，抗-TCTP單克隆抗體，克隆3C7，Cat.No.157H00007178-M01,以及抗-TCTP多克隆抗體，Cat.No.157H00007178-A01。已知抗-防衛(wèi)素-A5抗體的實(shí)例，且可得自SantaCruzBiotechnology目錄，抗-防衛(wèi)素-A5單克隆抗體，克隆8C8，Cat.No.sc-53997，以及AlphaDiagnosisInternationalInc.目錄，兔抗-防衛(wèi)素-A5多克隆抗體，Cat.No.HDEFA51-A。本發(fā)明方法中特異于或者非特異于腫瘤標(biāo)記物的結(jié)合配偶體可用作捕獲劑，作為檢測(cè)劑，或者作為捕獲劑和檢測(cè)劑?？梢酝ㄟ^(guò)任何檢測(cè)方式如直接或間接檢測(cè)方式觀測(cè)免疫反應(yīng)，即腫瘤標(biāo)記物/結(jié)合配偶體的結(jié)合。在直接檢測(cè)即不包含標(biāo)記情況中，免疫反應(yīng)通過(guò)例如表面等離子共振技術(shù)或者在具有傳導(dǎo)性聚合物的電極上通過(guò)循環(huán)伏安法(cyclicvoltametr)觀測(cè)。間接檢測(cè)是利用標(biāo)記“揭示試劑”結(jié)合配偶體，或者是感興趣的腫瘤標(biāo)記物自身進(jìn)行。在后者情況中，其隨后被描述為競(jìng)爭(zhēng)方法。術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記，，是指使標(biāo)記試劑的附著能直接或間接產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。這些標(biāo)記試劑非限制性包括·酶，其產(chǎn)生例如通過(guò)比色法、熒光或者發(fā)光而可被檢測(cè)的信號(hào)，所述酶例如是辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β"半乳糖苷酶或者葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；·生色團(tuán)，如熒光或發(fā)光化合物或染料；·放射性分子，如32P、35S或125I,以及·熒光分子如Alexa或藻藍(lán)蛋白。也可以使用間接檢測(cè)系統(tǒng)，例如能與抗配體反應(yīng)的配體。配體/抗配體對(duì)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，例如如下一對(duì)生物素/鏈霉抗生物素，半抗原/抗體，肽/抗體，糖/凝集素，多核苷酸/與該多核苷酸互補(bǔ)的序列。在這種情況中，其是具有結(jié)合配對(duì)物的配體。抗配體可以通過(guò)前文所述標(biāo)記試劑直接檢測(cè)，或者通過(guò)配體/抗配體自身檢測(cè)。這些間接檢測(cè)系統(tǒng)在一定條件下可以導(dǎo)致信號(hào)放大。這種信號(hào)放大技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，可參見(jiàn)本申請(qǐng)人先前的專利申請(qǐng)F(tuán)R98/10084或W0-A-95/08000，或者Chevalier等的文章59。根據(jù)所用標(biāo)記的類型，本領(lǐng)域技術(shù)人員加入使得可以觀測(cè)顯示標(biāo)記的試劑。舉例的上述免疫測(cè)定可以提及的是“夾心”方法，如ELISA、IRMA和RIA，“競(jìng)爭(zhēng)”方法和直接免疫檢測(cè)方法如免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、Western印跡和Dot印跡方法。質(zhì)譜分析法也可用于在生物學(xué)樣品中檢測(cè)本發(fā)明方法探求的腫瘤標(biāo)記物。光譜法的原理為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，例如在Patterson，S.60中描述。為此，將預(yù)處理或未預(yù)處理的生物學(xué)樣品經(jīng)過(guò)質(zhì)譜分析儀，將獲得的質(zhì)譜與本發(fā)明方法尋找的腫瘤標(biāo)記物的質(zhì)譜對(duì)比。舉例的樣品預(yù)處理方法包括將其經(jīng)過(guò)免疫捕獲支持物，所述免疫捕獲支持物包含本發(fā)明方法尋找的腫瘤標(biāo)記物的結(jié)合配偶體之一，例如本發(fā)明方法尋找的腫瘤標(biāo)記物的抗體。另一種樣品預(yù)處理方法包括預(yù)先分級(jí)分離所述生物學(xué)樣品，以將樣品的蛋白質(zhì)彼此分離。在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)中，樣品的主要蛋白質(zhì)可例如首先被耗竭。利用最近的技術(shù)進(jìn)步，也可以量化復(fù)雜的生物學(xué)介質(zhì)中的蛋白質(zhì)，使用以MRM(多反映監(jiān)測(cè))模式運(yùn)轉(zhuǎn)的三聯(lián)四極分析儀(triplequadripoleanalyzer)進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析(MS/MS)。這種運(yùn)轉(zhuǎn)模式具有雙重選擇性(兩個(gè)分析儀，親本離子選擇和產(chǎn)物離子選擇)，而且與其它掃描模式相比檢測(cè)靈敏性得以改良。這種方法的技術(shù)可行性最近已經(jīng)由AndersonandHunter61證實(shí)，其成功地在免疫耗竭豐度最高的蛋白質(zhì)后檢測(cè)到血漿濃度在一百ng/ml級(jí)別的蛋白質(zhì)。確定生物學(xué)樣品中感興趣的“mRNA”腫瘤標(biāo)記物的存在可以通過(guò)確定樣品中mRNA存在的任何方法進(jìn)行，即通過(guò)直接檢測(cè)mRNA或者間接檢測(cè)mRNA，或者通過(guò)確定樣品中RNA存在的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它方法進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)“直接檢測(cè)mRNA”是指證實(shí)生物學(xué)樣品中所述mRNA自身。直接檢測(cè)生物學(xué)樣品中mRNA可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方式進(jìn)行，例如通過(guò)與特異于該mRNA的結(jié)合配偶體雜交，其中進(jìn)行適當(dāng)?shù)腜CR擴(kuò)增，或者NASBA技術(shù)。術(shù)語(yǔ)“雜交”是指在合適條件下兩個(gè)核苷酸片段通過(guò)穩(wěn)定且特異的氫鍵彼此結(jié)合，形成雙鏈復(fù)合物。這些氫鍵在互補(bǔ)堿基之間形成，如腺嘌呤(A)與胸腺嘧啶(T)(或者尿嘧啶(U))(稱作A-T鍵)，或者鳥(niǎo)嘌呤(G)與胞嘧啶(C)(稱作G-C鍵)。兩個(gè)核苷酸片段的雜交可以是完全的(參見(jiàn)互補(bǔ)核苷酸片段或序列)，即在此雜交期間獲得的雙鏈復(fù)合物僅包含A-T鍵和C-G鍵。這種雜交也可以是部分雜交(參見(jiàn)足夠互補(bǔ)的核苷酸片段或序列)，即獲得的雙鏈復(fù)合物包含使得可以形成雙鏈復(fù)合物的A-T鍵和C-G鍵，但是也包含與互補(bǔ)堿基未鍵合的堿基。兩個(gè)核苷酸片段之間的雜交依賴于使用的雜交條件，特別是嚴(yán)格性。嚴(yán)格性被特別定義為兩個(gè)核苷酸片段的堿基成分的函數(shù)(function)，以及兩個(gè)核苷酸片段之間錯(cuò)配程度。嚴(yán)格性也可以依賴于反應(yīng)參數(shù)，如雜交溶液中存在的離子的濃度和類型、變性劑的性質(zhì)和濃度和/或雜交溫度。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知所有這些數(shù)據(jù)，且可以確定合適的條件。通常地，根據(jù)希望雜交的核苷酸片段的長(zhǎng)度，雜交溫度介于大約20-70°C之間，特別是介于35-65°C之間，鹽溶液的濃度介于大約0.5-1M之間。特異于或非特異于所述mRNA的結(jié)合配偶體是能結(jié)合該mRNA的任何配偶體。例如，可以提及的是核酸探針、擴(kuò)增引物，以及能結(jié)合該mRNA的任何其它分子。術(shù)語(yǔ)“雜交探針”是指包含5-100個(gè)核酸單位、特別是10-35個(gè)核酸單位的核苷酸片段，其在指定條件下具有雜交特異性，與特異于感興趣的靶基因的材料形成雜交復(fù)合物。雜交探針可包含使其可以被檢測(cè)的標(biāo)記。對(duì)于本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增引物”是指包含5-100個(gè)核酸單位、優(yōu)選15-30個(gè)核酸單位的核苷酸片段，其可以起始酶促聚合化如酶促擴(kuò)增反應(yīng)。術(shù)語(yǔ)“酶促擴(kuò)增反應(yīng)”是指通過(guò)至少一種酶的作用產(chǎn)生核苷酸片段的多個(gè)拷貝的過(guò)程。這種擴(kuò)增反應(yīng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，可以特別提及的是如下技術(shù)-PCR(聚合酶鏈反應(yīng))，如專利US4683195、US4683202和US4800159所述；-NASBA(基于核酸序列的擴(kuò)增)，見(jiàn)專利申請(qǐng)WO91/02818所述；及-TMA(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增)，見(jiàn)US5399491專利所述。術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)”是指插入染料如SYBRGreenI或者溴化乙錠的物理方法或者化學(xué)方法，或者使用標(biāo)記檢測(cè)的方法。有許多檢測(cè)核酸的方法62。合適的標(biāo)記如上文所述。對(duì)于本發(fā)明，雜交探針可以是“檢測(cè)”探針。在這種情況中，“檢測(cè)”探針用如上述標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。根據(jù)這種標(biāo)記的存在，可以檢測(cè)指定檢測(cè)探針與被檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄物之間的雜交反應(yīng)的存在。所述檢測(cè)探針可以特別是“分子信標(biāo)”檢測(cè)探針63。這些“分子信標(biāo)”在雜交期間成為具有熒光性。它們具有一個(gè)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，且含有熒光團(tuán)和猝光基團(tuán)。特異性環(huán)序列與其互補(bǔ)靶核酸序列的結(jié)合使得莖伸展，以及在激發(fā)期間以合適波長(zhǎng)發(fā)射熒光信號(hào)。雜交探針也可以是“捕獲”探針。在這種情況中，“捕獲”探針可以通過(guò)任何適當(dāng)方式被固定或者可以固定于固體支持物上，即例如通過(guò)共價(jià)鍵或者吸附而直接或間接固定。合適的固體支持物為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，例如可以提及的是合成材料或天然材料、乳膠、磁性粒子、金屬衍生物、凝膠等。所述固體支持物可以是微滴定平板形式，專利申請(qǐng)W0-A-94/12670中描述的膜或者粒子。在該支持物上也可以固定一些不同的捕獲探針，每個(gè)捕獲探針均特異于靶轉(zhuǎn)錄物。特別地，可以使用其上固定了大量探針的生物芯片作為支持物。探針固定于支持物上也為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，可以提及的是通過(guò)直接轉(zhuǎn)移、顯微沉積(microd印osition)、原位合成及光刻術(shù)固定探針。生物學(xué)樣品中編碼感興趣的腫瘤標(biāo)記物的基因中的DNA修飾或異常的證實(shí)可以通過(guò)確定樣品中DNA改變的任何方法進(jìn)行，即直接檢測(cè)突變，或者證實(shí)感興趣的基因座的甲基化模式改變，或者通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的確定樣品中DNA改變的任何其它方法進(jìn)行。突變可包括一個(gè)核苷酸由另一個(gè)核苷酸取代、缺失一或多個(gè)核苷酸以及插入一或多個(gè)核苷酸。所述突變可位于感興趣的腫瘤標(biāo)記物基因的編碼區(qū)，或者位于5’和3’非編碼區(qū)，如轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)或者轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。證實(shí)突變的策略基于分子生物學(xué)技術(shù)，包括如下步驟DNA提取、PCR擴(kuò)增或者另一擴(kuò)增技術(shù)、雜交和/或測(cè)序。在結(jié)腸直腸癌情況中，如下方法已經(jīng)成功用于檢測(cè)糞便DNA中的突變通過(guò)沉淀濃縮DNA，使用磁珠上的捕獲寡核苷酸使靶富集，PCR擴(kuò)增感興趣的基因，固相測(cè)序以鑒別點(diǎn)突變64。根據(jù)預(yù)期參考片段與突變片段之間大小的差異鑒別缺失。Imperiale等64描述了位于K-ras、APC和p53基因中的一組21個(gè)突變，使得可以檢測(cè)16/31侵潤(rùn)性癌。其它使用的DNA標(biāo)記物是BAT-26缺失，其是微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的標(biāo)記物，以及稱作長(zhǎng)DNA(L-DNA)的可高度擴(kuò)增的DNA，其不是特異性標(biāo)記物，但是似乎反映結(jié)腸腔中脫落的腫瘤細(xì)胞的紊亂的凋亡65。這些標(biāo)記物在靈敏性或特異性方面均不令人滿意。如前所述，DNA改變也可相應(yīng)于感興趣的腫瘤標(biāo)記物基因的甲基化模式的修飾。所述甲基化模式的修飾可相應(yīng)于低甲基化(甲基化數(shù)目減少)或者高甲基化(甲基化數(shù)目增多)。改變的單位位于感興趣的腫瘤標(biāo)記物基因的編碼區(qū)內(nèi)，或者位于5’和3’非編碼區(qū)，如轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)或者轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。DNA甲基化的分析可以使用基于定性和/或定量PCR的技術(shù)進(jìn)行，如MSP(甲基化特異性PCR)、亞硫酸氫鹽測(cè)序、結(jié)合PCR用甲基化敏感的限制酶消化、C0BRA(組合亞硫酸氫鹽限制分析)和Ms-SNuPE(甲基化敏感的單核苷酸引物延伸)。所有這些技術(shù)均已經(jīng)充分綜述以及在方法學(xué)文章中詳細(xì)描述66。在文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了在結(jié)腸直腸癌病例中的一些高甲基化基因。例如可以提及的是ALX4(無(wú)芒樣同源框-4)基因56、TPEF/HHP1(含有表皮生長(zhǎng)因子和卵泡抑素結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白)基因的啟動(dòng)子區(qū)67或者s印tin-9基因68。在本發(fā)明方法中，當(dāng)檢測(cè)至少兩個(gè)標(biāo)記物時(shí)，可以例如使用不同的免疫測(cè)定或者在同時(shí)多元測(cè)定中單獨(dú)證實(shí)。在本發(fā)明方法中，當(dāng)檢測(cè)不同性質(zhì)的兩個(gè)標(biāo)記物時(shí)，例如蛋白質(zhì)標(biāo)記物和mRNA標(biāo)記物，可以使用選自上述那些的兩種不同檢測(cè)方法。它們也也可以在系統(tǒng)反應(yīng)條件下在同一檢測(cè)介質(zhì)中同時(shí)檢測(cè)，如專利申請(qǐng)WO03/104490所述。這個(gè)專利申請(qǐng)中描述的檢測(cè)方法包括如下步驟，該檢測(cè)方法包括同時(shí)檢測(cè)樣品中的雜交和免疫反應(yīng)，可含有由至少一種核酸和不同性質(zhì)的至少一種其它配體組成的靶分析物(i)將已知體積的在反應(yīng)緩沖液中稀釋的樣品沉積在用所述靶分析物的捕獲配偶體預(yù)先包被的捕獲表面上，所述捕獲配偶體包含至少一個(gè)核酸探針和至少一個(gè)抗配體，(ii)在介于15°C_60°C之間的溫度下反應(yīng)，(iii)觀測(cè)因此獲得的雜交和免疫反應(yīng)。所述生物學(xué)樣品可能需要特殊處理，因?yàn)槠淇赡芎斜景l(fā)明方法尋找的腫瘤標(biāo)記物，或者另外其可能含有具有本發(fā)明方法尋找的標(biāo)記物的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，和/或能分泌本發(fā)明方法尋找的標(biāo)記物的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，對(duì)生物學(xué)樣品進(jìn)行預(yù)處理以分離所述液體中含有的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。短語(yǔ)“分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞”是指獲得富含循環(huán)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分?？梢酝ㄟ^(guò)如下方式對(duì)生物學(xué)樣品進(jìn)行處理以分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞在流式細(xì)胞儀中進(jìn)行細(xì)胞淘選，在Ficoll上富集，用特異性抗體包被的磁珠富集，或者使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的特異性富集的任何其它方法。在血液作為生物學(xué)樣品的情況中，循環(huán)腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)如下技術(shù)分離，即在Ficoll上分離細(xì)胞，組合使用與磁珠結(jié)合的抗-⑶45抗體耗竭血細(xì)胞(DynalBiotechASA,Norway)?？梢酝ㄟ^(guò)如下方式使用分離自生物學(xué)樣品的循環(huán)腫瘤細(xì)胞直接進(jìn)行本發(fā)明方法中探求的腫瘤標(biāo)記物檢測(cè)，即在通過(guò)細(xì)胞離心涂片器使循環(huán)腫瘤細(xì)胞沉積在載玻片上之后，例如通過(guò)用本發(fā)明方法尋找的腫瘤標(biāo)記物的抗體對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記。也可以在循環(huán)腫瘤細(xì)胞中直接進(jìn)行本發(fā)明方法尋找的腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)，使用如M6t6zeaU等69所述的流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行。在這些條件下，所述循環(huán)細(xì)胞可以在一定條件下處理，以使其能在所述細(xì)胞內(nèi)部阻斷本發(fā)明方法尋找的腫瘤標(biāo)記物。這種處理由Mathieu等7°描述。在使得細(xì)胞膜可滲透以使特異于本發(fā)明方法尋找的標(biāo)記物的結(jié)合配偶體能進(jìn)入細(xì)胞之后，進(jìn)行本發(fā)明方法尋找的腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)?；谘h(huán)細(xì)胞直接檢測(cè)本發(fā)明方法中使用的腫瘤標(biāo)記物也可以通過(guò)ELISP0T方法進(jìn)行，例如通過(guò)本申請(qǐng)人申請(qǐng)的專利申請(qǐng)WO03/076942中描述的方法進(jìn)行。這種方法是檢測(cè)和/或量化生物學(xué)樣品的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，該細(xì)胞在體外能釋放或分泌一或多種腫瘤標(biāo)記物，所述方法包括如下步驟(i)使一定量的所述細(xì)胞沉積于培養(yǎng)表面的底部，該底部附著了特異于所述腫瘤標(biāo)記物的至少一種結(jié)合配偶體，(ii)在一定條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，使其釋放或分泌所述腫瘤標(biāo)記物，該標(biāo)記物被免疫捕獲于所述培養(yǎng)表面的底部，(iii)通過(guò)洗滌除去細(xì)胞，(iv)加入特異于所述腫瘤標(biāo)記物的至少一種標(biāo)記的綴合物，及(ν)觀測(cè)由此獲得的標(biāo)記。直接檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中本發(fā)明方法使用的腫瘤標(biāo)記物也可以在所述細(xì)胞的培養(yǎng)基中進(jìn)行，在一定條件下培養(yǎng)細(xì)胞，由此其分泌本發(fā)明方法中使用的腫瘤標(biāo)記物，之后進(jìn)行檢測(cè)。釋放腫瘤標(biāo)記物或者腫瘤標(biāo)記物表達(dá)的培養(yǎng)條件是常規(guī)條件，如37°C濕化環(huán)境及5%CO2的條件。當(dāng)生物學(xué)樣品是固體樣品時(shí)，腫瘤標(biāo)記物的存在也可以在體內(nèi)、在腫瘤原位示出。為了在體內(nèi)在腫瘤中示出腫瘤標(biāo)記物的存在，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何成像技術(shù)。為此，所述腫瘤標(biāo)記物的結(jié)合配偶體可以與成像示蹤劑結(jié)合。術(shù)語(yǔ)“結(jié)合配偶體與成像示蹤劑的結(jié)合”是指能通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何成像方法檢測(cè)的示蹤劑或者直接或間接產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的示蹤劑的附著。因此，所述示蹤劑可以是放射性示蹤劑，如锝-99。在這種情況中，具有原發(fā)癌或者轉(zhuǎn)移癌的器官將結(jié)合所述腫瘤標(biāo)記物及其示蹤劑?？梢杂锰厥庀鄼C(jī)如Y-相機(jī)使由該器官發(fā)射的放射線成像。該設(shè)備收集由放射性物質(zhì)產(chǎn)生的閃爍，并因此可以觀測(cè)所述器官。在本發(fā)明另一方法中，所述示蹤劑可包含發(fā)射正電子的放射性物質(zhì)(氟18)。然后通過(guò)正電子發(fā)射斷層成像系統(tǒng)成像。在本發(fā)明另一優(yōu)選方法中，腫瘤標(biāo)記物的配偶體可以與納米粒子結(jié)合。所述納米粒子可以例如是超磁性(supramagnetic)納米粒子，如用于指導(dǎo)細(xì)胞標(biāo)記和通過(guò)核磁共振成像技術(shù)在體內(nèi)檢測(cè)的陰離子磁性納米粒子。它們也可以是金納米粒子。禾Ij用可以在體內(nèi)檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物的本發(fā)明方法，可以觀測(cè)身體中結(jié)合腫瘤標(biāo)記物的結(jié)合配偶體的區(qū)域、產(chǎn)生腫瘤標(biāo)記物的癌瘤，特別是在結(jié)腸直腸癌中，以及其遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)移癌的位置和包含的淋巴結(jié)的位置。本發(fā)明的方法不僅可用于結(jié)腸直腸癌的早期診斷，也可以用于結(jié)腸直腸癌的篩選、治療隨診、預(yù)后及復(fù)發(fā)診斷，因?yàn)橹挥邪┘?xì)胞分泌LEI，且其產(chǎn)生依賴于癌的級(jí)別，這些方面組成了本發(fā)明的另一方面。本發(fā)明通過(guò)如下實(shí)施例以及附圖1-21得以更清晰地理解，這些實(shí)施例只是例證本發(fā)明而不限制本發(fā)明之意。-圖1是通過(guò)ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個(gè)體(CRC-)血清中LEI(ng/ml)的圖示，-圖2是通過(guò)ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個(gè)體(CRC-)血清中埃茲蛋白(ng/ml)的圖示，-圖3是通過(guò)ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個(gè)體(CRC-)血清中?；被崴饷?(ng/ml)的圖示，-圖4是通過(guò)ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個(gè)體(CRC-)血清中L-FABP(ng/ml)的圖示，-圖5是通過(guò)ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個(gè)體(CRC-)血清中I-FABP(pg/ml)的圖示，-圖6是通過(guò)ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個(gè)體(CRC-)血清中載脂蛋白AI(yg/ml)的圖示，通過(guò)微滴定平板ELISA(圖6A)或者使用Lincoplex試劑盒(圖6B)，-圖7是使用Linco多元試劑盒分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個(gè)體(CRC-)血清中載脂蛋白AII(yg/ml)的圖示，-圖8是通過(guò)ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個(gè)體(CRC-)血清中I-絲束蛋白的RFV(相對(duì)熒光值)的圖示，-圖9是通過(guò)ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個(gè)體(CRC-)血清中β2-微球蛋白(ng/ml)的圖示，-圖10是通過(guò)ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個(gè)體(CRC-)血清中CEA(ng/ml)的圖示，-圖11是通過(guò)ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個(gè)體(CRC-)血清中CA19-9(U/ml)的圖示，-圖12是通過(guò)ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個(gè)體(CRC-)血清中睪酮(ng/ml)的圖示，-圖13是通過(guò)ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個(gè)體(CRC-)血清中E-鈣粘蛋白(ng/ml)的圖示，-圖14是通過(guò)ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個(gè)體(CRC-)血清中PAPl(ng/ml)的圖示，-圖15是通過(guò)ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個(gè)體(CRC-)血清中半乳凝素_3的RFV的圖示，-圖16是通過(guò)ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個(gè)體(CRC-)血清中LDH(ng/ml)的圖示，-圖17是通過(guò)ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個(gè)體(CRC-)血清中蛋白酶體20S(ng/ml)的圖示，-圖18是通過(guò)ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個(gè)體(CRC-)糞便中?；被崴饷?(ng/ml)的圖示，-圖19是通過(guò)ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個(gè)體(CRC-)糞便中半乳凝素_3的RFV的圖示，-圖20是通過(guò)ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個(gè)體(CRC-)糞便中蛋白酶體20S的RFV的圖示，-圖21是對(duì)LEI、埃茲蛋白和半乳凝素-3進(jìn)行ELISP0T測(cè)定的示意圖，示出Caco-2、HT-29和HT29-B6的每IO6個(gè)癌細(xì)胞的斑點(diǎn)數(shù)目。實(shí)施例1編碼腫瘤標(biāo)記物的基因的克隆與重組蛋白質(zhì)的表達(dá)1.cDNA擴(kuò)增與克隆將Caco-2結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含有2mM的L-谷氨酰胺，不含F(xiàn)CS(胎牛血清)(均來(lái)自Gibco)。為了克隆LEI、L-FABP和Gal_3基因，從IO8個(gè)Caco_2細(xì)胞沉淀中提取信使RNA，使用InvitrogenFastTrack2.0試劑盒(Cat.No.45-0019)根據(jù)廠商提供的方案進(jìn)行。在一個(gè)步驟中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR，使用450ng的Caco_2mRNA及SuperscriptIIIOneStepRT-PCRSystem試劑盒(InvitrogenCat.No.12574-018)以及使用PlatinumTaqDNA聚合酶，根據(jù)廠商提供的方案進(jìn)行。用于基因擴(kuò)增的PCR引物在表1中提供。表1i因和引物寡核苷酸LEIOL215(SEQIDNo.1)5'-ATGGAGCAGCTGAGCTCAGCAAAC-3'0L216(SEQIDNo.2)5'-CTAAGGGGAAGAAAATCTCCCCAA-3‘L-FABP正向(SEQIDNo.3)5'-CGGAGCGTCTCCCATGAGTTTCTCCGGCAAGTA-3'反向(SEQIDNo.4)5'-GAAATGCAGACTTGTCTAGATGCGCTTGCTGATGCGCTTGAAGACAATG-3'Gal-3OL217(SEQIDNo.5)5'-ATGGCAGACAATTTTTCGCTCC-3'OL218(SEQIDNo.6)_5’-TTATATCATGGTATATGAAGCACTGG-3，_將獲得DNA片段通過(guò)使用TA克隆試劑盒(InvitrogenCat.No.K4520-01)克隆進(jìn)載體pCR2.1T0P0(LEI和Gal-3)中，或者克隆進(jìn)用BsmBI和XbaI消化后的來(lái)自O(shè)rigene的載體PCMV6-XL4(L-FABP)中。對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，以核實(shí)cDNA確實(shí)符合預(yù)期序列。對(duì)于編碼?；被崴饷?的基因的克隆，使用來(lái)自Qiagen的RNAEasyMini試劑盒根據(jù)廠商提供的方案從IO8個(gè)Caco-2細(xì)胞沉淀中提取總RNA。使用IOng的Caco-2RNA和SuperscriptII酶(Invitrogen)根據(jù)廠商提供的方案進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。該逆轉(zhuǎn)錄引物是oligo(dT)ο得自這個(gè)反應(yīng)的cDNA用作PCR中模板，使用AccuPrimePfx試劑盒(InvitrogenCat.No.12344-024)根據(jù)廠商提供的方案進(jìn)行反應(yīng)。所述PCR引物是ACY-lFwd2(SEQIDNo.75'-GCGAATTCTTTAAGAAGGAGATATACATATGACGAGCAAAGGTCCGGAAGAGGAGCACCCATCG-3')和ACY-IRev(SEQIDNo.8:5’-GCAAGCTTCAGCTGTCACTGGGCAGGGC-3’)。在這些條件下，可以擴(kuò)增1.3kb片段，將其克隆進(jìn)ZeroBluntT0P0PCR克隆試劑盒型克隆載體(InvitrogenCat.No.K2820-20)中。對(duì)這個(gè)質(zhì)粒測(cè)序以核實(shí)cDNA確實(shí)符合預(yù)期序列。通過(guò)化學(xué)合成方法獲得含有I-FABP開(kāi)放讀框的如下DNA片段(SEQIDNo.9)，該合成由Geneart公司進(jìn)行。SEQIDNo.9GGTACCGAATTCCGCGTTTGACAGCACTTGGAAGGTAGACCGGAGTGAAAACTATGACAAGTTCATGGAAAAAATGGGTGTTAATATAGTGAAAAGGAAGCTTGCAGCTCATGACAATTTGAAGCTGACAATTACACAAGAAGGAAATAAATTCACAGTCAAAGAATCAAGCGCTTTTCGAAACATTGAAGTTGTTTTTGAACTTGGTGTCACCTTTAATTACAACCTAGCAGACGGAACTGAACTCAGGGGGACCTGGAGCCTTGAGGGAAATAAACTTATTGGAAAATTCAAACGGACAGACAATGGAAACGAACTGAATACTGTCCGAGAAATTATAGGTGATGAACTAGTCCAGACTTATGTGTATGAAGGAGTAGAAGCCAAAAGGATCTTTAAAAAGGATTCTAGAGTCGACGAGCTC。2.表達(dá)載體構(gòu)建將編碼LEI和半乳凝素_3的基因亞克隆進(jìn)原核表達(dá)載體PMR7871中，以及將L-FABP基因克隆進(jìn)載體pET3d(NewEnglandBiolabs)中。使用質(zhì)粒pCR2.1T0P0-LEI,pCR2.1TOPO-Gal-3和pCMV6-LFABP作為模板通過(guò)PCR導(dǎo)入克隆所需的限制位點(diǎn)。所述PCR酶是PromegaPfuDNA聚合酶，PCR反應(yīng)根據(jù)廠商指導(dǎo)進(jìn)行，引物示于表2中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>將含有編碼LEI或半乳凝素-3的開(kāi)放讀框的PCR產(chǎn)物用EcoRI和Hindlll限制酶消化。將片段導(dǎo)入用相同的酶限制的載體PMR78中(質(zhì)粒pMR-LEI和pMR-Gal-3)。載體PMR78含有與表達(dá)的蛋白質(zhì)符合讀框的6-組氨酸序列，使得可以通過(guò)金屬螯合親和層析純化。將L-FABPPCR產(chǎn)物克隆進(jìn)載體pET3d中NcoI和BamHI限制位點(diǎn)。對(duì)于酰化氨基酸水解酶1，將T0P0克隆載體直接用EcoRI和HindIII限制酶消化，以產(chǎn)生含有acyl開(kāi)放讀框的1.3kb片段，其被導(dǎo)入pStabyl(Eurogentec)中。該重組質(zhì)粒被稱作pStabyl-ACY。對(duì)于I-FABP，將由Geneart提供的克隆載體用EcoRI和SalI限制酶消化，以產(chǎn)生含有編碼序列的大約400bp片段，將其導(dǎo)入載體pMRCH79(衍生自載體pMR78，bioM6rieux)中。該重組質(zhì)粒被稱作pMRCH-IFABP?？梢苑謩e表達(dá)與GST(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)融合的埃茲蛋白和I-絲束蛋白的質(zhì)粒pGEX-埃茲蛋白和pGEX-I-絲束蛋白由InstitutCurie提供。3.重組蛋白質(zhì)表汰與鈍化將產(chǎn)生重組腫瘤標(biāo)記物的表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21及其衍生物(Stratagene)中。在室溫?fù)u動(dòng)培養(yǎng)。每種蛋白質(zhì)的精確培養(yǎng)條件示于表3中。IPTG是異丙基-0-D-1-硫代半乳糖酶。將細(xì)菌沉淀置于2XPBS(磷酸鹽緩沖鹽水)緩沖液中，并以1.5kbar通過(guò)細(xì)胞粉碎機(jī)(ConstantSystem)。將裂解產(chǎn)物在3000g在4°C離心30分鐘。上清含有可溶蛋白質(zhì)。所述沉淀含有包涵體。增溶包涵體的緩沖液根據(jù)所述蛋白質(zhì)而定。對(duì)于LEI，在含有5mL的Ni_NTA_S印harose樹(shù)脂(Qiagen)的柱上使用可溶分級(jí)分離法進(jìn)行純化，蛋白質(zhì)用含有450mM咪唑的2XPBSpH7.5洗脫。對(duì)于半乳凝素-3，將包涵體在含有1M尿素的2XPBS中溶解，經(jīng)過(guò)5mL的Ni-NTA-S印harose樹(shù)脂柱(Qiagen)，用含有450mM咪唑和1M尿素的2XPBSpH7.5洗脫Gal-3蛋白。對(duì)于L-FABP，使用可溶分級(jí)分離法進(jìn)行純化，使用來(lái)自Macherey-Nagel的Ni_IDA試齊U盒。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>對(duì)于GST-埃茲蛋白，通過(guò)GST親和層析，使用在含有8M尿素和lOmMDTT的lOOmMTris緩沖液中溶解的包涵體進(jìn)行純化。使用含有5mL谷胱甘肽瓊脂糖4快速流動(dòng)凝膠(Amersham)的層析柱。平衡和洗滌緩沖液是含有0.05%Tween20的2XPBS。洗脫緩沖液是含有20mM還原的谷胱甘肽的50mMTris-HCl(pH8)。對(duì)于?；被崴饷?，將培養(yǎng)物的可溶級(jí)分經(jīng)過(guò)AmershamHiTrapQFF柱，并且使用0.3MNaCl(pH7.5)洗脫ACY-1蛋白。由于一些其它蛋白質(zhì)在這些條件下被共洗脫，因此繼續(xù)在疏水性相互作用柱(HICPhenylHP，Amersham)上進(jìn)行純化。使用0.5MNaCl(pH7)洗脫ACY-1蛋白。重組GST-I-絲束蛋白蛋白由InstitutCurie以純化形式提供。重組鈣網(wǎng)蛋白蛋白由ProteusServicesforIndustry(Dijon，F(xiàn)rance)公司生產(chǎn)。編碼鈣網(wǎng)蛋白的序列通過(guò)化學(xué)合成方法獲得。實(shí)施例2腫瘤標(biāo)記物的單克降抗體的產(chǎn)牛1.動(dòng)物樽型對(duì)6-8周齡的雌性BALB/c(H_2d)小鼠在第一次免疫時(shí)進(jìn)行免疫試驗(yàn)。2.免疫原和免疫為了增加在小鼠中獲得的免疫應(yīng)答以及為了能產(chǎn)生單克隆抗體，根據(jù)實(shí)施例1所述的程序產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)形式的腫瘤標(biāo)記物。LDH蛋白得自SciPac公司(Cat.No.103-133)。這些蛋白質(zhì)與Freimd's佐劑(Sigma)混合，所述佐劑以油包水乳狀液形式制備，且已知其具有良好的免疫原性。每種腫瘤標(biāo)記物免疫3只小鼠。小鼠在第0、2和4周連續(xù)接受3次10yg劑量。所有注射均是皮下注射。第一次注射給予與完全Freimd’s佐劑的混合物，隨后兩次注射給予與不完全Freimd's佐劑的混合物。在第一次注射后D50-D70之間，通過(guò)靜脈內(nèi)注射100yg該重組蛋白質(zhì)再次刺激體液應(yīng)答。3.監(jiān)測(cè)體液應(yīng)答的出現(xiàn)為了監(jiān)測(cè)抗體的出現(xiàn)，定期從小鼠取血樣。使用ELISA檢測(cè)抗-腫瘤標(biāo)記物抗體的存在。感興趣的蛋白質(zhì)用于捕獲(lPg/孔)；飽和后，使抗原與不同稀釋度的檢測(cè)血清反應(yīng)(在37°C保溫1小時(shí))。血清中特異性抗體的存在通過(guò)使用與堿性磷酸酶綴合的結(jié)合尋找的抗體的AffiniPure山羊抗-小鼠IgG抗體(H+L,JacksonImmunoresearch,Catno.115-055-146)(0.1ug/well)表明。224.單克降抗體的產(chǎn)牛在最后一次注射每種腫瘤標(biāo)記物3天后，處死一只免疫的小鼠。取血液和脾。將得自脾的脾細(xì)胞與Sp2/0-Agl4骨髓瘤細(xì)胞一起培養(yǎng)，以使其融合并變成永生化，根據(jù)K6hlerandMilstein所述方案72’73進(jìn)行。在保溫12-14天之后，篩選獲得的雜交瘤上清以確定抗腫瘤標(biāo)記物抗體的存在，使用在這個(gè)實(shí)施例第3點(diǎn)描述的ELISA測(cè)定。當(dāng)GST融合蛋白用作免疫原時(shí)，針對(duì)GST的克隆通過(guò)使用未結(jié)合的GST捕獲進(jìn)行ELISA篩選得以消除。根據(jù)限制稀釋技術(shù)將陽(yáng)性雜交瘤集落亞克隆兩次，這種技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。5.通過(guò)免疫印跡鑒定單克降抗體針對(duì)各種腫瘤標(biāo)記物獲得的單克隆抗體列于表4中。通過(guò)Western印跡技術(shù)分析這些單克隆抗體。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>5.1.方法學(xué)制備Caco-2和HT-29細(xì)胞培養(yǎng)提取物，通過(guò)用含有8.3M尿素、2M硫脲、4%3_[(3-膽胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、100mMDTT,2%Servalyte4-9(Serva,Heidelberg,Germany)和0.lg/1OrangeG的600yl水溶液溶解細(xì)胞沉淀，然后根據(jù)NuPAGENovex凝膠樣品制備方案(Invitrogen)進(jìn)行處理。為了獲得組織提取物，使用手術(shù)刀切下GHBD001、GHBD004和CLSP109患者的腫瘤和粘膜活檢組織，然后使用50-ymMedicons以及l(fā)ml含有2.5mMEDTA和蛋白酶抑制劑(片劑，Roche)的PBS緩沖液在Medimachine系統(tǒng)(BectonDickinson)中提取10次。集合這些10ml的細(xì)胞懸浮液，制成25ml，然后在600g離心15分鐘。上清相應(yīng)于根據(jù)NuPAGENovex凝膠樣品制備方案處理的組織提取物。使用還原的樣品，最終總蛋白質(zhì)濃度為0.4mg/ml。在NuPAGENovexBis-Tris4-12%凝膠上沉積體積為20u1/孔，使用M0PS運(yùn)轉(zhuǎn)緩沖液。在遷移(200V，1小時(shí))及轉(zhuǎn)移至PVDF膜(400mA，45分鐘)之后，通過(guò)用氨基黑染色評(píng)定轉(zhuǎn)移物的性質(zhì)。將該膜用在TNT(15mMTris、0.14MNaCl.0.5%Tween20，pH8)溶液中的5%脫脂乳(R6gilait)在室溫飽和1小時(shí)。在飽和后，將該膜與在飽和溶液中稀釋為lOyg/ml的各種檢測(cè)抗體一起保溫1小時(shí)。在用TNT漂洗后，將該膜在室溫與在飽和溶液中稀釋為15000的抗小鼠-辣根過(guò)氧化物酶綴合物(CatNo.115-035-062，JacksonImmunoresearch){呆iU1/J、時(shí)。在漂1后，使用SubstrateSupersignalWestDuraExtended試劑盒(CatNo.34076,Pierce)根據(jù)推薦的使用指導(dǎo)進(jìn)行顯影。使用來(lái)自Biorad的VersaDoc成像系統(tǒng)測(cè)量該膜上的化學(xué)發(fā)光信號(hào)?；赪estern印跡成像，使用QuantityOne軟件(Bio-Rad)評(píng)估相應(yīng)于各種腫瘤標(biāo)記物的條帶的體積。所述體積相應(yīng)于條帶的表面積乘以化學(xué)發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)度。5.2.結(jié)果Western印跡結(jié)果示于表5，表中示出了Western印跡分析的相應(yīng)于感興趣的腫瘤標(biāo)記物的條帶的體積，其是檢測(cè)的各個(gè)樣品的函數(shù)。這些結(jié)果示出檢測(cè)的腫瘤標(biāo)記物確實(shí)由Caco-2和HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞系表達(dá)，而且也在組織中表達(dá)，這些根據(jù)使用得自該患者的腫瘤和粘膜的提取物示出?？梢詫?duì)比使用抗體在樣品上獲得的信號(hào)強(qiáng)度與使用其它樣品和相同抗體獲得信號(hào)強(qiáng)度。所用技術(shù)使得可以證實(shí)組織(非遠(yuǎn)離樣品)中所述標(biāo)記物的存在與否，以及抗體對(duì)于標(biāo)記物的特異性。這個(gè)技術(shù)不用于這個(gè)實(shí)施例的遠(yuǎn)離樣品中，因?yàn)槠洳豢梢酝茢噙h(yuǎn)離樣品中腫瘤標(biāo)記物的存在與否，也不可以確定所述樣品中所述腫瘤標(biāo)記物的濃度是否增加或降低。此外，使用的實(shí)驗(yàn)方案不能對(duì)比一種抗體的反應(yīng)性與另一種抗體的反應(yīng)性。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>NT:未檢測(cè)。5.3.抗I-絲束蛋白的單克隆抗體在GHBD004患者中，8C8C5抗體未使得對(duì)應(yīng)1_絲束蛋白的條帶顯色或者僅微弱顯色。這些樣品中I-絲束蛋白的存在可以通過(guò)使用例如8G2D2抗體證實(shí)，該抗體在印跡中對(duì)于I-絲束蛋白具有較好親和性。由于I-絲束蛋白是包含具有70%以上同源性的兩個(gè)其它同種型(L-絲束蛋白和T-絲束蛋白)的蛋白質(zhì)家族成員，我們檢測(cè)了獲得的單克隆抗體的所有克隆與GST-絲束蛋白-L和GST-絲束蛋白-T蛋白質(zhì)(InstitutCurie提供)的反應(yīng)性。在這個(gè)篩選結(jié)束時(shí)，我們選擇與其它家族成員不具有任何交叉反應(yīng)性的克隆3D11D10、8C8C5、3A3H2和8G2D2。這些抗體確實(shí)特異于I-絲束蛋白同種型。實(shí)施例3腫瘤標(biāo)記物的血清測(cè)定1.患者和樣品根據(jù)2個(gè)Huriet-Iaw協(xié)議，血樣收集自分布于法國(guó)的8個(gè)臨床中心網(wǎng)。為了獲得血清，將該血樣置于干燥試管中。為了獲得血漿，將該血樣置于EDTA試管中。在凝固后，將試管以IOOOg離心10分鐘，取出血清，等份并在-80°c貯存。將血漿試管以IOOOg直接離心10分鐘，取出血漿，等份并在-80°c貯存。樣品完全記錄了病人的病史。2.LEI腫瘤標(biāo)記物的血清測(cè)定使用實(shí)施例2中描述的抗體以及使用Vidas自動(dòng)化設(shè)備(bioM6rieUX)進(jìn)行ELISA以測(cè)定LEI蛋白。為此，使用VidasHBsAgUltra試劑盒(bioM6rieux，Cat.No.30315)的試劑進(jìn)行ELISA。該試劑如相應(yīng)的信息頁(yè)(ref.11728D-FR-2005/05)所述使用，具有如下修改1.離心管用10μg/ml濃度的捕獲抗體10E1H1敏化。2.HBsAgUltracartridge第二個(gè)孔的內(nèi)容物用300μ1在VidasHBsAgUltra試劑盒的第二個(gè)孔的緩沖液(具有山羊血清和lg/Ι疊氮化鈉的緩沖液)中稀釋為1μg/ml的與生物素結(jié)合的揭示抗體21B10A5替換。3.將血清、血漿或者糞便樣品(50μ1)在HBsAgUltracartridge的第二個(gè)孔中直接稀釋，所述樣品是純的或者在VidasHBsAgUltra試劑盒的第二個(gè)孔的緩沖液(具有山羊血清和lg/Ι疊氮化鈉的緩沖液)中1/20稀釋。4.使用Vidas自動(dòng)化設(shè)備和HBsAgUltra試劑盒的方案進(jìn)行ELISA。5.在減去背景噪音之后獲得粗略值(crudevalue)形式的結(jié)果(在反應(yīng)之前讀取底物)。通過(guò)測(cè)定重組蛋白質(zhì)形式的腫瘤標(biāo)記物的濃度范圍制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。繪制的該標(biāo)準(zhǔn)曲線的χ軸是報(bào)道的腫瘤標(biāo)記物濃度，y軸是由Vidas讀取的信號(hào)(RFV或者相對(duì)熒光數(shù)值)。檢測(cè)的體液(血液、血清、血漿、糞便)中存在的腫瘤標(biāo)記物的濃度通過(guò)報(bào)道的相應(yīng)于Vidas讀取的RFV信號(hào)的濃度計(jì)算。分析患者獲得的量示于圖1。在該圖中，注意到IV期結(jié)腸直腸癌患者的3份血清及III期結(jié)腸直腸癌患者的1份血清示出其血清LEI的量明顯增加。3.埃茲蛋白腫瘤標(biāo)記物的血清測(cè)定使用實(shí)施例2中描述的抗體以及使用Vidas自動(dòng)化設(shè)備(bioM6rieUX)進(jìn)行ELISA以測(cè)定埃茲蛋白蛋白。為此，使用VidasHBsAgUltra試劑盒(bioM6rieux，Cat.No.30315)的試劑進(jìn)行ELISA。該試劑如相應(yīng)的信息頁(yè)(ref.11728D-FR-2005/05)所述使用，具有如下修改1.離心管用30μg/ml濃度的捕獲抗體4A9H5敏化。2.HBsAgUltracartridge第二個(gè)孔的內(nèi)容物用300μ1在VidasHBsAgUltra試劑盒的第二個(gè)孔的緩沖液(具有山羊血清和lg/Ι疊氮化鈉的緩沖液)中稀釋為1μg/ml的與生物素結(jié)合的揭示抗體4A7A6C1替換。3.將血清、血漿或者糞便樣品(50μ1)在HBsAgUltracartridge的第二個(gè)孔中直接稀釋。4.使用Vidas自動(dòng)化設(shè)備和HBsAgUltra方案進(jìn)行ELISA，其中樣品與捕獲抗體和揭示抗體的保溫步驟進(jìn)行100次循環(huán)。5.在減去背景噪音之后獲得粗略值(crudevalue)形式的結(jié)果(在反應(yīng)之前讀取底物)。檢測(cè)的體液(血液、血清、血漿、糞便)中存在的腫瘤標(biāo)記物的濃度通過(guò)第2段關(guān)于測(cè)定LEI所述方法計(jì)算。分析患者獲得的量示于圖2。在該圖中，注意到IV期結(jié)腸直腸癌患者的3份血清示出其血清埃茲蛋白的量明顯增加。4.酰化氨基酸水解酶1腫瘤標(biāo)記物的血清測(cè)定使用實(shí)施例2中描述的抗體以及使用Vidas自動(dòng)化設(shè)備(bioM6rieUX)進(jìn)行ELISA以測(cè)定?；被崴饷?蛋白。為此，使用VidasHBsAgUltra試劑盒(bioMerieux,Cat.No.30315)的試劑進(jìn)行ELISA0該試劑如相應(yīng)的信息頁(yè)(ref.11728D-FR-2005/05)所述使用，具有如下修改1.離心管用20μg/ml濃度的捕獲抗體2A7F6敏化。2.HBsAgUltracartridge第二個(gè)孔的內(nèi)容物用300μ1在VidasHBsAgUltra試劑盒的第二個(gè)孔的緩沖液(具有山羊血清和lg/Ι疊氮化鈉的緩沖液)中稀釋為1μg/ml的與生物素結(jié)合的揭示抗體11H7D9替換。3.將血清、血漿或者糞便樣品(100μ1)在HBsAgUltracartridge的第二個(gè)孔中直接稀釋。4.使用Vidas自動(dòng)化設(shè)備和HBsAgUltra方案進(jìn)行ELISA，其中樣品與捕獲抗體和揭示抗體的保溫步驟進(jìn)行100次循環(huán)。5.在減去背景噪音之后獲得粗略值(crudevalue)形式的結(jié)果(在反應(yīng)之前讀取底物)。檢測(cè)的體液(血液、血清、血漿、糞便)中存在的腫瘤標(biāo)記物的濃度通過(guò)第2段關(guān)于測(cè)定LEI所述方法計(jì)算。分析患者獲得的量示于圖3。在該圖中，注意到II期結(jié)腸直腸癌患者的1份血清、III期結(jié)腸直腸癌患者的1份血清以及IV期結(jié)腸直腸癌患者的2份血清示出血清酰化氨基酸水解酶1的量明顯增加。5.L-FABP腫瘤標(biāo)記物的血清測(cè)定使用HycultBiotechnology公司銷售的ELISA試劑盒測(cè)定人L-FABP蛋白(Cat.No.HK404)。這個(gè)試劑盒可以量化細(xì)胞培養(yǎng)上清或者血清、血漿或尿液中的L-FABP蛋白，以確定肝臟損害的存在。我們遵循廠商推薦的程序，有兩處修改保溫在37°C而不是在室溫進(jìn)行，在測(cè)定之前血清稀釋為1/10。L-FABP蛋白的測(cè)定可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的備選技術(shù)進(jìn)行。通過(guò)ELISA測(cè)定患者血清L-FABP的結(jié)果在表6中給出。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>aCRC+結(jié)腸直腸癌患者；CRC-健康個(gè)體圖4示出這項(xiàng)分析的結(jié)果。在檢測(cè)的血清中，141個(gè)結(jié)腸直腸癌患者中的41個(gè)患者的血清L-FABP濃度高于17ng/ml，而在對(duì)照組中，無(wú)個(gè)體的血清L-FABP濃度超過(guò)這個(gè)數(shù)值。在這41個(gè)患者中，I期結(jié)腸直腸癌患者8個(gè)、II期結(jié)腸直腸癌患者8個(gè)、III期結(jié)腸直腸癌患者13個(gè)，IV期結(jié)腸直腸癌患者12個(gè)。觀測(cè)的141個(gè)結(jié)腸直腸癌患者的平均血清L-FABP濃度是16.6士1.3ng/ml。112個(gè)健康個(gè)體的平均值為6.6士0.2ng/ml(陰性對(duì)照)。這個(gè)差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.0001，單側(cè)t-檢驗(yàn)，使用Welch’s校正不等方差)。6.I-FABP腫瘤標(biāo)記物的血清測(cè)定使用HycultBiotechnology公司銷售的ELISA試劑盒，測(cè)定人I-FABP蛋白(Cat.No.HK406)。這個(gè)試劑盒可以量化細(xì)胞培養(yǎng)上清或者血清、血漿或尿液中的I-FABP蛋白，以確定小腸中缺血性損害的存在。我們遵循廠商推薦的程序?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的備選技術(shù)測(cè)定I-FABP蛋白。圖5示出這項(xiàng)測(cè)定的結(jié)果。在檢測(cè)的血清中，40個(gè)結(jié)腸直腸癌患者中有15個(gè)患者的血清I-FABP濃度高于40pg/ml，而在對(duì)照組中，24個(gè)個(gè)體中僅2個(gè)個(gè)體超過(guò)這個(gè)數(shù)值。更明顯地，I期結(jié)腸直腸癌患者的3份血清、III結(jié)腸直腸癌患者的2份血清以及IV期結(jié)腸直腸癌患者的1份血清的血清I-FABP濃度高于100pg/ml。在CRC-對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)高于此數(shù)值的濃度。7.載脂蛋白AI腫瘤標(biāo)記物的血清測(cè)定通過(guò)兩種不同的免疫測(cè)定技術(shù)測(cè)定血清載脂蛋白AI。首先，使用微滴定平板夾心ELISA。將96孔平板用liig/孔的抗-ApoAI單克隆抗體-克隆1404(BiodesignCat.No.H45404)包被。在用PBS-0.05%Tween20(PBS-T)洗滌3次后，將該平板用在PBS-T中10%奶粉在37°C飽和1小時(shí)。將該平板再于PBS-T中洗滌3次，將檢測(cè)血清樣品的100u1標(biāo)準(zhǔn)范圍稀釋液或者100u1的1/100000稀釋液沉積于平板上，將該平板在37°C保溫2小時(shí)。所述標(biāo)準(zhǔn)范圍是通過(guò)將ApoAI蛋白(BiodesignCat.No.A50620H)在PBS_T，BSA1%(1.6-100ng/ml)中稀釋而制備。在用PBS-T洗滌3次后，加入0.1ug/孔與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的多克隆檢測(cè)抗體(BiodesignCat.No.K45452P)，將該平板在37°C保溫2小時(shí)。再次用PBS-T洗滌3次后，加入100u1/孔的OptEIA底物(BD)。20分鐘后，當(dāng)發(fā)生生色時(shí)，用2N硫酸結(jié)束反應(yīng)，在450nm測(cè)量吸光度。圖6A示出這項(xiàng)測(cè)定的結(jié)果。我們證實(shí)結(jié)腸直腸癌患者中ApoAI的血清濃度降低。38個(gè)I期-IV期CRC患者中的平均濃度為675士36ug/ml，而在27個(gè)健康個(gè)體(對(duì)照組)中其平均值更高1040士39yg/ml。這個(gè)差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001，單側(cè)t-檢驗(yàn))。作為對(duì)比，使用夾心ELISA技術(shù)，在13個(gè)肝癌患者中ApoAI的平均血清濃度為1175士87yg/ml。血清濃度降低證實(shí)ApoAI因此是結(jié)腸直腸癌的特異性標(biāo)記物，可以通過(guò)免疫測(cè)定證實(shí)這種降低。使用的第二種測(cè)定技術(shù)是Linco公司銷售的多元測(cè)定法，其可以在同一樣品中同時(shí)測(cè)定一些載脂蛋白，包括AI和AII(Cat.No.AP0-62K).。使用廠商推薦的程序進(jìn)行。圖6B示出這項(xiàng)測(cè)定的結(jié)果。使用該第二種技術(shù)證實(shí)CRC患者中ApoAI血清濃度降低。34個(gè)I期-IV期CRC患者中ApoAI平均濃度為768士30ug/ml，而在17個(gè)健康個(gè)體(對(duì)照組)中其平均值更高1194士51ug/ml。這個(gè)差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001,單側(cè)t-檢驗(yàn))。8.載脂蛋白All腫瘤標(biāo)記物的血清測(cè)定使用Linco多元試劑盒測(cè)定血清載脂蛋白All。圖7示出這項(xiàng)測(cè)定的結(jié)果。我們證實(shí)結(jié)腸直腸癌患者中ApoAll的血清濃度降低。34個(gè)I期-IV期CRC患者中ApoAll平均濃度為170士11iig/ml，而在17個(gè)健康個(gè)體(對(duì)照組)中其平均值更高277士16iig/ml。這個(gè)差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001,單側(cè)t-檢驗(yàn))。9.I-絲束蛋白腫瘤標(biāo)記物的血清測(cè)定使用實(shí)施例2中描述的抗體以及使用Vidas自動(dòng)化設(shè)備(bioM6rieUX)進(jìn)行ELISA以測(cè)定I-絲束蛋白蛋白。為此，使用VidasHBsAgUltra試劑盒(bioM6rieux，Cat.No.30315)的試劑進(jìn)行ELISA。該試劑如相應(yīng)的信息頁(yè)(ref.11728D-FR-2005/05)所述使用，具有如下修改1.離心管用15ug/ml濃度的捕獲抗體3D11D10敏化。2.HBsAgUltracartridge第二個(gè)孔的內(nèi)容物用300u1在VidasHBsAgUltra試劑盒的第二個(gè)孔的緩沖液(具有山羊血清和lg/1疊氮化鈉的緩沖液)中稀釋為1Pg/ml的與生物素結(jié)合的揭示抗體8C8C5替換。3.將血清、血漿或者糞便樣品(100ill)在HBsAgUltracartridge的第二個(gè)孔中直接稀釋。4.使用Vidas自動(dòng)化設(shè)備和HBsAgUltra方案進(jìn)行ELISA。5.在減去背景噪音之后獲得粗略值(crudevalue)形式的結(jié)果(在反應(yīng)之前讀取底物)。檢測(cè)的體液(血液、血清、血漿、糞便)中存在的腫瘤標(biāo)記物的濃度通過(guò)第2段關(guān)于測(cè)定LEI所述方法計(jì)算。分析患者獲得的量示于圖8。在該圖中，注意到檢測(cè)的結(jié)腸直腸癌患者的2份血清示出血清I-絲束蛋白的量明顯增加。10.B組、CEA、CA19-9和半乳凝素_3腫瘤標(biāo)記物的血清測(cè)定使用本申請(qǐng)人的Vidas32-微球蛋白、VidasCEA、VidasCA19-9和Vidas睪酮測(cè)定試劑盒根據(jù)每個(gè)試劑盒的程序分別測(cè)定32-微球蛋白丄￡4丄々19-9和睪酮腫瘤標(biāo)記物。使用E-鈣粘蛋白EIA試劑盒(TakaraBiochemicals,Tokyo,Japan)根據(jù)該試劑盒程序測(cè)定E-鈣粘蛋白。使用PANCREPAPELISA試劑盒(DynaBio，Marseille,France)根據(jù)該試劑盒程序測(cè)定再生胰島衍生蛋白3a蛋白，其也被稱作胰腺炎相關(guān)蛋白(PAP1)。使用實(shí)施例2中描述的抗體測(cè)定半乳凝素_3和LDH蛋白。使用專利EP0434670中描述的抗體測(cè)定蛋白酶體20S。為此，使用Vidas自動(dòng)化設(shè)備(bioM6rieUX)和VidasHBsAgUltra試劑盒(bioMerieux,Cat.No.30315)的試劑進(jìn)行ELISA測(cè)定。該試劑如相應(yīng)的信息頁(yè)(ref.11728D-FR-2005/05)所述使用，具有如下修改1.離心管用5-30ug/ml濃度的捕獲抗體敏化。412.HBsAgUltracartridge第二個(gè)孔的內(nèi)容物用300yl在具有山羊血清和lg/1疊氮化鈉的緩沖液中稀釋為1Pg/ml的與生物素結(jié)合的揭示抗體替換。3.如果需要，在第二個(gè)孔的緩沖液中稀釋之后，將血清、血漿或者糞便樣品(100ill)在HBsAgUltracartridge的第二個(gè)孔中直接稀釋。4.使用Vidas自動(dòng)化設(shè)備和HBsAgUltra方案進(jìn)行ELISA反應(yīng)。樣品與捕獲抗體和揭示抗體保溫的步驟進(jìn)行14-100次循環(huán)。5.在減去背景噪音之后獲得粗略值(crudevalue)形式的結(jié)果(在反應(yīng)之前讀取底物)。檢測(cè)的體液(血液、血清、血漿、糞便)中存在的腫瘤標(biāo)記物的濃度通過(guò)第2段關(guān)于測(cè)定LEI所述方法計(jì)算。各個(gè)腫瘤標(biāo)記物的測(cè)定條件示于表7。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>分析患者獲得的02-微球蛋白、CEA、CA19_9、睪酮、E-鈣粘蛋白、再生胰島衍生蛋白3a、半乳凝素-3、LDH和蛋白酶體20S腫瘤標(biāo)記物的量分別示于圖9-17。結(jié)腸直腸癌患者的3份血清示出血清02-微球蛋白的量增加。結(jié)腸直腸癌患者的10份血清示出血清CEA的量增加。更明顯地，III期結(jié)腸直腸癌患者的1份血清以及IV期結(jié)腸直腸癌患者的7份血清示出血清CEA的量明顯增加。結(jié)腸直腸癌患者的9份血清示出其血清CA19-9的量增加。更明顯地，III期結(jié)腸直腸癌患者的1份血清以及IV期結(jié)腸直腸癌患者的7份血清示出血清CA19-9的量明顯增加。結(jié)腸直腸癌患者的10份血清示出血清睪酮的量降低。更明顯地，II期結(jié)腸直腸癌患者的1份血清和III期結(jié)腸直腸癌患者的1份血清以及IV期結(jié)腸直腸癌患者的2份血清示出血清睪酮的量降低。結(jié)腸直腸癌患者的2份血清示出血清再生胰島衍生蛋白3a的量增加。IV期結(jié)腸直腸癌患者的4份血清、III期結(jié)腸直腸癌患者的2份血清以及II期結(jié)腸直腸癌患者的1份血清示出血清半乳凝素_3的量明顯增加。實(shí)施例4組合腫瘤標(biāo)記物的血清測(cè)定的應(yīng)用本申請(qǐng)人在實(shí)施例3中揭示了在某些結(jié)腸直腸癌患者血流中可以觀測(cè)到腫瘤標(biāo)記物的量異常升高或者異常降低。令人驚奇地，在同一患者中未系統(tǒng)地觀測(cè)兩個(gè)指定標(biāo)記物在血液中的量的增加或降低。結(jié)果，組合一些腫瘤標(biāo)記物可以增加經(jīng)鑒別患有結(jié)腸直腸癌的患者數(shù)目。因此，A患者也許存在一或多種腫瘤標(biāo)記物(X組)升高或降低，X組的所述標(biāo)記物在B患者中也許正常；在這個(gè)B患者中，一或多種其它腫瘤標(biāo)記物(Y組)也許升高或降低，Y組的所述標(biāo)記物在A患者中也許正常。本申請(qǐng)人測(cè)定的各個(gè)腫瘤標(biāo)記物因此可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種數(shù)學(xué)算法組合。例如非限制性地進(jìn)行如下方法1.設(shè)定每個(gè)腫瘤標(biāo)記物的閾值。2.當(dāng)結(jié)腸直腸癌患者血液中腫瘤標(biāo)記物的量增加時(shí)，將針對(duì)指定患者獲得的血液中的量除以其閾值。當(dāng)結(jié)腸直腸癌患者血液中腫瘤標(biāo)記物的量降低時(shí)，將針對(duì)指定患者獲得的血液中的量變成倒數(shù)并乘以其閾值。3.當(dāng)“血液中的量除以閾值”高于1時(shí)，將該比率乘以系數(shù)，例如10。由此獲得的數(shù)值稱作所研究的患者、考慮的腫瘤標(biāo)記物的“得分”。4.累加各個(gè)腫瘤標(biāo)記物的得分，將其用特異于每個(gè)標(biāo)記物的因子進(jìn)行加權(quán)。在下文實(shí)施例中，所有加權(quán)因子均設(shè)定為1。5.將得分總和除以累加得分總數(shù)，由此獲得的數(shù)值稱作“總得分”。6.當(dāng)其總得分高于閾值時(shí)，診斷該患者患有結(jié)腸直腸癌。包含L-FABP的選擇的2、3、4、5、8和9個(gè)標(biāo)記物的總得分在表8中示出。L-FABP與LEI腫瘤標(biāo)記物的組合因此對(duì)于同一組的79個(gè)患者可以獲得29個(gè)結(jié)腸直腸癌患者增加的總得分“2”，而單獨(dú)測(cè)定L-FABP或LEI分別僅示出27個(gè)或4個(gè)患者的量增加。L-FABP、CEA和CA19-9腫瘤標(biāo)記物的組合因此對(duì)于同一組79個(gè)患者可以獲得48個(gè)結(jié)腸直腸癌患者增加的總得分“3”，而單獨(dú)測(cè)定L-FABP、CEA或CA19-9分別僅示出27、23和12個(gè)患者的量增加。L-FABP、CEA、CA19-9和Gal_3腫瘤標(biāo)記物的組合因此對(duì)于同一組79個(gè)患者可以獲得50個(gè)結(jié)腸直腸癌患者增加的總得分“4c”，而單獨(dú)測(cè)定L-FABP、CEA、CA19-9或Gal_3分別僅示出27、23、12和10個(gè)患者的量增加。L_FABP、CEA、LEI和?；被崴饷?腫瘤標(biāo)記物的組合因此對(duì)于同一組79個(gè)患者可以獲得46個(gè)結(jié)腸直腸癌患者增加的總得分“4d”，而單獨(dú)測(cè)定L-FABP、CEA、LEI或?；被崴饷?分別僅示出27、23、4和3個(gè)患者的量增加。L-FABP、CEA、CA19-9和ApoAl腫瘤標(biāo)記物的組合因此對(duì)于同一組79個(gè)患者可以獲得51個(gè)結(jié)腸直腸癌患者增加的總得分“4e”，而單獨(dú)測(cè)定L-FABP、CEA或CA19-9分別僅示出27、23和12個(gè)患者的量增加，以及單獨(dú)測(cè)定ApoAl僅示出3個(gè)患者的量減少。L-FABP、CEA、CA19-9和LEI腫瘤標(biāo)記物的組合因此對(duì)于同一組79個(gè)患者可以獲得50個(gè)結(jié)腸直腸癌患者增加的總得分“4f”，而單獨(dú)測(cè)定L-FABP、CEA、CA19-9或LEI分別僅示出27、23、12和4個(gè)患者的量增加。L-FABP、CEA、CA19-9、LEI和ACY腫瘤標(biāo)記物的組合因此對(duì)于同一組79個(gè)患者可以獲得50個(gè)結(jié)腸直腸癌患者增加的總得分“5”，而單獨(dú)測(cè)定L-FABP、CEA、CA19-9、LEI或ACY分別僅示出27、23、12、4和3個(gè)患者的量增加。L-FABP、CEA、LEI、ACY、^2_微球蛋白、蛋白酶體20S、PAP和E-鈣粘蛋白腫瘤標(biāo)記物的組合因此對(duì)于同一組79個(gè)患者可以獲得52個(gè)結(jié)腸直腸癌患者增加的總得分“8”，而單獨(dú)測(cè)定L-FABP、CEA、LEI、ACY、^2-微球蛋白、蛋白酶體20S、PAP或E-鈣粘蛋白分別僅示出27、23、4、3、8、5、6和1個(gè)患者的量增加。L-FABP、CEA、CA19-9、LEI、ACY、32_微球蛋白、蛋白酶體20S、PAP和E-鈣粘蛋白腫瘤標(biāo)記物的組合因此對(duì)于同一組79個(gè)患者可以獲得55個(gè)結(jié)腸直腸癌患者增加的總得分“9i”，而單獨(dú)測(cè)定L-FABP、CEA、CA19-9、LEI、ACY、32-微球蛋白、蛋白酶體20S、PAP或E-鈣粘蛋白分別僅示出27、23、12、4、3、8、5、6和1個(gè)患者的量增加。L-FABP、CEA、CA19-9、LEI、ACY、32_微球蛋白、蛋白酶體20S、Gal-3和ApoAl腫瘤標(biāo)記物的組合因此對(duì)于同一組79個(gè)患者可以獲得60個(gè)結(jié)腸直腸癌患者增加的總得分“9j”，而單獨(dú)測(cè)定L-FABP、CEA、CA19-9、LEI、ACY、^2-微球蛋白、蛋白酶體20S或Gal_3分別僅示出27、23、12、4、3、8、5和10個(gè)患者的量增加，以及單獨(dú)測(cè)定ApoAl僅示出3個(gè)患者的量減少。表844<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>a:L-FABP禾口LEI組合b:L-FABP,CEA和CA19-9組合c:L-FABP,CEA,CA19-9和Gal-3組合d:L-FABP,CEA,ACY禾口LEI組合e:L-FABP,CEA,CA19-9和ApoA1組合f:L-FABP,CEA,CA19-9和LEI組合g:L-FABP,CEA,CA19-9,LEI和ACY組合h:L-FABP,CEA,LEI，ACY,2-微球蛋白，E_鈣粘蛋白，PAP和蛋白酶體20S組合i:L-FABP，CEA，CA19_9，LEI，ACY，2-微球蛋白，E-鈣粘蛋白，PAP和蛋白酶體20Sj:L-FABP，CEA，CA19-9，LEI，ACY，2-微球蛋白，Gal-3，ApoA1和蛋白酶體20S組合實(shí)施例5糞便腫瘤標(biāo)記物測(cè)定提取重約lg的糞便，加入含有l(wèi)g/L疊氮化物的10ml的100mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)。將該混合物旋動(dòng)均質(zhì)1分鐘。然后將樣品在冰上進(jìn)行4次7秒超聲處理。通過(guò)以2000g在4°C離心10分鐘除去不溶的級(jí)分。將上清在-30°C貯存直至進(jìn)行測(cè)定。如果需要，在HBskgUltracartridge的第一個(gè)孔的緩沖液中適當(dāng)稀釋糞便之后，使用實(shí)施例3所述的ELISA在糞便中查找腫瘤標(biāo)記物。使用該檢驗(yàn)測(cè)定酰化氨基酸水解酶1、半乳凝素_3和蛋白酶體20S的結(jié)果分別示于圖18-20。在結(jié)腸直腸癌患者的10、14和8份糞便中分別觀測(cè)到酰化氨基酸水解酶1、半乳凝素_3和蛋白酶體20S的量增加。實(shí)施例6通過(guò)ELISP0T技術(shù)檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物1.細(xì)胞培養(yǎng)將LnCAP前列腺癌細(xì)胞系在RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中補(bǔ)加了2mML_谷氨酰胺、10mMHEPES、lmM丙酮酸鈉和10%FCS(均來(lái)自Gibco)。該細(xì)胞用作陰性對(duì)照。將Caco-2結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系在含有2mML_谷氨酰胺而無(wú)FCS(均來(lái)自Gibco)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將HT-29結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系在含有2mML_谷氨酰胺和10%FCS(均來(lái)自Gibco)的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將HT-29/B6結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系在含有4mML_谷氨酰胺而無(wú)FCS(均來(lái)自Gibco)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將細(xì)胞維持在37°C的具有5%C02保溫儀中。2.ELISP0T技術(shù)這種方法可以確定分泌蛋白質(zhì)的細(xì)胞數(shù)目。將帶有PVDF膜(MultiscreenIP,Millipore)的96-孔ELISP0T平板用在無(wú)菌PBS中的10yg/ml小鼠抗腫瘤標(biāo)記物單克隆抗體(捕獲抗體，見(jiàn)下表9，該表示出了用于ELISP0T中的抗體)在+4°C包被過(guò)夜，100u1/孔。然后將該平板用PBS洗滌，并用含有10%FCS的培養(yǎng)基飽和。平行地，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶消化、計(jì)數(shù)，然后稀釋為105個(gè)細(xì)胞/ml。每個(gè)孔分配200yl這種細(xì)胞懸浮液，這-原液的連續(xù)稀釋液也是如此。然后將該平板在37°C在5%C02濕潤(rùn)環(huán)境中保溫20小時(shí)，隨后用含有0.05%Tween-20的PBS洗滌。剩余的細(xì)胞通過(guò)用冰水處理10分鐘裂解，再次洗滌平板。然后加入0.1yg/孔揭示抗體_即待測(cè)腫瘤標(biāo)記物的生物素?；膯慰寺】贵w(表9)(在室溫保溫2小時(shí))。通過(guò)加入Extravidin-堿性磷酸酶(Sigma)和底物5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽/硝基藍(lán)四唑(BCIP/NBT，Biorad)揭示斑點(diǎn)。背景噪音相應(yīng)于在LnCap孔中測(cè)量的斑點(diǎn)數(shù)目，在所用讀取條件下在0-8之間變化。從特異性信號(hào)中減去非特異性斑點(diǎn)的平均數(shù)。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>每一百萬(wàn)個(gè)保溫的細(xì)胞中分泌腫瘤標(biāo)記物的Caco-2、HT-29和HT-29/B6細(xì)胞的數(shù)目示于圖21。ELISP0T技術(shù)可以證實(shí)所述腫瘤標(biāo)記物由結(jié)腸癌細(xì)胞系釋放或分泌?？梢允褂眠@個(gè)技術(shù)查找患者體內(nèi)循環(huán)腫瘤細(xì)胞，根據(jù)本申請(qǐng)人申請(qǐng)的專利申請(qǐng)W003/076942所述方法進(jìn)行。棚列7側(cè)醒腳趟龍■敍體刪■示適1.方法學(xué)首先，對(duì)組織微陣列載玻片脫石蠟。為此，將其在如下浴中相繼保溫10分鐘甲基環(huán)己烷(兩次)、100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇和水。然后將該玻片用含有0.l%Tween20的TBS(TBS-T)攪拌漂洗10分鐘。抗原在10mM檸檬酸鹽緩沖液pH6中通過(guò)加熱至90°C40分鐘、然后冷卻至室溫30分鐘再活化。內(nèi)源性過(guò)氧化物酶通過(guò)在含有3%H202的TBS-T中保溫5分鐘而被抑制。然后將該玻片用在TBS-T中3%BSA在37°C在濕化箱中飽和1小時(shí)。隨后將該玻片與在含有3%BSA的TBS-T中稀釋為10ug/ml的如下一級(jí)抗體一起保溫2小時(shí)(在37°C在濕化箱中保溫)抗-白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑(克隆3D9C2)、抗-埃茲蛋白(克隆5G2D12)、抗-?；被崴饷?(克隆8A8A10)或者抗-I-絲束蛋白(克隆8D6A3)。在進(jìn)行3次在TBS-T中洗滌10分鐘后，將該玻片與在飽和溶液中稀釋為1/400的辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的抗小鼠二級(jí)抗體(Cat.No.115-035-003JacksonImmunoresearch)一起在37°C在濕化箱中保溫2小時(shí)。對(duì)該玻片進(jìn)行3次在TBS-T中洗滌10分鐘，然后進(jìn)行3次在PBS中洗滌10分鐘。使用SigmaFast底物(Cat.No.D-4168，Sigma-Aldrich)使玻片顯色5分鐘。通過(guò)在PBS中洗滌終止染色。使用Harris蘇木精(Cat.No.MHS16,Sigma-Aldrich)復(fù)染30秒。在用水和用PBS洗滌后，將玻片置于顯微鏡下觀察。根據(jù)這項(xiàng)應(yīng)用特異性選擇用于免疫組織化學(xué)標(biāo)記的抗體，不依賴于其在ELISA或者在Western印跡中的反應(yīng)性。2.白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑的免疫組織化學(xué)檢測(cè)組織微陣列載玻片用于篩選大量樣品。這些樣品是點(diǎn)于玻片上的結(jié)腸組織。患者的特性(結(jié)腸直腸癌組織微陣列上存在的結(jié)腸組織斑點(diǎn)的特性)以及用抗-白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑抗體免疫標(biāo)記的結(jié)果示于表10。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>該表中結(jié)果證實(shí)在健康結(jié)腸粘膜活檢:組織中，無(wú)標(biāo)記(10個(gè)陰性結(jié)果)。該標(biāo)記在腺瘤中也是陰性的(1/1)。該標(biāo)記在結(jié)腸腺癌的上皮細(xì)胞中是陽(yáng)性的(8/11患者陽(yáng)性)。在基質(zhì)中無(wú)標(biāo)記。3.埃茲蛋白的免疫組織化學(xué)檢測(cè)組織微陣列載玻片用于篩選大量樣品。這些樣品是點(diǎn)滴于玻片上的結(jié)腸組織。對(duì)于每個(gè)結(jié)腸腺癌患者，在腫瘤中心取3份樣品，在侵潤(rùn)前沿取3份樣品以及在健康組織取3份樣品。表11示出了用抗-埃茲蛋白抗體免疫標(biāo)記的結(jié)果；示出的標(biāo)記水平是在分析的3份樣品的最大強(qiáng)度。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>在30個(gè)患者中，25個(gè)患者呈現(xiàn)出與相鄰健康組織相比在腫瘤(腫瘤中心或侵潤(rùn)前沿)中埃茲蛋白過(guò)表達(dá)。4.酰化氨基酸水解酶1的免疫組織化學(xué)檢測(cè)組織微陣列載玻片用于篩選大量樣品。這些樣品是點(diǎn)滴于玻片上的結(jié)腸組織。對(duì)于每個(gè)結(jié)腸腺癌患者，在腫瘤中心取3份樣品，在侵潤(rùn)前沿取3份樣品以及在健康組織取3份樣品。表12示出了用抗-酰化氨基酸水解酶抗體免疫標(biāo)記的結(jié)果；示出的標(biāo)記水平是在分析的3份樣品的最大強(qiáng)度。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>在30個(gè)患者的樣品中，21個(gè)患者呈現(xiàn)出與相鄰健康組織相比在腫瘤(腫瘤中心或者侵潤(rùn)前沿)中酰化氨基酸水解酶過(guò)表達(dá)。5.I-絲束蛋白的免疫組織化學(xué)檢測(cè)組織微陣列載玻片用于篩選大量樣品。這些樣品是點(diǎn)于玻片上的結(jié)腸和直腸組織C患者的特性(結(jié)腸直腸癌組織微陣列上存在的結(jié)腸組織斑點(diǎn)的特性)以及用抗-I-絲束蛋白抗體免疫標(biāo)記的結(jié)果示于表13c表13<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>表中結(jié)果證實(shí)-在健康結(jié)腸粘膜活檢組織中，該標(biāo)記在8個(gè)樣品中較弱(+)，在2個(gè)樣品中是++。該標(biāo)記在結(jié)腸腺瘤樣品(1/1)中也較弱(+)。該標(biāo)記在結(jié)腸腺癌上皮細(xì)胞中是強(qiáng)陽(yáng)性++(6/9患者++，3個(gè)患者較弱+，包括結(jié)腸粘液性腺癌)。在基質(zhì)中無(wú)標(biāo)記；_在健康直腸粘膜活檢組織中，該標(biāo)記以非特異性方式存在于表面上皮(3/4)，在1個(gè)樣品中是++水平。該標(biāo)記在直腸腺瘤中是強(qiáng)陽(yáng)性++(5/9)或者謹(jǐn)慎+(4/9)。該標(biāo)記在直腸腺癌的上皮細(xì)胞中也是強(qiáng)陽(yáng)性++(3/4患者是++，1個(gè)患者較弱+)。在基質(zhì)中無(wú)標(biāo)記。參考文獻(xiàn)1.J.D.Potter,JNatlCancerInst.，91，916-322J.Faivre,2001,Epidemio1ogieetdepistageducancercolorectal[Colorectalcancerepidemiologyandscreening],publisherSpringer34567891011121314151617181920212223242526272829303132333435E.Chanetal.，1985，JBiolChem，260，2629-2632R.Dasetal.，2001，ClinCancerRes，7，1706-1715J.Stuliketal.，2001，Electrophoresis，22，3019-3025T.Yamazakietal.，1999，JSurgOncol，72，83-87P.GoldetS.Freedman,1965,JExpMed，467-481M.Duffy,2001,ClinChem，624-630Y.Kimetal.,2003,AnnClinLabSci,32-38:J.L.Magnanietal.,1983,CancerResearch,43,5489-5492:E.Remold-O'Donne11etal.,1992,ProcNatlAcadSciUSA，89，563-5639:J.Cooleyetal.,2001,Biochemistry,15762-15770:M.Algrainetal.，1993，JCellBiol，120，129-139:ff.G.JiangetS.Hiscox,1996,AnticancerRes,16,861—865:S.Hiscoxetff.G.Jiang,1999,JCellSci,112，3081-3090:T.Xiaoetal，2005，Mol.Cell.Proteomics，4，1480-1486:M.Andersetff.Dekant,1994,AdvancesinPharmacology,431-448:K.Lorentzetal.,1975,ClinicaChimicaActa,263-269:K.LorentzetB.Flatter,1975,ClinicaChimicaActa,271-274:R.M.Cooketal.，1993，JBioChem,17010-17017:Y.E.Milleretal.，1989，JClinInvest,2120-2124:S.Balabanovetal.,2001,EurJBiochem，5977-5980:D.A.Sweetseretal.，1987，JBiolChem，266，16060-16071:M.Pelsersetal.，2003，ClinBiochem,36，529—535:R.Xiao,etal.,2005,MolecularCancer,4,1-17:E.E.Niederkofleretal.,2003,JLipidRes,44，630—639:G.L.Hortin,2006，ClinicalChemistry,52(7)，1223-1237:J.Y.Engwegenetal.,2006,WorldJGastroenterol,12(10),1536-1544:Z.Zhangetal.，2004，CancerResearch,64，5882-5890:H.Hachemetal.,1986,JChemClinBiochem,24,161—166:C.S.Lin,etal.，1993，JBiolChem，268，2781-92:V.Delanoteetal.,2005,ActaPharamaSinica769—779:S.Nakaharaetal.,2005,Apoptosis,10,267-275:I.Iuriscietal.，2000，ClinCanRes，6，1389-1393:A.P.Arrigoetal.，1988，Nature，331，192—19436:TLavabre-Bertrandetal.，2001，Cancer，92，2493-250037:M.K.Scwartz，2006，ClinChimActa，1992，77-8238:D.J.McCooletal.，1999，BiochemJ,593-60039:J.L.Iovannaetal.,1994,Gastroenterology,106,728-73440:Y.Motooetal.，1999，DigDisSci，44，1142-114741:M.Herlynetal.,1979,ProcNatlAcadSciUSA,76，1438-144242:A.ArmstrongetS.Eck,2003,CancerBiolTher,2,320-32543:D.Herlynetal.，1982，ProcNatlAcadSciUSA，79，4761-476544:HAbeetal.,2002,JImmunolMethods，270，227-23345:V.Baraketal.，2004，ClinBiochem，37，529-54046:H.Kimetal.,2006,AnnClinLabSci，36，294-29847:F.Rocaetal.,2006,JSurgOncol,151-16048:C.H.Damskyetal.，1983，Cell，455-46649:M.Katayamaetal.,1994,BrJCancer,580—58550:C.ffillmannsetal.,2004,ClinExpMetastasis,75-7851:J.Holmgrenetal.,1984,BrMedJ(Clin.Re.Ed.)，288，Ed.)，288，1479--148252:T.L.Klugetal.，1986，Int.J.Cancer，38，6661-66953:P.Kuuselaetal.,1991,Br.J.Cancer,63,636-64054:M.Hollandetal.，1993；Medicina(B.Aires),53(2):117_2355:F.Modeletal.,July2006,WorldCongressonGastrointestinalCancer,((DetectionofMethylatedDNAinPlasmafromColorectalCancerPatientsandControlsbyReal-TimePCRAnalysisofSeptin9》56:M.P.Ebertetal.,2006,Gastroentrology,131(5),1418-143057:C.Biancoetal.,2006,Clin.CancerRes.,12,5158—516458:R.Yasumatsuetal.,2006,AmJPhysiolLungCellMolPhysiol291，L619-L62759:J.Chevalieretal.,1997,JHistochemCytochem,45,481—49160:S.Patterson,2000,Massspectrometryandproteomics.PhysiologicalGenomics2,59丨-6561:L.AndersonandC.L.Hunter,2006,MolCellProteomics,5,573-588.62:L.J.Krickaetal.，1999，ClinicalChemistry,45(4),453-45863:S.TyagiandF.R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