中藥黃連與吳茱萸的提取物聯(lián)合5-氟尿嘧啶在制備治療腸癌藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及中藥復(fù)方左金方與化療藥物聯(lián)合治療的新用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 大腸癌是消化系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤之一，包括結(jié)腸癌和直腸癌，每年全球有約 120萬名患者被確診為結(jié)直腸癌，而有超過60萬名患者直接或間接死于結(jié)直腸癌，其發(fā)病率 和死亡率分別位于第三位和第四位。男性結(jié)直腸癌的發(fā)病率高于女性，結(jié)直腸癌發(fā)病率在 40歲以下年齡段較低，但會隨著年齡的增大而增加。大腸癌是中國最常見也是目前最受關(guān) 注的惡性腫瘤之一。從90年代開始，發(fā)達(dá)國家的結(jié)直腸癌發(fā)病率開始逐年下降，但是中國等 亞洲發(fā)展中國家仍逐年上升，在男性患者中這一流行病學(xué)特征更加明顯，嚴(yán)重威脅著人類 的身體健康。
[0003] 手術(shù)被認(rèn)為是目前治療結(jié)腸癌的主要手段，但由于結(jié)腸癌發(fā)病的隱蔽性和診療手 段的局限性，多數(shù)結(jié)腸癌發(fā)現(xiàn)時已進(jìn)入結(jié)腸癌發(fā)病中晚期，不適于手術(shù)治療。目前臨床上對 腸癌一般采取以化療為主、放療、生物免疫治療等為輔的治療手段。但化療有巨大的不良反 應(yīng)，導(dǎo)致急性肝損傷和腎臟損傷等，大大限制了化療藥物用量，阻礙了藥物功效的發(fā)揮，此 外放療治療容易導(dǎo)致放射性腦、脊髓損傷、放射性腦神經(jīng)損傷、放射性唾液腺損傷以及放射 性的后誘發(fā)癌等并發(fā)癥。
[0004] 因此，中醫(yī)藥結(jié)合化療治療中晚期腸癌越來越顯出優(yōu)勢。中醫(yī)藥對大腸癌的治療 研究已經(jīng)涉及腫瘤發(fā)生、發(fā)展、死亡、衰老等領(lǐng)域，在大腸癌治療中發(fā)揮了積極的作用。大量 醫(yī)療實踐證明：中醫(yī)藥配合大腸癌手術(shù)切除后的輔助治療(化學(xué)、靶向、基因、放射、內(nèi)分泌、 生物療法等），對降低復(fù)發(fā)、減輕毒副反應(yīng)、延長病人生存期、提高患者生活質(zhì)量都有明顯的 優(yōu)勢.此外，中醫(yī)藥的成本相對較低，實用性廣。但是中藥抗腸癌制劑單調(diào)，療效不確切，目 前尚無具有廣泛治療作用的臨床制劑問世，大多數(shù)中藥制劑為輔助治療用藥，其臨床應(yīng)用 缺乏規(guī)范，且應(yīng)用效果不理想，嚴(yán)重制約了抗腸癌中藥及其復(fù)方的廣泛應(yīng)用和得到國際社 會的認(rèn)可。
[0005] 左金方（Zou jinPerscription)出自《丹溪心法》，由君藥黃連（Coptischinensis ?1')和佐使藥吳茱萸化￥0(1丨31'11丨36〇3印(]\188.外6111：11.)按6:1重量比例組成，被各藥典收 載，其藥性偏寒，主治肝郁化火，胃失和降，脅痛脘痞、嘔吐吞酸、嘈雜似饑、脈弦數(shù)而口苦舌 赤等偏于胃火較甚者?，F(xiàn)代醫(yī)理研究表明左金方有保護(hù)胃粘膜、抑制胃酸分泌、抗?jié)?、?響胃腸運(yùn)動的作用。目前臨床常用于急慢性胃炎和消化性潰瘍。近來，研究證明左金方能誘 導(dǎo)體外培養(yǎng)腸癌細(xì)胞HT-29的凋亡，它通過上調(diào)腫瘤組織中的Bax蛋白的表達(dá)，降低Bcl-2和 Survivin蛋白的表達(dá)，顯著抑制了人腸癌裸小鼠移植瘤的生長。
[0006] 目前以術(shù)前氟尿嘧啶(5-FU)為基礎(chǔ)的放化療是局部晚期直腸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療。5-FU 是放療增敏劑，但對有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的治療效果不佳，會帶來一些如肛門和性功能損傷的 問題，且不能使生存期進(jìn)一步延長。所以，由于5-FU具有生物利用度低，對腫瘤細(xì)胞選擇性 小，毒副作用大，治療劑量與中毒劑量接近等缺點(diǎn)，大大限制了其臨床應(yīng)用。
[0007] 中國專利申請101785807A公開了質(zhì)量比為6:1的中藥黃連與吳茱萸的提取物在制 備治療胃癌藥物中的應(yīng)用，以及中藥復(fù)方左金方在制備治療胃癌藥物中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供中藥黃連與吳茱萸的提取物與5-FU(5-氟脲嘧啶)聯(lián)合在制 備治療腸癌藥物中的用途。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，中藥黃連與吳茱萸的提取物與5-FU(5-氟脲嘧啶)聯(lián)合用于 治療腸癌，優(yōu)選的是將質(zhì)量比為6:1的中藥黃連與吳茱萸的提取物與化學(xué)治療劑5-氟脲嘧 啶聯(lián)合應(yīng)用，更優(yōu)選的是以中藥復(fù)方左金方的制備方式制備所述提取物，因此復(fù)方左金方 以及依據(jù)該復(fù)方制備的左金丸均包含在本發(fā)明范圍內(nèi)，此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的 是，以左金方為基礎(chǔ)藥方，添加其他輔助藥材制備的復(fù)方藥物也包含在本發(fā)明中。在腸癌的 治療中，所述聯(lián)合是指同時給藥或者序慣給藥，即在給予患者提取物之前或者同時或者之 后給予5-FU。
[0010]本發(fā)明通過細(xì)胞體外試驗證明，中藥黃連與吳茱萸的提取物與5-FU聯(lián)合用藥比提 取物單獨(dú)，或者5-FU單獨(dú)用藥對腸癌的治療效果更好。中藥黃連與吳茱萸的提取物與5-FU 聯(lián)合用藥，顯著提高了 FHC人正常結(jié)腸直腸粘膜上皮細(xì)胞的存活率，大幅降低了 5-FU的細(xì)胞 毒性作用，通過促進(jìn)HT-29細(xì)胞中Bax蛋白的高表達(dá)和Bcl-2、Survivin蛋白的低表達(dá)，促進(jìn) 人腸癌細(xì)胞的凋亡。本發(fā)明的研究成果對降低臨床抗腸癌化療藥物的毒副作用，提高治療 效果，具有重大的意義。
【附圖說明】
[0011]圖1是本發(fā)明左金方作用于FHC人結(jié)腸直腸粘膜上皮細(xì)胞的CCK-8試驗結(jié)果，顯示 提取物濃度、作用時間與FHC存活率的關(guān)系；
[0012]圖2是本發(fā)明5-FU作用于FHC人結(jié)腸直腸粘膜上皮細(xì)胞的CCK-8試驗結(jié)果，顯示5-FU濃度、作用時間與FHC存活率的關(guān)系；
[0013]圖3是本發(fā)明左金方作用于結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果，顯示提取物 濃度、作用時間與HT-29凋亡率的關(guān)系；
[0014]圖4是本發(fā)明5-FU作用于結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果，顯示5-FU濃 度、作用時間與HT-29凋亡率的關(guān)系；
[0015] 圖5是空白對照，1.00yg/mL左金方，50.0yg/mL 5-FU以及1.00yg/mL左金方聯(lián)合 50 . Oyg/mL 5-FU分別作用FHC細(xì)胞24h的CCK-8試驗結(jié)果，顯示特定濃度的提取物、5-FU、提 取物聯(lián)合5-FU與FHC存活率的關(guān)系；
[0016] 圖6是空白對照，1 ·00yg/mL左金方，100·Oyg/mL 5-FU以及1 ·00yg/mL左金方聯(lián)合 100.Oyg/mL 5-FU分別作用FHC細(xì)胞24h的CCK-8試驗結(jié)果，顯示特定濃度的提取物、5-FU、提 取物聯(lián)合5-FU與FHC存活率的關(guān)系；
[0017] 圖7是空白對照，1 · 00yg/mL提取物，50 · Oyg/mL 5-FU，1 · 00yg/mL提取物聯(lián)合50 · ομ g/mL 5-FU分別作用HT-29細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果，顯示特定濃度的提取物、5-FU、提取 物聯(lián)合5-FU與HT-29凋亡率的關(guān)系；
[0018] 圖8是空白對照，1.00yg/mL提取物，100.0 yg/mL 5-FU，1.00yg/mL提取物聯(lián)合 100.Oyg/mL 5-FU分別作用HT-29細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果，顯示特定濃度的提取物、5-FU、提取物聯(lián)合5-FU與HT-29凋亡率的關(guān)系；
[0019] 圖9是空白對照，1.00yg/mL左金方，100.0yg/mL 5-FU，1.00yg/mL左金方聯(lián)合 100.0yg/mL 5-FU分別作用HT-29細(xì)胞24h，調(diào)節(jié)細(xì)胞中BAX、Bcl-2和Survivin蛋白表達(dá)的 Western Blotting凝膠電泳圖（n = 6);
[0020] 圖 10是空白對照，1.00yg/mL提取物，50.0yg/mL 5-FU，100.00yg/mL 5-FU，1.00y g/mL提取物聯(lián)合50·Oyg/mL 5-FU以及1 ·00yg/mL提取物聯(lián)合100·0yg/mL5-FU分別作用HT-29細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)顯微鏡觀察圖（X 200)。
【具體實施方式】 [0021] -、試驗材料
[0022]細(xì)胞株:FHC細(xì)胞(人正常結(jié)腸直腸粘膜上皮細(xì)胞）、HT-29細(xì)胞(人結(jié)腸癌細(xì)胞)購 自中山大學(xué)動物實驗部細(xì)胞中心。用含有體積分?jǐn)?shù)為10 %的FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，于37 °C，5%的C02孵箱中培養(yǎng)3天進(jìn)行一次傳代，傳代按1:3進(jìn)行。取生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。
[0023]中藥黃連與吳茱萸的提取物（下稱提取物或左金方）：中藥黃連（Coptis chinensis Fr)與吳茱萸(Evodiarutaecarp(Juss. )benth.)為市售購買，按6:1 質(zhì)量混合， 經(jīng)水煎、濃縮和冷凍干燥制成水提物。原藥材經(jīng)水提后，得到水提物260(mg)/生藥(g)。
[0024] 左金方傳統(tǒng)湯劑凍干粉：由本實驗室提供，取30g黃連與5g吳茱萸，加8倍蒸餾水浸 泡30min，加水煎煮3次，每次30min，過濾，合并3次濾液，冷凍干燥，每克干粉含生藥3.98g; 經(jīng)HPLC法測定，左金方凍干粉中含小檗堿39.85%，巴馬汀9.19%，藥根堿4.86%，吳茱萸堿 0.17%，吳茱萸次堿0.19%。
[0025] 制備成試驗中給藥濃度的左金方的方法:將左金方凍干粉溶于去離子水中，配置 成lmg/mL的母液，實驗時用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。
[0026] 5-FU:購自天津金耀氨基酸有限公司，規(guī)格：10ml: 0.25g，批號：1412011。
[0027]制備成試驗中給藥濃度的5-FU的方法:取適量5-氟尿嘧啶注射液原液加細(xì)胞培養(yǎng) 液配制成lmg/m 1母液，實驗時用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。
[0028]二、檢測方法及數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法 [0029] l、CCK-8檢測細(xì)胞活性
[0030] 采用CCK-8檢測試劑盒在規(guī)定時間內(nèi)觀察左金方或者5-FU或者左金方聯(lián)合5-FU對 培養(yǎng)FHC細(xì)胞的存活率的影響，其中將未經(jīng)處理的對照組細(xì)胞的存活率設(shè)定為100%。
[0031] 2、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率
[0032] 調(diào)整HT-29細(xì)胞密度為2X105/mL，以1.5mL/well種入6孔板。每組6個復(fù)孔。藥物作 用24h后，細(xì)胞刷刮取細(xì)胞，800r · m