專利名稱：含金膠抗原敏感膜包覆電極的梅毒診斷器件的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種含金膠抗原敏感膜包覆電極的梅毒診斷器件，該梅毒診斷器
件是基于抗原/抗體特異性反應(yīng)來診斷梅毒抗原的專用微流控芯片，屬于分析測試領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
梅毒(Syphilis)是由梅毒螺旋體(T. pallidum, TP)引起的一種性傳播疾病 (Sexually transmitted disease, STD)。在自然情況下梅毒螺旋體只感染人類，人是梅毒 唯一傳染源，主要通過性接觸傳播。另也可通過胎盤垂直傳播，引起胎兒先天性梅毒。少數(shù) 人也可經(jīng)輸血感染。80年代以來，梅毒在我國再次死灰復(fù)燃，據(jù)全國性病控制中心統(tǒng)計，我 國梅毒發(fā)病率年增長率達52.7%，且先天性梅毒和神經(jīng)梅毒發(fā)病率增加明顯，在全球亦有 逐漸上升的趨勢，梅毒不僅已經(jīng)成為世界性的嚴重社會和公共衛(wèi)生問題，而且也是危害人 群健康的主要疾病之一。因此，選擇簡單、快速、高敏感性和特異性診斷方法和試劑，對梅毒 早期診斷，發(fā)現(xiàn)傳染源，控制梅毒傳播具有重要意義。 目前常用的梅毒診斷方法有病原學(xué)檢查、非梅毒螺旋體抗原血清試驗、TP快速檢 測試紙條、梅毒螺旋體血球凝集試驗(TPHA)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)等。病原學(xué)檢查的原理 是取患者損害的滲出物或淋巴結(jié)穿剌術(shù)得到的組織液，觀察螺旋體的特征性形態(tài)和運動方 式，在理論上對早期梅毒有較高的檢出率，但受到條件的制約(包括就診用藥、高質(zhì)量的熒 光顯微鏡、試劑和技術(shù)等)也較多，因此實際檢出率并不高。TP快速檢測試紙條雖克服了檢 測時間長、試劑昂貴等缺陷，但國內(nèi)暫時未有詳細報道其靈敏性和特異性效果，因此不可用 于確診試驗。非梅毒螺旋體抗原血清試驗的原理是目前診斷梅毒常用的血清學(xué)初篩試驗， 在很多文獻中都提到非梅毒螺旋體抗原血清試驗雖然簡易、快速、易于觀察結(jié)果，適合于大 量人群的血清篩查，但敏感性、特異性較差，有時會出現(xiàn)生物學(xué)假陽性和假陰性反應(yīng)，容易 造成漏檢和誤檢，所以不適合用于一期梅毒、先天梅毒、神經(jīng)梅毒的診斷。TPHA雖然其敏感 性和特異性高，主要被用于梅毒確診試驗，但對療效觀察意義不大。PCR法是較新的診斷方 法，它能對生殖器潰瘍進行早期鑒別診斷，區(qū)分梅毒、生殖器皰疹及軟下疳。但當前診斷梅 毒的PCR仍存在引物的非特異性、對血清/全血等敏感性低等缺點。而且當皮損開始愈合、 分泌物減少、血清學(xué)試驗陽性反應(yīng)時，采用PCR方法就不合適。另外，PCR方法易受標本中 的組織和細胞碎片等物質(zhì)抑制，導(dǎo)致PCR假陰性結(jié)果。所以PCR檢測不宜用作判愈。 TP快速檢測試紙條、非梅毒螺旋體抗原血清試驗、TPHA以及PCR等檢測方法均屬 于免疫分析。以上免疫分析本身有很強的選擇性，對傳染病的早期診斷，判斷療效及預(yù)后等 方面均有重要的意義。然而重大傳染病的檢測非常復(fù)雜，傳統(tǒng)的免疫分析通常只針對單一 抗原進行檢測。由于一種診斷抗原可出現(xiàn)在不同致病菌，或不同診斷抗原可在同一致病菌 同時出現(xiàn)，因此，開展高效的多重免疫分析方法(SMIAs)，從生物相關(guān)性的角度真實地定性、 定量反映各種致病菌抗原的種類和數(shù)量，在早期預(yù)防和聯(lián)檢多種傳染病、判斷傳染病菌發(fā) 展程度、觀察和評價治療效果等方面都具有重要的醫(yī)學(xué)價值。 電化學(xué)免疫傳感器具有自動化程度高、廉價、易制備、快速靈敏等獨特優(yōu)勢，配合免疫反應(yīng)的高效專一，非常適合構(gòu)建重大傳染病多重免疫分析檢測的分析儀。有"生命科 學(xué)集成電路"之稱的微流控芯片(lab-on-chip)是構(gòu)建微型化、集成化的電化學(xué)免疫傳感 器的理想技術(shù)。微流控芯片技術(shù)是將采樣、預(yù)處理、加試劑、反應(yīng)、分離、檢測等集成在一塊 微芯片上完成的一門前沿技術(shù)，具有分析速度快、信息量大、試劑消耗少、污染小、操作費用 低、儀器使用簡便等優(yōu)點。且非常適合工業(yè)化生產(chǎn)。微流控技術(shù)代表著21世紀分析儀器走 向微型化、集成化的發(fā)展方向。構(gòu)建適合于重大傳染病檢測的微流控安培檢測芯片具有以 下優(yōu)勢(l)通過微加工技術(shù)很容易在芯片上集成多個檢測通道和檢測電極，做到多目標 物同時分析，技術(shù)可行性高。(2)通過微流動注射技術(shù)，樣品在管路中流動保證了電極表面 時刻更新，較好克服了電極易被污染，造成假陽性率高、結(jié)果平行性差等問題。(3)微流控傳 感器上管路直徑只有Pm級，反應(yīng)池體積也只有PL級，分析時所需試劑用量極少，分析物 到達電極表面的擴散距離短、因此可以大大減少溫育時間，實現(xiàn)快速聯(lián)檢目標。(4)目前微 流控傳感器多基于光學(xué)檢測系統(tǒng)，儀器昂貴體積大，全集成很難，而且檢測成本很高，限制 了其推廣。而傳感器中采用電化學(xué)檢測，體積小、自動化程度高、成本低。 目前，在微流控芯片技術(shù)領(lǐng)域，利用梅毒多種特異性抗體來同時檢測、快速診斷多 種梅毒抗原的相關(guān)技術(shù)和方法尚未見報道。

實用新型內(nèi)容本實用新型所要解決的技術(shù)問題是，在微流控芯片技術(shù)這樣一個總的技術(shù)框架 內(nèi)，研發(fā)出一種能夠利用梅毒多種特異性抗體來對多種梅毒抗原進行同時檢測、快速診斷 的專用微流控芯片。 本實用新型通過如下方案解決所述技術(shù)問題，該方案提供的裝置是一種含金膠抗 原敏感膜包覆電極的梅毒診斷器件，該器件是微流控芯片，該微流控芯片的結(jié)構(gòu)包括貼合 裝設(shè)在一起的兩片板狀物，所述兩片板狀物分別是微流控芯片的蓋片以及微流控芯片的基 片，在所述兩片板狀物之間的相互貼合的位置上裝設(shè)有管道，以及，三個池狀物，管道的一 端經(jīng)由歧管狀流體通道分別與其中的兩個池狀物聯(lián)通，管道的另一端與余下的一個池狀物 聯(lián)通，以及，依序分別裝設(shè)在所述管道內(nèi)不同位置上的工作電極以及對電極以及參比電極，
所述工作電極由金屬電極以及貼附在所述金屬電極上的包埋了梅毒特異性抗體的金膠敏 感膜構(gòu)成，本案特別之處在于，所述管道的構(gòu)造呈并聯(lián)構(gòu)造，所述呈并聯(lián)構(gòu)造的管道由四條
分支管道并聯(lián)構(gòu)成，以及，所述工作電極的數(shù)量是四個，該四個工作電極的裝設(shè)位置分別位 于所述四條分支管道內(nèi)，以及，該四個工作電極其表層金膠敏感膜結(jié)構(gòu)中的特異性抗體分 別是對梅毒抗原能特異性結(jié)合的四種梅毒抗體物質(zhì)，該四種抗體物質(zhì)分別是梅毒特異性抗 體TP0684、 TP0453、 TP0821及TP0319。 所述金膠敏感膜是將殼聚糖金膠溶液與梅毒特異性抗體溶液充分混合均勻，并使
其干燥成膜而成。所述金膠敏感膜中的梅毒特異性抗體均為辣根過氧化物酶或者葡糖糖氧
化酶標記的梅毒抗體，所述金膠敏感膜已包含為固定上述各梅毒特異性抗體而引入其中的
輔助性介質(zhì)，所述輔助性介質(zhì)例如殼聚糖、醋酸纖維素、明膠其中的一種或它們的混合物。 所述微流控芯片結(jié)構(gòu)中的所述管道以及所述分支管道以及所述歧管狀流體通道，
其內(nèi)徑尺寸均可以是任意選定的尺寸，但是，出于盡量少用待測液樣以及降低試劑損耗等
方面的考慮，所述管道以及所述分支管道以及所述歧管狀流體通道最好均選用毛細管級的3/5頁
通道，所述毛細管級的通道意即毛細管通道，其內(nèi)徑與通常意義上的毛細管的內(nèi)徑相當。所 述毛細管其內(nèi)部通道的橫截面形狀可以是任意的形狀，所述橫截面形狀例如圓形、橢圓形、 方形、矩形、條形，當然也可以是任意的存在彎曲的線形，并且，所述毛細管的內(nèi)部形狀隨著 管道的延伸，不同部位的橫截面形狀也可以允許是不同的形狀。僅就毛細管一詞而言，其技 術(shù)含義是公知的。 本案微流控芯片的結(jié)構(gòu)中涉及若干種電極，其尺寸是適于安置在相應(yīng)位置管道內(nèi) 的尺寸，但是，基于盡量少用待測液樣以及降低試劑損耗等方面的考慮，所述電極均為適于 安置在毛細管內(nèi)的微小尺寸的電極，其中的每一個電極的形狀均可以是任意選定的形狀， 所述任意選定的形狀例如方片形狀、矩形片狀、條狀或圓形片狀等等。 本案微流控芯片結(jié)構(gòu)中涉及若干個池狀物，所述池狀物是用于過渡性儲液的池形 或囊形構(gòu)造，其中的每一個池狀物的內(nèi)腔其形狀均可以是任意選定的形狀，所述內(nèi)腔形狀 例如圓柱形空腔狀、方柱形空腔狀、橢圓形空腔狀或球形空腔狀等等。所述池狀物的尺寸可 以是任意選定的尺寸，但是，為了能夠盡量少用待測液樣以及降低試劑損耗，所述池狀物最 好是能夠與毛細管匹配的微小型的池狀物。 本案裝置當然還可以進一步包括一些附件，所述附件例如多道電化學(xué)工作站以及 微流動泵等等，所述多道電化學(xué)工作站的技術(shù)含義以及微流動泵的技術(shù)含義是公知的。本 案微流控芯片結(jié)構(gòu)中涉及的各個工作電極以及對電極以及參比電極等，可以分別經(jīng)由相應(yīng) 的專用串線與所述多道電化學(xué)工作站的相應(yīng)接口進行聯(lián)接。所述專用串線是用來將各所述 電極與所述多道電化學(xué)工作站的各相應(yīng)接口進行相互聯(lián)接的專用電纜。所述微流動泵專用 于驅(qū)動微量液體流動，所述微流動泵可以與按需選定的任意一個所述池狀物聯(lián)通。 本案微流控芯片的具體實現(xiàn)路徑可以有多種，選其一詳解如下 —、高聚物(PC :聚碳酸酯)蓋片上化學(xué)鍍微金電極的制備 1 、以石英/鉻板為光掩模，用選擇波長的紫外光作為光源對PC蓋片表面的選擇性 區(qū)域進行輻射。 2、采用己二胺作為胺化劑，l-[3，-(N-N- 二甲基胺)丙基]_3-己基碳二亞胺鹽酸
鹽為偶合劑對經(jīng)過選擇性區(qū)域照射的PC蓋片進行胺化反應(yīng)。 3、將經(jīng)過選擇性區(qū)域胺化反應(yīng)的PC蓋片浸入氯金酸中反應(yīng)。 4、用蒸餾水清洗以后，再將其浸入硼氫化鈉溶液中還原。 5、用蒸餾水清洗以后，再將其浸入0. 5mol/L的硫氰化鉀溶液中超聲清洗30Min。 6、將經(jīng)過清洗的PC蓋片浸入含有金離子、絡(luò)合劑和還原劑甲醛的鍍液中，于 45-60。C下反應(yīng)lh。 7、將鍍有微金電極的蓋片放入烘箱中退火處理約3h，即得到本發(fā)明的高聚物多微 金電極蓋片。其中微金電極長3mm，寬3mm，厚度約為0. lmm。相互之間間距約為3mm。 二、帶有微通道的高聚物(PC :聚碳酸酯)基片的制作 1、制作單晶硅陽模 繪制芯片設(shè)計圖，圖形線條寬度約為25-100 ym，采用高清晰激光照排系統(tǒng)輸出在 透明的膠片上，即得到光刻掩模。 通過化學(xué)氣相沉積法在基片表面上沉積一層氮化硅薄膜作為犧牲層，在此基片上 通過旋轉(zhuǎn)覆膜技術(shù)覆蓋一層光敏膠，于烘箱中6(TC處理15-20min ;將光刻掩模覆蓋在基片上，通過暴光成像的原理將光刻掩模上的圖像轉(zhuǎn)移到基片表面的光膠層上；通過干法腐蝕 的方法將光膠層上的平面二維圖形加工成具有一定深度的立體結(jié)構(gòu)。即可得到具有凸起的
通道的單晶硅陽模。制備好的單晶硅陽模依次用^02 : 112504溶液(體積比為i : 4)，丙
酮和蒸餾水清洗，以除去其表面的氧化物。 2、采用熱壓法復(fù)制微通道 將PC片切割成長約6cm，寬4cm的尺寸。超聲清洗，自然涼干，在熱壓裝置中將PC 片加熱到軟化溫度(ll(TC)左右，然后在單晶硅陽模上施加一定的壓力，并持續(xù)約lmin，即 可在PC片壓制出與單晶硅陽?；パa的微通道。然后，將陽模和刻有微通道的PC基片一起 冷卻后脫模，就得到所需的微通道。 3、在蓋片上制作三個微小型池狀物 在蓋片上采用金剛鉆在不同的位置上分別鉆出三個微小型池狀物。 三、將高聚物微金電極蓋片和帶有微通道的高聚物基片在低溫氧等離子氣氛中處
理干凈。 四、將包埋四種梅毒特異性抗體的金膠敏感膜分別貼合于對應(yīng)的微金工作電極 上。 五、芯片封合 在顯微鏡下對準高聚物微金電極蓋片和帶有微通道的高聚物基片，將此基片和蓋 片固定并用二片蓋玻片夾緊，放置在烘箱中于一定溫度下保溫15min，即可得到所需的四通 道微流控芯片。 六、將步驟四所完成的PC片分別在工作電極、參考電極及對電極末端利用銀膠接 上銅片作為導(dǎo)線，待銀膠完全干后再封上熱熔膠以固定銅片，即完成整個四通道微流控芯 片的制作。 詳解的本案微流控芯片的上述具體實現(xiàn)路徑其相關(guān)各個操作參數(shù)可以根據(jù)實際 需要進行調(diào)整。 本案微流控芯片的使用方法 采用外加微泵驅(qū)動液流在四通道微流控芯片的毛細管通道中穩(wěn)定流動，利用四通
道電化學(xué)分析儀器分別對四種梅毒診斷抗原加以檢測。 本案微流控芯片的具體檢測使用步驟如下 1、在微管路中加入血清樣品液，在外加微泵驅(qū)動下，各種梅毒抗原分子被各通道 中電極表面上金膠敏感膜包埋的相應(yīng)的辣根過氧化物酶標記的梅毒特異性抗體捕獲。 2、辣根過氧化物酶標記的梅毒特異性抗體與血清樣品中的梅毒抗原形成免疫復(fù) 合物。 3、采用多通道電化學(xué)分析儀，加入鄰苯二酚等電子媒介體，采用安培法檢測上述 反應(yīng)引起的電流變化，由此獲得各種分析物的種類和含量。 4、將結(jié)果進行綜合分析，對梅毒抗原進行綜合診斷。 本實用新型的優(yōu)點是，在一塊物理器件即微流控芯片上集成了分別包覆有四種梅 毒特異性抗體物質(zhì)的四個工作電極，該四個工作電極分別針對檢測梅毒的四種特征診斷抗 原，本案微流控芯片是一種能夠利用梅毒多種特異性抗體進行同時檢測的梅毒診斷專用微 流控芯片，其集成構(gòu)造的結(jié)構(gòu)特點決定了該芯片的使用有助于加快梅毒診斷速度、提高診斷準確率、降低梅毒診斷費用。
圖1是本案微流控芯片實施例構(gòu)造示意圖，所展示的是該例結(jié)構(gòu)的俯視角度下的 透視的形態(tài)，圖中未描繪出所述附件。 圖中，1、2、 10分別是三個裝設(shè)位置不同的池狀物，3是歧管狀流體通道，4、7、 11、 14分別是裝設(shè)位置不同但相互并聯(lián)形成并聯(lián)聯(lián)通結(jié)構(gòu)的四條分支管道，5是裝設(shè)在分支管 道4內(nèi)的其表層金膠敏感膜結(jié)構(gòu)中的特異性抗體物質(zhì)為梅毒特異性抗體TP0684的工作電 極，6是裝設(shè)在分支管道7內(nèi)的其表層金膠敏感膜結(jié)構(gòu)中的特異性抗體物質(zhì)為梅毒特異性 抗體TP0453的工作電極，12是裝設(shè)在分支管道11內(nèi)的其表層金膠敏感膜結(jié)構(gòu)中的特異性 抗體物質(zhì)為梅毒特異性抗體TP0821的工作電極，13是裝設(shè)在分支管道14內(nèi)的其表層金膠 敏感膜結(jié)構(gòu)中的特異性抗體物質(zhì)為梅毒特異性抗體TP0319的工作電極，8是對電極，9是參 比電極。
具體實施方式在圖1所展示的本案實施例中，該器件也即微流控芯片的結(jié)構(gòu)包括貼合裝設(shè)在一 起的兩片板狀物，兩片板狀物分別是微流控芯片的蓋片以及微流控芯片的基片，在兩片板 狀物之間的相互貼合的位置上裝設(shè)有管道，以及，三個池狀物，該三個池狀物分別是池狀物 1、池狀物2和池狀物IO，所述管道的一端經(jīng)由歧管狀流體通道3分別與池狀物1以及池狀 物2聯(lián)通，所述管道的另一端與余下的一個池狀物10聯(lián)通，以及，依序分別裝設(shè)在所述管 道內(nèi)不同位置上的工作電極以及對電極8以及參比電極9，工作電極由金屬電極以及貼附 在所述金屬電極上的包埋了梅毒特異性抗體的金膠敏感膜構(gòu)成，所述管道的構(gòu)造呈并聯(lián)構(gòu) 造，該呈并聯(lián)構(gòu)造的管道由四條分支管道并聯(lián)構(gòu)成，該四條分支管道分別是分支管道4以 及分支管道7以及分支管道11以及分支管道14，以及，工作電極的數(shù)量是四個，該四個工作 電極分別是工作電極5以及工作電極6以及工作電極12以及工作電極13，其中，工作電極 5是裝設(shè)在分支管道4內(nèi)的其表層金膠敏感膜結(jié)構(gòu)中的特異性抗體物質(zhì)為梅毒特異性抗體 TP0684的工作電極，工作電極6是裝設(shè)在分支管道7內(nèi)的其表層金膠敏感膜結(jié)構(gòu)中的特異 性抗體物質(zhì)為梅毒特異性抗體TP0453的工作電極，工作電極12是裝設(shè)在分支管道11內(nèi)的 其表層金膠敏感膜結(jié)構(gòu)中的特異性抗體物質(zhì)為梅毒特異性抗體TP0821的工作電極，工作 電極13是裝設(shè)在分支管道14內(nèi)的其表層金膠敏感膜結(jié)構(gòu)中的特異性抗體物質(zhì)為梅毒特異 性抗體TP0319的工作電極。圖1中沒有繪出作為附件的微流動泵及多道電化學(xué)工作站等附 屬件。本例結(jié)構(gòu)中的各池狀物可以根據(jù)需要與作為附件的微流動泵按任何方式聯(lián)通。本例 結(jié)構(gòu)中的各工作電極以及對電極以及參比電極可以分別經(jīng)由各自專用的電纜或曰串線分 別與作為附件的多道電化學(xué)工作站的對應(yīng)電纜接口或曰串線接口聯(lián)接。似乎有必要在這里 作一點額外的補充說明抗體與抗原是彼此相關(guān)的但又不同的物質(zhì)，它們之間的相互關(guān)系， 通俗一點地比喻，就好比是一套鎖具中的鎖與鑰的關(guān)系。
權(quán)利要求含金膠抗原敏感膜包覆電極的梅毒診斷器件，該器件是微流控芯片，該微流控芯片的結(jié)構(gòu)包括貼合裝設(shè)在一起的兩片板狀物，所述兩片板狀物分別是微流控芯片的蓋片以及微流控芯片的基片，在所述兩片板狀物之間的相互貼合的位置上裝設(shè)有管道，以及，三個池狀物，管道的一端經(jīng)由歧管狀流體通道分別與其中的兩個池狀物聯(lián)通，管道的另一端與余下的一個池狀物聯(lián)通，以及，依序分別裝設(shè)在所述管道內(nèi)不同位置上的工作電極以及對電極以及參比電極，所述工作電極由金屬電極以及貼附在所述金屬電極上的包埋了梅毒特異性抗體的金膠敏感膜構(gòu)成，其特征是，所述管道的構(gòu)造呈并聯(lián)構(gòu)造，所述呈并聯(lián)構(gòu)造的管道由四條分支管道并聯(lián)構(gòu)成，以及，所述工作電極的數(shù)量是四個，該四個工作電極的裝設(shè)位置分別位于所述四條分支管道內(nèi)，以及，該四個工作電極其表層金膠敏感膜結(jié)構(gòu)中的特異性抗體分別是對梅毒抗原能特異性結(jié)合的四種梅毒抗體物質(zhì)，該四種抗體物質(zhì)分別是梅毒特異性抗體TP0684、TP0453、TP0821及TP0319。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含金膠抗原敏感膜包覆電極的梅毒診斷器件，其特征在于，所述管道以及所述分支管道以及所述歧管狀流體通道均為毛細管通道。
專利摘要本實用新型涉及一種含金膠抗原敏感膜包覆電極的梅毒診斷器件，該器件是微流控芯片，屬于分析測試領(lǐng)域。快速且廉價地診斷梅毒病患是相關(guān)診療技術(shù)進步的目標之一，本實用新型提供一種指向上述目標的診斷器件。本案要點是，該器件也即微流控芯片內(nèi)含有呈并聯(lián)構(gòu)造的管道，該并聯(lián)構(gòu)造含有四條相互并聯(lián)的分支管道，共有四個工作電極分別裝設(shè)在所述四條分支管道內(nèi)，所述工作電極由金屬電極以及貼附在所述金屬電極上的包埋了梅毒特異性抗體的金膠敏感膜構(gòu)成，該四個工作電極表層的各自的金膠敏感膜分別包埋了四種不同的梅毒特異性抗體物質(zhì)，該四種抗體物質(zhì)分別是梅毒特異性抗體TP0684、TP0453、TP0821及TP0319。該芯片具有簡約的集成的結(jié)構(gòu)。
文檔編號G01N33/571GK201449391SQ20082018445
公開日2010年5月5日 申請日期2008年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日
發(fā)明者巫遠招, 干寧, 李天華, 李榕生, 楊欣, 王峰, 王魯雁 申請人:寧波大學(xué)