專(zhuān)利名稱(chēng)：一種小動(dòng)物全腦標(biāo)本的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種標(biāo)本的制備方法，特別是涉及一種小動(dòng)物全腦標(biāo)本的制備方法。
背景技術(shù)：
制作腦部神經(jīng)元染色標(biāo)本，觀察神經(jīng)元形態(tài)，在臨床診斷和科學(xué)研究中都應(yīng)用廣泛。它 主要涉及兩種技術(shù)神經(jīng)元染色和標(biāo)本包埋技術(shù)。其中神經(jīng)元染色技術(shù)主要包括兩類(lèi) Golgi-Cox染色，普通染料(如蘇木精，亞甲基藍(lán))染色。包埋技術(shù)按包埋劑的不同主要分 為石蠟包埋、火棉膠包埋和樹(shù)脂包埋等。
根據(jù)染色技術(shù)和包埋技術(shù)的不同組合，目前常用的神經(jīng)元染色標(biāo)本制備方法主要有以下 幾類(lèi)
石蠟切片標(biāo)本臨床病理分析通常制作石蠟標(biāo)本。其主要步驟是標(biāo)本整體石蠟包埋， 再切片，然后使用普通染料對(duì)切片染色，最后裝裱切片。
火棉膠全腦標(biāo)本其主要步驟是標(biāo)本先整體Golgi-Cox染色，再整體火棉膠包埋。
樹(shù)脂切片標(biāo)本其主要步驟是標(biāo)本整體樹(shù)脂包埋，再半薄切片，然后使用美藍(lán)-品紅 等染料對(duì)切片進(jìn)行染色，最后裝裱切片。
以上各方法的主要性能參數(shù)如表l所示
表l
標(biāo)本 制作流程 石蠟切片標(biāo)本 整體包埋，切片后染
色
火棉膠全腦標(biāo)本 整體染色，再包埋
染色方法 包埋劑切片厚度(微米)
染料染色 石蠟 4-20
Golgi-Cox法 火棉膠
5—200樹(shù)脂切片標(biāo)本 整體包埋，切片后染色染料染色 樹(shù)脂 0.5-2
以上方法能滿(mǎn)足很多需要，但有以下不足無(wú)法在三個(gè)方向以相同的亞微米級(jí)分辨率觀
察全腦神經(jīng)元三維形態(tài)。石蠟標(biāo)本和火棉膠標(biāo)本的切片較厚，觀察神經(jīng)元三維形態(tài)時(shí)，縱向
分辨率(5微米)遠(yuǎn)低于橫向分辨率(亞微米)。樹(shù)脂切片標(biāo)本雖然能獲得亞微米切片，但 是制作的標(biāo)本不是全腦標(biāo)本，且染色方法僅僅只染神經(jīng)元胞體而不染神經(jīng)元的樹(shù)突和軸突， 因此無(wú)法觀察全腦神經(jīng)元的完整形態(tài)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種小動(dòng)物全腦標(biāo)本的制備方法，可以染較多神經(jīng)元， 能同時(shí)染神經(jīng)元胞體、樹(shù)突和軸突，對(duì)比度高，不易褪色，能夠在亞微米尺度觀察全腦神經(jīng) 元三維形態(tài)結(jié)構(gòu)。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種小動(dòng)物全腦標(biāo)本的制備方法，其包括如下步驟
a取小動(dòng)物腦樣本，將小動(dòng)物深度麻醉，斷頭處死，取腦，腦樣本可以為取自大鼠、小 鼠、青蛙、兔、貓等的全腦，也可以為腦的一部分，將其固定浸染； b將固定染色后的腦樣本黑化，所用黑化液為PH值大于10的堿液； c將上述得到的腦樣本進(jìn)行脫水，包括100 %重量脫水劑脫水；
d將黑化后的腦樣本采用包埋劑進(jìn)行浸膠，包括連續(xù)兩次100%重量的包埋劑浸膠； e將經(jīng)包埋劑浸膠后的腦樣本放入包埋盒中，加入100%重量包埋劑浸沒(méi)腦樣本； f將浸沒(méi)腦樣本的包埋盒加熱，使包埋劑聚合，聚合溫度為35 8(TC，聚合時(shí)間為6小 時(shí) 4天。
上述制備方法，其中，所述步驟b和c之間還包括步驟bl將黑化后的腦樣本用流水沖洗 ，沖洗時(shí)間為O. 5 24小時(shí)。
上述制備方法，其中，固定液可以為Golgi-Cox法固定液，也可采用鎢酸鹽改良Cox法固 定液，所述固定液的組成為
升汞 0. 1% 10%重量
重鉻酸鉀0. 1% 10%重量
鉻酸鉀 0. 1% 10%重量
鎢酸鈉或鎢酸鉀0% 10%重量
5蒸餾水 余量。
上述制備方法，其中，所述步驟a中固定浸染在l 2天后換固定液一次，之后每隔20 30天換固定液一次，至少換液3次，固定浸染的溫度為0 10(TC。
上述制備方法，其中，所述步驟b中，所述黑化液為氫氧化鋰、氨水、氫氧化鈉或氫氧 化鉀。
上述制備方法，其中，所述步驟c中所用脫水劑為酒精、丙酮、正丁醇、叔丁醇、蔗糖 或它們的組合。
上述制備方法，其中，所述步驟c中脫水為采用不同濃度的脫水劑進(jìn)行梯度脫水，之后 采用100%重量脫水劑脫水，各濃度脫水劑的脫水時(shí)間為O. 5 12小時(shí)，采用梯度脫水可以有 效防止標(biāo)本的變形，采用越密集的梯度越有利于防止變形，如果不關(guān)心變形，可以不采用梯 度脫水，直接進(jìn)行100%重量脫水。
上述制備方法，其中，所述步驟d或e中所用包埋劑為SPURR環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑，也可以采 用環(huán)氧樹(shù)脂618和環(huán)氧樹(shù)脂812包埋劑，這幾種包埋劑均為市場(chǎng)上可以買(mǎi)到的包埋劑。
上述制備方法，其中，所述步驟d中采用不同濃度的包埋劑進(jìn)行梯度包埋劑浸膠，之后 采用100%重量包埋劑浸膠，浸膠溫度為室溫，各濃度包埋劑的浸膠時(shí)間為O. 5 12小時(shí)，采 用梯度包埋劑浸膠可以有效防止標(biāo)本的變形，采用越密集的梯度越有利于防止變形，如果不 關(guān)心變形問(wèn)題，可以不采用梯度包埋劑浸膠，直接進(jìn)行100%重量包埋劑浸膠。
上述制備方法，其中，在所述步驟a固定浸染之后和所述步驟c的100X重量脫水劑脫水 前，采用普通染料對(duì)腦樣本進(jìn)行復(fù)染，即可以在固定染色后黑化前進(jìn)行復(fù)染，可以在流水沖 洗前或后復(fù)染，可以在梯度脫水過(guò)程中進(jìn)行，例如在進(jìn)行90%重量脫水劑脫水后100%重量 脫水劑脫水前進(jìn)行復(fù)染，或者，在所述步驟f之后將制得的標(biāo)本進(jìn)行切片，再對(duì)切片進(jìn)行普 通染料染色；所述的普通染料為亞甲基藍(lán)、Nissl染色液、蘇木精、伊紅、苯胺藍(lán)或中性紅
本發(fā)明的小動(dòng)物全腦標(biāo)本的制備方法，能染較多神經(jīng)元，能同時(shí)染神經(jīng)元胞體、樹(shù)突和 軸突，對(duì)比度高，不易褪色；制得的標(biāo)本適合50納米到100微米各種不同厚度的切片；宏觀 上進(jìn)行全腦整體染色，微觀上可實(shí)現(xiàn)連續(xù)亞微米切片，因此就能橫向、縱向都以相同的亞微 米級(jí)分辨率觀察全腦標(biāo)本顯微結(jié)構(gòu)(如神經(jīng)元)的三維形態(tài)；該方法能制作大量染色的連續(xù) 切片，以用于需要批量切片的場(chǎng)合。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例2 5的小動(dòng)物全腦標(biāo)本的制備流程圖2為實(shí)施例2的橫向分辨率為0. 3微米*0. 3微米，厚度為O. 3微米的鼠腦切片局部圖像。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖及實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。 實(shí)施例l
1、 取材取成年小鼠，深度麻醉后，斷頭，解剖取出全腦；
2、 固定、染色新鮮全腦立刻放入固定液中固定染色，浸染溫度為(TC，染色90天，定 期換新液，固定l天后換液一次，以后每隔20天換液一次，至少換液3次，固定液配方為
升汞 7%重量 重鉻酸鉀 7%重量 鉻酸鉀 5%重量 蒸餾水 81%重量
固定液必須現(xiàn)配，且必須最后加入鉻酸鉀溶液，固定液須用棕色瓶裝，并錫紙包瓶置暗 處，以減少光照的影響，且要經(jīng)常搖動(dòng)試劑瓶；
3、 黑化把染色后的全腦樣本浸入PH值大于10的氫氧化鋰中24小時(shí)，腦樣本變?yōu)槟G
色；
4、 梯度脫水腦樣本依次經(jīng)50% (重量)酒精，70% (重量)酒精，85% (重量)酒精 ，95% (重量)酒精，100% (重量)酒精，100%酒精丙酮(重量比1:1)， 100%重量丙酮脫 水各2小時(shí)，然后在100%重量丙酮中脫水12小時(shí)；
5、 浸膠標(biāo)本依次經(jīng)50%重量包埋劑，75%重量包埋劑，和連續(xù)兩次100%重量包埋劑室 溫下浸膠各8小時(shí)，包埋劑采用spurr環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑(市售)，溶劑為丙酮，包埋劑配方
ERL-4221: IO重量份 DER-736: 7. 6重量份 NSA: 26重量份 DMAE:0. 2重量份；
6、 包埋把腦樣本放到合適大小的包埋盒中，再慢慢添加100%重量包埋劑，浸沒(méi)腦樣
本；
7、 聚合把浸沒(méi)腦樣本的包埋盒置于6(TC烘箱中加熱36小時(shí)，聚合完畢把標(biāo)本放到干 燥器中靜置待其冷卻。實(shí)施例2
1、 取材取成年小鼠，深度麻醉后，斷頭，解剖取出全腦；
2、 固定、染色新鮮全腦立刻放入固定液中固定染色，浸染溫度為25。C，染色120天， 定期換新液，固定2天后換液一次，以后每隔25天換液一次，至少換液3次，固定液配方為
升汞 10%重量 重鉻酸鉀 10%重量 鉻酸鉀 10%重量 鎢酸鈉 5%重量 蒸餾水 65%重量
固定液必須現(xiàn)配，且必須最后加入鉻酸鉀溶液，固定液須用棕色瓶裝，并錫紙包瓶置暗 處，以減少光照的影響，且要經(jīng)常搖動(dòng)試劑瓶；
3、 黑化把染色后的全腦樣本浸入PH值大于10的氫氧化鈉中12小時(shí)，腦樣本變?yōu)槟G
色；
4、 流水沖洗將腦樣本用流水沖洗24小時(shí)；
5、 梯度脫水腦樣本依次經(jīng)20% (重量)酒精，30% (重量)酒精，50% (重量)酒精 ，70% (重量)酒精，100% (重量)酒精，脫水各0.5小時(shí)，之后再用100% (重量)酒精 脫水10小時(shí)；
6、 浸膠標(biāo)本依次經(jīng)30%重量包埋劑，50%重量包埋劑，70%重量包埋劑，和100%重量 包埋劑室溫下浸膠各O. 5小時(shí)，之后再在100%重量包埋劑中室溫下浸膠12小時(shí)，包埋劑采用 spurr環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑(市售)，溶劑為丙酮，包埋劑配方
ERL-4221: IO重量份 DER-736: 6重量份 NSA: 26重量份 DMAE:0. 2重量份；
7、 包埋把腦樣本放到合適大小的包埋盒中，再慢慢添加100%重量包埋劑，浸沒(méi)腦樣
本；
8、 聚合把浸沒(méi)腦樣本的包埋盒置于8(TC烘箱中加熱6小時(shí)，聚合完畢把標(biāo)本放到干燥 器中靜置待其冷卻。
圖2為本實(shí)施例的橫向分辨率為0. 3微米*0. 3微米，厚度為O. 3微米的鼠腦切片局部圖像實(shí)施例3
1、 取材取青蛙，深度麻醉后，斷頭，解剖取出全腦；
2、 固定、染色新鮮全腦立刻放入固定液中固定染色，浸染溫度為5(TC，染色120天， 定期換新液，固定2天后換液一次，以后每隔30天換液一次，至少換液3次，固定液配方為
升汞 0. 1%重量
重鉻酸鉀 1.5%重量 鉻酸鉀 1%重量 鎢酸鉀 0. 1%重量
蒸餾水 97. 3%重量
固定液必須現(xiàn)配，且必須最后加入鉻酸鉀溶液，固定液須用棕色瓶裝，并錫紙包瓶置暗 處，以減少光照的影響，且要經(jīng)常搖動(dòng)試劑瓶；
3、 黑化把染色后的全腦樣本浸入PH值大于10的氨水中1小時(shí)，腦樣本變?yōu)槟G色；
4、 流水沖洗將腦樣本用流水沖洗O. 5小時(shí)；
5、 梯度脫水腦樣本依次經(jīng)10% (重量)正丁醇，30% (重量)正丁醇，50% (重量) 正丁醇，70% (重量)正丁醇，100% (重量)正丁醇，脫水各5小時(shí)，之后再用100% (重
量)正丁醇脫水12小時(shí)；
6、 浸膠腦樣本依次經(jīng)20%重量包埋劑，40%重量包埋劑，60%重量包埋劑，80%重量 包埋劑和100%重量包埋劑室溫下浸膠各2小時(shí)，之后再在100 %重量包埋劑中室溫下浸膠10小 時(shí)，包埋劑采用spurr環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑(市售)，溶劑為丙酮，包埋劑配方
ERL-4221: IO重量份 DER-736: IO重量份 NSA: 26重量份 DMAE:0. 2重量份；
7、 包埋把腦樣本放到合適大小的包埋盒中，再慢慢添加100%重量包埋劑，浸沒(méi)腦樣
本；
8、 聚合把浸沒(méi)腦樣本的包埋盒置于35。C烘箱中加熱96小時(shí)，聚合完畢把標(biāo)本放到干 燥器中靜置待其冷卻；
9、 將得到的標(biāo)本切片，用普通染料亞甲基籃溶液對(duì)標(biāo)本進(jìn)行復(fù)染。 實(shí)施例4
1、取材取成年大鼠，深度麻醉后，斷頭，解剖取出全腦；
92、 固定、染色新鮮全腦立刻放入固定液中固定染色，浸染溫度為10(TC，染色100天
，定期換新液，固定l天后換液一次，以后每隔30天換液一次，至少換液3次，固定液配方為
升汞 2%重量 重鉻酸鉀 0. 1%重量
鉻酸鉀 0. 1%重量
鎢酸鉀 0. 8%重量
蒸餾水 97%重量
固定液必須現(xiàn)配，且必須最后加入鉻酸鉀溶液，固定液須用棕色瓶裝，并錫紙包瓶置暗 處，以減少光照的影響，且要經(jīng)常搖動(dòng)試劑瓶；
3、 復(fù)染用普通染料蘇木精對(duì)上述腦樣本進(jìn)行復(fù)染；
4、 黑化把復(fù)染后的腦樣本浸入PH值大于10的氫氧化鉀中15小時(shí)，腦樣本變?yōu)槟G色
5、 流水沖洗將腦樣本用流水沖洗2小時(shí)；
6、 脫水腦樣本經(jīng)連續(xù)兩次100% (重量)叔丁醇脫水12小時(shí)；
7、 浸膠腦樣本經(jīng)連續(xù)兩次100%重量包埋劑室溫下浸膠12小時(shí)，包埋劑采用spurr環(huán)
氧樹(shù)脂包埋劑(市售)，溶劑為丙酮，包埋劑配方 ERL-4221: IO重量份 DER-736: 8. 5重量份 NSA: 26重量份 DMAE:0. 2重量份；
8、 包埋把腦樣本放到合適大小的包埋盒中，再慢慢添加100%重量包埋劑，浸沒(méi)腦樣
本；
9、 聚合把浸沒(méi)腦樣本的包埋盒置于5(TC烘箱中加熱80小時(shí)，聚合完畢把標(biāo)本放到干 燥器中靜置待其冷卻。
實(shí)施例5
1、 取材取成年兔，深度麻醉后，斷頭，解剖取出全腦；
2、 固定、染色新鮮全腦立刻放入固定液中固定染色，浸染溫度為25。C，染色90天， 定期換新液，固定2天后換液一次，以后每隔20天換液一次，至少換液3次，固定液配方為
升汞 10%重量重鉻酸鉀 5%重量 鉻酸鉀 8%重量 鎢酸鉀 10%重量 蒸餾水 67%重量
固定液必須現(xiàn)配，且必須最后加入鉻酸鉀溶液，固定液須用棕色瓶裝，并錫紙包瓶置暗 處，以減少光照的影響，且要經(jīng)常搖動(dòng)試劑瓶；
3、 黑化把復(fù)染后的腦樣本浸入PH值大于10的氫氧化鋰中20小時(shí)，腦樣本變?yōu)槟G色
4、 流水沖洗將腦樣本用流水沖洗24小時(shí)；
5、 梯度脫水腦樣本依次經(jīng)10% (重量)丙酮，30% (重量)丙酮，50% (重量)丙酮 ，70% (重量)丙酮，脫水各2小時(shí)，之后用普通染料苯胺藍(lán)對(duì)腦樣本進(jìn)行復(fù)染，之后再經(jīng)
連續(xù)兩次100% (重量)正丁醇脫水12小時(shí)；
6、 浸膠腦樣本依次經(jīng)40%重量包埋劑，55%重量包埋劑，70%重量包埋劑，85%重量 包埋劑和100%重量包埋劑室溫下浸膠各4小時(shí)，之后再在100%包埋劑中室溫下浸膠12小時(shí)， 包埋劑采用spurr環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑(市售)，溶劑為丙酮，包埋劑配方
ERL-4221: IO重量份 DER-736: 7. l重量份 NSA: 26重量份 DMAE:0. 2重量份；
7、 包埋把腦樣本放到合適大小的包埋盒中，再慢慢添加100%重量包埋劑，浸沒(méi)腦樣
本；
8、 聚合:把浸沒(méi)腦樣本的包埋盒置于6(TC烘箱中加熱45小時(shí)，聚合完畢把標(biāo)本放到干燥器 中靜置待其冷卻。
權(quán)利要求
權(quán)利要求1一種小動(dòng)物全腦標(biāo)本的制備方法，其包括如下步驟a取小動(dòng)物腦樣本，將其固定浸染；b將固定染色后的腦樣本黑化，所用黑化液為PH值大于10的堿液，黑化時(shí)間為1～24小時(shí)；c將上述得到的腦樣本進(jìn)行脫水，包括100％重量脫水劑脫水；d將黑化后的腦樣本采用包埋劑進(jìn)行浸膠，包括連續(xù)兩次100％重量的包埋劑浸膠；e將經(jīng)包埋劑浸膠后的腦樣本放入包埋盒中，加入100％重量包埋劑浸沒(méi)腦樣本；f將浸沒(méi)腦樣本的包埋盒加熱，使包埋劑聚合，聚合溫度為35～80℃，聚合時(shí)間為6小時(shí)～96小時(shí)。
2.如權(quán)利要求l所述的制備方法，其中，所述步驟b和c之間還包括步 驟bl將黑化后的腦樣本用流水沖洗，沖洗時(shí)間為O. 5 24小時(shí)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其中，所述步驟a中固定浸染的 固定液的組成為升汞 0. 1% 10%重量重鉻酸鉀 0. 1% 10%重量 鉻酸鉀 0. 1% 10%重量鎢酸鈉或鎢酸鉀0% 10%重量 蒸餾水 余量。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述步驟a中固定浸染在1 2天后換固定液一次，之后每隔20 30天換固定液一次，至少換液3次，固定浸染的溫度為0 100。C。
5.如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其中，所述步驟b中，所述黑化 液為氫氧化鋰、氨水、氫氧化鈉或氫氧化鉀。
6.如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其中，所述步驟c中所用脫水劑 為酒精、丙酮、正丁醇、叔丁醇、蔗糖或它們的組合。
7.如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其中，所述步驟c中脫水為采用 不同濃度的脫水劑進(jìn)行梯度脫水，之后采用100%重量脫水劑脫水，各濃度脫水劑的脫水時(shí) 間為O. 5 12小時(shí)。
8.如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其中，所述步驟d或e中所用包 埋劑為SPURR環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑。
9.如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其中，所述步驟d中采用不同濃 度的包埋劑進(jìn)行梯度包埋劑浸膠，之后采用100%重量包埋劑浸膠，各濃度包埋劑的浸膠時(shí) 間為O. 5 12小時(shí)。
10.如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其中，在所述步驟a固定浸染 之后和所述步驟c的100X重量脫水劑脫水前，采用普通染料對(duì)腦樣本進(jìn)行復(fù)染，或者，在所 述步驟f之后將制得的標(biāo)本進(jìn)行切片，再對(duì)切片進(jìn)行普通染料染色；所述的普通染料為亞甲 基藍(lán)、Nissl染色液、蘇木精、伊紅、苯胺藍(lán)或中性紅。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種小動(dòng)物全腦標(biāo)本的制備方法，其包括如下步驟a.取小動(dòng)物腦樣本，將其固定浸染；b.將固定染色后的腦樣本黑化，所用黑化液為pH值大于10的堿液，黑化時(shí)間為1～24小時(shí)；c.將上述得到的腦樣本進(jìn)行脫水，包括100％重量脫水劑脫水；d.將黑化后的腦樣本采用包埋劑進(jìn)行浸膠，包括連續(xù)兩次100％重量的包埋劑浸膠；e.將經(jīng)包埋劑浸膠后的腦樣本放入包埋盒中，加入100％重量包埋劑浸沒(méi)腦樣本；f將浸沒(méi)腦樣本的包埋盒加熱，使包埋劑聚合，聚合溫度為35～80℃，聚合時(shí)間為6小時(shí)～96小時(shí)。本發(fā)明的小動(dòng)物全腦標(biāo)本的制備方法可以染較多神經(jīng)元，能同時(shí)染神經(jīng)元胞體、樹(shù)突和軸突，對(duì)比度高，不易褪色，能夠在亞微米尺度觀察全腦神經(jīng)元三維形態(tài)結(jié)構(gòu)。
文檔編號(hào)G01N1/30GK101458182SQ20081030643
公開(kāi)日2009年6月17日 申請(qǐng)日期2008年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月22日
發(fā)明者斌 張, 李安安, 王冰然, 駱清銘, 輝 龔 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)